專利名稱：一種酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物催化領(lǐng)域，更具體涉及一種酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法。
背景技術(shù)：
紅景天苷是糖的半縮醛羥基與醇羥基脫水形成的醇苷，是一種由葡萄糖與酪醇以糖苷鍵結(jié)合而成的糖苷，酪醇為其苷元，為傳統(tǒng)中藥紅景天中的主要有效成分，具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲勞、抗輻射和抗病毒等多種功能，同時還具有延緩機體衰老、防止老年疾病等功效，尤其在軍事醫(yī)學、航天醫(yī)學、運動醫(yī)學和保健醫(yī)學等方面具有十分重要的應(yīng)用價值。傳統(tǒng)獲得紅景天苷的方式主要為以植物紅景天為原料提取制得，植物體中紅景天苷的合成可分為兩個階段一是苷元酪醇的合成；二是葡萄糖和酪醇結(jié)合形成紅景天苷， 由于野生紅景天資源匱乏，人工種植因根腐病而未獲得成功，此外此法通常需要通過浸泡、 醇提、有機溶劑萃取、硅膠柱層析、大孔吸附樹脂層析等繁瑣的處理過程，產(chǎn)率低；以化學法、植物細胞培養(yǎng)以及微生物發(fā)酵制備紅景天苷的研究已有報道，化學法合成紅景天苷存在合成時需要昂貴的糖苷供體，同時必須經(jīng)過羥基保護和脫保護步驟，同時藥物中間體回收處理繁瑣等缺陷；植物細胞培養(yǎng)法因設(shè)備昂貴，技術(shù)難度大，而未能投入到實際生產(chǎn)中； 微生物發(fā)酵法因產(chǎn)量低也無法進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。酶催化合成紅景天苷的方法具有反應(yīng)條件溫和，具有很好的位置選擇性和立體專一性，產(chǎn)物結(jié)構(gòu)單一，純度高等優(yōu)點，受到國內(nèi)外科技工作者的青睞。該酶本質(zhì)上屬于水解酶類，但在一定條件下又可催化逆水解反應(yīng)，因此在水相體系中，該反應(yīng)受熱力學平衡的影響導致紅景天苷的轉(zhuǎn)化率難以提高，因此需嚴格控制反應(yīng)體系中的水含量。但在傳統(tǒng)有機溶劑中酶又容易失活且底物葡萄糖或酪醇的溶解性差，不利于反應(yīng)進行，因此需要有一種全新的反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，離子液體的出現(xiàn)可望在同一反應(yīng)體系中協(xié)調(diào)以上困難，實現(xiàn)紅景天苷的高效率生物轉(zhuǎn)化。離子液體是常溫下呈液態(tài)的鹽，通過對陰陽離子的設(shè)計可調(diào)節(jié)對無機物、水、有機物及聚合物的溶解性，因此通過設(shè)計可提高反應(yīng)介質(zhì)中極性基質(zhì)葡萄糖和非極性基質(zhì)酪醇的濃度促使反應(yīng)有利于合成而非水解，同時離子液體具有較好的生物相容性，酶在離子液體組成的兩相或單相體系中能夠保持較高的酶活力，有利于反應(yīng)的不斷進行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有反應(yīng)體系的缺陷，提供一種酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，該方法操作簡單，并使酶催化合成紅景天苷的效率得以提高。本發(fā)明是通過如下技術(shù)內(nèi)容實施的
一種酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法是將葡萄糖，酪醇和酶與含有緩沖溶液的溶劑中反應(yīng)，采用常規(guī)的方法收集紅景天苷，所述的溶劑包含離子液體，有機溶劑中的一種或兩種。所述的離子液體采用1，3- 二甲基咪唑硫酸單甲酯，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，1-己基_3甲基咪唑四氟硼酸鹽，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽中的任意一種。所述的離子液體的體積含量為0 100%。所述的離子液體的體積含量為14 19%。所述的有機溶劑采用叔丁醇、1，4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、四氫呋喃中的任意一種。所述的有機溶劑的體積含量為0 100%。所述的有機溶劑的體積含量為56 76%。所述反應(yīng)的轉(zhuǎn)速為100 350 rpm，最佳為200 305rpm，所述反應(yīng)的溫度為40 60°C。所述的酶的濃度為2g/L，所采用的酶為β -葡萄糖苷酶。所述的葡萄糖的濃度為40 180g/L，酪醇的濃度為180 260 g/L。本發(fā)明的優(yōu)點為與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明采用由離子液體組成的反應(yīng)介質(zhì)作為酶催化直接糖基化合成紅景天苷的反應(yīng)體系，可以保證酶活力和酶的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)體系中底物的溶解性，降低了反應(yīng)體系中的水活度，無需使用昂貴的糖苷供體，可一步合成紅景天苷，產(chǎn)物分離純化工藝簡單，純度高，未反應(yīng)的酪醇可回收利用，降低了生產(chǎn)成本，可滿足迅速發(fā)展醫(yī)藥行業(yè)的需求。


圖1為酶催化直接糖基化合成紅景天苷反應(yīng)式。
具體實施例方式一種酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法是將葡萄糖，酪醇和酶與含有緩沖溶液的溶劑中反應(yīng)，采用常規(guī)的方法收集紅景天苷，所述的溶劑包含離子液體，有機溶劑中的一種或兩種。所述的離子液體采用1，3- 二甲基咪唑硫酸單甲酯，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，1-己基_3甲基咪唑四氟硼酸鹽，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽中的任意一種。所述離子液體的體積含量為0 100%。所述的離子液體的體積含量為14 19%。所述的有機溶劑采用叔丁醇、1，4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、四氫呋喃中的任意一種。所述的有機溶劑的體積含量為0 100%。所述的有機溶劑的體積含量為56 76%。所述反應(yīng)的轉(zhuǎn)速為100 350rpm，最佳為 200 305rpm。所述的酶的濃度為2g/L，所采用的酶為β -葡萄糖苷酶。所述的葡萄糖的濃度為40 180g/L，酪醇的濃度為180 260 g/L。所述的緩沖溶液的pH為4 8，最佳為5 7，優(yōu)選采用磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽緩沖溶液中的任意一種，反應(yīng)體系中緩沖溶液體積含量為0 100%，最佳為5 30%。所述反應(yīng)溫度為40 60°C，最佳為50 60°C ； 所述反應(yīng)時間為1 7天，最佳為2 5天；
反應(yīng)結(jié)束后，利用高效液相色譜儀進行產(chǎn)物紅景天苷含量檢測，通過簡單的萃取工藝， 可從反應(yīng)液中方便的提取產(chǎn)物紅景天苷，同時對未反應(yīng)的底物酪醇進行回收利用，以降低生產(chǎn)成本。實施例1
在IOml試管中加入55yL的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，396yLl，4-二氧六環(huán)和 99 μ Ll- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向反應(yīng)介質(zhì)中加入22mg葡萄糖，33mg酪醇，加入 1. Img酶引發(fā)反應(yīng)，在200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)2天。在預定時間取樣550 μ L，加入8. 5ml甲醇終止反應(yīng)并超聲波震蕩20min，14000rpm 離心5min，上清液用0. 45um的濾膜進行過濾，利用高效液相色譜儀(LC-10A)對紅景天苷產(chǎn)量進行測定。SPD-10A紫外可見檢測器；依利特C18 (4. 6mmX250mmX5um)；流動相為甲醇水(15:85)，流速lml/min ；檢測波長275nm ；柱溫室溫；進樣量20 μ L。經(jīng)檢測反應(yīng)體系中紅景天苷濃度為3. 6g/L.
實施例2
在IOml試管中加入55 μ L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，500 μ Ll-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向反應(yīng)介質(zhì)中加入22mg葡萄糖，33mg酪醇，加入1. Img酶引發(fā)反應(yīng)，在200rpm 的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)2天。采用實施例1相同的檢測方法對產(chǎn)物紅景天苷進行檢測， 產(chǎn)物濃度可達0. 58g/L。實施例3
在IOml試管中加入55yL的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，396yLl，4-二氧六環(huán)和 99 μ Ll- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向反應(yīng)介質(zhì)中加入22mg葡萄糖，99mg酪醇，加入 1. Img酶引發(fā)反應(yīng)，在200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)2天。采用實施例1相同的檢測方法對產(chǎn)物紅景天苷進行檢測，產(chǎn)物濃度可達7. 9g/L。實施例4
在IOml試管中加入55yL的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，396yLl，4-二氧六環(huán)和 99 μ Ll- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向反應(yīng)介質(zhì)中加入22mg葡萄糖，143mg酪醇，加入 1. Img酶引發(fā)反應(yīng)，在200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)2天。采用實施例1相同的檢測方法對產(chǎn)物紅景天苷進行檢測，產(chǎn)物濃度可達7. Og/L。實施例5
在IOml試管中加入165 μ L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，308 μ Li，4-二氧六環(huán)和 77 μ Ll- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向其中加入葡萄糖55mg，酪醇llOmg。加入1. Img 酶引發(fā)反應(yīng)，在200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)2天。采用實施例1相同的檢測方法對產(chǎn)物紅景天苷進行檢測，產(chǎn)物濃度可達4. 5g/L。實施例6
在IOml試管中加入27. 5μ L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，418 μ Li，4- 二氧六環(huán)和 104. 5 μ Ll-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向其中加入葡萄糖55mg，酪醇llOmg。加入 1. Img酶引發(fā)反應(yīng)，在200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)2天。采用實施例1相同的檢測方法對產(chǎn)物紅景天苷進行檢測，產(chǎn)物濃度可達0. 7g/L。實施例7
在IOml試管中加入55yL的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，396yLl，4-二氧六環(huán)和 99yLl-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向其中加入葡萄糖99mg，酪醇llOmg。加入1. Img 酶引發(fā)反應(yīng)，在200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)2天。采用實施例1相同的檢測方法對產(chǎn)物紅景天苷進行檢測，產(chǎn)物濃度可達7. 9g/L。實施例8
在IOml試管中加入82. 5 μ L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，374 μ Li，4- 二氧六環(huán)和 93. 5 μ Ll-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向其中加入葡萄糖55mg，酪醇llOmg。加入1. Img 酶引發(fā)反應(yīng)，在305rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)2天。采用實施例1相同的檢測方法對產(chǎn)物紅景天苷進行檢測，產(chǎn)物濃度可達15. Og/L。實施例9
在IOml試管中加入82. 5 μ L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，374 μ L的1，4- 二氧六環(huán)和 93. 5 μ L的1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向該反應(yīng)介質(zhì)中加入55mg葡萄糖，IlOmg酪醇，加入1. Img酶引發(fā)反應(yīng)，在200rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上于60°C下振蕩反應(yīng)2天，采用實施例 1相同的檢測方法對產(chǎn)物進行檢測，其濃度可達2. 8g/L。實施例10
在IOml試管中加入82. 5 μ L的檸檬酸-磷酸鹽緩沖溶液，374 μ L的1，4- 二氧六環(huán)和 93. 5 μ L的1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，向該反應(yīng)介質(zhì)中加入55mg葡萄糖，IlOmg酪醇，加入1. Img酶引發(fā)反應(yīng)，在275rpm的旋轉(zhuǎn)式搖床上振蕩反應(yīng)5天，采用實施例1相同的檢測方法對產(chǎn)物進行檢測，其濃度可達18. 9g/L。實施例11
反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液(50ml)過濾，濾渣用甲醇洗滌3次(50ml X 3)，棄去濾渣，合并濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，將所得固體用50ml乙醚萃取，離心取上清液，剩余固體用200ml 無水乙醇萃取，離心取上清液，將乙醚部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，可得未反應(yīng)的酪醇以循環(huán)使用，無水乙醇部分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑可得純度達90%以上的紅景天苷白色粉末0. 92g，得率 87. 6%以上。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述方法是將葡萄糖， 酪醇和酶與含有緩沖溶液的溶劑反應(yīng)，采用常規(guī)的方法收集紅景天苷，所述的溶劑包含離子液體，有機溶劑一種或兩種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述的離子液體采用1，3-二甲基咪唑硫酸單甲酯，1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽，1-己基_3甲基咪唑四氟硼酸鹽，1- 丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽，1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽中的任意一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述的離子液體的體積含量為0 100%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述的離子液體的體積含量為14 19%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述的有機溶劑采用叔丁醇、1，4-二氧六環(huán)、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、四氫呋喃中的任意一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述的有機溶劑的體積含量為0 100%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述的有機溶劑的體積含量為56 76%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述反應(yīng)的轉(zhuǎn)速為100 350rpm，所述反應(yīng)的溫度為40 60°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述的酶的濃度為2g/L，所采用的酶為β-葡萄糖苷酶。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，其特征在于所述的葡萄糖的濃度為40 180g/L，酪醇的濃度為180 260 g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶催化直接糖基化合成紅景天苷的方法，該方法是將葡萄糖，酪醇和酶與含有緩沖溶液的溶劑中反應(yīng)，采用常規(guī)的方法收集紅景天苷，所述的溶劑包含離子液體和有機溶劑。與現(xiàn)有方法相比，本發(fā)明采用由離子液體組成的反應(yīng)介質(zhì)作為酶催化直接糖基化合成紅景天苷的反應(yīng)體系，可以保證酶活力和酶的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)體系中底物的溶解性，降低了反應(yīng)體系中的水活度，無需使用昂貴的糖苷供體，可一步合成紅景天苷，產(chǎn)物分離純化工藝簡單，純度高，未反應(yīng)的酪醇可回收利用，降低了生產(chǎn)成本，可滿足迅速發(fā)展醫(yī)藥行業(yè)的需求。
文檔編號C12P19/44GK102174620SQ20111004917
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者岳磊, 林瓊妹, 林磊, 石賢愛, 許格, 郭養(yǎng)浩 申請人:福州大學