專利名稱：一種通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程和轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域，涉及一種通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法。
背景技術(shù)：
菊花(Chrysanthemum grandif lorum)，菊科多年生草本植物，原產(chǎn)中國，栽培歷史悠久，品種豐富，花型花色千變?nèi)f化，觀賞價(jià)值極高，是中國十大傳統(tǒng)名花之一，也是深受廣大民眾喜歡的園藝植物，廣泛應(yīng)用于盆花、切花等，居世界四大切花之首。但夏季高溫使其觀賞價(jià)值和栽培生產(chǎn)時(shí)間范圍受到影響。為了解決菊花的周年穩(wěn)定供應(yīng)，獲得適應(yīng)夏季高溫氣候的菊花材料，提高菊花耐熱性成為當(dāng)今研究的重要課題。目前有關(guān)菊花耐熱性鑒定與耐熱性研究的報(bào)道不少，但關(guān)于通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高菊花的耐熱性方研究報(bào)道還相對較少。熱激蛋白是一類在有機(jī)體受到高溫等逆境刺激后大量表達(dá)的蛋白，是植物對逆境脅迫短期適應(yīng)的必需組成成分，對減輕逆境脅迫引起的傷害有很大的作用。熱激蛋白種類很多，其中分子量為70kDa的HSP70是最保守、最普遍的。目前關(guān)于HSP70是否能提高抗逆性的報(bào)道很少。Cheng等報(bào)道指出水母雪蓮中的HSP70受到高溫和低溫脅迫短時(shí)處理的強(qiáng)烈表達(dá)(Cheng等，2006) ；Cho等研究表明轉(zhuǎn)HSP70-1基因的煙草能增強(qiáng)植株的抗旱性(Cho 等，2006)。在植物的遺傳轉(zhuǎn)化途徑中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是應(yīng)用最為廣泛的方法之一，其中有效的植物表達(dá)載體至關(guān)重要。將耐熱基因HSP70構(gòu)建植物表達(dá)載體，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化，可獲得具有耐逆特性的新種質(zhì)。對于優(yōu)良作物新品種的培育及在生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，具有重要意義。參考文獻(xiàn)陳亞瓊.熱激蛋白與生物環(huán)境適應(yīng)及進(jìn)化的關(guān)系[J].自然科學(xué)進(jìn)展，2006， 16(9) :1066-1073.Vierling E. The roles of heat shock proteins in plants[J]. Plant Mot Biol, 1991, 42 :579-620. Lindquist S, Craig E A. The heat shock proteins[J]. Annu Rev Genet, 1988,22 :631-677. Larkindale J, Knight M R. Protection against heat stress-induced oxidative damage inArabidopsis involves calcium, abscisic acid, ethylene, and salicylic acid[J] · Plant Physiol, 2002 :128 :682-95.Necchi A, Pogna N E, Mapelli S. Early and late heat shock proteins in wheats and other cerealspecies[J]. PlantPhysiol, 1987,84 :1378-1384.Ferguson D L, Guikema J A, Paulsen G M. Ubiquitin pool modulation and protein degradationin wheat roots during high temperature stress[J]. Plant Physiol,1990,92 :740-746. Cho E K, Hong C B.Over-expression of tobacco NtHSP70-lcontributes to drought-stresstolerance in plants[J]. Plant CellRep,2006；25 :349-58.Liqin C,Zhiping J,Chunxiang F,Dexiu Z.Cloning and expression analysis of a hsp70genefrom Saussurea medusa[J]. DNA Sequence,2006 ； 17 (2) 159-165.Alvim F C, Carolino S M B, Cascardo J C Μ, Nunes C C, Martinez C A, Otoni W C, Fontes E P B.Enhanced accumulation of BiP in transgenic plants confers tolerance to water stress [J]. PlantPhysiol, 2001 ；126 :1042-1054.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于為解決現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中切花菊對高溫、干旱和高鹽耐逆性不強(qiáng)的問題，提供一種通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法。CgHSP70基因是從菊花 (Chrysanthemum grandiflorum) ‘鐘山紫桂，中克隆得到的耐熱基因，序列為SEQ IDN0. 1。 本發(fā)明涉及的植物表達(dá)載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)基因植物的分子檢測及轉(zhuǎn)基因后代對高溫、干旱及高鹽的抗逆性分析。為利用基因工程技術(shù)開展耐逆性菊花新品種分子育種提供方法和實(shí)例。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的構(gòu)建包含CgHSP70基因的植物表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將CgHSP70基因?qū)肭谢ň眨⒔?jīng)過潮霉素篩選抗性植株；經(jīng)過潮霉素抗性篩選得到陽性轉(zhuǎn)化植株，對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR檢測，熒光定量PCR檢驗(yàn)內(nèi)源基因已整合到切花菊基因組DNA上。對轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行耐高溫、干旱和高鹽分析，最終獲得抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因菊花植株。一種通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，該方法包括以下步驟(1)構(gòu)建 CgHSP70 基因的植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301_CgHSP70以菊花‘鐘山紫桂’為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CgHSP70基因的上下游分別引入SmaI和)(baI酶切位點(diǎn)，上游引物為CgHSP70-F 5 ' -CCCCGGGATGGCTGGTAAAGGTGAA-3 ‘，下游引物為 CgHSP70_R 5 ‘ -AG TAGAACAGATAAATATCGACCACA-3 ‘，將擴(kuò)增出來的含有CgHSP70完整開放閱讀框的PCR產(chǎn)物片段與T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，提取陽性質(zhì)粒，由SmaI和)(baI雙酶切得到的CgHSP70基因片段，與SmaI和)(baI雙酶切線性化的表達(dá)載體pCAMBIA1301連接，并轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，酶切電泳檢測并測序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-CgHSP70 構(gòu)建成功，所述的 CgHSP70 基因序列為 SEQ ID NO. 1 ；(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化菊花采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CgHSP70基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到菊花中，進(jìn)行培養(yǎng)初步獲得抗性植株。上述的通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，步驟( 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CgHSP70基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到菊花中，進(jìn)行培養(yǎng)初步獲得抗性植株的操作過程為制備感受態(tài)的農(nóng)桿菌，將步驟(1)中構(gòu)建的含有CgHSP70基因的植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-CgHSP70轉(zhuǎn)入感受態(tài)的農(nóng)桿菌菌株中；取組培瓶中菊花苗頂端葉盤作為轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中預(yù)培3d，然后浸入備好的轉(zhuǎn)入了 CgHSP70基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液中感染lOmin，用濾紙吸干菌液后再將其接種到共培養(yǎng)基上黑暗中共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4代，等分化出的抗性芽長至2 3厘米時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初步獲得抗性植株。
菊花組織培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，pH5. 8 6. 0，IOOKpa, 121°C滅菌20分鐘；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6_芐氨基嘌呤 lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；篩選培養(yǎng)基MS+潮霉素10mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6_芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. lmg/L ；生根培養(yǎng)基1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0. lmg/L。詳細(xì)過程為以上過程中所用的農(nóng)桿菌菌株為EHA105，從YEB(50μg/mL利福平) 平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50 μ g/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm,
培養(yǎng)至OD值0. 5，而后冰浴菌液30min，離心收集菌體，懸浮于2mL預(yù)冷的的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200 μ L/管分裝，待用。取10 μ L pCAMBIA1301_CgHSP70載體質(zhì)粒，加入200 μ L感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，液氮冷凍5min，37°C 5min,加入800 μ L YEB液體培養(yǎng)基，28 0C 200rpm預(yù)培養(yǎng)4h，菌液涂板于YEB (50 μ g/mL利福平+50 μ g/mL卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，28°C暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用于轉(zhuǎn)化菊花。以切花菊‘神馬’葉片為外植體，取組培瓶中菊花苗頂端葉盤(0. 5cmX0. 5cm)作為轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3d，然后浸入備好的農(nóng)桿菌菌液中感染lOmin，用濾紙吸干菌液后再接種到共培養(yǎng)基上黑暗中共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4代，等分化出的抗性芽長至2 3厘米時(shí)切下綠芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，當(dāng)根系發(fā)達(dá)成為完整的植株，經(jīng)煉苗后移栽至營養(yǎng)土直徑5cm盆缽，獲得植株為具有潮霉素抗性TO代轉(zhuǎn)基因菊花，初步獲得抗性植株。上述的通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其在于將轉(zhuǎn)CgHSP70基因初步獲得的抗性植株進(jìn)行分子檢測(PCR和熒光定量PCR分子檢測)，篩選陽性植株，獲得轉(zhuǎn)基因菊花株系(I)PCR 檢測取生根篩選得到的潮霉素抗植株嫩葉及未轉(zhuǎn)化株嫩葉，采取CTAB法提取基因組DNA。由于是同源轉(zhuǎn)化，將hptll基因作為檢測目標(biāo)。根據(jù)hptll基因兩端合成擴(kuò)增反應(yīng)引物，擴(kuò)增出的基因的片段長度408bp，引物序列為HII-F CTCGATGAGCTGATGCTTTGGG, HII-R :GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA。分別以潮霉素抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株DNA為模板，以 HII-F和HII-R為引物，進(jìn)行PCR檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。(2)熒光定量PCR檢測按照熒光定量試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))說明書建立擴(kuò)增體系。每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各個(gè)樣品的Ct值，以未轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)為基準(zhǔn)值，計(jì)算各轉(zhuǎn)基因植株及野生型基因相對表達(dá)情況。擴(kuò)增出的基因片段長度為lKbp，引物序列為HSP-F :GCTTGCTGAGGCGGATGAGT^PHSP-R ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC，以I^saA擴(kuò)增的基因片段為內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增片段長度為127bp，引物序列PsaA-F CCAATAACCACGACCGCTAA, PsaA-R :CACAGTCCTCCCAAGTAA。上述的通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其在于對所獲得轉(zhuǎn)基因植株后代進(jìn)行抗性分析(1)采集轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)化植株生長一致的幼苗葉片，用去離子水洗凈，紗布擦干，去除主脈并剪成0. 5cm2的小片，放入燒杯中并準(zhǔn)確加入20mL去離子水，用真空泵抽氣 IOmin后分別在室溫、40°C、45°C、50°C、55°C和60 V的水浴中放置20min，取出靜置冷卻濁， 并測定相對電導(dǎo)率，擬合Logistic回歸方程，得到高溫半致死溫度(LT5tl)。
(2)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株高溫脅迫處理后恢復(fù)生長存活率分析為檢測轉(zhuǎn)基因植株的高溫脅迫耐性，對轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株進(jìn)行高溫脅迫處理。處理后，將轉(zhuǎn)基因及未轉(zhuǎn)基因植株苗種植于營養(yǎng)缽中恢復(fù)生長一周，然后統(tǒng)計(jì)存活率并觀察生長情況。(3)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株干旱脅迫處理后恢復(fù)生長存活率分析為檢測轉(zhuǎn)基因植株的干旱脅迫耐性，對轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株進(jìn)行干旱脅迫處理。處理后，將轉(zhuǎn)基因及未轉(zhuǎn)基因植株腳芽扦插苗種植于營養(yǎng)缽中恢復(fù)生長兩周，然后統(tǒng)計(jì)存活率并觀察生長情況。(4)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株鹽脅迫處理后恢復(fù)生長存活率分析為檢測轉(zhuǎn)基因植株的鹽脅迫耐性，對轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株進(jìn)行鹽脅迫處理。 處理后將植株根系用去離子水沖洗3遍，并種植于新營養(yǎng)缽中澆足水恢復(fù)生長一周，統(tǒng)計(jì)植株存活率并觀察生長情況。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的方法選育了轉(zhuǎn)基因菊花材料，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將CgHSP70基因整合到菊花基因組中，通過高溫、干旱及高鹽試驗(yàn)分析獲得耐高溫、干旱及高鹽的轉(zhuǎn)基因菊花株系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與野生型株系和轉(zhuǎn)空載體植株相比，轉(zhuǎn)CgHSP70的植株耐高溫、干旱及高鹽能力得到很大提高，而野生型植株和轉(zhuǎn)空載體的CgHSP70的植株抗性很弱。利用本方法可以顯著提高菊花的耐逆性。


圖1 植物重組表達(dá)質(zhì)粒pCAMBIA1301_CgHSP70構(gòu)建圖譜R，右邊界；L，左邊界；CgHSP70表達(dá)熱激蛋白70的基因；hpt為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因。圖2 植物表達(dá)載體構(gòu)建酶切驗(yàn)證圖A，Marker ；B,植物表達(dá)載體圖3 轉(zhuǎn)基因切花菊的轉(zhuǎn)化和再生過程A，轉(zhuǎn)化葉盤分化出愈傷組織；B，轉(zhuǎn)化葉盤分化出抗性芽；C，抗性芽生根；D，抗性芽生根培養(yǎng)長成完整植株。圖4 轉(zhuǎn)CgHSP70基因植株的PCR檢測結(jié)果M，DL2000Marker ；1-5,轉(zhuǎn)基因切花菊植株；6、未轉(zhuǎn)化切花菊；7、質(zhì)粒 PBI121-HSP70陽性對照；8、以水為模板陰性對照。圖5 熒光定量PCR檢測CgHSP70基因在轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)WT 野生型植株；Vector 轉(zhuǎn)空載體植株；Thl_9轉(zhuǎn)CgHSP70基因株系圖6 熒光定量PCR檢測高溫脅迫后CgHSP70基因在轉(zhuǎn)基因和未轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)WT 野生型植株；Vector 轉(zhuǎn)空載體植株；Th4轉(zhuǎn)CgHSP70基因植株圖7 轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)基因植株在高溫脅迫后Mh內(nèi)的表型分析圖8 轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株未脅迫處理(23°C )和高溫脅迫(45°C )處理后恢復(fù)生長存活率分析圖9 轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株未脅迫(23°C )處理和干旱脅迫(30°C )處理后恢復(fù)生長存活率分析
圖10 轉(zhuǎn)基因植株和未轉(zhuǎn)基因植株未脅迫處理和高鹽處理脅迫處理后恢復(fù)生長存活率分析
具體實(shí)施例方式下面對發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。實(shí)施例11、植物表達(dá)載體pCAMBIA 1301_CgHSP70的構(gòu)建以菊花‘鐘山紫桂’為材料，提取總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa) 取1 μ g總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RNase消化cDNA產(chǎn)物，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CgHSP70基因的上下游分別引入SmaI和)(baI酶切位點(diǎn)，上游引物為 CgHSP70-F 5' -CCCCGGGATGGCTGGTAAAGGTGAA-3 ‘，下游引物為 CgHSP70_R 5 ‘ -AGTAGAAC AGATAAATATCGACCACA-3 ‘。50 μ L 反應(yīng)體系10 X RCR Buffer 5. 0 μ L，CgHSP70_F、 CgHspYo-RsLll-OyL(Zoymol-IZl)jClNTp mix 4. 0μ L(2. 5mmol 'L-1),PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 2 μ L, cDNA 模板 1 μ L, ddH20 37. 8 μ L ；反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 4min，然后 94°C解鏈 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 Imin 30sec，反應(yīng) 33 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin; PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒(AXYGEN)回收純化，用T4DNA連接酶(TaKaRa)連接到T-載體 (TaKaRa)，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行序列測定，測定序列為SEQ ID NO. 1。提取含有目的片段的T-載體及表達(dá)載體PCAMBIA1301質(zhì)粒DNA并雙酶切，酶切體系為10XBuffer K 2. 5 μ 1，Sma I 2. 0 μ 1，Xba I 2. 0 μ 1，質(zhì)粒 DNA 10 μ 1，ddH20 補(bǔ)齊至 50μ 1，37°C過夜充分酶切。將含有CgHSP70完整開放閱讀框的片段和pCAMBIA1301線性化質(zhì)粒片段分別回收，并將兩個(gè)片段連接。連接反應(yīng)體系為T4Buffer 2.0μ1，Τ4連接酶 Ι.ομ 1，載體回收液Ι.ομ 1，目的基因回收液4.0 μ 1，dd H2O補(bǔ)齊至20 μ 1，4°C過夜連接。 將連接好的重組質(zhì)粒pCAMBIA 1301-CgHSP70轉(zhuǎn)化T0P10細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，酶切電泳檢測并測序驗(yàn)證(圖1和圖2)。2、農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)葉盤法轉(zhuǎn)化菊花制備感受態(tài)的農(nóng)桿菌，將CgHSP70基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301_CgHSP70轉(zhuǎn)入感受態(tài)的農(nóng)桿菌菌株中，詳細(xì)過程從YEB (50 μ g/mL利福平)平板上挑取EHA105單菌落，接種于50mL含50 μ g/mL利福平的YEB液體培養(yǎng)基中，200rpm，培養(yǎng)至OD值0. 5，而后冰浴菌液30min，離心收集菌體，懸浮于2mL預(yù)冷的的IOOmM CaCl2 (20%甘油)溶液中，200 μ L/管分裝，待用。取10 μ L pCAMBIA 1301-CgHSP70載體質(zhì)粒，加入200 μ L感受態(tài)細(xì)胞，冰浴30min，液氮冷凍5min， 37°C 5min,加入800 μ L YEB液體培養(yǎng)基，28°C 200rpm預(yù)培養(yǎng)4h，菌液涂板于YEB (50 μ g/mL 利福平+50 μ g/mL卡那霉素)固體培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2天，挑取單克隆檢測，選取陽性克隆搖菌，用于轉(zhuǎn)化菊花。采用同樣方法將空白載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105中，作為對照。采用的農(nóng)桿菌指包含CgHSP70基因和空白載體的植物表達(dá)載體的EHA10 5，用 YEB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌EHA105 ；將轉(zhuǎn)CgHSP70基因和空白載體的轉(zhuǎn)基因植株后代分
8別命名為Th和Vector，以切花菊‘神馬’葉片為外植體，采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將菊花 (Chrysanthemum grandiflorum) ‘鐘山紫桂，中克隆得到的CgHSP70基因?qū)搿耨R，。取組培瓶中‘神馬’苗頂端葉盤(0. 5cmX0. 5cm)作為轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3d， 然后浸入備好的農(nóng)桿菌菌液中感染lOmin，用濾紙吸干菌液后再接種到共培養(yǎng)基上黑暗中共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4代，等分化出的抗性芽長至2 3cm時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初步獲得抗性植株(圖3)。菊花組織培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，pH5. 8 6. 0，IOOKpa, 121°C滅菌20分鐘；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6_芐氨基嘌呤 lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；篩選培養(yǎng)基MS+潮霉素10mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6_芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. lmg/L ；生根培養(yǎng)基1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0. lmg/L。2、將轉(zhuǎn)CgHSP70基因抗性植株進(jìn)行分子檢測(PCR及熒光定量PCR)呈陽性，獲得轉(zhuǎn)基因菊花株系1)PCR 檢測取生根篩選得到的潮霉素抗性植株嫩葉及未轉(zhuǎn)化株嫩葉，采取CTAB法提取基因組DNA。由于是同源轉(zhuǎn)化，將hptll基因作為檢測目標(biāo)。根據(jù)hptll基因序列合成擴(kuò)增引物，擴(kuò)增片段長為408bp,引物序列為HII-F CTCGATGAGCTGATGCTTTGGG, HII-R GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA。分別以潮霉素抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株DNA為模板，以HII-F 和HII-R為引物，進(jìn)行PCR檢測。擴(kuò)增體系為1 μ LDNA模板，2. 5 μ LlO XPCRBuffer, 2 μ L dNTP, 1. 5μ L 2. 5mmol .I^MgCl2，5U · μ L-1Taq 酶 0. 2 μ L，HII-F 禾口 HII-R 各 1 μ L，去離子水補(bǔ)足25yL。擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性lmin，58°C退火45s，72°C延伸Imin, 32個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析(如圖4)。圖中可以看到，轉(zhuǎn)CgHSP70的植株中有6個(gè)株系擴(kuò)增出與陽性對照相同的特異擴(kuò)增帶，轉(zhuǎn)PCAMBIA1301 空載體和野生型植株沒有擴(kuò)增出條帶。2)熒光定量RT-PCR檢測采用TaKaRa公司生產(chǎn)的RNAiso Reagent試劑盒，提取抗潮霉素植株葉片及未轉(zhuǎn)化株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，用熒光定量RT-PCR對CgHSP70基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。按照熒光定量試劑盒(SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212)) 說明書建立25 μ 1擴(kuò)增體系95°C預(yù)變性Imin ；95°C變性15s，60°C退火15s，72°C延伸 45s, 40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各個(gè)樣品的Ct值，以未轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)為基準(zhǔn)值，計(jì)算各轉(zhuǎn)基因植株及野生型基因相對表達(dá)情況。特異引物擴(kuò)增出的片段長為 115bp，引物序列為HSP-F GCTTGCTGAGGCGGATGAGT 和 HSP-R :ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC， 以I^saA擴(kuò)增的基因片段為內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增的基因片段長度為127bp，引物序列JsaA-F: CCAATAACCACGACCGCTAA, PsaA-R :CACAGTCCTCCCAAGTAA。根據(jù)熒光定量PCR檢測結(jié)果(圖幻，轉(zhuǎn)CgHSP70的植株株系基因表達(dá)量高于野生型和轉(zhuǎn)空載體植株，轉(zhuǎn)基因株系中Thl、Th4、Th9表達(dá)量明顯較高，而轉(zhuǎn)空載體植株與野生型相比表達(dá)量都比較低。證實(shí)內(nèi)源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入切花菊基因組DNA中并表達(dá)。3)45°C高溫處理轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株熒光定量PCR分析將轉(zhuǎn)基因及未轉(zhuǎn)基因植株組培苗分別種植于營養(yǎng)缽中，栽培基質(zhì)為按1 1比例混和的營養(yǎng)土 蛭石混和物，種植于溫室(23 土 2°C，12h光周期)中，待轉(zhuǎn)基因及未轉(zhuǎn)基因植株展葉8 10片時(shí)，將植株移至光照培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為45°C，分別在0，1，3，6， 12，24h取葉片0. lg(3次重復(fù))液氮保存。采用TaKaRa公司生產(chǎn)的RNAiso Reagent試劑盒，提取轉(zhuǎn)基因及未轉(zhuǎn)基因植株葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA，用熒光定量PCR對 CgHSP70基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測。熒光定量PCR檢測方法同幻。CgHSP70基因特異引物序列為HSP-F GCTTGCTGAGGCGGATGAGT 和 HSP-R :ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC，以 I3SaA 擴(kuò)增的基因片段為內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增的基因片段長度為127bp，引物序列JsaA-F :CCAATAACCACGACCGCTAA， PsaA-R :CACAGTCCTCCCAAGTAA。根據(jù)熒光定量PCR檢測(圖6)，在45°C條件下，與未轉(zhuǎn)化植株和轉(zhuǎn)空載體植株相比，Th4植株中短時(shí)間內(nèi)快速提高，且在第Ih時(shí)達(dá)到最高，而未轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)空載體植株 CgHSP70基因的表達(dá)雖然也在Ih達(dá)到最高，但一直保持較低水平。轉(zhuǎn)基因株系在短時(shí)間內(nèi)合成大量的熱激蛋白，從而提高植株的抗逆性。3、轉(zhuǎn)基因植株后代的抗性分析1)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株高溫半致死溫度(LT5tl)及相對電導(dǎo)率回歸方程分析采集轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)化植株生長一致的土培苗葉片，先用自來水沖洗干凈，然后用去離子水漂洗3次，在濾紙上吸干。將葉片剪成0.5cm2的小葉片，稱取0. lg，放入裝有20mL去離子水的試管中，在真空泵中抽氣IOmin后分別在40 V、45°C、50 V、55 V和60 V的水浴中放置20min，取出靜置冷卻池，用電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率后全部放入100°C沸水浴中煮沸20min 以殺死植物組織。取出冷卻在25°C恒溫下測定電導(dǎo)率，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。以室溫下植物葉片的電導(dǎo)率作為對照，按下式計(jì)算細(xì)胞傷害率。細(xì)胞傷害率=[(l-Rt/Rm)/(l-Ct/Cm)]X100%并測定相對電導(dǎo)率，式中Rt為不同水浴溫度電導(dǎo)率，Rm為沸水浴后電導(dǎo)值，Ct和Cm為對照煮前和煮后電導(dǎo)值。將處理溫度與細(xì)胞的傷害用Logistic方程Y = k/(IWbx)來擬合，方程中Y代表細(xì)胞的傷害率，χ 代表處理溫度，k為細(xì)胞傷害率的飽和容量，由于細(xì)胞傷害率消去了本底干擾，因而k值為 100，a、b為方程參數(shù)。為了確定a，b的值，將方程進(jìn)行線性化處理，ln[(K-y)/y] = lna_bx， 令yl = ln[(K-y)/y]，則轉(zhuǎn)化為細(xì)胞傷害率(yi)與處理溫度(χ)的直線方程。通過直線回歸的方法求得a，b值及相關(guān)系數(shù)R，高溫半致死溫度LT5tl= ln[(l/a)]/b (蓋鈞鎰，2000)。 所得數(shù)據(jù)統(tǒng)一使用SYSTAT 7. 0 (SYSTAT，1997)軟件進(jìn)行單因素方差分析(表1)。表1轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株葉片電導(dǎo)率的Logistic方程參數(shù)及半致死溫度 (LT50)
10
權(quán)利要求
1.一種通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)構(gòu)建CgHSP70基因的植物表達(dá)載體以菊花‘鐘山紫桂’為材料，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，在CgHSP70基因的上下游分別引入SmaI和)(baI酶切位點(diǎn)，上游引物為 CgHSP70-F 5 ' -CCCCGGGATGGCTGGTAAAGGTGAA-3 ‘，下游引物為 CgHSP70_R 5 ‘ -AGTAG AACAGATAAATATCGACCACA-3 ‘，將擴(kuò)增出來的含有CgHSP70完整開放閱讀框的PCR產(chǎn)物片段與T-載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，提取陽性質(zhì)粒，由SmaI和^CbaI雙酶切得到的CgHSP70基因片段，與SmaI和)(baI雙酶切線性化的表達(dá)載體pCAMBIA1301 連接，轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細(xì)胞，提取陽性質(zhì)粒，酶切電泳檢測并測序驗(yàn)證，植物表達(dá)載體 pCAMBIA1301-CgHSP70 構(gòu)建成功，所述的 CgHSP70 基因序列為 SEQ IDN0. 1 ；(2)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CgHSP70基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到切花菊中，進(jìn)行培養(yǎng)初步獲得抗性植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于步驟(2)的操作過程為制備感受態(tài)的農(nóng)桿菌，將步驟(1)中構(gòu)建的含有CgHSP70基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-CgHSP70轉(zhuǎn)入感受態(tài)的農(nóng)桿菌菌株中；取組培瓶中菊花苗頂端葉盤作為轉(zhuǎn)化受體，在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3d，然后浸入備好的轉(zhuǎn)入了 CgHSP70基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌液中感染lOmin，用濾紙吸干菌液后再將其接種到共培養(yǎng)基上黑暗中共培養(yǎng)3d，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3 4代，等分化出的抗性芽長至2 3厘米時(shí)轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，初步獲得抗性植株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于菊花組織培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，pH5. 8 6. 0，100Kpa、12rC滅菌20分鐘；預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6-芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+6_芐氨基嘌呤lmg/L+萘乙酸0. 5mg/L ；篩選培養(yǎng)基MS+潮霉素10mg/L+羧卞青霉素500mg/L+6_芐氨基嘌呤Img/ L+萘乙酸0. lmg/L ；生根培養(yǎng)基1/2MS+潮霉素8mg/L+萘乙酸0. lmg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于所用的農(nóng)桿菌菌株為EHA105。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于將轉(zhuǎn)CgHSP70基因初步獲得的抗性植株進(jìn)行PCR和熒光定量PCR分子檢測，篩選陽性植株，獲得轉(zhuǎn)基因菊花株系(1)PCR檢測取生根篩選得到的潮霉素抗植株嫩葉及未轉(zhuǎn)化植株嫩葉，采取CTAB法提取基因組 DNA，將hptll基因作為檢測目標(biāo)，根據(jù)hptll基因兩端合成擴(kuò)增反應(yīng)引物，擴(kuò)增片段長為 408bp,引物序列為HII-F CTCGATGAGCTGATGCTTTGGG, HII-R GCTTCTGCGGGCGATTTGTGTA ； 分別以潮霉素抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株DNA為模板，以HII-F和HII-R為引物，進(jìn)行PCR檢測； 分子檢測篩選獲得抗性株系，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析；(2)熒光定量PCR檢測建立擴(kuò)增體系，每個(gè)樣品重復(fù)3次，根據(jù)數(shù)據(jù)分析得到各個(gè)樣品的Ct值，以未轉(zhuǎn)化植株的表達(dá)為基準(zhǔn)值，計(jì)算各轉(zhuǎn)基因植株及野生型基因相對表達(dá)情況；特異引物片段長為115bp,引物序列為HSP-F :GCTTGCTGAGGCGGATGAGT 和 HSP-R :ACCTGATGGTGCGGGTTCCTC， 以PsaA擴(kuò)增的基因片段為內(nèi)標(biāo)，擴(kuò)增片段長度為127bp，引物序列為JsaA-F CCAATAACCACGACCGCTAA, PsaA-R :CACAGTCCTCCCAAGTAA，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高菊花抗逆性的方法，其特征在于對所獲得轉(zhuǎn)基因植株后代進(jìn)行抗性分析(1)采集轉(zhuǎn)基因株系和未轉(zhuǎn)化植株生長一致的幼苗葉片，用去離子水洗凈，紗布擦干， 去除主脈并剪成0. 5cm2的小片，放入燒杯中并準(zhǔn)確加入20mL去離子水，用真空泵抽氣 1011^11后分別在室溫、401、451、501、551和60°C的水浴中放置20min，取出靜置冷卻濁， 并測定相對電導(dǎo)率，擬合Logistic回歸方程，得到高溫半致死溫度(LT5tl)；(2)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株高溫脅迫處理后恢復(fù)生長存活率分析為檢測轉(zhuǎn)基因植株的高溫脅迫耐性，對轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株WT進(jìn)行45°C高溫脅迫處理，處理后，將轉(zhuǎn)基因及未轉(zhuǎn)基因植株苗種植于營養(yǎng)缽中恢復(fù)生長一周，然后統(tǒng)計(jì)存活率并觀察生長情況；(3)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株干旱脅迫處理后恢復(fù)生長存活率分析為檢測轉(zhuǎn)基因植株的干旱脅迫耐性，對轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株WT進(jìn)行干旱脅迫處理，處理后，將轉(zhuǎn)基因及未轉(zhuǎn)基因植株苗種植于營養(yǎng)缽中恢復(fù)生長兩周，然后統(tǒng)計(jì)存活率并觀察生長情況；(4)轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株鹽脅迫處理后恢復(fù)生長存活率分析為檢測轉(zhuǎn)基因植株的鹽脅迫耐性，對轉(zhuǎn)基因株系及野生型植株WT進(jìn)行鹽脅迫處理，處理后將植株根系用去離子水沖洗3遍，并種植于新營養(yǎng)缽中澆足水恢復(fù)生長一周，統(tǒng)計(jì)植株存活率并觀察生長情況。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程和轉(zhuǎn)基因育種領(lǐng)域，涉及一種通過轉(zhuǎn)CgHSP70基因提高切花菊抗逆性的方法。將從菊花“鐘山紫桂”中克隆得到的CgHSP70基因構(gòu)建植物表達(dá)載體采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入到切花菊中，進(jìn)行培養(yǎng)初步獲得抗性植株，經(jīng)過潮霉素抗性篩選得到陽性轉(zhuǎn)化植株。對轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行PCR和熒光定量PCR分析，證實(shí)內(nèi)源基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA中并發(fā)生轉(zhuǎn)錄。對轉(zhuǎn)基因植株后代進(jìn)行抗性分析證實(shí)其對高溫、干旱及高鹽的抗性有明顯的提高。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)化內(nèi)源CgHSP70基因并正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)，及在逆境下誘導(dǎo)該基因的表達(dá)從而提高切花菊的抗逆性，為利用基因工程技術(shù)選育菊花抗逆性品種提供新穎而使用的方法，將有效推動(dòng)菊花生物技術(shù)育種進(jìn)程。
文檔編號C12Q1/68GK102174566SQ20111004892
公開日2011年9月7日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者朱喜榮, 管志勇, 蔣甲福, 陳發(fā)棣, 陳煜 , 陳素梅, 高海順 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)