專利名稱：眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存及其培養(yǎng)擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人體眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存方法和眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的提取與應(yīng)用是一項(xiàng)新課題，目前尚未見到相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)之不足，而提供一種眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存及其培養(yǎng)擴(kuò)增方法，它可以提取眼袋間質(zhì)細(xì)胞并長(zhǎng)期保存和大量培養(yǎng)，培養(yǎng)出來到間質(zhì)細(xì)胞可用于促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合、促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合、促進(jìn)心肌損傷的修復(fù)、促進(jìn)肝功能損傷的修復(fù)。本發(fā)明的技術(shù)解決措施如下1、眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存方法，1)、在凈化工作臺(tái)下，將眼袋脂肪組織從無(wú)菌容器中移出，放入無(wú)菌器皿中；2)、加入無(wú)菌的且含有抑菌劑的滲透壓為270-330m0sm/kg的磷酸鹽緩沖溶液，輕輕沖洗后，移出磷酸鹽緩沖溶液；3)、用手術(shù)剪快速將組織剪碎，盡量剔除黃色部分，直至組織塊長(zhǎng)寬高皆為l-2mm ；4)、再次加入磷酸鹽緩沖溶液重懸組織塊，200g-300g離心5分鐘，棄去上層磷酸鹽緩沖溶液，選取下層沉淀組織塊備用；5)、取6孔孔培養(yǎng)板，每孔用眼科鑷植入一枚至多枚組織塊，用蓋玻片加壓蓋住，加入少量貼壁培養(yǎng)基至潤(rùn)濕底面；6)、按M孔板計(jì)算，每孔加入已配制完全的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液0. 3-0. 5ml，在36-380C 1% -5% CO2條件下培養(yǎng)48h后，每孔再加入0. 3-0. 5ml已配制完全的間充質(zhì)干細(xì)
胞培養(yǎng)液，每3天半量換液一次；7)、組織塊植入約3天，當(dāng)組織塊周圍可見有散在的長(zhǎng)梭形細(xì)胞時(shí)，每3天半量換液一次；8)、至每孔培養(yǎng)的原代細(xì)胞增至70% 80%融合；9)、移出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入1-1. 5ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液，用吸管吸取磷酸鹽緩沖溶液輕柔的沖洗培養(yǎng)層，移去磷酸鹽緩沖溶液，重復(fù)一次；10)、每孔加入0. 2ml消化液，使充分浸潤(rùn)后輕搖培養(yǎng)瓶，約1_3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去消化液，并加入Iml完全培養(yǎng)基終止消化；11)、用吸管吸取細(xì)胞懸液，輕柔的沖洗培養(yǎng)層后，收集細(xì)胞懸液于無(wú)菌容器中，混勻，取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)；
12)、取300g，在4°C溫度條件下，離心5min后，棄去上清液；13)、采用差速貼壁法，棄去30分鐘內(nèi)的貼壁細(xì)胞，未貼壁細(xì)胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，棄去1小時(shí)內(nèi)未貼壁的細(xì)胞；14)、篩選出的貼壁細(xì)胞采用密度為1. 073g/ml-l. 077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法離心；15)、將分層篩選出的細(xì)胞用IOml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打混勻，傳入2個(gè)T75培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)足5ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)；16)、傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至亞匯合狀態(tài)；17)、使用含有7% -10%的二甲基亞砜組分的凍存液凍存脂肪間質(zhì)細(xì)胞。所述抑菌劑為0. 002 % -0.01%的苯扎氯銨配置在PBS中，每毫升PBS含有卡那霉素 20-100 毫克；PBS 的配方為稱取 NaC18g、KC10. 2g、Na2HP04 · 12H203. 489g、KH2P040. 2g,溶于900ml左右的三蒸水中，用HCl或NaOH調(diào)整PH值至7. 3-7. 4之間。眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，1)、將已接種的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)達(dá)到70% 80%融合，2)、移出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，每瓶加入5ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液用吸管吸取磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗培養(yǎng)層后，移去磷酸鹽緩沖溶液，重復(fù)一次；3)、加入3ml消化液，使充分浸潤(rùn)后輕搖培養(yǎng)瓶，約1_3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去消化液，并加入5ml完全培養(yǎng)基終止消化；4)、用吸管吸取細(xì)胞懸液，反復(fù)沖洗培養(yǎng)層后，收集細(xì)胞懸液于無(wú)菌容器中，混勻，取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)；5)、300g，4°C，離心5分鐘，棄去上清液；6)、將沉淀的細(xì)胞用間充質(zhì)干細(xì)胞載體培養(yǎng)基吹打混勻，加入紙載體培養(yǎng)瓶中，在37°C條件下滾屏培養(yǎng)3-4天，準(zhǔn)備凍存；7)、把細(xì)胞凍存液平衡到4°C ；8)、將消化液和新鮮培養(yǎng)基放置到室溫中，間或搖動(dòng)；9)、用75%乙醇消毒培養(yǎng)基瓶外壁，放置到超凈臺(tái)上；10)、將紙載體培養(yǎng)瓶取出，用75%乙醇棉球消毒瓶底；11)、用吸管吸棄舊培養(yǎng)基，更換吸管，加入等量細(xì)胞洗滌液，輕輕搖晃使其覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶，吸棄細(xì)胞洗滌液，更換吸管，重復(fù)洗滌一次；12)、加入25ml細(xì)胞消化液，旋轉(zhuǎn)紙載體培養(yǎng)瓶，消化2分鐘，吹打吸取消化液，終止消化；13)、再次加入25ml細(xì)胞消化液，旋轉(zhuǎn)紙載體培養(yǎng)瓶，消化2分鐘，吹打吸取消化液，終止消化。14)、合并消化液，300g, 4°C，離心5分鐘，收集部分上清液，做細(xì)菌、支原體檢測(cè)；15)、棄去其余上清液，細(xì)胞沉淀用適量4°C細(xì)胞凍存液懸浮；16)、細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞凍存密度至106/ml，將細(xì)胞懸液收集加入1. 8ml冷凍管中，標(biāo)記細(xì)胞批次和密度于管壁外固定位置。所述消化液配方為稱取胰蛋白酶0. Ig-O. 25，加入PH為7. 0-7. 4的100ml PBS，攪
拌均勻，使其完全溶解，過濾除菌后分裝后置于4°C冰箱中即可。
本發(fā)明的有益效果在于它可以提取眼袋間質(zhì)細(xì)胞并長(zhǎng)期保存和大量培養(yǎng)，培養(yǎng)出來到間質(zhì)細(xì)胞可用于促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合、促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合、促進(jìn)心肌損傷的修復(fù)、促進(jìn)肝功能損傷的修復(fù)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存方法，1)、在凈化工作臺(tái)下，將眼袋脂肪組織從無(wú)菌容器中移出，放入無(wú)菌器皿中；2)、加入無(wú)菌的且含有抑菌劑的滲透壓為270-330m0sm/kg的磷酸鹽緩沖溶液，輕輕沖洗后，移出磷酸鹽緩沖溶液；3)、用手術(shù)剪快速將組織剪碎，盡量剔除黃色部分，直至組織塊長(zhǎng)寬高皆為l-2mm ；4)、組織塊加入再次加入磷酸鹽緩沖溶液，200g-300g離心5分鐘，棄去上層磷酸鹽緩沖溶液，選取下層沉淀組織塊備用；5)、取6孔孔培養(yǎng)板，每孔用眼科鑷植入一枚或多枚組織塊，用蓋玻片加壓蓋住，加入少量貼壁培養(yǎng)基至潤(rùn)濕底面；6)、按M孔板計(jì)算，每孔加入已配制完全的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液03-0. 5ml，在36-380C 1% -5% CO2條件下培養(yǎng)48h后，每孔再加入0. 3-0. 5ml已配制完全的間充質(zhì)干細(xì)
胞培養(yǎng)液，每3天半量換液一次；7)、組織塊植入約3天，當(dāng)組織塊周圍可見有散在的長(zhǎng)梭形細(xì)胞時(shí)，每3天半量換液一次；8)、至每孔培養(yǎng)的原代細(xì)胞增至70% 80%融合；9)、移出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入1-1. 5ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液，用吸管吸取磷酸鹽緩沖溶液輕柔的沖洗培養(yǎng)層，移去磷酸鹽緩沖溶液，重復(fù)一次；10)、每孔加入0. 2ml消化液，使充分浸潤(rùn)后輕搖培養(yǎng)瓶，一般消化時(shí)間控制在3分鐘之內(nèi)，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去消化液，并加入Iml
完全培養(yǎng)基終止消化；11)、用吸管吸取細(xì)胞懸液，輕柔的沖洗培養(yǎng)層后，收集細(xì)胞懸液于無(wú)菌容器中，混勻，取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)；12)、取300g，在4°C溫度條件下，離心5min后，棄去上清液；13)、采用差速貼壁法，棄去30分鐘內(nèi)的貼壁細(xì)胞，未貼壁細(xì)胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，棄去1小時(shí)內(nèi)未貼壁的細(xì)胞；14)、篩選出的貼壁細(xì)胞采用密度為1. 073g/ml-l. 077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法離心；15)、將分層篩選出的細(xì)胞用IOml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打混勻，傳入2個(gè)T75培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)足5ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)；16)、傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至亞匯合狀態(tài)；17)、使用含有7% -10%的二甲基亞砜組分的凍存液凍存脂肪間質(zhì)細(xì)胞。所述抑菌劑為0. 002 % -0.01%的苯扎氯銨配置在PBS中，每毫升PBS含有卡那霉素 20-100 毫克；PBS 的配方為稱取 NaC18g、KC10. 2g、Na2HP04 · 12H203. 489g、KH2P040. 2g,溶于900ml左右的三蒸水中，用HCl或NaOH調(diào)整PH值至7. 3-7. 4之間。眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，1)、將已接種的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)達(dá)到70% 80%融合，2)、移出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，每瓶加入5ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液用吸管吸取磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗培養(yǎng)層后，移去磷酸鹽緩沖溶液，重復(fù)一次；3)、加入3ml消化液，使充分浸潤(rùn)后輕搖培養(yǎng)瓶，一般消化時(shí)間控制在3分鐘之內(nèi)，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去消化液，并加入5ml完全培養(yǎng)基終止消化；4)、用吸管吸取細(xì)胞懸液，反復(fù)沖洗培養(yǎng)層后，收集細(xì)胞懸液于無(wú)菌容器中，混勻，取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)；5)、300g，4°C，離心5分鐘，棄去上清液；6)、將沉淀的細(xì)胞用間充質(zhì)干細(xì)胞載體培養(yǎng)基吹打混勻，加入紙載體培養(yǎng)瓶中，在37°C條件下滾屏培養(yǎng)3-4天，準(zhǔn)備凍存；7)、把細(xì)胞凍存液平衡到4°C ；8)、將消化液和新鮮培養(yǎng)基放置到室溫中，間或搖動(dòng)；9)、用75%乙醇消毒培養(yǎng)基瓶外壁，放置到超凈臺(tái)上；10)、將紙載體培養(yǎng)瓶取出，用75%乙醇棉球消毒瓶底；11)、用吸管吸棄舊培養(yǎng)基，更換吸管，加入等量細(xì)胞洗滌液，輕輕搖晃使其覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶，吸棄細(xì)胞洗滌液，更換吸管，重復(fù)洗滌一次；12)、加入25ml細(xì)胞消化液，旋轉(zhuǎn)紙載體培養(yǎng)瓶，消化2分鐘，吹打吸取消化液，終止消化；13)、再次加入25ml細(xì)胞消化液，旋轉(zhuǎn)紙載體培養(yǎng)瓶，消化2分鐘，吹打吸取消化液，終止消化。14)、合并消化液，300g, 4°C，離心5分鐘，收集部分上清液，做細(xì)菌、支原體檢測(cè)；15)、棄去其余上清液，細(xì)胞沉淀用適量4°C細(xì)胞凍存液懸??；16)、細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞凍存密度至106/ml，將細(xì)胞懸液收集加入1. 8ml冷凍管中，標(biāo)記細(xì)胞批次和密度于管壁外固定位置。所述消化液配方為稱取胰蛋白酶0. Ig-O. 25，加入PH為7. 0-7. 4的100ml PBS，攪
拌均勻，使其完全溶解，過濾除菌后分裝后置于4°C冰箱中即可。
權(quán)利要求
1.眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存方法，其特征在于.1)、在凈化工作臺(tái)下，將眼袋脂肪組織從無(wú)菌容器中移出，放入無(wú)菌器皿中；.2)、加入無(wú)菌的且含有抑菌劑的滲透壓為270-330m0sm/kg的磷酸鹽緩沖溶液，輕輕沖洗后，移出磷酸鹽緩沖溶液；.3)、用手術(shù)剪快速將組織剪碎，盡量剔除黃色部分，直至組織塊大小約.2mm X 2mm X 2mm ；.4)、再次加入磷酸鹽緩沖溶液重懸組織塊，200g-300g離心5分鐘，棄去上層磷酸鹽緩沖溶液，選取下層沉淀組織塊備用；.5)、取6孔孔培養(yǎng)板，每孔用眼科鑷植入一枚至多枚組織塊，用蓋玻片加壓蓋住，加入少量貼壁培養(yǎng)基至潤(rùn)濕底面；.6)、按M孔板計(jì)算，每孔加入已配制完全的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液0.3-0. 5ml,在.36-380C 1% -5% CO2條件下培養(yǎng)48h后，每孔再加入0. 3-0. 5ml已配制完全的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液，每3天半量換液一次；.7)、組織塊植入約3天，當(dāng)組織塊周圍可見有散在的長(zhǎng)梭形細(xì)胞時(shí)，每3天半量換液一次；.8)、至每孔培養(yǎng)的原代細(xì)胞增至70% 80%融合；.9)、移出培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，每孔加入1-1.5ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液，用吸管吸取磷酸鹽緩沖溶液輕柔的沖洗培養(yǎng)層，移去磷酸鹽緩沖溶液，重復(fù)一次；.10)、每孔加入0.2ml消化液，使充分浸潤(rùn)后輕搖培養(yǎng)瓶，約1-3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去消化液，并加入Iml完全培養(yǎng)基終止消化；.11)、用吸管吸取細(xì)胞懸液，輕柔的沖洗培養(yǎng)層后，收集細(xì)胞懸液于無(wú)菌容器中，混勻，取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)；.12)、取300g，在4°C溫度條件下，離心5min后，棄去上清液；.13)、采用差速貼壁法，棄去30分鐘內(nèi)的貼壁細(xì)胞，未貼壁細(xì)胞繼續(xù)貼壁培養(yǎng)，棄去1小時(shí)內(nèi)未貼壁的細(xì)胞；.14)、篩選出的貼壁細(xì)胞采用密度為1.073g/ml-l. 077g/ml的淋巴細(xì)胞分離液，采用密度梯度離心法離心；.15)、將分層篩選出的細(xì)胞用IOml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打混勻，傳入2個(gè)T75培養(yǎng)瓶，每個(gè)培養(yǎng)瓶中補(bǔ)足5ml間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37°C、5% C02條件下培養(yǎng)；.16)、傳代細(xì)胞生長(zhǎng)至亞匯合狀態(tài)；.17)、使用含有7%-10%的二甲基亞砜組分的凍存液凍存脂肪間質(zhì)細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存方法，其特征在于抑菌劑為0. 002% -0. 01%的苯扎氯銨配置在PBS中，每毫升PBS含有卡那霉素20-100毫克；PBS的配方為稱取 NaC18g、KC10. 2g、Na2HPO4 · 12H203. 489g、KH2PO4O. 2g，溶于 900ml 左右的三蒸水中，用HCl或NaOH調(diào)整PH值至7. 3-7. 4之間。
3.眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，其特征在于.1)、將已接種的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，在37°C、5%(X)2條件下培養(yǎng)達(dá)到70% 80%融合，.2)、移出培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，每瓶加入5ml無(wú)菌磷酸鹽緩沖溶液用吸管吸取磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗培養(yǎng)層后，移去磷酸鹽緩沖溶液，重復(fù)一次；3)、加入3ml消化液，使充分浸潤(rùn)后輕搖培養(yǎng)瓶，約1-3分鐘，肉眼觀察瓶壁半透明的細(xì)胞層，當(dāng)見到出現(xiàn)細(xì)針孔空隙時(shí)，棄去消化液，并加入5ml完全培養(yǎng)基終止消化；4)、用吸管吸取細(xì)胞懸液，反復(fù)沖洗培養(yǎng)層后，收集細(xì)胞懸液于無(wú)菌容器中，混勻，取樣細(xì)胞計(jì)數(shù)；5)、300g，4°C，離心5分鐘，棄去上清液；6)、將沉淀的細(xì)胞用間充質(zhì)干細(xì)胞載體培養(yǎng)基吹打混勻，加入紙載體培養(yǎng)瓶中，在37°C條件下滾屏培養(yǎng)3-4天，準(zhǔn)備凍存；7)、把細(xì)胞凍存液平衡到4°C；8)、將消化液和新鮮培養(yǎng)基放置到室溫中，間或搖動(dòng)；9)、用75%乙醇消毒培養(yǎng)基瓶外壁，放置到超凈臺(tái)上；10)、將紙載體培養(yǎng)瓶取出，用75%乙醇棉球消毒瓶底；11)、用吸管吸棄舊培養(yǎng)基，更換吸管，加入等量細(xì)胞洗滌液，輕輕搖晃使其覆蓋整個(gè)培養(yǎng)瓶，吸棄細(xì)胞洗滌液，更換吸管，重復(fù)洗滌一次；12)、加入25ml細(xì)胞消化液，旋轉(zhuǎn)紙載體培養(yǎng)瓶，消化2分鐘，吹打吸取消化液，終止消化；13)、再次加入25ml細(xì)胞消化液，旋轉(zhuǎn)紙載體培養(yǎng)瓶，消化2分鐘，吹打吸取消化液，終止消化。14)、合并消化液，300g,4°C，離心5分鐘，收集部分上清液，做細(xì)菌、支原體檢測(cè)；15)、棄去其余上清液，細(xì)胞沉淀用適量4°C細(xì)胞凍存液懸??；16)、細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞凍存密度至106/ml，將細(xì)胞懸液收集加入1.8ml冷凍管中，標(biāo)記細(xì)胞批次和密度于管壁外固定位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，其特征在于所述消化液配方為稱取胰蛋白酶0. lg-0. 25g，加入PH為7. 0-7. 4的100ml PBS，攪拌均勻，使其完全溶解，過濾除菌后分裝后置于4°C冰箱中即可。
全文摘要
眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞的分離保存方法，采用手術(shù)刀切除獲取眼袋脂肪組織，摘取其中間質(zhì)組織，并用貼壁法分離細(xì)胞。眼袋脂肪間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，采用紙載體技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)組織，使用成分明確無(wú)異基因組分凍存并長(zhǎng)期保存細(xì)胞。此分離保存方法可以提取眼袋間質(zhì)細(xì)胞，大量培養(yǎng)并長(zhǎng)期保存，培養(yǎng)出來的間質(zhì)細(xì)胞可用于促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合、促進(jìn)糖尿病潰瘍愈合、促進(jìn)心肌損傷的修復(fù)、促進(jìn)肝功能損傷的修復(fù)。
文檔編號(hào)C12N5/077GK102586180SQ20111000751
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者劉擁軍, 劉洋, 吳明遠(yuǎn), 張麗麗, 施潔琦, 黃家學(xué) 申請(qǐng)人:協(xié)和華東干細(xì)胞基因工程有限公司