專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療瘺的自體和異體脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)用于治療瘺的臨床有效量的人脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的方法，以及由該方法制備的組合物，其中，基質(zhì)干細(xì)胞可獲自自體和異體脂肪組織。
背景技術(shù)：
再生醫(yī)學(xué)是指治療損傷組織或功能惡化的組織和/或器官的方法，通常涉及利用多能干細(xì)胞的細(xì)胞療法。骨髓來(lái)源的干細(xì)胞，為用于再生醫(yī)學(xué)的成體干細(xì)胞主要類(lèi)型中的一種，可在體外增殖并分化成各種細(xì)胞類(lèi)型，包括例如肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等。此外，骨髓來(lái)源的干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)活性，因而可用于異體骨髓移植或用作自身免疫病的免疫抑制劑。由于脂肪組織也含有大量的干細(xì)胞，目前已經(jīng)開(kāi)展了大量的脂肪干細(xì)胞作為移植物的的應(yīng)用研究。與其它種類(lèi)的組織相比，脂肪組織含有相當(dāng)大量的干細(xì)胞(即分離自脂肪組織的干細(xì)胞是分離自相同量的骨髓的約1，000倍)，并且脂肪來(lái)源的干細(xì)胞像骨髓來(lái)源的干細(xì)胞一樣，是多能的，可分化成軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞等。此外，脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞表現(xiàn)出與骨髓來(lái)源的干細(xì)胞類(lèi)似的細(xì)胞表面標(biāo)志的表達(dá)，并且具有體內(nèi)和體外的自體或異體免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)活性。瘺是體內(nèi)不正常產(chǎn)生的通道，并且可在體內(nèi)的各個(gè)位置由不同原因產(chǎn)生。最經(jīng)常發(fā)生的瘺通常存在于腸系統(tǒng)中，包括肛門(mén)和直腸。肛門(mén)瘺通常由炎癥性疾病引起，其中炎癥發(fā)生在肛門(mén)腺，傳播到皮膚外部，滲出分泌物，如膿液，是約20%的肛門(mén)痔瘡的發(fā)病原因。肛門(mén)瘺實(shí)質(zhì)上是指直腸道和肛周皮膚之間的不正常通道，并且誘發(fā)糞便通過(guò)開(kāi)放位點(diǎn)而不是肛門(mén)的不正常排泄。這主要是由于發(fā)生肛門(mén)直腸膿腫，其反過(guò)來(lái)形成分泌膿液的瘺。這種形成的瘺被稱(chēng)為‘肛瘺’。也即，肛瘺是肛門(mén)直腸膿腫爆發(fā)時(shí)，形成于直腸或肛管內(nèi)部至肛周皮膚的細(xì)長(zhǎng)孔。肛瘺還可分為下述與在肛門(mén)性能中發(fā)揮重要作用的外肛門(mén)括約肌有關(guān)的4類(lèi)(1)內(nèi)括約肌肛瘺，其具有形成于內(nèi)肛門(mén)括約肌和外肛門(mén)括約肌之間的瘺束；(2)經(jīng)括約肌肛瘺，其具有穿透外括約肌的瘺束；(3)括約肌上肛瘺，其具有形成于外括約肌上部的瘺束；和(4)括約肌外肛瘺，其具有在直腸附近肛門(mén)腺窩上部而不是肛門(mén)腺窩本身形成的原發(fā)性瘺束。通常已知引起肛瘺的主要原因是肛周腺體的感染，此外，有時(shí)肛瘺的發(fā)生是由于肺結(jié)核、克羅恩氏病、癌癥、白血病、白細(xì)胞減少癥等引起。克羅恩氏病的特征是慢性的和復(fù)發(fā)性的腸道炎癥，并被定為罕見(jiàn)病。由克羅恩氏病引起的瘺可包括，如與陰道相連的直腸-陰道瘺、腸道附近形成的腸道瘺等，以及以上所述的肛瘺。大部分的瘺可通過(guò)外科手術(shù)進(jìn)行治療。治療肛周和直腸內(nèi)的瘺的重要目的在于徹底治療疾病同時(shí)保留肛門(mén)括約肌的正常功能。然而，外科手術(shù)后瘺通常會(huì)復(fù)發(fā)，并可導(dǎo)致如肛門(mén)功能紊亂引起的大便失禁等。因此，目前手術(shù)的方法不能提供滿(mǎn)意的治療效果。
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瘺手術(shù)可包括，如瘺切開(kāi)術(shù)、泄液線(xiàn)、應(yīng)用推進(jìn)皮瓣(advanced flap)、肌肉加注法 (muscle filling procedure)、應(yīng)用纖維蛋白膠等。這些中，纖維蛋白膠已在一般的手術(shù)中被用作外科手術(shù)密封劑，通過(guò)混合纖維蛋白原和凝血酶而形成纖維蛋白凝塊。對(duì)于肛瘺，通過(guò)外部開(kāi)口將纖維蛋白膠注入到瘺束中，從而填滿(mǎn)瘺束以及肛瘺的內(nèi)部開(kāi)口。最近幾年中，隨著與干細(xì)胞有關(guān)的研究的廣泛開(kāi)展，已經(jīng)開(kāi)展了通過(guò)移植干細(xì)胞到瘺位置治療肛瘺的方法。例如，Mizuno 等人(Plast. Reconstr. Surg. 2002，109 :199-209) 證實(shí)了分離自脂肪組織的成體干細(xì)胞可分化成肌肉細(xì)胞，而Damian等人(Dis Colon Rectum 2005,48 :1416-1423)在臨床試驗(yàn)的第I階段，證實(shí)了脂肪干細(xì)胞可安全地應(yīng)用于治療患有克羅恩氏病的患者的肛瘺。此外，據(jù)報(bào)道，當(dāng)患有克羅恩氏病的患者進(jìn)行成體干細(xì)胞移植以治療直腸肛瘺時(shí)，即使在移植3個(gè)月后也沒(méi)有發(fā)生大便失禁。已知體外培養(yǎng)脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞是易于實(shí)現(xiàn)的。然而，為獲得臨床有效量的細(xì)胞，通常需要相對(duì)較大數(shù)量的脂肪組織和較長(zhǎng)期的培養(yǎng)階段。特別是，治療患有慢性的和 /或復(fù)發(fā)性的疾病，如克羅恩氏病患者的瘺，需要大量的細(xì)胞以及改良的細(xì)胞培養(yǎng)方法。此外，如果允許使用異體脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，那它們?cè)谂R床上是非常有用的。WO 2006/136244(2006年12月觀日)公開(kāi)了應(yīng)用脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的瘺治療及其應(yīng)用。然而，由于治療中所用的脂肪干細(xì)胞獲自患者本身，如果患者沒(méi)有足夠的脂肪組織、脂肪組織中所含的干細(xì)胞的數(shù)量相當(dāng)?shù)汀⒒蛘卟荒芘囵B(yǎng)自體干細(xì)胞，那么就有可能無(wú)法提供臨床適合的治療。特別是，在患有克羅恩氏瘺的患者的情況下，會(huì)遇到重大的腸道炎癥，引起患者的體重減輕以及體質(zhì)指數(shù)的降低。對(duì)于這種病人，就很難保證足夠量的脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞。此外，由于疾病持續(xù)了很長(zhǎng)時(shí)間并惡化，通常引起人體中多個(gè)瘺的發(fā)生， 而且瘺的尺寸也會(huì)相對(duì)增加，就需要大量的干細(xì)胞來(lái)治療患者。同時(shí)，對(duì)于體外培養(yǎng)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)實(shí)施現(xiàn)有專(zhuān)利(W0 2007/011797、US 6，777，231 等)或發(fā)表的文獻(xiàn)((組織工程學(xué))Tissue Engineering 7 (2)，211—228，2001 等)中所公開(kāi)的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)方法時(shí)，體外培養(yǎng)細(xì)胞需要較長(zhǎng)的時(shí)間，使得難以獲得臨床有效量的細(xì)胞。因此，會(huì)降低臨床應(yīng)用中的實(shí)際效率。盡管還不知道確切的理由，脂肪干細(xì)胞的增殖率因個(gè)體不同而有差異，并且由于脂肪干細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不能活躍增殖而使細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)常失敗。此外，脂肪干細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括如多能型、免疫調(diào)節(jié)活性等可根據(jù)其供體不同而有差異。因此，應(yīng)用具臨床有效特征的異體脂肪干細(xì)胞可改善治療瘺的效果。技術(shù)問(wèn)題因此，本發(fā)明涉及在瘺治療中的分離自人脂肪組織的基質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供生產(chǎn)臨床有效量的基質(zhì)干細(xì)胞的改良方法，以及用前述方法生產(chǎn)的脂肪干細(xì)胞組合物。技術(shù)方案為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供用于治療瘺的脂肪干細(xì)胞組合物，其含有異體脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)上述的另一個(gè)目的，本發(fā)明提供制備含有脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的脂肪干細(xì)胞組合物的方法，該方法包括如下步驟(a)從目標(biāo)體(subject)中收集脂肪組織；(b)從脂肪組織中分離基質(zhì)血管成分(‘SVF’ )；
(c)在基質(zhì)培養(yǎng)中培養(yǎng)SVF ；(d)在含有作為生長(zhǎng)因子的EGF或bFGF的擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)SVF，以培養(yǎng)脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞；和(e)培養(yǎng)脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞至少一代(passage)。根據(jù)本發(fā)明，還提供由上述方法制備的脂肪干細(xì)胞組合物，以及治療瘺的方法，該方法包括給瘺患者施用前述組合物的步驟。本發(fā)明大體上涉及生產(chǎn)用于治療瘺的臨床有效量的人脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的方法，以及由該方法制備的組合物。移植中所用的脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞可分離自自體和/或異體脂肪組織。更具體地，根據(jù)本發(fā)明，在治療中可應(yīng)用異體脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞而不用從目標(biāo)患者中分離脂肪組織，并且可選擇具有更加優(yōu)異的治療效果的脂肪干細(xì)胞，從而具備臨床適用性。此外，對(duì)于分離自自體或異體脂肪組織的基質(zhì)血管成分(下文中，通常被稱(chēng)為 iSVF')的培養(yǎng)，本發(fā)明可適當(dāng)?shù)貞?yīng)用基質(zhì)培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基來(lái)進(jìn)行培養(yǎng)，從而在短時(shí)間內(nèi)有效生產(chǎn)出臨床有效量的基質(zhì)干細(xì)胞。更具體地，本發(fā)明可利用含特定生長(zhǎng)因子，如堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(下文中，被稱(chēng)為‘bFGF’ )或表皮生長(zhǎng)因子(下文中，被稱(chēng)為‘EGF’ ) 的擴(kuò)增培養(yǎng)基，從而顯著地減少干細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間和易于控制干細(xì)胞因個(gè)體而不同的生長(zhǎng)速率。此外，由本發(fā)明方法生產(chǎn)的脂肪干細(xì)胞與現(xiàn)有的細(xì)胞培養(yǎng)方法生產(chǎn)的干細(xì)胞相比，表現(xiàn)出優(yōu)異的分化速率和免疫調(diào)節(jié)活性。如果通過(guò)抽脂從患者中分離而提供大量脂肪組織，可純化和使用該脂肪來(lái)源的干細(xì)胞。然而，在多數(shù)情況下，為獲得足量的用于移植的脂肪來(lái)源的干細(xì)胞，需要有增殖階段。 即，在計(jì)算抽脂獲得的脂肪組織的量、分離自脂肪組織的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)目和移植所需的細(xì)胞的數(shù)目后，應(yīng)該進(jìn)行細(xì)胞的培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)以獲得臨床有效量的干細(xì)胞。為進(jìn)行異體移植，可進(jìn)行繼代培養(yǎng)以充分去除一系列可誘發(fā)免疫反應(yīng)的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，以生產(chǎn)同質(zhì)的基質(zhì)干細(xì)胞群。優(yōu)選地，應(yīng)該進(jìn)行至少一次繼代培養(yǎng)。在本申請(qǐng)中，“基質(zhì)培養(yǎng)基”是指用于培養(yǎng)SVF的培養(yǎng)基，可通過(guò)添加10% FBS和抗生素至適合的細(xì)胞培養(yǎng)基，如DMEM或DMEM/F12中而制備。另一方面，“擴(kuò)增培養(yǎng)基”
是指用于增殖脂肪來(lái)源的干細(xì)胞的培養(yǎng)基，并可在基質(zhì)培養(yǎng)基中額外含有bFGF或EGF。與常規(guī)培養(yǎng)方法(W0 2007/011797)所需的約72 120小時(shí)的平均倍增時(shí)間相比，根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)方法，脂肪來(lái)源的干細(xì)胞的平均倍增時(shí)間為約48小時(shí)，從而達(dá)到顯著增加的效果。如

圖1所示，在本發(fā)明的設(shè)定的培養(yǎng)條件下，每個(gè)傳代中的平均培養(yǎng)時(shí)間為4天，而常規(guī)方法的每個(gè)傳代的平均培養(yǎng)時(shí)間為7天，因此本發(fā)明顯著減少了細(xì)胞生產(chǎn)的時(shí)間，即生產(chǎn)足量細(xì)胞數(shù)所需的時(shí)間。例如，為利用50ml提供的脂肪抽吸細(xì)胞 (Iipoaspirate)獲得1 X IO8脂肪干細(xì)胞，現(xiàn)有的培養(yǎng)方法需要至少30天。相比之下，當(dāng)提供的脂肪干細(xì)胞培養(yǎng)于本發(fā)明的在常規(guī)基質(zhì)培養(yǎng)基中含有bFGF或EGF的擴(kuò)增培養(yǎng)基中時(shí)， 可在約15天內(nèi)獲得預(yù)期的產(chǎn)物。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，如果提供的脂肪干細(xì)胞少于50ml，現(xiàn)有的培養(yǎng)方法難以生產(chǎn)臨床有效量的脂肪干細(xì)胞，然而本發(fā)明提供改良的培養(yǎng)方法以克服這種困難。對(duì)于培養(yǎng)基質(zhì)干細(xì)胞，不同供體的脂肪組織其倍增時(shí)間有很大不同，然而，本發(fā)明可最小化因供體個(gè)體差異而導(dǎo)致的培養(yǎng)時(shí)間差異。因此，本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法可適于確保用于治療瘺的臨床有效量的細(xì)胞。通常，已知隨著體外培養(yǎng)世代數(shù)的增加，干細(xì)胞的多能性降低。因此，需要能維持所需的干細(xì)胞多能性的培養(yǎng)方法。與現(xiàn)有的培養(yǎng)方法相比，當(dāng)使用本發(fā)明的培養(yǎng)方法時(shí)，干細(xì)胞表現(xiàn)出優(yōu)異的分化成肌細(xì)胞、骨細(xì)胞等的多能性。此外，本發(fā)明獲得的脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞順利地保留固有的多能性和免疫調(diào)節(jié)活性，甚至表現(xiàn)出更優(yōu)異的效果。即，根據(jù)本發(fā)明，如果干細(xì)胞培養(yǎng)于含有bFGF或EGF的擴(kuò)增培養(yǎng)基中，作為干細(xì)胞固有特性的多能性和免疫調(diào)節(jié)活性能更好地被維持，因而獲得優(yōu)異的臨床效果。已知脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞不誘發(fā)對(duì)異體細(xì)胞的免疫反應(yīng)，但具有免疫調(diào)節(jié)活性以抑制誘發(fā)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明提出異體脂肪干細(xì)胞可用于瘺的治療。例如，當(dāng)在活化克羅恩氏病患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell)的條件下加入脂肪干細(xì)胞時(shí)，免疫反應(yīng)可被抑制(或被控制)。這種情況下，異體干細(xì)胞基本上具有與自體干細(xì)胞相同或優(yōu)于自體干細(xì)胞的功能。因此，自體脂肪干細(xì)胞可有效地用于治療克羅恩氏病引起的瘺或其它類(lèi)型的瘺。本發(fā)明中用于移植的基質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)培養(yǎng)1 10個(gè)傳代制備，并且優(yōu)選這種干細(xì)胞的 50%，更優(yōu)選 80%)^CD10、C13、CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105 和 Oct 4 呈陽(yáng)性，對(duì)0034、0045、00104、00106 和 Mro-I 呈陰性。從下述的詳細(xì)描述中可更清楚的知曉本發(fā)明的細(xì)節(jié)。在本申請(qǐng)上下文中，“基質(zhì)血管成分(SVF) ”是指分離自脂肪組織的細(xì)胞，是指脂肪組織用膠原酶處理和離心去除大多數(shù)成熟脂肪細(xì)胞后剩下的細(xì)胞群?！爸緛?lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞”是指獲自SVF的間充質(zhì)干細(xì)胞，且還可被稱(chēng)為“脂肪來(lái)源的干細(xì)胞(ASC) ”、“脂肪來(lái)源的成體干細(xì)胞(ADAS)”、“脂肪干細(xì)胞”等。本申請(qǐng)所用的“瘺”是指體內(nèi)產(chǎn)生的不正常通道。這種瘺的實(shí)例包括肛瘺、肛門(mén)直腸瘺、直腸陰道瘺、膀胱瘺、腸道瘺、糞瘺等，但不具體限于此?！爱愺w移植”是指移植同一物種的其它或另一個(gè)體的特定組織、器官或細(xì)胞，更具體地，在自體組織、器官或細(xì)胞不能使用的情況下，移植另一個(gè)人或其它動(dòng)物的特定組織、 器官或細(xì)胞。本發(fā)明主要包括從自體或異體脂肪組織中收集SVF，并培養(yǎng)來(lái)自于SVF的脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞，而這一方法已經(jīng)有報(bào)道。本發(fā)明通過(guò)改良美國(guó)專(zhuān)利No. 6，777，231中提出的常規(guī)方法，提出用于治療瘺的臨床有效量的細(xì)胞的生產(chǎn)方法。更具體地，美國(guó)專(zhuān)利 No. 6，777，231公開(kāi)的方法包括使用膠原酶處理抽脂獲得的脂肪組織并制備SVF、培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞群，即在含有10%牛血清的由DMEM或DMEM/F12(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基 /漢姆F-12營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基)組成的基質(zhì)培養(yǎng)基中的SVF，培養(yǎng)孵育的細(xì)胞至少一個(gè)傳代直到它們生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿的80% 90%。另一方面，本發(fā)明包括在基質(zhì)培養(yǎng)基中孵育SVF 24小時(shí)，然后，將孵育的細(xì)胞轉(zhuǎn)接至還含有bFGF或EGF及基質(zhì)培養(yǎng)基的擴(kuò)增培養(yǎng)基中。根據(jù)本發(fā)明，可通過(guò)往基質(zhì)培養(yǎng)基中添加0. 1 lOOng/ml，優(yōu)選1 lOng/ml的bFGF或EGF 制備擴(kuò)增培養(yǎng)基，從而增加了細(xì)胞分化速率，并維持多能性和免疫調(diào)節(jié)活性。因此，本發(fā)明提供改良的細(xì)胞生產(chǎn)方法。本發(fā)明中的脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)抽脂或手術(shù)切除從人皮下脂肪組織中獲得，但不具體限于此。
假如細(xì)胞培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基沒(méi)有特別限定為下面的描述，本發(fā)明中用于移植的自體或異體脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞可根據(jù)下述的方法獲得。(1)從抽脂獲得的脂肪組織中分離SVF。用KRB溶液洗滌并用膠原酶處理脂肪組織后，繼續(xù)進(jìn)行離心。去除上層液體，往下層加入生理上適合的鹽水溶液(如磷酸緩沖液)形成懸浮液。接下來(lái)，進(jìn)行離心，恢復(fù)成含有SVF的下層。(2)在基質(zhì)培養(yǎng)基中孵育SVF。用基質(zhì)培養(yǎng)基中懸浮SVF后，將濃度為10，000 40，000個(gè)細(xì)胞/cm2的懸浮液接種到培養(yǎng)皿中，并在那進(jìn)行培養(yǎng)?；|(zhì)培養(yǎng)基為含有10%牛血清的由DMEM或DMEM/F12(達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基/漢姆F-12營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基)組成的培養(yǎng)基，并用于培養(yǎng)SVF 24 小時(shí)。(3)在擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育去除基質(zhì)培養(yǎng)基后，加入擴(kuò)增培養(yǎng)基用于增殖粘附(或凝集)的細(xì)胞。擴(kuò)增培養(yǎng)基含有10%牛血清和0. 1 100ng/ml的EGF或0. 1 100ng/ml的bFGF的DMEM或DMEM/ F12，其作用為加速脂肪來(lái)源的(粘附或凝集的)基質(zhì)干細(xì)胞的增殖，從而在短時(shí)間內(nèi)顯著增加細(xì)胞的數(shù)量。(4)繼代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞充滿(mǎn)80 90%的培養(yǎng)皿底部時(shí)，去除擴(kuò)增培養(yǎng)基，用胰蛋白酶進(jìn)行處理從培養(yǎng)皿中收獲細(xì)胞。為了繼代培養(yǎng)，細(xì)胞應(yīng)當(dāng)以1 3 1 4的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笤谛碌呐囵B(yǎng)皿中用擴(kuò)增培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。通過(guò)如上所述的步驟，可進(jìn)行進(jìn)一步的繼代培養(yǎng)。(5)確認(rèn)免疫調(diào)節(jié)活性由于異體脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞根據(jù)其種類(lèi)(個(gè)體)的不同而具有不同的免疫調(diào)節(jié)活性，因此在觀察和鑒定獲自至少一代繼代培養(yǎng)的脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性后，可選擇和使用具有優(yōu)異免疫調(diào)節(jié)活性的異體脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)比自體細(xì)胞更優(yōu)良的臨床效果。附圖簡(jiǎn)述通過(guò)下述的詳細(xì)說(shuō)明以及所附附圖，將能更加清楚地知曉本發(fā)明的上述和其它目的、特征和其它優(yōu)點(diǎn)，其中圖1所示為基質(zhì)培養(yǎng)基或擴(kuò)增培養(yǎng)基中孵育的脂肪干細(xì)胞的CPDL ；圖2所示為基質(zhì)培養(yǎng)基或擴(kuò)增培養(yǎng)基中孵育20天后的脂肪干細(xì)胞的產(chǎn)量；圖3為基質(zhì)培養(yǎng)基或擴(kuò)增培養(yǎng)基中孵育的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行肌細(xì)胞分化的照片 (X40)；圖4為基質(zhì)培養(yǎng)基或擴(kuò)增培養(yǎng)基中孵育的脂肪干細(xì)胞進(jìn)行骨細(xì)胞分化的照片 (X40)；圖5所示為脂肪干細(xì)胞的免疫原性；圖6所示為脂肪干細(xì)胞在MLR中的免疫抑制活性；圖7所示為PHA-刺激的免疫反應(yīng)中，自體和異體脂肪干細(xì)胞IFN-Y的分泌抑制活性；圖8所示為PHA-刺激的免疫反應(yīng)中，自體和異體脂肪干細(xì)胞TNF-α的分泌抑制活性；圖9所示為PHA-刺激的免疫反應(yīng)中，基質(zhì)培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞的IFN- γ和TNF- α的分泌抑制活性(n = 9)；圖10為脂肪干細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白分泌活性的照片(Χ40)；以及圖11為移植脂肪干細(xì)胞前后肛瘺的照片。最佳實(shí)施方式接下來(lái)，將詳細(xì)描述本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案和實(shí)施例。然而，這些實(shí)施例僅用作說(shuō)明，并非旨在限制本發(fā)明。實(shí)施例1人脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法通常通過(guò)抽脂獲得脂肪組織，但不特別限于此。根據(jù)下述方法從抽脂獲得的脂肪組織中分離脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞用等體積的 KRB溶液洗滌獲得的脂肪組織3 4次以去除脂肪組織中的血液。往脂肪組織中加入等體積的膠原酶溶液，在37°C水浴中進(jìn)行反應(yīng)。將反應(yīng)產(chǎn)物置于離心管中，20°C、1200rpm離心 10分鐘。去除作為上清液的脂肪層，不加振蕩輕柔地分離出剩下的下層膠原酶溶液。將基質(zhì)培養(yǎng)基加入到膠原酶溶液中制備懸浮液，然后于20°C、1200rpm離心5分鐘。這里，沉淀部分為基質(zhì)血管成分，也即SVF，而將上清液棄去。在基質(zhì)培養(yǎng)基中懸浮SVF，接種到培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中于37°C、5% CO2下培養(yǎng)M 小時(shí)。去除培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液(下稱(chēng)‘PBS’ )洗滌SVF后，將SVF在含有l(wèi)ng/ml濃度的bFGF或含有5ng/ml濃度的EGF的基質(zhì)培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖。當(dāng)脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)皿80 90%時(shí)，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，以分離和獲得單個(gè)類(lèi)型的細(xì)胞。獲得的單個(gè)細(xì)胞以1 3 1 4的比例用擴(kuò)增培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋?zhuān)酉聛?lái)進(jìn)行繼代培養(yǎng)。圖1所示為基質(zhì)培養(yǎng)基或擴(kuò)增培養(yǎng)基中孵育的脂肪干細(xì)胞的CPDL，圖2所示為基質(zhì)培養(yǎng)基或擴(kuò)增培養(yǎng)基中孵育20天后脂肪干細(xì)胞的產(chǎn)量。如這些圖中所示，發(fā)現(xiàn)如果脂肪干細(xì)胞在含bFGF或EGF及基質(zhì)培養(yǎng)基的擴(kuò)增培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率是使用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，即單純的基質(zhì)培養(yǎng)基時(shí)的3倍。當(dāng)1. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞在前述的每個(gè)培養(yǎng)基中孵育 20天，基質(zhì)培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基中的平均細(xì)胞產(chǎn)量分別為9. 7 X IO6和1.9X108。因此，可以看出擴(kuò)增培養(yǎng)基中收集的細(xì)胞約為基質(zhì)培養(yǎng)基中的20倍。下述表1示出了不同培養(yǎng)基的倍增時(shí)間和細(xì)胞產(chǎn)量。表 權(quán)利要求
1.用于治療瘺的脂肪干細(xì)胞組合物，其含有異體脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中通過(guò)培養(yǎng)至少一代生產(chǎn)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少50%的脂肪干細(xì)胞組合物對(duì)⑶10、⑶13、 CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105 和 Oct 4 呈陽(yáng)性，而對(duì) CD34、CD45、CD104、CD106 和 Stro-I呈陰性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少80%的脂肪干細(xì)胞組合物對(duì)⑶10、⑶13、 CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105 和 Oct 4 呈陽(yáng)性，而對(duì) CD34、CD45、CD104、CD106 和Stro-I呈陰性。
5.制備含有脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的脂肪干細(xì)胞組合物的方法，該方法包括如下步驟(a)從目標(biāo)體中收集脂肪組織；(b)從脂肪組織中分離基質(zhì)血管成分(SVF)；(c)在基質(zhì)培養(yǎng)中培養(yǎng)SVF;(d)在含有作為生長(zhǎng)因子的EGF或bFGF的擴(kuò)增培養(yǎng)基中培養(yǎng)SVF，以培養(yǎng)脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞；和(e)培養(yǎng)脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞至少一代。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中步驟(d)的擴(kuò)增培養(yǎng)基含有濃度為0.1 IOOng/ ml 的 EGF 或 bFGF。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述擴(kuò)增培養(yǎng)基含有濃度為1 lOng/ml的EGF 或bFGF。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述脂肪組織收集自異體目標(biāo)體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其還包括測(cè)定通過(guò)培養(yǎng)至少一代獲得的脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)活性，以及選擇具有極佳的免疫抑制活性的異體脂肪來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求5 9任一項(xiàng)所述的方法制備的脂肪干細(xì)胞組合物。
11.用于治療瘺的方法，其包括向瘺患者施用權(quán)利要求10所述的脂肪干細(xì)胞組合物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及生產(chǎn)用于治療瘺的臨床有效量的人脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的方法和由該方法制備的組合物。本發(fā)明的方法通過(guò)改良常規(guī)的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法，可在短期內(nèi)有效生產(chǎn)臨床有效量的脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞。與那些通過(guò)常規(guī)方法制備的細(xì)胞組合物相比，通過(guò)本發(fā)明方法獲得的含有脂肪組織來(lái)源的基質(zhì)干細(xì)胞的脂肪干細(xì)胞組合物表現(xiàn)出優(yōu)異的多能性與免疫調(diào)節(jié)活性，因而更適于治療瘺。特別是，由于在異體脂肪來(lái)源的干細(xì)胞中，免疫反應(yīng)被抑制，因而本發(fā)明的細(xì)胞組合物具有極佳的臨床用途。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102421444SQ200980158931
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2009年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日
發(fā)明者李圣求, 金美亨 申請(qǐng)人:安特羅根有限公司