專(zhuān)利名稱(chēng)：一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
豬肺炎支原體是引起豬的接觸性慢性呼吸道疾病的重要病原之一，是全世界廣泛存在嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要豬病病原之一，其主要危害是引起豬的生長(zhǎng)受阻、飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，繼發(fā)引起其他疾病的發(fā)生并加重發(fā)病癥狀。豬支原體肺炎滅活疫苗可以減少喘氣病的發(fā)生，但優(yōu)質(zhì)疫苗的前提需要有一種好的培養(yǎng)基來(lái)支撐。培養(yǎng)基是人工合成各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供微生物生長(zhǎng)的基質(zhì)。支原體是一種微小原核生物，無(wú)細(xì)胞壁，可在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，形成小菌落，但培養(yǎng)條件要求十分苛刻，且生長(zhǎng)速度慢，從而難以培養(yǎng)，這樣對(duì)防治豬氣喘病的研究造成困難。1964年Goodwin等首先使用煮沸豬肺組織的滅活細(xì)胞培養(yǎng)基成功進(jìn)行豬肺炎支原體的分離培養(yǎng)。1965年Switer氏等和Goodwin等都各自成功地研究出了能形成菌落的固體培養(yǎng)基。1973年，我國(guó)上海農(nóng)科院畜牧獸醫(yī)研究所將豬肺炎支原體通過(guò)豬肺埋塊細(xì)胞培養(yǎng)240余代的基礎(chǔ)上，參考Goodwin等報(bào)導(dǎo)的復(fù)合培養(yǎng)基，使用了無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。1975 年江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院在Switer的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上作了一些改進(jìn)，創(chuàng)造了 KM2培養(yǎng)基。2000年版獸醫(yī)生物制品制造及檢驗(yàn)規(guī)程中提出以腦心浸粉和PPLO肉湯為主要原料的豬肺炎支原體培養(yǎng)基。2006年農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中提出豬支原體肺炎的病原分離用似6培養(yǎng)基。但現(xiàn)有技術(shù)的共同缺點(diǎn)是，豬肺炎支原體在培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度較慢，同時(shí)活菌滴度在IO7 IO8CCU 左右，活菌滴度低，不夠理想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種營(yíng)養(yǎng)成分豐富、滲透壓適合豬肺炎支原體生長(zhǎng)，且生長(zhǎng)快、活菌滴度高的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，按照該培養(yǎng)基培養(yǎng)的豬肺炎支原體生長(zhǎng)速度快、 活菌滴度高，分離的敏感性強(qiáng)，可用于豬肺炎支原體生化特征、遺傳、免疫等方面的研究。本發(fā)明另一目的是提供該豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的提供一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基主要由A液和B液和C液和/ 或瓊脂組成；A液由腦心浸出液、PPLO肉湯、去離子水組成；B液由10XHank’S液、乳清蛋白水解物、酵母浸出液、丙酮酸鈉、示蛋白胨、硫代硫酸鈉、0. 酚紅、青霉素、去離子水組成； C液為健康馬血清。其中，上述成分的配比如下A液腦心浸出液2. 0 5. 0g、PPL0肉湯1. 5 5. 0g、 去離子水200 300ml ；B液10XHank，s液1. 0 5. 0ml、乳清蛋白水解物1. 0 3. 0g、 酵母浸出液3. 0 5. 0g、丙酮酸鈉0. 8 2. 5g、示蛋白胨1. 0 3. 0g、硫代硫酸鈉0. 1 0. 5g、0. 酚紅10 20ml、青霉素200 400u/ml、去離子水500 600ml ；C液健康馬血清 140 200ml ；瓊脂 7. 0 10g。
進(jìn)一步，上述成分的配比如下A液腦心浸出液4. 5g、PPLO肉湯4. 0g、去離子水260ml ；B液dOXHank，s液3. 0ml、乳清蛋白水解物1. 25g、酵母浸出液4. 5g、丙酮酸鈉l.Og、示蛋白胨1.5g、硫代硫酸鈉0. 135g、0. 酚紅17ml、青霉素200u/ml、去離子水 560ml ；C液健康馬血清160ml ；瓊脂IOgo本發(fā)明 還提供了該豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于制備步驟如下①按配比稱(chēng)取A液各成分，將各成分混合，攪拌，使之完全溶解，116°C高壓滅菌20 分鐘，冷卻后備用；②按配比稱(chēng)取B液各成分，將各成分混合，攪拌，使之完全溶解，用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆?；③按配比稱(chēng)取C液成分，將A液、B液和C液充分混合均勻，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7. 6 7. 8，即得豬肺炎支原體的液體培養(yǎng)基。進(jìn)一步，該豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法中還可包括如下步驟按配比稱(chēng)取瓊月旨，加入步驟③制得的培養(yǎng)基中，混合均勻，從而得到豬肺炎支原體的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明的豬肺炎支原體培養(yǎng)基運(yùn)用微生物學(xué)、有機(jī)、無(wú)機(jī)分析化學(xué)的技術(shù)原理，對(duì)不同的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)和膽固醇等諸多營(yíng)養(yǎng)組分的組合進(jìn)行了篩選，對(duì)培養(yǎng)基的PH值、滲透壓、離子強(qiáng)度等進(jìn)行了比較，研究出了適合豬肺炎支原體快速生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。 該培養(yǎng)基的配方中除基本成分外，在培養(yǎng)基中還添加了硫代硫酸鈉、丙酮酸鈉，上述成分的添加能明顯提高豬肺炎支原體的的活菌滴度(CCU)；對(duì)豬肺炎支原體分離的敏感性強(qiáng)； 未添加前活菌滴度為lX107(XU/ml lX108(XU/ml，添加后活菌滴度為lX108(XU/ml 1 X IOkiCXUAiI ；活菌滴度和分離的敏感性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基。通過(guò)下列實(shí)施例將更具體的說(shuō)明本發(fā)明，但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是為了說(shuō)明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明培養(yǎng)基的制備液體培養(yǎng)基A液腦心浸出液2. 0g、PPLO肉湯5. 0g、去離子水300ml以上各成分混合，攪拌，使之完全溶解，116°C高壓滅菌20分鐘，冷卻后備用；B液10XHank’ s液5. 0ml、乳清蛋白水解物1. 0g、酵母浸出液5. 0g、丙酮酸鈉 0. 8g、示蛋白胨3. 0g、硫代硫酸鈉0. lg、0. 酚紅10ml、青霉素400U/ml、去離子水545ml以上各成分混合，攪拌，使之完全溶解，用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆?；C液健康馬血清140ml將A液、B液和C液充分混合均勻，lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7. 6，制得豬肺炎支原體液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基在1000ml液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂8. Og實(shí)施例2本發(fā)明培養(yǎng)基的制備液體培養(yǎng)基A液腦心浸出液4. 5g、PPLO肉湯4. 0g、去離子水260ml
以上各成分混合，攪拌，使之完全溶解，116°C高壓滅菌20分鐘，冷卻后備用；B液10XHank，s液3. 0ml、乳清蛋白水解物1. 25g、酵母浸出液4. 5g、丙酮酸鈉 1. 0g、示蛋白胨1. 5g、硫代硫酸鈉0. 135g、0. 酚紅17ml、青霉素200U/ml、去離子水560ml以上各成分混合，攪拌，使之完全溶解，用0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆?；C液健康馬血清160ml將A液、B液和C液充分混合均勻，lmol/L氫氧化鈉調(diào)整pH至7. 8，制得豬肺炎支原體液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基在1OOOml液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂IOg實(shí)施例3本發(fā)明培養(yǎng)基的制備液體培養(yǎng)基A液腦心浸出液5. 0g、PPLO肉湯1. 5g、去離子水200ml以上各成分混合，攪拌，使之完全溶解，116°C高壓滅菌20分鐘，冷卻后置4°C保存B液10XHank’ s液1. 0ml、乳清蛋白水解物3. 0g、酵母浸出液3. 0g、丙酮酸鈉 2. 5g、示蛋白胨1. 0g、硫代硫酸鈉0. 5g、0. 酚紅20ml、青霉素200U/ml、去離子水579ml以上各成分混合，攪拌，使之完全溶解，用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆?；C液健康馬血清200ml將A液、B液和C液充分混合均勻，lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整pH至7. 7，制得豬肺炎支原體液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基在1000ml液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加瓊脂7. Og實(shí)施例4本發(fā)明豬肺炎支原體培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)中幾種培養(yǎng)基的比較試驗(yàn)1本發(fā)明培養(yǎng)基與現(xiàn)有技術(shù)中幾種培養(yǎng)基活菌滴度比較試驗(yàn)1. IMhp菌株和培養(yǎng)條件將購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察的豬肺炎支原體CVCC355濟(jì)南系Z株、ATCC引進(jìn)豬肺炎支原體25934J株和自行分離鑒定的豬肺炎支原體DJ-166株分別接種本發(fā)明的豬肺炎支原體培養(yǎng)基和現(xiàn)有技術(shù)的3種培養(yǎng)基，種子繼代復(fù)壯后，分別按 10% (V/V)的比例接種，37°C培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)基的顏色變黃、pH由7. 6降至6. 8 6. 9時(shí)，無(wú)菌取出培養(yǎng)物。1. 2活菌滴度(CCU)測(cè)定每個(gè)菌株取12只無(wú)菌試管，每管裝4. 5ml含豬肺炎支原體培養(yǎng)基，在第1管加入0. 5ml生長(zhǎng)良好的培養(yǎng)物，混合均勻后，吸取0. 5ml加入第2根管， 如此進(jìn)行10倍系列稀釋至最末1管，同時(shí)設(shè)未加菌液的豬肺炎支原體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。試驗(yàn)管設(shè)三個(gè)重復(fù)。之后，將試管放置37°C恒溫箱中靜止培養(yǎng)，每日觀察1次，主要觀察培養(yǎng)基的顏色變化和渾濁度，連續(xù)觀察時(shí)間為14日，最后發(fā)生顏色變化的小管稀釋度即為該培養(yǎng)物的CCU滴度。此試驗(yàn)共進(jìn)行了 3次。2 結(jié)果2. 1豬肺炎支原體Z株接種4種培養(yǎng)基3次生長(zhǎng)試驗(yàn)CCU (顏色變化單位)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。表1豬肺炎支原體Z株接種4種培養(yǎng)基3次生長(zhǎng)試驗(yàn)CXU測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于主要由A液和B液和C液和/或瓊脂組成；A 液由腦心浸出液、PPLO肉湯、去離子水組成；B液由lOXHank’ s液、乳清蛋白水解物、酵母浸出液、丙酮酸鈉、示蛋白胨、硫代硫酸鈉、0. 酚紅、青霉素、去離子水組成；C液為健康馬血清。
2.權(quán)所述的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于上述成分的配比如下A液腦心浸出液 2. 0 5. 0g,PPLO 肉湯 1. 5 5. 0g、去離子水 200 300ml ；B 液10XHank，s 液 1. 0 5. 0ml、乳清蛋白水解物1. 0 3. 0g、酵母浸出液3. 0 5. 0g、丙酮酸鈉0. 8 2. 5g、示蛋白胨1. 0 3. 0g、硫代硫酸鈉0. 1 0. 5g、0. 酚紅10 20ml、青霉素200 400u/ml、去離子水500 600ml ；C液健康馬血清140 200ml ；瓊脂7. 0 10g。
3.權(quán)所述的豬肺炎支原體培養(yǎng)基，其特征在于上述成分的配比如下A液腦心浸出液4. 5g、PPLO肉湯4. 0g、去離子水260ml ；B液10 XHank，s液3. 0ml、乳清蛋白水解物 1. 25g、酵母浸出液4. 5g、丙酮酸鈉1. 0g、示蛋白胨1. 5g、硫代硫酸鈉0. 135g、0. 酚紅 17ml、青霉素200u/ml、去離子水560ml ；C液健康馬血清160ml ；瓊脂10g。
4.權(quán)、1-3任一項(xiàng)所述的豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于制備步驟如下①按配比稱(chēng)取A液各成分，將各成分混合，攪拌，使之完全溶解，116°C高壓滅菌20分鐘，冷卻后備用；②按配比稱(chēng)取B液各成分，將各成分混合，攪拌，使之完全溶解，用0.22 μ m濾膜過(guò)濾除菌，4°C保存?zhèn)溆茫虎郯磁浔确Q(chēng)取C液成分，將A液、B液和C液充分混合均勻，用lmol/L氫氧化鈉溶液調(diào)整PH至7. 6 7. 8，即得豬肺炎支原體培養(yǎng)基。
5.權(quán)4所述的豬肺炎支原體培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于還可進(jìn)一步包括如下步驟按配比稱(chēng)取瓊脂，加入步驟③制得的培養(yǎng)基中，混合均勻。
全文摘要
本發(fā)明提供一種豬肺炎支原體培養(yǎng)基及其制備方法，屬于獸醫(yī)生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的豬肺炎支原體液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成成分為腦心浸液、乳清蛋白水解物、PPLO肉湯、酵母浸粉、示蛋白胨、硫代硫酸鈉、Hank’s液、丙酮酸鈉、0.1％酚紅溶液、青霉素和去離子水，使用前加入健康馬血清。在液體培養(yǎng)基中加入瓊脂，得到豬肺炎支原體的固體培養(yǎng)基。本發(fā)明的豬肺炎支原體培養(yǎng)基活菌滴度可達(dá)1×109CCU/ml～1×1010CCU/ml；活菌滴度和分離的敏感性均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基，豬肺炎支原體生長(zhǎng)速度快、分離的敏感性強(qiáng)；該培養(yǎng)基制備方法工藝簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，適合工業(yè)化大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102154167SQ20111000123
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者張峰, 王海燕, 石松, 趙亞榮, 車(chē)艷杰, 閆國(guó)輝, 高潔, 高玉梅 申請(qǐng)人:北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司, 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司