專利名稱：對(duì)hppd抑制劑型除草劑耐受的植物的制作方法
對(duì)HPPD抑制劑型除草劑耐受的植物導(dǎo)言本發(fā)明涉及編碼從屬于赭纖蟲科(Blepharismidae)的原生生物獲得的輕苯基丙酮酸雙加氧酶(EC I. 13. 11. 27，本文中縮寫為HPH))的核酸序列，以及由其編碼的蛋白質(zhì)，還涉及包含此類核酸序列的嵌合基因，還涉及此類核酸序列、蛋白質(zhì)或嵌合基因用于獲得對(duì)HPH)抑制劑型除草劑耐受的植物的用途。
背景技術(shù)：
HPPD是催化酪氨酸降解產(chǎn)物對(duì)羥苯基丙酮酸(本文中縮寫為HPP)轉(zhuǎn)化為尿黑酸(本文中縮寫為HG)的反應(yīng)的酶，尿黑酸是植物中生育酚和質(zhì)體醌的前體(Crouch N. P.等人(1997)Tetrahedron,53,20,6993-7010, Fritze 等人,(2004), Plant Physiology 1 34 1388-1400)。生育酚作為膜連結(jié)的抗氧化劑發(fā)揮作用。質(zhì)體醌首先作為PSII和細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體之間的電子載體發(fā)揮作用，其次，其是八氫番茄紅素不飽和酶(參與類胡蘿卜素的生物合成)的氧化還原輔因子。迄今為止，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的超過(guò)700條來(lái)自多種生物的核酸序列被注釋為編碼具有HPH)結(jié)構(gòu)域的推定蛋白質(zhì)，包括UniProtKB/TrEMBL數(shù)據(jù)庫(kù)中給出的A8R3H6檢錄號(hào)下以及NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中給出的BAF91881檢錄號(hào)下公開的序列。但對(duì)那些中的大多數(shù)(包括對(duì)應(yīng)于檢錄號(hào)A8R3H6/BAF91881的序列)而言，尚未在體外檢驗(yàn)或植物內(nèi)手段中證明所述蛋白質(zhì)具有HPH)酶促活性，也沒有證明此類HPH)蛋白在植物中表達(dá)時(shí)可賦予針對(duì)HPro抑制劑型除草劑的除草劑耐受性。在本領(lǐng)域范疇內(nèi)已經(jīng)描述了若干HPro蛋白及其ー級(jí)序列，特別是細(xì)菌(例如假單胞菌屬(Ruetschi等人，Eur. J. Biochem. ,205,459-466,1992, WO 96/38567))、植物(例如擬南芥屬(W0 96/38567，GenebankAF047834)、胡蘿卜(W0 96/38567，Genebank 87257)、燕麥(Avena sativa) (TO 02/046387)、小麥(TO02/046387)、寬葉臂形草(Brachiaria platyphylla) (W0 02/046387)、蔡藜草(Cenchrusechinatus) (W002/046387)、硬直黒麥草(Lolium rigidum) (W0 02/046387)、葦葉羊茅(Festuca arundinacea) (W0 02/046387)、狗尾草(Setaria faberi) (W0 02/046387)、牛筋草(Eleusine indica) (W0 02/046387)、高梁屬(Sorghum) (W0 02/046387)、球抱子菌屬(Coccicoides) (Genebank C0ITRP)、日本黃連(Coptis japonica) (W0 06/132270)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) (ES 2275365))或哺乳動(dòng)物(例如小鼠或豬)的 HPPD 蛋白。指出的參考文獻(xiàn)中公開的相應(yīng)序列通過(guò)引用并入本文。大多數(shù)植物通過(guò)arrogenate 合成酪氨酸(Abou-Zeid 等人(1995), Applied EnvMicrob 41 :1298-1302 ;Bonner 等人，(1995)，Plant CellsPhysiol. 36,1013-1022 ；Byng等人，(1981), Phytochemistry 6 :1289-1292 ；Connely and Conn(1986), Z. Naturforsch41c :69-78 ；Gaines 等人，(1982)，Plants 156 :233-240)。在這些植物中，HPP 僅源于酪氨酸的降解。另ー方面，在例如釀酒酵母的酵母或大腸桿菌的細(xì)菌等的生物中，HPP是酪氨酸前體，并且通過(guò)預(yù)苯酸脫氫酶(prephenate dehydrogenase,下文中稱為F1DH)的作用(將預(yù)苯酸轉(zhuǎn)化為 HPP)來(lái)合成(Lingens 等人，(1967)European J. Biochem 1:363-374;Sampathkumar and Morrisson (1982), Bioch Biophys Acta 701:204-211)。在這些生物中，HPP的生產(chǎn)因此直接與芳香族氨基酸生物合成途徑(莽草酸途徑)相關(guān)聯(lián)，而不與酪氨酸降解途徑相關(guān)聯(lián)。對(duì)HPro的抑制導(dǎo)致光合作用的解偶聯(lián)，缺乏輔助捕光色素(accessorylight-harvesting pigments),以及最重要地，由于缺少正常情況下由類胡蘿卜素提供的光保護(hù)導(dǎo)致的UV照射和活性氧類別對(duì)葉綠體的破壞(褪色)(Norris等人(1995), PlantCell 7:2139-2149)。光合活性組織的褪色導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和植物死亡。已證明，抑制HPro并且與該酶特異性結(jié)合以抑制HPP向尿黑酸的轉(zhuǎn)化的ー些分子是非常有效的選擇性除草剤。目前，大多數(shù)可商業(yè)獲得的HPro抑制劑型除草劑屬于這四個(gè)化學(xué)家族之一I)三酮類，例如，磺草酮[即2-[2-氯-4-(甲基磺?；?苯甲酰基]-1，3-環(huán)己ニ酮]，甲基磺草酮[即2- [4-(甲基磺?；?-2-硝基苯甲?；鵠-I，3-環(huán)己ニ酮];環(huán)磺酮 (化1^0廿101^)[8卩2-[2-氯-4-(甲基磺?；?-3-[(2，2，2，_三-氟こ氧基)甲基]苯甲?；鵠-1, 3-環(huán)-己ニ酮];莊無(wú)忌(tefuryltrione)[即2-[2-氯-4_(甲基磺?；?-3_[[(四氫-2-呋喃基)甲氧基]甲基]苯甲?；鵠-1,3-環(huán)己ニ酮]];13；^5^10ロ5^0116[即4-輕基~3-[ [2-[ (2-甲氧基こ氧基)甲基]-6- ( ニ氟甲基)-3-卩比唳基]羰基]ニ環(huán)[3. 2. I]辛-3-烯-2-酮];雙環(huán)磺草酮(Benzobicyclon)[即3- (2-氯-4-甲磺?；郊柞；?-2-苯基硫代ニ環(huán)[3. 2. I]羊-2-烯-4-酮]2) ニ酮腈類，例如2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)-丙-1，3- ニ酮和2-氰基-I- [4-(甲基磺?；?-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基環(huán)丙基)丙-1，3_ ニ酮；3)異’惡唑類，例如異-愚氟草[即(5-環(huán)丙基-4-異’惡唑基)[2_(甲基磺?；?-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]。在植物中，異讓氟草被快速代謝為DKN (展示出HPH)抑制劑性質(zhì)的ニ酮腈類化合物)；和4)pyrazolinate,例如苯批唑草麗(topramezone)[即[3_(4, 5_ 二氧 _3_ 異
唑基)-2-甲基-4-(甲基磺酰基)苯基](5-羥基-I-甲基-IH-吡唑-4-基)甲酮]和pyrasulfotole [ (5_輕基-I, 3_ ニ甲基卩比唑_4_基(2_甲橫酸基-4-三氣甲基苯基(trifIuaromethylphenyl))甲酮]；pyrazofen[2_[4_(2,4_ ニ氯苯甲酸基)-I, 3_ ニ 甲基吡唑-5-基氧]苯こ酮]。這些抑制HPro的除草劑可在展現(xiàn)出代謝耐受性的作物植物(例如玉米(Zeamays),它們?cè)谄渲斜谎杆俳到?中使用以抵擋草(grass)和/或闊葉雜草(Schulz等人，(1993). FEBS letters,318,162-166 ;Mitchell 等人，(2001)Pest Management Science,Vol 57,120-128 ;Garcia 等人，(2000)Biochem.，39，7501-7507 ;Pallett 等人，(2001)PestManagement Science, Vol 57，133-142)。為拓展這些抑制HPH)的除草劑的范圍，進(jìn)行了若干努力，以向植物(特別是沒有代謝耐受性或代謝耐受性運(yùn)作欠佳的植物)賦予在農(nóng)藝學(xué)田間條件下可接受的耐受性水平。除了分流HPro介導(dǎo)的尿黑酸生產(chǎn)(US 6,812,010)的嘗試之外，還已過(guò)表達(dá)敏感型(sensitive)酶，以在植物中以相對(duì)除草劑來(lái)說(shuō)足夠的量生產(chǎn)靶標(biāo)酶(W096/38567)。HPH)的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致對(duì)異ず惡氟草(IFT)的ニ酮腈類衍生物(DKN)的更好的出苗前(pre-emergence)耐受性，但是就針對(duì)出苗后處理的耐受性而言，耐受性是不足的(Matringe 等人，(2005)，Pest Management Science 61 :269-276)。第三種策略是突變HPro，以獲得下述靶標(biāo)酶，其保留有其催化HPP轉(zhuǎn)化為尿黑酸的性質(zhì)，同時(shí)對(duì)HPro抑制劑不如突變前的天然HPro敏感。該策略已成功應(yīng)用于生產(chǎn)對(duì)2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-甲基磺?；?4-三氟甲基苯基)-丙-1，3- ニ酮和2-氰基-I- [4-(甲基磺?；?-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基環(huán)丙基)丙-1，3_ ニ酮(屬于ニ酮腈類家族的兩種抑制HPH)的除草劑(W0 99/24585))耐受的植物(EP496630)。Pro215Leu、Gly336Glu、Gly336Ile 和更特別地 Gly336Trp (突變的氨基酸的位置是參照假單胞菌屬HPH)示出的)被鑒定為負(fù)責(zé)于針對(duì)用這些ニ酮腈類除草劑進(jìn)行的出苗前處理的増加的耐受性的突變，并且它們不造成酶活性的變化。更近來(lái)地，將假單胞菌屬HPro基因引入煙草和大豆的質(zhì)體基因組已顯示出比核轉(zhuǎn)化更為有效，其甚至賦予了針對(duì)異P惡氟草的出苗后應(yīng)用的耐受性(Dufourmantel等人，2007, Plant Biotechnol J. 5(I) :118-33)。 在WO 04/024928中，發(fā)明人已尋求通過(guò)增加HPP前體進(jìn)入這些植物的細(xì)胞的通量來(lái)增加異戍ニ烯基醌(prenylquinone)在植物細(xì)胞中的生物合成(例如質(zhì)體醌、生物酹的合成)。這已經(jīng)通過(guò)PDH酶的過(guò)表達(dá)將所述前體的合成與“莽草酸”途徑關(guān)聯(lián)來(lái)進(jìn)行了。他們還提到，用編碼I3DH酶的基因轉(zhuǎn)化植物使得增加所述植物對(duì)HPH)抑制劑的耐受性成為可倉(cāng)^:。在專利申請(qǐng)WO 2009/144079中，公開了編碼在熒光假單胞菌的HPH)蛋白的第336位突變的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)的核酸序列及其用于獲得對(duì)HPH)抑制劑型除草劑耐受的植物的用途。在WO 2002/046387中，已經(jīng)鑒定來(lái)自植物的HPH)蛋白的若干結(jié)構(gòu)域與賦予對(duì)多種HPro抑制劑型除草劑的耐受性相關(guān)，但是既沒有顯示植物內(nèi)數(shù)據(jù)也沒有顯示生物化學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)驗(yàn)證所描述的結(jié)構(gòu)域功能的影響。在WO 2008/150473中，示例了兩種不同的耐受性機(jī)制——經(jīng)修飾的編碼突變體HPH)酶的燕麥基因和CYP450玉蜀黍單加氧酶(nsfl基因)的組合，以獲得改進(jìn)的針對(duì)HPTO抑制劑型除草劑的耐受性，但是沒有公開證實(shí)基于兩種蛋白質(zhì)的組合的協(xié)同效果的數(shù)據(jù)。盡管開發(fā)顯示出針對(duì)上文所述的若干HPro抑制劑型除草劑耐受的植物獲得了成功，但仍需要開發(fā)和/或改進(jìn)植物對(duì)較新的或?qū)θ舾刹煌腍Pro抑制劑的耐受性，特別是對(duì)屬于三酮類(例如磺草酮、甲基磺草酮、環(huán)磺酮、雙環(huán)磺草酮和bicyclopyrone)和pyrazolinate (例如,苯卩比唑草酮和Dyrasulfotole)的類別的HPF1D抑制劑的耐受性。發(fā)明描述本發(fā)明因此涉及轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)，所述轉(zhuǎn)基因植物含有編碼可從或從屬于赭纖蟲科的生物獲得的HPro蛋白質(zhì)的基因及其變體或突變體，更尤其涉及來(lái)自屬于赭纖蟲屬(Bkpharisma)的生物的編碼展示出能催化對(duì)羥苯基丙酮酸到尿黑酸的轉(zhuǎn)化的性質(zhì)的HPPD酶的基因，其變體或突變體，并且所述植物較之不含任何此類HPH)編碼轉(zhuǎn)基因的植物而言對(duì)HPro抑制劑更不敏感。來(lái)自赭纖蟲科的編碼HPro蛋白質(zhì)的基因被選為優(yōu)秀的HPro抑制劑耐受的候選者，這是因?yàn)樗鼈冚^之敏感的擬南芥屬HPro蛋白質(zhì)(被用作為對(duì)HPro抑制劑型除草劑敏感的參照分子)而言在與HPro抑制劑耐受性相關(guān)的位置上的氨基酸組成上具有高分岐性，這是在HPro蛋白質(zhì)中以實(shí)驗(yàn)和結(jié)構(gòu)方式測(cè)定的。更具體地，本發(fā)明因此涉及對(duì)下述轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)，所述轉(zhuǎn)基因植物含有可從或從屬于赭纖蟲科的生物(尤其是赭纖蟲屬，更尤其是從日本赭纖蟲(Bkpharismajaponicum)種獲得的)獲得的、編碼展示出能催化對(duì)羥苯基丙酮酸到尿黑酸的轉(zhuǎn)化的性質(zhì)的HPH)酶的基因，其變體或突變體，并且所述植物較之不含任何此類HPH)轉(zhuǎn)基因的植物而言對(duì)HPro抑制劑更不敏感。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本文中命名為“本發(fā)明的HPro蛋白質(zhì)”或“赭纖蟲屬HPro蛋白質(zhì)”的HPro蛋白質(zhì)，其是與SEQ ID No. 4在2至382位氨基酸上的氨基酸序列(特別是與SEQ ID No. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID No. 6)具有至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPI3D蛋白質(zhì)。在另ー實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本文中命名為“本發(fā)明的HPro蛋白質(zhì)”或“赭纖蟲屬HPro蛋白質(zhì)”的HPro蛋白質(zhì)，其是與SEQ ID No. 4在2至382位氨基酸上的氨基酸序列(特別是與SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白質(zhì)，并且其中SEQ ID No. 4的第185位至第382位的任何氨基酸可改為任何天然存在的氨基酸，優(yōu)選地，其可以是任何保守取代。在另ー實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本文中命名為“本發(fā)明的HPro蛋白質(zhì)”或“赭纖蟲屬HPro蛋白質(zhì)”的HPro蛋白質(zhì)，其是與SEQ ID No. 4在2至382位氨基酸上的氨基酸序列(特別是與SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白質(zhì)，并且其在括號(hào)給出的其編號(hào)(相對(duì)于SEQID No. 4的編號(hào))所定義的位置上具有下述氨基酸中的ー個(gè)或多個(gè)，即，His (183)、Ser (226)、Asn (241)、Gln (265)、His (266)、Tyr (295)、Gln (334)、Phe (347)、Glu (349)、Gly (360)和 Asn (363)。在另ー實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本文中命名為“本發(fā)明的HPro蛋白質(zhì)”或“KordiaHPro蛋白質(zhì)”的HPro蛋白質(zhì)，其是與SEQ ID No. 4在2至382位氨基酸上的氨基酸序列(特別是與SEQ ID Nos. 4、5、6或7中任一的氨基酸序列，優(yōu)選SEQ ID No. 6)具有至少75%、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %或至少99 %的氨基酸序列同一性的HPH)蛋白質(zhì)，并且在表(i)的第二列給出的各位置上，原來(lái)出現(xiàn)的氨基酸可被表
(i)第三列中列出的氨基酸中的任何取代。表⑴
權(quán)利要求
1.包含與可在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子有效連接的編碼序列的嵌合基因，其特征在于，所述編碼序列包含編碼赭纖蟲屬羥苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)蛋白質(zhì)或與赭纖蟲屬HPro蛋白質(zhì)具有至少75 %序列同一性的蛋白質(zhì)的核酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的嵌合基因，其特征在于，HPro蛋白質(zhì)是日本赭纖蟲HPro蛋白質(zhì)或與日本赭纖蟲HPro蛋白質(zhì)具有至少75%序列同一性的蛋白質(zhì)。
3.權(quán)利要求I或2的嵌合基因，其中編碼所述蛋白質(zhì)的DNA可通過(guò)使用至少20個(gè)核苷酸的引物或探針從赭纖蟲屬DNA獲得，所述引物或探針與SEQ ID No. I的DNA雜交。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任意一項(xiàng)所述的嵌合基因，其特征在于，其編碼包含SEQIDNo. 4從第2位氨基酸至第382位氨基酸的氨基酸序列的HPH)蛋白質(zhì)，或者與SEQ ID No. 4從第2位氨基酸至第382位氨基酸的氨基酸序列具有至少75%序列同一性的蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任意一項(xiàng)所述的嵌合基因，其特征在于，其編碼HPH)蛋白質(zhì)序列，并且包含SEQ ID No. 3從第400位核苷酸至第1542位核苷酸的核苷酸序列，或者是在嚴(yán)格雜交條件下與此類序列雜交的DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任意一項(xiàng)所述的嵌合基因，其特征在于，其在HPH)編碼序列的下游包含編碼在植物中具有活性的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的核酸序列，使得轉(zhuǎn)運(yùn)肽/HPro融合蛋白被所述嵌合基因編碼。
7.包含根據(jù)權(quán)利要求I至6中任意一項(xiàng)所述的至少一種嵌合基因的載體。
8.植物細(xì)胞、植物部分、植物或種子，其特征在于其包含根據(jù)權(quán)利要求I至7中任意一項(xiàng)所述的嵌合基因。
9.權(quán)利要求8的植物細(xì)胞、植物部分、植物或種子，其還包含編碼PDH酶的嵌合基因。
10.權(quán)利要求8或9的植物細(xì)胞、植物部分、植物或種子，其還包含賦予對(duì)生長(zhǎng)調(diào)控因子，優(yōu)選對(duì)2，4-D或麥草畏，和/或?qū)σ种埔阴Ｈ樗岷厦?ALS)、EPSP合酶(EPSPS)和/或谷氨酰胺合酶(GS)的除草劑的耐受性的一種或多種嵌合基因。
11.獲得對(duì)HPH)抑制劑型除草劑耐受的植物的方法，其特征在于，將根據(jù)權(quán)利要求I至6之一的嵌合基因引入所述植物。
12.用于在區(qū)域或田間控制雜草的方法，所述區(qū)域或田間含有根據(jù)權(quán)利要求8、9或10的植物或種子，或者待栽種權(quán)利要求8、9或10的植物或種子，所述方法包括向所述區(qū)域或田間應(yīng)用對(duì)所述雜草來(lái)說(shuō)是毒性的劑量的HPH)抑制劑型除草劑，并且不顯著影響根據(jù)權(quán)利要求8、9或10的種子或植物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用于控制雜草的方法，其特征在于，所述HPH)抑制劑選自異^氟草、環(huán)磺酮、甲基磺草酮、磺草酮、pyrasulfotole、苯吡唑草酮、2-氰基-3-環(huán)丙基 _1_ (2_S02CH3_4_CF3 苯基)丙 _1，3_ _■麗和 2_ 氛基 _3_ 環(huán)丙基-I- (2_S02CH3_4_2，3 Cl2苯基)丙-I，3- 二酮、bicyclopyrone、雙環(huán)磺草酮、莊無(wú)忌、二酮腈和節(jié)草唑。
14.用于獲得油或膳食的方法，所述方法包括種植根據(jù)權(quán)利要求8、9或10的植物，任選地，用HPH)抑制劑型除草劑處理此類植物，收獲種粒，以及碾磨種粒，以制造膳食，以及任選地，提取油。
15.赭纖蟲屬HPro或者與赭纖蟲屬HPro具有至少75%序列同一性的HPro用于使得植物對(duì)HPro抑制劑型除草劑耐受的用途。
16.權(quán)利要求15的用途，其中所述HPro抑制劑型除草劑選自異1*1氟草、環(huán)磺酮、甲基橫草麗、橫草麗、pyrasulfotole、苯卩比唑草麗、2_氛基-3-環(huán)丙基-I-(2-S02CH3-4_CF3苯基)丙-1，3- 二麗和 2_ 氛基-3-環(huán)丙基-I-(2-S02CH3-4_2，3 Cl2 苯基)丙-1，3- 二麗、 bicyclopyrone、雙環(huán)磺草酮、莊無(wú)忌、二酮腈和節(jié)草唑。
全文摘要
本發(fā)明涉及編碼從屬于赭纖蟲科的原生生物獲得的羥苯基丙酮酸雙加氧酶(EC 1.13.11.27，本文中縮寫為HPPD)的核酸序列以及由其編碼的蛋白，還涉及包含此類核酸序列的嵌合基因，還涉及此類核酸序列、蛋白或嵌合基因用于獲得對(duì)HPPD抑制劑型除草劑耐受的植物的用途。
文檔編號(hào)C12N9/02GK102770531SQ201080064559
公開日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月23日
發(fā)明者A·舒爾茨, B·拉博爾, F·波雷, G·朗格, N·克尼特爾-奧特勒本, R·海因 申請(qǐng)人:拜爾知識(shí)產(chǎn)權(quán)有限公司