專利名稱：用于在植物中增強(qiáng)種子特異性基因表達(dá)而促進(jìn)增強(qiáng)的多不飽和脂肪酸合成的調(diào)節(jié)性核酸分子的制作方法
用于在植物中增強(qiáng)種子特異性基因表達(dá)而促進(jìn)增強(qiáng)的多不飽和脂肪酸合成的調(diào)節(jié)性核酸分子本發(fā)明原則上涉及脂肪酸的重組生產(chǎn)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了新核酸分子，其包含編碼脂肪酸去飽和酶、延伸酶、?；D(zhuǎn)移酶的核酸序列、與所述核酸序列有效連接的終止子序列和高表達(dá)的種子特異性啟動(dòng)子，其中增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)與所述啟動(dòng)子功能性連接。本發(fā)明還提供了含有所述核酸分子的重組表達(dá)載體、已經(jīng)導(dǎo)入該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，和用于大規(guī)模生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFAs)例如花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)或二十ニ碳六烯酸(DHA)的方法。發(fā)明描述轉(zhuǎn)基因在植物中的表達(dá)強(qiáng)烈地受多種外部及內(nèi)部因素影響，從而導(dǎo)致變動(dòng)和不可預(yù)測(cè)水平的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。經(jīng)常不得不產(chǎn)生大量的轉(zhuǎn)化體并進(jìn)行分析，以鑒定具有合乎需要的表達(dá)強(qiáng)度的株系。由于轉(zhuǎn)化并篩選表達(dá)強(qiáng)度合乎需要的株系是昂貴和耗費(fèi)人力的，故需要ー個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因在植物中高表達(dá)。當(dāng)不得不在轉(zhuǎn)基因植物中協(xié)調(diào)表達(dá)幾個(gè)基因以實(shí)現(xiàn)特定效應(yīng)吋，鑒于必須鑒定其中每個(gè)基因均強(qiáng)烈表達(dá)的植物，這個(gè)問題尤其突出。例如，取決于構(gòu)建體設(shè)計(jì)和各個(gè)轉(zhuǎn)化事件中T-DNA插入基因座的位置效應(yīng)，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可以顯著地變動(dòng)。強(qiáng)啟動(dòng)子可以部分地克服這些難題。然而，顯示強(qiáng)烈表達(dá)同時(shí)特異性合乎需要的合適啟動(dòng)子的可獲得性經(jīng)常有限。為了確?？色@得具有合乎需要的表達(dá)特異性的充足啟動(dòng)子，額外啟動(dòng)子的鑒定和表征可能有助于彌合這種缺ロ。然而，具有相應(yīng)特異性和強(qiáng)度的啟動(dòng)子的天然可獲得性和費(fèi)時(shí)的候選啟動(dòng)子表征阻礙了合適的新啟動(dòng)子的鑒定。為了克服這些難題，已經(jīng)顯示多祥的遺傳元件和/或基序積極地影響基因表達(dá)。 在它們當(dāng)中，已經(jīng)認(rèn)可ー些內(nèi)含子作為具有改善基因表達(dá)的強(qiáng)大潛能的遺傳元件。雖然機(jī)制大多未知，但是已經(jīng)顯示ー些內(nèi)含子積極地影響成熟mRNA的穩(wěn)態(tài)量，這可能通過增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性、改善的mRNA成熟、增強(qiáng)的胞核mRNA輸出和/或改善的翻譯起始來影響(例如 Huang和Gorman，1990 ；Le Hir等人，2003 ；Nott等人，2004)。由于顯示僅所選的內(nèi)含子增加表達(dá)，故剪接本身很可能解釋不了觀察到的效果。將內(nèi)含子與啟動(dòng)子功能性連接時(shí)觀察到的基因表達(dá)增加稱作內(nèi)含子介導(dǎo)的基因表達(dá)增強(qiáng)(IME)并且已經(jīng)在多種單子葉植物(例如Callis等人，1987 ；Vasil等人，1989 ； Bruce等人，1990 ；Lu等人，2008)和雙子葉植物(例如Chung等人，2006 ；Kim等人，2006 ； Rose等人，2008)得到顯示。在這個(gè)方面，顯示內(nèi)含子相對(duì)于翻譯起始位點(diǎn)(ATG)的位置對(duì)于內(nèi)含子介導(dǎo)的基因表達(dá)增強(qiáng)至關(guān)重要(Rose等人，2004)。繼內(nèi)含子增強(qiáng)基因表達(dá)的潛能之后，顯示為數(shù)不多的內(nèi)含子還在植物中于其原有核苷酸環(huán)境下影響組織特異性。發(fā)現(xiàn)報(bào)道基因表達(dá)依賴于含有多達(dá)2個(gè)內(nèi)含子的基因組區(qū)域的存在(Sieburth等人，1997 ；Wang等人，2004)。也已經(jīng)報(bào)道5，UTR內(nèi)含子對(duì)啟動(dòng)子元件的恰當(dāng)功能性是重要的，這可能歸因于內(nèi)含子中存在的組織特異性基因控制元件(Fu等人，199 ;Fu等人，1995b ；Vitale等人，2003 ；Kim等人，2006)。然而，這些研究還顯示內(nèi)含
4子與異源啟動(dòng)子的組合可以對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)度和/或特異性產(chǎn)生強(qiáng)烈的不利影響(Vitale 等人，2003 ；Kim 等人，2006 ；W02006/003186、W02007/098042)。例如，組成型花椰菜花葉病毒CaMV35S強(qiáng)啟動(dòng)子因與芝麻％FAD25’ UTR內(nèi)含子組合而不利地影響表達(dá)(Kim等人， 2006)。與這些觀察結(jié)果相反，ー些文獻(xiàn)顯示通過IME增強(qiáng)核酸的表達(dá)而不影響相應(yīng)啟動(dòng)子的組織特異性(SchUnemarm等人，2004)。本領(lǐng)域中尚未顯示與異源啟動(dòng)子功能性連接時(shí)增強(qiáng)種子特異性表達(dá)的內(nèi)含子或NEENA。在本申請(qǐng)中，描述了與種子特異性啟動(dòng)子功能性連接時(shí)增強(qiáng)所述啟動(dòng)子的表達(dá)同時(shí)不影響其特異性的其他核酸分子。在本申請(qǐng)中將這些核酸分子描述為“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸” (NEENA)。內(nèi)含子具有從各自的前mRNA剪接下來的內(nèi)在特征。與其相反，本申請(qǐng)中即將陳述的核酸不必要一定包含于mRNA中，或如果存在于mRNA中，沒有必要一定從mRNA中剪接下來，以增強(qiáng)源自與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子的表達(dá)。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一實(shí)施方案涉及促進(jìn)多不飽和脂肪酸合成增強(qiáng)的多核苷酸，因此它通常涉及多不飽和脂肪酸的重組生產(chǎn)。脂肪酸是具有在眾多生物學(xué)過程中發(fā)揮基礎(chǔ)作用的長鏈烴側(cè)基團(tuán)的羧酸。脂肪酸在自然界中罕以游離形式存在，相反，以酯化形式作為脂類的主要組分出現(xiàn)。因此，脂類/ 脂肪酸是能量的來源(例如，氧化)。此外，脂類/脂肪酸是細(xì)胞膜的不可分割部分，并且因此對(duì)處理生物學(xué)或生物化學(xué)信息是必不可少的。脂肪酸可以分成兩類由碳單鍵形成的飽和脂肪酸和含有一個(gè)或多個(gè)處于順式構(gòu)型的碳雙鍵的不飽和脂肪酸。不飽和脂肪酸由屬于非血紅素-鐵酶類型的末端去飽和酶產(chǎn)生。這些酶的每ー種均是包括1種或2種其他蛋白質(zhì)即細(xì)胞色素沾和NADH-細(xì)胞色素b5 還原酶的電子傳遞系統(tǒng)的部分。細(xì)胞色素沾功能性也可以N端地與一種單ー蛋白的去飽和酶部分融合。具體而言，此類酶催化脂肪酸分子的碳原子間雙鍵的形成，例如，通過催化脂肪酸的氧依賴性脫氫(Sperling等人，200 。人和其他哺乳動(dòng)物具有有限范圍的為形成不飽和脂肪酸中特定雙鍵所需要的去飽和酶并且因而具有合成必需脂肪酸(例如，長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA))的有限能力。因而，人們不得不通過其膳食攝取某些脂肪酸。此類必需脂肪酸包括例如亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3)。相反，昆蟲、微生物和植物能夠合成種類多得多的不飽和脂肪酸及它們的衍生物。實(shí)際上，脂肪酸的生物合成是植物和微生物的ー項(xiàng)主要活動(dòng)。長鏈多不飽和脂肪酸(LCPUFA)如二十ニ碳六烯酸(DHA，22 6 (4，7，10，13，16， 19))是哺乳動(dòng)物中多種組織和細(xì)胞器(神經(jīng)、視網(wǎng)膜、腦和免疫細(xì)胞)的細(xì)胞膜的必需組分。例如，腦磷脂中超過30%的脂肪酸是22:6 (n-3)和20:4(n-6) (Crawford, Μ. Α.，等人，(1997)Am. J. Clin. Nutr. 66 1032S-1041S) 在視網(wǎng)膜中，DHA占據(jù)視桿外區(qū)(光受體細(xì)胞的光敏部分)多于60%的總脂肪酸(Giusto，N.M.，等人(2000) Prog. Lipid Res. 39 315-391)。臨床研究已經(jīng)顯示，DHA對(duì)嬰兒中腦的生長和發(fā)育和成人中正常腦功能的維持是重要的(Martinetz，Μ. (1992) J. Pediatr. 120 :S129_S138)。DHA 還顯著地影響參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的光受體功能、視紫紅質(zhì)激活和視桿與視錐發(fā)育(Giusto，N.M.，等人Q000) Prog. Lipid Res. 39 :315-391)。此外，還發(fā)現(xiàn)DHA對(duì)疾病如高血壓、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化、抑郁、血栓形成和癌癥的某些積極影響(Horrocks，L.A.和Yeo，Y.K. (1999)Pharmacol.Res. 40:211-215)。因此，脂肪酸的適宜膳食對(duì)人健康是重要的。因?yàn)榇祟愔舅岵荒鼙粙雰?、幼兒和老年人有效合成，故從膳食中充分?jǐn)z取這些脂肪酸對(duì)于這些個(gè)體是特別重要的 (Spector, Α. A. (1999)Lipids 34 :S1_S3)。目前，DHA的主要來源是來自魚類和藻類的油。魚油是這種脂肪酸的主要和傳統(tǒng)來源，然而，它通常因銷售它的時(shí)間被氧化。此外，魚油的供給量是高度不定的，尤其鑒于魚群正在縮減。另外，油的藻類來源因低產(chǎn)量和高提取成本而是昂貴的。EPA和ARA 二者均是Δ 5必需脂肪酸。它們形成人和動(dòng)物的獨(dú)特類型的食品和飼料組分。EPA屬于酰基鏈中具有5個(gè)雙鍵的η-3系列。EPA存在于海鮮中并且在來自北大西洋的多油魚類中豐富。ARA屬于具有4個(gè)雙鍵的η-6系列。與EPA中存在的那些性能相比，在ω-3位置缺少雙鍵賦予ARA不同的性能。從ARA產(chǎn)生的類花生酸類具有強(qiáng)烈的炎癥性能和血小板聚集性能，而源自EPA的那些類花生酸類具有抗炎性能和抗血小板聚集性能。ARA可以從ー些食物如肉、魚和蛋類獲得，但是其濃度低。γ -亞麻酸(GLA)是哺乳動(dòng)物中存在的另ー種必需脂肪酸。GLA是極長鏈η_6脂肪酸和多種活性分子的代謝中間體。在哺乳動(dòng)物中，長鏈多不飽和脂肪酸的形成受Δ6去飽和作用限速。許多生理學(xué)和病理學(xué)狀況如老化、應(yīng)激、糖尿病、濕疹和ー些感染已經(jīng)顯示抑制Δ 6去飽和步驟。此外，GLA因氧化和與某些疾病(例如癌癥或炎癥)相關(guān)的快速細(xì)胞分裂而易于分解代謝。因此，膳食補(bǔ)充GLA可以降低這些疾病的風(fēng)險(xiǎn)。臨床研究已經(jīng)顯示，膳食補(bǔ)充GLA在治療ー些病理學(xué)疾病如特應(yīng)性濕疹、經(jīng)前綜合征、糖尿病、高膽固醇血癥、炎性疾病和心血管疾病方面是有效的。對(duì)于DHA或?qū)τ贓PA/DHA的混合物，已經(jīng)顯示非常多的有益健康效果。DHA是ー種具有6個(gè)雙鍵的η-3極長鏈脂肪酸。雖然生物技術(shù)為生產(chǎn)特色的脂肪酸提供了有吸引力的途徑，但是現(xiàn)有技術(shù)不能提供用于大規(guī)模生產(chǎn)不飽和脂肪酸的高效手段。因此，需要產(chǎn)生不飽和脂肪酸如DHA、EPA和 ARA的改進(jìn)和高效方法。因而，本發(fā)明涉及多核苷酸，其包含a)編碼具有去飽和酶或延伸酶活性的多肽的至少ー個(gè)核酸序列；b)與所述核酸序列有效連接的至少ー個(gè)種子特異性和/或種子偏好性植物啟動(dòng)子；c)與所述核酸序列有效連接的至少ー個(gè)終止子序列，和d)與所述啟動(dòng)子功能性連接并且與所述啟動(dòng)子和與a)中定義的所述多肽為異源的一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，如根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語“多核苷酸”涉及包含核酸序列的多核苷酸，其中所述核酸序列編碼具有去飽和酶或延伸酶活性的多肽。優(yōu)選地，由本發(fā)明多核苷酸編碼的在植物中表達(dá)后具有去飽和酶或延伸酶活性的多肽應(yīng)當(dāng)能夠增加例如種子油或整個(gè)植物或其部分中PUFA并且尤其LCPUFA的量。與產(chǎn)生LCPUFA的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾葏?，這種增加優(yōu)選地是統(tǒng)計(jì)顯著的，其中所述轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锉磉_(dá)現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)的為 LCPUFA合成所需要的成套去飽和酶和延伸酶，但是不表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)法(包括例如Mudent t-檢驗(yàn))，確定ー種增加是否具有顯著性。更優(yōu)選地，所述增加是與所述對(duì)照相比，含有LCPUFA的甘油三酯的量増加至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或至少30%。優(yōu)選地，之前所指的LCPUFA是具有C-20或C-22脂肪酸主體(body)的多不飽和脂肪酸、更優(yōu)選地是ARA、EPA或DHA。在后續(xù)的實(shí)施例中描述用于測(cè)量之前提到的活性的合適測(cè)定法。如本文所用的術(shù)語“去飽和酶”或“延伸酶”指導(dǎo)入雙鍵至脂肪酸碳鏈中、優(yōu)選地至具有18、20或22碳脂肪酸分子中的去飽和酶或?qū)毳颂挤肿又林舅崽兼溨?、?yōu)選地至具有18、20或22碳脂肪酸分子中的延伸酶的活性。優(yōu)選的多核苷酸是這些多核苷酸，它們具有如SEQ ID NOs :95、96、97、98、99、100 或101中所示的核酸序列，編碼顯示去飽和酶或延伸酶活性的多肽(見表3)。其他優(yōu)選的多核苷酸是這些多核苷酸，它們具有如SEQ ID NOs :102或103中所示的核酸序列，編碼顯示去飽和酶或延伸酶活性的多肽(還見表4)，其中除表3中所列的多核苷酸之外，所述多核苷酸尤其還用于22:6n-3(DHA)的合成，即在油菜籽中合成。如本文中所意指的優(yōu)選的種子特異性啟動(dòng)子選自油菜籽蛋白、USP、Conlinin, SBP.Fae.Arc和LuPXR的啟動(dòng)子。如本文中所意指的其他最優(yōu)選的種子特異性啟動(dòng)子由如 SEQ ID NOs :25、26、27、28、四或30中所示的核酸序列編碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉用于使單向啟動(dòng)子變成雙向啟動(dòng)子的方法和使用啟動(dòng)子序列的互補(bǔ)物或反向互補(bǔ)物以產(chǎn)生與原始序列具有相同啟動(dòng)子特異性的啟動(dòng)子的方法。用于組成型及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的此類方法例如由 Xie 等人(2001) "Bidirectionalization of polar promoters in plants(植物中極性啟動(dòng)子的雙向化)”(Nature Biotechnology 19，第677-679頁)描述。作者描述了添加最小啟動(dòng)子至任意給定啟動(dòng)子的5’引發(fā)端足以在兩個(gè)方向獲得啟動(dòng)子控制表達(dá)，同時(shí)具有相同的啟動(dòng)子特異性。如下文描述的術(shù)語“NEENA”用于表述“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸”，所述核酸指這樣的序列和/或核酸分子，其是具有在與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子的控制下增強(qiáng)核酸表達(dá)的內(nèi)在特性的特定序列。因而，與要求保護(hù)的NEENA功能性連接的高表達(dá)啟動(dòng)子在互補(bǔ)或反向互補(bǔ)情況下是有功能的，并且因此所述NEENA在互補(bǔ)或反向互補(bǔ)情況下也是有功能的。原則上，NEENA可以與任意的啟動(dòng)子如組織特異性、誘導(dǎo)型、發(fā)育特異性或組成型啟動(dòng)子功能性連接。相應(yīng)的NEENA將導(dǎo)致在與ー種或多種NEENA功能性連接的相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的異源核酸的增強(qiáng)的種子特異性表達(dá)。增強(qiáng)除種子特異性啟動(dòng)子之外的啟動(dòng)子例如組成型啟動(dòng)子或具有不同組織特異性的啟動(dòng)子的表達(dá)將影響這些啟動(dòng)子的特異性。核酸在相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的表達(dá)將在種子中顯著增加，在所述種子中，在NEENA未與其啟動(dòng)子功能性連接的情況下，本來不可以檢測(cè)到或僅微弱地檢測(cè)到所述核酸的轉(zhuǎn)錄物。因此，組織特異性或發(fā)育特異性啟動(dòng)子或任意其他啟動(dòng)子可以通過將ー種或多種如上文所述的NEENA 分子與所述啟動(dòng)子功能性連接而變成種子特異性啟動(dòng)子。就本發(fā)明而言，優(yōu)選的NEENA由 SEQ ID NOs :11、12、13、14、15、16、17、18、19、10、21、22、23 或 24 中所示的序列編碼。就本發(fā)明而言，更優(yōu)選的NEENA由SEQ ID NOs :6、7、8、9或10中所示的序列編碼。另外，本發(fā)明包括(i)具有下述序列的核酸分子，所述序列與如SEQ ID NO :6至M定義的任一序列具有80%或更大的同一性，優(yōu)選地，該同一性是85%或更大，該同一性更優(yōu)選地是90%或更大，該同一性甚至更優(yōu)選地是95%或更大、96%或更大、97%或更大、98%或更大或99% 或更大，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該同一性相對(duì)于如SEQ ID NO :6至M所定義的任一序列是100%，或者(ii)具有i)或ii)的核酸分子的100個(gè)或更多連續(xù)堿基、優(yōu)選地150個(gè)或更多連續(xù)堿基、更優(yōu)選地200個(gè)或更多連續(xù)堿基、或甚至更優(yōu)選地250個(gè)或更多連續(xù)堿基的片段，所述片段具有如具備SEQ ID NO :6至M所定義的任一序列的相應(yīng)核酸分子那樣的增強(qiáng)表達(dá)活性，例如65%或更大、優(yōu)選地70%或更大、更優(yōu)選地75%或更大，甚至更優(yōu)選地 80%或更大、85%或更大或90%或更大的增強(qiáng)表達(dá)活性，在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，該片段具有95%或更大的增強(qiáng)表達(dá)活性，或者iii)作為前文在i)至ii)下提及的核酸分子中任一者的互補(bǔ)物或反向互補(bǔ)物的核酸分子，或者iv)使用如表6中所示的寡核苷酸引物，通過 PCR可獲得的核酸分子，或者ν)具有100個(gè)或更多核苷酸、150個(gè)或更多核苷酸、200個(gè)或更多核苷酸或250個(gè)或更多核苷酸的核酸分子，所述核酸分子在等同于在50°C于7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.5M NaP04、l mM EDTA 雜交，以及在 50°C或 65°C、優(yōu)選地 65°C于 2 X SSC、 0. 1% SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO 6至M描述的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少50個(gè)、優(yōu)選地至少100、更優(yōu)選地至少150、甚至更優(yōu)選地至少200、最優(yōu)選地至少250個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子雜交。優(yōu)選地，所述核酸分子在等同于在50°C于 % 十二烷基硫酸鈉(SDQ、0. 5Μ NaP04、lmM EDTA雜交，以及在50°C或65°C、優(yōu)選地65°C于IX SSC、0. 1% SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO :6至M描述的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少50個(gè)、優(yōu)選地至少100、更優(yōu)選地至少150、甚至更優(yōu)選地至少200、最優(yōu)選地至少250個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子雜交；更優(yōu)選地，所述核酸分子在等同于在50°C于 7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaP04、lmM EDTA雜交，以及在50°C或65°C、優(yōu)選地65°C于
0.IX SSC、0. 1% SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO :1至15描述的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列或其互補(bǔ)物的至少50個(gè)、優(yōu)選地至少100個(gè)、更優(yōu)選地至少150個(gè)、甚至更優(yōu)選地至少200個(gè)、最優(yōu)選地至少250個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子雜交。如以上在iv)下所述，使用如表6中所示的寡核苷酸，通過PCR可獲得的核酸分子是例如使用如下文實(shí)施例3. 2中所述的條件，從來自擬南芥屬(Arabidopsis)植物如擬南芥(A. thaiiana)的基因組DNA中可獲得的。優(yōu)選地，ー個(gè)或多個(gè)NEENA與種子特異性啟動(dòng)子功能性連接并且將增強(qiáng)在所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子的表達(dá)。待用于本發(fā)明任意方法中的種子特異性啟動(dòng)子可以源自植物例如單子葉或雙子葉植物、源自細(xì)菌和/或病毒或可以是合成性啟動(dòng)子。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與NEENA功能性連接的待使用的種子特異性啟動(dòng)子是與表5的SEQ ID NOs
1、2、3、4或5中所示NEENA連接的種子特異性啟動(dòng)子。與NEENA功能性連接的高表達(dá)性種子特異性啟動(dòng)子可以用于任意植物中，所述植物包括例如苔蘚、蕨類、裸子植物或被子植物，例如單子葉或雙子葉植物。在ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與NEENA功能性連接的本發(fā)明所述啟動(dòng)子可以用于單子葉或雙子葉植物中，優(yōu)選地是作物植物如谷物、大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物、馬鈴薯、甜菜、稻、小麥、高粱、大麥、 芭蕉屬植物、甘蔗、芒屬植物等。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，與NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子可以用于單子葉作物植物如谷物、稻、小麥、高粱、大麥、芭蕉屬植物、芒屬植物或甘蔗中。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子可以用于雙子葉作物植物如大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物或馬鈴薯中。如本申請(qǐng)中所用的高表達(dá)的種子特異性啟動(dòng)子意指例如與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子，所述NEENA引起該啟動(dòng)子在植物種子或其部分中增強(qiáng)的種子特異性表達(dá)，其中源自功能性連接于NEENA的相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子的RNA積累或RNA合成速率高干，優(yōu)選地明顯高于由缺少本發(fā)明NEENA的相同啟動(dòng)子在種子中引起的表達(dá)。優(yōu)選地，與相同條件下培育的包含不與本發(fā)明NEENA功能性連接的相同種子特異性啟動(dòng)子的同齡對(duì)照植物相比，植物中相應(yīng)核酸的RNA的量和/或RNA合成速率和/或RNA穩(wěn)定性増加50%或更多，例如100%或更多、優(yōu)選地200%或更多、更優(yōu)選地5倍或更多、甚至更優(yōu)選地10倍或更多、最優(yōu)選地20倍或更多，例如50倍。在本文中使用吋，顯著更高指技術(shù)人員知曉如何確定的統(tǒng)計(jì)顯著性，例如通過對(duì)相應(yīng)的數(shù)據(jù)集合應(yīng)用統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)如t_檢驗(yàn)。用于檢測(cè)由啟動(dòng)子賦予的表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已經(jīng)的。例如，該啟動(dòng)子可以與標(biāo)記基因如GUS、GFP或螢光素酶基因功能性連接，并且可以在植物或其部分中測(cè)定由相應(yīng)標(biāo)記基因編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的活性。作為代表性實(shí)例，下文詳細(xì)描述用于檢測(cè)螢光素酶的方法。其他方法例如是通過本領(lǐng)域已知的方法，例如RNA印跡分析法、qPCR、連綴(rim-on)測(cè)定法或本領(lǐng)域所述的其他方法測(cè)量受該啟動(dòng)子控制的核酸分子的RNA穩(wěn)態(tài)水平或合成速率，或者使用特異性抗體通過本領(lǐng)域已知的方法例如蛋白質(zhì)印跡法和/或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)編碼的蛋白質(zhì)。技術(shù)人員知曉多種用于功能性連接兩個(gè)或多個(gè)核酸分子的方法。此類方法可以包括限制性切割/連接法、不依賴連接酶的克隆法、重組工程法、重組或合成法。其他方法可以用來功能性連接兩個(gè)或多個(gè)核酸分子。就核酸分子或DNA而言，術(shù)語“異源的”指這樣的核酸分子，所述核酸分子有效連接于或受到操作以變成有效連接于自然界中不與該核酸分子有效連接或自然界中與該核酸分子在不同位置有效連接的第二種核酸分子。例如，本發(fā)明的NEENA在其天然環(huán)境中與其天然啟動(dòng)子功能性連接，而在本發(fā)明中，它與可能源自相同生物、不同生物或可能是合成性啟動(dòng)子的另ー個(gè)啟動(dòng)子連接。它也可以意指本發(fā)明的NEENA與其天然啟動(dòng)子連接，但是處于所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子相對(duì)于包含其天然NEENA的啟動(dòng)子為異源。此外，應(yīng)當(dāng)理解，啟動(dòng)子和/或處在與本發(fā)明NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子相對(duì)于所述NEENA為異源，原因是它們的序列已經(jīng)受到例如突變?nèi)绮迦?、缺失等操作，從而啟?dòng)子和/或處在所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子的天然序列被修飾并且因此已經(jīng)相對(duì)于本發(fā)明的NEENA變成異源。也可以理解，當(dāng)NEENA與其天然啟動(dòng)子功能性連接，其中NEENA的位置相對(duì)于所述啟動(dòng)子改變，從而該啟動(dòng)子在這種操作后顯示更高表達(dá)時(shí)，該NEENA相對(duì)于功能性連接至NEENA的核酸為異源。如本文中所意指的顯示增強(qiáng)的核酸分子種子特異性表達(dá)的植物意指與相同條件下培育的沒有與相應(yīng)核酸分子功能性連接的相應(yīng)NEENA的對(duì)照植物相比，具有更高的、優(yōu)選地統(tǒng)計(jì)顯著更高的核酸分子種子特異性表達(dá)的植物。這種對(duì)照植物可以是野生型植物或是包含控制與本發(fā)明植物中相同的基因的相同啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述啟動(dòng)子不與本發(fā)明的NEENA連接。通常，NEENA可以相對(duì)于處在與NEENA功能性連接的所述啟動(dòng)子控制下的核酸分子為異源，或它可以相對(duì)于該啟動(dòng)子和處在該啟動(dòng)子控制下的核酸分子均為異源。如本發(fā)明所意指的術(shù)語“延伸酶活性”指如以下段落中所定義的完整延伸復(fù)合體的活性，并且還將該術(shù)語理解為具有β-酮酰輔酶A合酶活性的延伸復(fù)合體的第一組分的活性，所述酮酰輔酶A合酶活性決定完整延伸復(fù)合體的底物特異性。在將延伸酶活性僅理解為合酶活性的情況下，本發(fā)明的多肽還需要包括e)編碼具有β -酮酰還原酶活性的多肽的至少ー個(gè)核酸序列；f)編碼具有脫水酶活性的多肽的至少ー個(gè)核酸序列；或g)編碼具有烯酰輔酶A還原酶活性的多肽的至少ー個(gè)核酸序列，其中e)至g)中定義的核酸序列相對(duì)于具有去飽和酶或延伸酶活性的所述多肽為異源。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸包含編碼脂肪酸脫水酶_/烯酰輔酶A還原酶(nECR) 蛋白的核酸序列，所述nECR蛋白具有催化脂肪酸延伸的中間體脫水和還原的活性。脂肪酸延伸以下述4種酶代表的四個(gè)步驟催化形成完整延伸復(fù)合體的 KCR (β -keto-acyl-CoA-synthase, β -酮酰基輔酶 A 合酶)、KCR (β -keto-acyl-CoA reductase, β -酮?；o酶A還原酶)，DH(脫水酶)和ECR(烯酰輔酶A還原酶)。在第一步驟中，脂肪酸輔酶A酯與丙ニ酸單酰輔酶A縮合，產(chǎn)生由碳原子延長的β -酮?；o酶A 中間體和C02。該中間體的酮基隨后由KCR還原成羥基。在下一個(gè)步驟中，DH切去羥基(Η20 產(chǎn)生)，形成2-烯酰基輔酶A酷。在終末步驟中，在第2、3位置的雙鍵由ECR還原，形成延長的 t基輔酶 A 酉旨(Buchanan, Gruissem, Jones (2000) Biochemistry&Molecular biology of plants, American Society of Plant Physiologists)。DH 和 ECR 活性可能也由ー種単一蛋白賦予，其中所述單ー蛋白是DH部分和ECR部分的天然或人工融合物，在本發(fā)明中稱作新烯酰輔酶A還原酶(nECR)。在本發(fā)明中，e)至f)中所定義的全部核酸序列中的任一序列或e)至f)中所定義的這些核酸序列中僅至少ー個(gè)序列可以以不同生物中出現(xiàn)的任何組合包含于所述多核苷酸中。還包括包含任一前述核酸序列之片段的多核苷酸作為本發(fā)明的核酸分子。該片段應(yīng)當(dāng)編碼仍具有如上所述nECR活性的多肽。因而，所述多肽可以包含或由賦予所述生物學(xué)活性的本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)域組成。如本文中所意指的片段優(yōu)選地包含任一前述核酸序列的至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少250個(gè)或至少500個(gè)連續(xù)核苷酸或編碼這樣的氨基酸序列，其包含任一前述氨基酸序列的至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少20個(gè)、至少 30個(gè)、至少50個(gè)、至少80個(gè)、至少100個(gè)或至少150個(gè)連續(xù)氨基酸。上文所提及的變體核酸分子或片段優(yōu)選地編碼這樣的多肽，其保留至少10%、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %或至少90 %由所述核苷酸序列編碼的多肽所顯示的nECR活性。如根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語“多核苷酸”還涉及包含核酸序列的多核苷酸，其中所述核酸序列編碼具有?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。優(yōu)選地，由本發(fā)明多核苷酸編碼的在植物中表達(dá)后具有?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽應(yīng)當(dāng)能夠增加例如種子油或整個(gè)植物或其部分中PUFA 和尤其酯化成甘油三酯的LCPUFA的量。與產(chǎn)生LCPUFA的轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锵啾葏迹@種增加優(yōu)選地是統(tǒng)計(jì)顯著的，其中所述轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锉磉_(dá)了為LCPUFA合成所需要的最少成套去飽和酶和延伸酶，但是不表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。這種轉(zhuǎn)基因植物可以優(yōu)選地表達(dá)由 W02009/016202的實(shí)施例5表11中所列載體LJB765包含的去飽和酶和延伸酶或DHA合成所需要的相似成套去飽和酶和延伸酶?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)法(包括例如 Student t-檢驗(yàn))，確定ー種增加是否具有顯著性。更優(yōu)選地，所述增加是與所述對(duì)照相比， 含有LCPUFA的甘油三酯的量至少5 %、至少10 %、至少15 %、至少20 %或至少30 %的增加。優(yōu)選地，之前所指的LCPUFA是具有C-20、C-22或C-M脂肪酸主體的多不飽和脂肪酸、更優(yōu)選地是EPA或DHA、最優(yōu)選地是DHA。在后續(xù)的實(shí)施例中描述用于測(cè)量之前提到的活性的合適測(cè)定法?？梢酝ㄟ^多種天然來源以及人工來源獲得如上文所指的變體核酸分子。例如， 可以使用上文提到的具體核酸分子作為基礎(chǔ)，通過體外和體內(nèi)誘變方法獲得核酸分子。另外，作為同源物或直向同源物的核酸分子可以從多種動(dòng)物、植物或真菌物種獲得。優(yōu)選地， 它們從植物如藻類例如等鞭金藻(Isochrysis)、Mantoniella, Ostreococcus 或隱甲藻 (Crypthecodinium)、藻類 / 娃藻如揭指藻(Phaeodactylum)、海鏈藻(Thalassiosira)或破囊壺菌(Thraustochytrium)、笞蘇如小立碗蘇(Physcomitrella)或角齒蘇(Ceratodon) 或高等植物如報(bào)春花科(Primulaceae)如粉報(bào)春(Aleuritia)、Calendula stellata、 Osteospermum spinescens 或 Osteospermum hyoseroides、微生物如真菌如曲感偶 (Aspergillus)、疫霉屬(Phytophthora)、蟲霉屬(Entomophthora)、毛霉屬(Mucor)或被孢霉屬(Mortierella)、細(xì)菌如希瓦氏菌(Siewanella)、酵母或動(dòng)物獲得。優(yōu)選的動(dòng)物是線蟲如隱桿線蟲(Caenorhabditis)、昆蟲或脊椎動(dòng)物。在脊椎動(dòng)物當(dāng)中，該核酸分子可以優(yōu)選地源自真骨類(Euteleostomi)、輻鰭亞綱(Actinopterygii)；新鰭亞綱(Neopterygii)；真骨魚次亞綱(Teleostei)；真骨魚亞派(Euteleostei)、原棘鰭總目(Protacanthopterygii)、 鮭形目(Salmoniformes)；鮭科(Salmonidae)或太平洋鮭屬(Oncorhynchus)，更優(yōu)選地來自鮭形目，最優(yōu)選地，鮭科，如鮭屬(Salmo)，例如來自下述屬和物種虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、澳鱒CTrutta trutta)或河鱒(Salmo trutta fario)。另外，該核酸分子可以從硅藻如海鏈藻(Thallasiosira)或褐指藻(Phaeodactylum)獲得。因而，本發(fā)明還涉及包含至少ー個(gè)核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列編碼顯示去飽和酶、延伸酶或β -酮酰還原酶、脫水酶或烯酰輔酶A還原酶活性的上述多肽外，還編碼具有?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。因此，本發(fā)明的多核苷酸還包含至少ー個(gè)編碼具有酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的核酸序列，其中所述核酸序列相對(duì)于具有去飽和酶、延伸酶、β -酮酰還原酶、脫水酶或烯酰輔酶A還原酶活性的所述多肽為異源，并且其中至少ー個(gè)種子特異性植物啟動(dòng)子和至少ー個(gè)終止子序列與所述核酸序列有效連接，并且其中一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)分子與所述啟動(dòng)子功能性連接并相對(duì)于所述啟動(dòng)子為異源。如本文所用的術(shù)語“酰基轉(zhuǎn)移酶活性”或“?；D(zhuǎn)移酶”包括能夠通過轉(zhuǎn)酯過程將 PUFA和尤其LCPUFA從酰基輔酶A池或膜磷脂轉(zhuǎn)移至甘油三酯、從酰基輔酶A池轉(zhuǎn)移至膜脂類和從膜脂類轉(zhuǎn)移至?；o酶A池或者參與前述轉(zhuǎn)移過程的全部酶活性和酶。將理解，這種酰基轉(zhuǎn)移酶活性將導(dǎo)致例如種子油中酯化成甘油三酯的LCPUFA増加。特別地，構(gòu)思這些?；D(zhuǎn)移酶能夠產(chǎn)生具有酯化的EPA或甚至DHA的甘油三酷，或構(gòu)思這些?；D(zhuǎn)移酶能夠通過在酰基輔酶A池(延伸場(chǎng)所)和膜脂類(去飽和的主要場(chǎng)所)之間增加指向所需PUFA 的特定中間體的流量而增強(qiáng)所需PUFA的合成。具體而言，如本文所用的?；D(zhuǎn)移酶活性涉及溶血磷脂酰基轉(zhuǎn)移酶(LPLAT)活性、優(yōu)選地溶血磷脂酰膽堿酰基轉(zhuǎn)移酶(LPCAT)或溶血磷脂酰乙醇胺?；D(zhuǎn)移酶(LPEAT)活性、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAAT)活性、磷脂ニ酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(PDAT)活性、甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)活性或ニ酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)，并且更優(yōu)選地涉及PLAT、LPAAT, DGAT, PDAT或GPAT活性。編碼具有如上所述酰基轉(zhuǎn)移酶活性的多肽的多核苷酸可能例如從致病疫霉 (Phythophthora infestance)獲得。根據(jù)本發(fā)明，編碼具有如上所述去飽和酶或延伸酶活性的多肽的多核苷酸可能例如從破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium ssp.)獲得。存在于宿主細(xì)胞中的優(yōu)選?；D(zhuǎn)移酶是選自LPLAT、LPAAT, DGAT, PDAT和GPAT的至少ー種酶。尤其優(yōu)選以下LPLAT 來自秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)的LPLAT(Ce) (W02004076617)、來自 Mantoniella squamata 的 LPCAT(Ms)(W02006069936)和來自 Ostreococcus tauri 的 LPCAT(Ot) (W02006069936)、來自致病疫霉的 pLPLAT_01332 (Pi) (編碼多肽 SEQ-ID No. 125 的 SEQ-ID No. :104)、pLPLAT_01330 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. 126 的 SEQ-ID No. 105)、pLPLAT_07077 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :127 的 SEQ-ID No. :106)、LPLAT_18374(Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :128 的 SEQ-ID No. :107)、 pLPLAT_14816 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :129 的 SEQ-ID No. 108)、LPCAT_02075 (Pi) (編碼多肽 SEQ-ID No. 132 的 SEQ-ID No. :111)、pLPAAT_06638 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :133 的 SEQ-ID No. :112) ；LPAAT 來自高山被孢霉(Mortierella alpina) 的 LPAAT (Ma) 1. 1 (W02004087902)；來自高山被孢霉的 LPAAT (Ma) 1. 2 (W02004087902)、 來自致病疫霉的 LPAAT_13842 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. 130 的 SEQ-ID No. 109)、 pLPAAT_10763 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :131 的 SEQ-ID No. :110) ；DGAT 來自寇氏隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)的 DGAT2 (Ce) (W02004087902)、pDGATl_12278 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :134 的 SEQ-ID No. :113)、DGAT2_03074 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :135 的 SEQ-ID No. :114)、pDGAT2_08467 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :136 的 SEQ-ID No. :115)、 DGAT2_08470 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :137 的 SEQ-ID No. :116)、pDGAT2_03835_mod (Pi) (編碼多肽 SEQ-ID No. 138 的 SEQ-ID No. :117)、DGAT2_11677_mod(Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. 139 的 SEQ-ID No. :118)、DGAT2_08432_mod (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. 140 的 SEQ-ID No. :119)、pDGAT2_08431 (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :141 的 SEQ-ID No. :120)、DGAT_13152_mod (Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :142 的 SEQ-ID No. 121)、PDAT pPDAT_11965-mod(Pi)(編碼多肽 SEQ-ID No. :143 的 SEQ-ID No. :122)； 和 GPAT :pGPAT-PITG_18707 (編碼多肽 SEQ-ID No. :144 的 SEQ-ID No. :123)和 pGPAT-PITG_03371 (編碼多肽 SEQ-ID No. :145 的 SEQ-ID No. :124)。然而，可以鑒定來自其他物種的直向同源物、旁系同源物或其他同源物。優(yōu)選地，它們從植物如藻類例如等鞭金藻、Mantoniella、蠔球藻或隱甲藻、藻類/硅藻如褐指藻或海鏈藻或破囊壺菌、苔蘚如小立碗蘚或角齒蘚或高等植物如報(bào)春花科如粉報(bào)春)、 Calendula stellata、Osteospermum spinescens或Osteospermum hyoseroides、微生物如真菌如曲霉屬、疫霉屬、蟲霉屬、毛霉屬或被孢霉屬、細(xì)菌如希瓦氏菌、酵母或動(dòng)物獲得。優(yōu)選的動(dòng)物是線蟲如隱桿線蟲、昆蟲或脊椎動(dòng)物。在脊椎動(dòng)物當(dāng)中，該核酸分子可以優(yōu)選地源自真骨類、輻鰭亞綱；新鰭亞綱；真骨魚次亞綱；真骨魚亞派、原棘鰭總目、鮭形目；鮭科或太平洋鮭屬，更優(yōu)選地來自鮭形目，最優(yōu)選地，鮭科，如鮭屬，例如來自下述屬和物種虹鱒、 澳鱒或河鱒。另外，該核酸分子可以從硅藻如海鏈藻或褐指藻獲得。因而，如根據(jù)本發(fā)明使用的術(shù)語“多核苷酸”還包括前述具體多核苷酸的變體，其代表本發(fā)明多核苷酸的直向同源物、旁系同源物或其他同源物。另外，本發(fā)明多核苷酸變體還包括人工產(chǎn)生的突變蛋白。所述突變蛋白包括例如通過誘變技術(shù)產(chǎn)生并且顯示出改進(jìn)或改變的底物特異性的酶，或者由密碼子優(yōu)化的多核苷酸產(chǎn)生的酶。所述多核苷酸變體優(yōu)選地包含這樣的核酸序列，其特征在于所述序列可以由編碼具有氨基酸序列(即，對(duì)于?；D(zhuǎn)移酶，如 SEQ ID NOs :125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、 139、140、141、142、143、144或145任一者中所示的氨基酸序列)的多肽的多核苷酸，通過至少ー個(gè)核苷酸置換、添加和/或缺失，從 SEQ ID NOs :95、96、97、98、99、100、101、102、103、
104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、 123或IM任一者中所示的前述具體核酸序列衍生，因而所述變體核酸序列應(yīng)當(dāng)仍編碼具有如上所述的去飽和酶或延伸酶活性的多肽。變體還包括這樣的多核苷酸，其包含能夠與前述具體核酸序列雜交，優(yōu)選地在嚴(yán)格雜交條件下雜交的核酸序列。這些嚴(yán)格條件是技術(shù)人貝 ti知的并凡ロぷ以在 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, N. Y. (1989),6. 3. 1-6. 3. 6中找到。嚴(yán)格雜交條件的優(yōu)選實(shí)例是在6 X氯化鈉/檸檬酸鈉 (=SSC)中在大約45°C雜交，隨后ー個(gè)或多個(gè)在0. 2 X SSC, 0. 1 % SDS中在50至65°C的洗滌步驟的條件。技術(shù)人員知道這些雜交條件取決于核酸的類型而不同，并且例如有機(jī)溶劑存在時(shí)在溫度和緩沖液濃度方面不同。例如，在“標(biāo)準(zhǔn)雜交條件”下，溫度根據(jù)核酸的類型在42°C和58°C之間在濃度0. 1至5XSSC(pH 7. 2)的含水緩沖液中不同。若上文提及的緩沖液中存在有機(jī)溶剤，例如50%甲酰胺，則標(biāo)準(zhǔn)條件下的溫度是大約42°C。DNA:DNA雜交分子的雜交條件優(yōu)選地是0. 1 X SSC和200C至45°C，優(yōu)選地在30°C和45°C之間。DNA RNA 雜交分子的雜交條件優(yōu)選地是0. 1乂55(和30で至55で，優(yōu)選地在45で和55で之間。以上提及的雜交溫度是例如在甲酰胺不存在下對(duì)長度大約IOObp (=堿基對(duì))及G+C含量 50%的核酸所確定的。通過參考教科書如上文提到的教科書或以下教科書=Sambrook等人，"Molecular Cloning"，Cold Spring Harbor Laboratory，1989 ;Hames禾ロHiggins(編著)1985，“ Nucleic Acids Hybridization :A Practical Approach"，IRL Press at Oxford University Press, Oxford ；Brown (Ed.)1991, “ Essential Molecular Biology A Practical Approach"，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，技術(shù)人員知道如何確定所要求的雜交條件。備選地，多核苷酸變體是通過基于PCR的技術(shù)如基于混合寡核苷酸引物(即，使用針對(duì)本發(fā)明多肽保守結(jié)構(gòu)域的簡(jiǎn)并引物)的DNA擴(kuò)增法可獲得的。可以通過本發(fā)明多核苷酸的核酸序列或本發(fā)明多肽的氨基酸序列的序列比較鑒定本發(fā)明多肽的保守結(jié)構(gòu)域。在后續(xù)實(shí)施例中描述合適作為PCR引物的寡核苷酸以及合適的PCR 條件。作為模板，可以使用來自細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物的DNA或cDNA。另外，變體包括這樣的多核苷酸，所述多核苷酸包含與SEQ ID NOs :95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、
105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123或 124任一者中所示的核酸序列至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一的核酸序列， 優(yōu)選地編碼保留如上所述去飽和酶、延伸酶或?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽。另外，還包括這樣的多核苷酸，所述多核苷酸包含了編碼具有下述氨基酸序列的多肽的核酸序列，所述氨基酸序列與由 SEQ ID NOs :95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、 110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123 或 124 任一者中顯示的核酸序列所編碼的氨基酸序列(即，對(duì)于?；D(zhuǎn)移酶，如SEQ ID NOs :125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144 或 145 任一者中中所示的氨基酸序列)至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一，其中所述多肽優(yōu)選地
13保留如上所述去飽和酶、延伸酶或?；D(zhuǎn)移酶活性。優(yōu)選地在整個(gè)氨基酸或核酸序列區(qū)域內(nèi)計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)值。對(duì)于技術(shù)人員，一系列基于多種算法的程序可用于比較不同的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用已經(jīng)并入EMBOSS軟件包(EMBOSS 歐洲分子生物學(xué)開放軟件包(The European Molecular Biology Open Software Suite), Rice, P. , Longden, I.禾ロ Bleasby,A,Trends in Genetics 16 (6)，276-277，2000)中 Needle 程序內(nèi)的 Needleman 和 Wunsch 算法(Needleman 1970、J. Mol. Biol. (48) :444-453)，針對(duì)親緣遠(yuǎn)的相關(guān)蛋白質(zhì)使用BLOSUM 45或PAM250評(píng)分矩陣或針對(duì)親緣較近的相關(guān)蛋白質(zhì)使用BLOSUM 62或PAM160 評(píng)分矩陣以及空位開ロ罰分16、14、12、10、8、6或4和空位延伸罰分0. 5、1、2、3、4、5或6， 確定兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)?？梢栽趆ttp://emboss, sourceforge. net找到用于本地安裝EMBOSS軟件包的指南以及與TOB-krvices的鏈接。使用Needle程序用于比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列的參數(shù)的優(yōu)選、非限制性實(shí)例是默認(rèn)參數(shù)，包括EBL0SUM62評(píng)分矩陣、 空位開ロ罰分10和空位延伸罰分0.5。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用EMBOSS軟件包 (EMBOSS 歐洲分子生物學(xué)開放軟件包(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice, P.，Longden，I. ^P Bleasby, A, Trends in Genetics 16 (6)，276-277，2000) 中的Needle程序，使用EDNAFULL評(píng)分矩陣和空位開ロ罰分16、14、12、10、8、6或4和空位延伸罰分0.5、1、2、3、4、5或6，確定兩個(gè)核苷酸序列之間的同ー性百分?jǐn)?shù)。使用徹6(116程序聯(lián)合用于比對(duì)兩個(gè)氨基酸序列的參數(shù)的優(yōu)選、非限制性實(shí)例是默認(rèn)參數(shù)，包括EDNAFULL評(píng)分矩陣、空位開ロ罰分10和空位延伸罰分0.5?？梢赃M(jìn)一歩使用本發(fā)明的核酸序列和蛋白質(zhì)序列作為“查詢序列”以針對(duì)公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，以例如鑒定其他家族成員或相關(guān)序列。 此類檢索可以使用Altschul等人的BLAST系列程序(第2. 2版)(Altschul 1990，J. Mol. Biol. 215 :403-10)進(jìn)行。使用本發(fā)明核酸序列作為查詢序列的BLAST可以用BLASTn、 BLASTx或tBLASTx程序，使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行以獲得與本發(fā)明核酸序列編碼的序列同源的核苷酸序列(BLASTrutBLASTx)或氨基酸序列(BLASTx)。使用本發(fā)明核酸序列編碼的蛋白質(zhì)序列作為查詢序列的BLAST可以用BLASTp或tBLASTn程序，使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行以獲得與本發(fā)明序列同源的氨基酸序列(BLASTp)或核酸序列(tBLASTn)。為了出于比較目的獲得空位比對(duì)結(jié)果，如 Altschul 等人(Altschul 1997，Nucleic Acids Res. 25(17) :3389-3402)中所述，可以利用具有默認(rèn)參數(shù)的空位BLAST。以下框圖顯示多種BLAM程序的查詢序列和命中序列的序列類型的關(guān)系。
輸入查詢序列轉(zhuǎn)換的查詢算法轉(zhuǎn)換的命中實(shí)際數(shù)據(jù)庫DNABLASTnDNAPRTBLASTpPRTDNAPRTBLASTxPRTPRTtBLASTnPRTDNADNAPRTtBLASTxPRTDNA
還包括包含任一前述核酸序列之片段的多核苷酸作為本發(fā)明的多核苷酸。該片段應(yīng)當(dāng)編碼仍具有如上所述去飽和酶和延伸酶活性的多肽。因而，所述多肽可以包含或由賦予所述生物學(xué)活性的本發(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)域組成。如本文中所意指的片段優(yōu)選地包含任一前述核酸序列的至少50個(gè)、至少100個(gè)、至少250個(gè)或至少500個(gè)連續(xù)核苷酸或編碼這樣的氨基酸序列，其包含任一前述氨基酸序列的至少20個(gè)、至少30個(gè)、至少50個(gè)、至少80個(gè)、 至少100個(gè)或至少150個(gè)連續(xù)氨基酸。上文所提及的變體多核苷酸或片段優(yōu)選地編碼這樣的多肽，所述多肽明顯程度地保留去飽和酶或延伸酶活性，優(yōu)選地至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、 至少 60%、至少 70%、至少80%或至少90% 由 SEQ ID NOs :95、96、97、98、99、100、101、102、 103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、 122、123或IM任一者中所示的核酸序列編碼的任ー多肽(S卩，對(duì)于酰基轉(zhuǎn)移酶，如SEQ ID NOs 125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144或145任一者中所顯示的多肽)顯示出的去飽和酶和延伸酶活性。該活性可以如后續(xù)實(shí)施例中所述檢驗(yàn)。本發(fā)明的多核苷酸基本上由前述核酸序列組成或包含前述核酸序列。因而，它們也可以含有其他核酸序列。優(yōu)選地，除可讀框之外，本發(fā)明的多核苷酸可以還在編碼基因區(qū)的3’端和5’端包含非翻譯序列該編碼基因區(qū)5’末端上游的序列的至少500個(gè)、優(yōu)選地200個(gè)、更優(yōu)選地100個(gè)核苷酸和該編碼基因區(qū)3’末端下游的序列的至少100個(gè)、優(yōu)選地50個(gè)、更優(yōu)選地20個(gè)核苷酸。另外，本發(fā)明的多核苷酸可以編碼融合蛋白，其中該融合蛋白的ー個(gè)配偶體是由上文提及的核酸序列編碼的多肽。此類融合蛋白可以包含脂肪酸或 PUFA生物合成途徑的其他酶、用于監(jiān)測(cè)表達(dá)的多肽(例如，緑色、黃色、藍(lán)色或紅色熒光蛋白、堿性磷酸酶等)或可以充當(dāng)可檢測(cè)標(biāo)記或出于純化目的充當(dāng)輔助手段的所謂“標(biāo)簽”作為額外部分。用于不同目的的標(biāo)簽是本領(lǐng)域熟知的并且包括FLAG-標(biāo)簽、6個(gè)組氨酸的標(biāo)簽、MYC-標(biāo)簽等。本發(fā)明的多核苷酸應(yīng)當(dāng)優(yōu)選地作為分離的多核苷酸(即，純化或至少從其天然環(huán)境如其天然基因座中分離)或以基因修飾或外源(即人工)操作過的形式提供。例如，分離的多核苷酸可以包含在衍生該核酸分子的細(xì)胞的基因組DNA中天然分布于該核酸分子側(cè)翼少于大約51Λ、41Λ、31Λ、21Λ、11Λ、0. 51Λ或0. Ikb的核苷酸序列。該多核苷酸優(yōu)選地以雙鏈或單鏈分子的形式提供。應(yīng)當(dāng)理解，提到本發(fā)明的任一前述多核苷酸吋，本發(fā)明還指之前所指的具體序列或其變體的互補(bǔ)鏈或反向互補(bǔ)鏈。所述多核苷酸包括DNA (包括cDNA和基因組DNA)或RNA多核苷酸。然而，本發(fā)明還涉及源自本發(fā)明多核苷酸并且能夠干擾本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)錄或翻譯的多核苷酸變體。此類變體多核苷酸包括反義核酸、核酶、siRNA分子、嗎啉代核酸(磷酰ニ胺嗎啉代寡聚物)、形成寡核苷酸的三螺旋、抑制性寡核苷酸或微RNA分子，它們均應(yīng)當(dāng)因存在互補(bǔ)或基本上互補(bǔ)的序列而特異性識(shí)別本發(fā)明的多核苷酸。這些技術(shù)是技術(shù)人員熟知的。前述種類的合適變體多核苷酸可以基于本發(fā)明多核苷酸的結(jié)構(gòu)輕易地設(shè)計(jì)。另外，還包含化學(xué)修飾的多核苷酸，這包括天然存在的修飾的多核苷酸如糖基化或甲基化的多核苷酸或人工修飾的多核苷酸如生物素?；亩嗪塑账帷Ｔ诒景l(fā)明多核苷酸的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸還包含與所述核酸序列有效連接的表達(dá)控制序列。如本文所用的術(shù)語“表達(dá)控制序列”指能夠掌控即啟動(dòng)并控制目的核酸序列(在本文情況下，上文提及的序列)轉(zhuǎn)錄的核酸序列。這種序列通常包含啟動(dòng)子或啟動(dòng)子與增強(qiáng)子序列的組合或由其組成。多核苷酸的表達(dá)包括核酸分子的轉(zhuǎn)錄，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)錄成可翻譯的mRNA。額外的調(diào)節(jié)元件可以包括轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子以及翻譯增強(qiáng)子。以下啟動(dòng)子和表達(dá)控制序列可以優(yōu)選地在本發(fā)明的表達(dá)載體中使用。cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、 lpp-lac、laclq、T7、T5、T3、gal、trc、ara、SP6、λ -PR 或 λ -PL 啟動(dòng)子優(yōu)選地在革蘭氏陰性細(xì)菌中使用。對(duì)于革蘭氏陽性細(xì)菌，可以使用啟動(dòng)子amy和SP02。優(yōu)選地使用來自酵母的啟動(dòng)子或真菌啟動(dòng)子 ADCU AOXlr, GALU MFa、AC、P-60、CYCU GAPDH、TEF、rp28、 ADH0對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞或生物表達(dá)，優(yōu)選地使用啟動(dòng)子CMV-、SV40-、RSV-啟動(dòng)子(勞斯肉瘤病毒)、CMV-增強(qiáng)子、SV40-增強(qiáng)子。來自植物的啟動(dòng)子CaMV/35S(Franck 1980, Cell 21: 285-294]、PRPl (Ward 1993，Plant. Mol. Biol. 22)、SSU、OCS, lib4、usp、STLS1、B33、nos 或遍在蛋白或菜豆蛋白啟動(dòng)子。另外，在本上下文中優(yōu)選誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如ΕΡ-Α-0，388，186 Al (即，芐氨磺酰誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、Gatz 1992, Plant J. 2 :397-404(即，四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)、EPO 335S卩，脫落酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)或WO 93/21334 ( S卩，乙醇或環(huán)己醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子)中描述的啟動(dòng)子。其他的合適植物啟動(dòng)子是來自馬鈴薯的胞質(zhì)FBP酶啟動(dòng)子或 ST-LSI 啟動(dòng)子(Stockhaus 1989，EMBO J. 8，2445)、來自大豆(Glycine max)的磷酸核糖焦磷酸轉(zhuǎn)酰胺酶啟動(dòng)子(Genebank登錄號(hào)U87999)或EP0249676A1中所述的結(jié)節(jié)特異性啟動(dòng)子。特別優(yōu)選能夠在參與脂肪酸生物合成的組織中引起表達(dá)的啟動(dòng)子。另外，根據(jù)實(shí)踐，特別優(yōu)選種子特異性啟動(dòng)子，如USP啟動(dòng)子，及其他啟動(dòng)子如LeB4、DC3、菜豆蛋白或油菜籽蛋白啟動(dòng)子。進(jìn)ー步特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是可以用于單子葉或雙子葉植物并且在 US 5，608，152(來自菜籽油菜的油菜籽蛋白啟動(dòng)子)、WO 98/45461 (來自擬南芥屬植物的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子)、US5，504，200(來自菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白啟動(dòng)子)、 W091/13980(來自蕓苔屬(Brassica)植物的 Bce4 啟動(dòng)子)、由 Baeumlein 等人，Plant J.， 2,2,1992 :233-239(來自豆科植物的LEB4啟動(dòng)子)描述的種子特異性啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子適用于雙子葉植物。以下啟動(dòng)子適用于單子葉植物來自大麥的Ipt2-或Iptl-啟動(dòng)子(W0 95/15389和WO 95/23230)、來自大麥的大麥醇溶蛋白啟動(dòng)子和適用且在WO 99/16890中描述的其他啟動(dòng)子。原則上，可以將全部天然啟動(dòng)子連同它們的調(diào)節(jié)序列一起用于所述新方法。同樣，額外或単獨(dú)地使用合成性啟動(dòng)子是可能和有利的，尤其當(dāng)它們介導(dǎo)種子特異性表達(dá)時(shí)，例如，如WO 99/16890中所述。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，使用種子特異性啟動(dòng)子來增強(qiáng)目的PUFA或LCPUFA的產(chǎn)生。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用由SEQ ID NOs :25、 26,27,28,29或30任一者中所示的核酸序列編碼的啟動(dòng)子。術(shù)語“有效連接”意指將表達(dá)控制序列和目的核酸連接，從而所述目的核酸的表達(dá)可以由所述表達(dá)控制序列掌控，即，表達(dá)控制序列應(yīng)當(dāng)與所述待表達(dá)的核酸序列功能性連接。因而，所述表達(dá)控制序列和待表達(dá)的核酸序列可以彼此物理地連接，例如，通過將表達(dá)控制序列插在待表達(dá)核酸序列的5’末端。備選地，表達(dá)控制序列和待表達(dá)核酸可以是僅物理地接近，從而表達(dá)控制序列能夠掌控至少ー個(gè)目的核酸序列的表達(dá)。表達(dá)控制序列和待表達(dá)的核酸優(yōu)選地相隔不多于 500bp、300bp、100bp、80bp、60bp、40bp、20bp、10bp 或 5bp。在本發(fā)明多核苷酸的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述多核苷酸還包含與該核酸序列有效連接的終止子序列。優(yōu)選地，所用的終止子由SEQ ID NOs :36或37中所示的核苷酸序列編碼。更優(yōu)選地，所用的終止子由SEQ ID NOs :31、32、33、34或35中所示的核苷酸序列編碼。如本文所用的術(shù)語“終止子”指能夠終止轉(zhuǎn)錄的核酸序列。這些序列將導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄裝置從待轉(zhuǎn)錄的核酸序列解離。優(yōu)選地，終止子應(yīng)當(dāng)在植物中并且尤其在植物種子中有效。 合適的終止子是本領(lǐng)域已知的，并且優(yōu)選地包括在待表達(dá)核酸序列下游的多聚腺苷化信號(hào)如SV40多聚腺苷化位點(diǎn)或tk多聚腺苷化位點(diǎn)或在Loke等人(Loke (199 Plant Physiol 138，第1457-1468頁)中所示的植物特異性信號(hào)之一。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的載體。術(shù)語“載體”優(yōu)選地包括噬菌體、質(zhì)粒、病毒載體以及人工染色體，如細(xì)菌或酵母人 エ染色體。另外，該術(shù)語還涉及允許將定向構(gòu)建體隨機(jī)或位點(diǎn)定向地整合至基因組DNA中的定向構(gòu)建體。此類定向構(gòu)建體優(yōu)選地包含足夠長度的用于如下文詳述的同源或異源重組的DNA。包含本發(fā)明多核苷酸的載體優(yōu)選地還包含用于宿主中増殖和/或選擇的選擇標(biāo)記。 載體可以通過本領(lǐng)域熟知的多項(xiàng)技術(shù)并入宿主細(xì)胞中。如果被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，載體可以停留在細(xì)胞質(zhì)中或可以并入基因組中。在后一種情況下，可以理解載體可以進(jìn)一歩包含允許同源重組或異源插入的核酸序列。載體可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入原核或真核細(xì)胞中。如本上下文中所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”、接合和轉(zhuǎn)導(dǎo)，意圖包括用于將外來核酸分子(例如DNA)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的多種現(xiàn)有技術(shù)方法，包括磷酸鈣、氯化銣或氯化鈣共沉淀法、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、天然感受態(tài)法、碳基團(tuán)簇法(carbon-based cluster)、化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移法、電穿孔法或粒子轟擊法?？梢栽赟ambrook等人(Molecular Cloning :A Laboratory Manual.,祐 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，NY，1989)禾ロ在其他實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)如 Methods in Molecular Biology, 1995,第44卷，Agrobacterium protocols,編者Gartland 和Davey，Humana Press, Totowa, New Jersey中找到用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染包括植物細(xì)胞在內(nèi)的宿主細(xì)胞的合適方法。備選地，可以通過熱休克或電穿孔技術(shù)導(dǎo)入質(zhì)粒載體。如果載體是病毒，則在施加至宿主細(xì)胞之前，可以使用適宜包裝細(xì)胞系在體外包裝該載體。優(yōu)選地，本文提到的載體(VC-LJBXXX)適合用作克隆載體，即，在微生物系統(tǒng)中可復(fù)制。此類載體確保在細(xì)菌并且優(yōu)選地在酵母或真菌中高效克隆，并且使得植物的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化成為可能。那些必須提到的載體尤其是多種雙元和共整合載體系統(tǒng)，它們適用于 T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。通常，此類載體系統(tǒng)的特征在于，它們至少含有為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所需要的vir基因和界定T-DNA的序列(T-DNA邊界)。這些載體系統(tǒng)優(yōu)選地也包含其他順式調(diào)節(jié)區(qū)如啟動(dòng)子和終止子和/或可以借以鑒定適宜的已轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞或生物的選擇標(biāo)記。共整合載體系統(tǒng)使得vir基因和T-DNA序列安置在同一個(gè)載體上，而雙元系統(tǒng)基于至少兩個(gè)載體，其中之一攜帯vir基因，但無T-DNA，同時(shí)第二個(gè)載體攜帯T-DNA，但無vir基因。因而，最后提到的載體相對(duì)小，易于操作并且可以在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中均復(fù)制。這些雙元載體包括來自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的載體。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地使用 Binl9、ρΒΙΙΟΙ、pBinAR、pGPTV 和 pCAMBIA?？梢栽?Hellens 等人，Trends in Plant Science (2000) 5,446-451中找到對(duì)雙元載體及其用途的綜述。另外，通過使用適宜的克隆載體，可以將所述多核苷酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞生物如植物或動(dòng)物中并且因而用于植物的轉(zhuǎn)化，如在 Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press, Boca Raton, Florida), 第 6/7 早，第 71-119 頁(1993) ；F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ；弓I 自Transgenic Plants,朱 1 卷，Engineering and Utilization, Kung 禾ロ R. Wu 編著，Academic Press, 1993,15-38 ；B. Jenes等人，Techniques for Gene Transfer,弓| 自 Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering and Utilization,Kung 禾ロ R. Wu 編者，Academic Press(1993),128-143 ；Potrykus 1991, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205-225中發(fā)表和引用的那些載體。更優(yōu)選地，本發(fā)明的載體是表達(dá)載體。在這種表達(dá)載體中，即，包含本發(fā)明的多核苷酸的載體使得所述核酸序列與允許在原核或真核細(xì)胞或其分離的級(jí)分中表達(dá)的表達(dá)控制序列有效連接(也稱作“表達(dá)盒”)。合適的表達(dá)載體是本領(lǐng)域已知的，如Okayama-Berg cDNA ^ ii ic # pcDVl (Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNAU pcDNA3 (Invitrogene) pSPORTl (GIBC0 BRL)。常見的融合表達(dá)載體的其他實(shí)例是pGEX(Pharmacia Biotech Inc ；Smith 1988， Gene 67 :31-40)、pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA)禾ロ pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E-結(jié)合蛋白和蛋白A分別地與重組靶蛋白融合。合適的誘導(dǎo)型非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實(shí)例尤其是 pTrc(Amann 1988,Gene 69:301—315)禾ロ pET lld(Studier 1990, Methods in Enzymology 185,60-89)。pTrc載體的靶基因表達(dá)基于由宿主RNA聚合酶從雜合trp-lac融合啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。來自pET Ild載體的靶基因表達(dá)基于T7-gnl0-lac融合啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，這由共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7 gnl)介導(dǎo)。這種病毒聚合酶由宿主菌株BL21 (DE3)或HMS174 (DE3) 從原住性λ原噬菌體提供，其中所述原噬菌體攜帶處于lac UV 5啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄性控制下的 T7 gnl基因。技術(shù)人員熟悉其他在原核生物中適用的載體；這些載體例如是大腸桿菌中的 pLG338、pACYC184、pBR 系列如 pBR322、pUC 系列如 pUC18 或 pUC19、M113mp 系列、pKC30、 pR印4、pHSl、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-Bl、 λgtll 或pBdCl，鏈霉菌中的 pIJ101、pIJ364、pIJ702 或 pIJ361，芽孢桿菌屬中的 pUB110、pC194 或 pBD214，棒桿菌屬中的PSA77或pAJ667。用于釀酒酵母中表達(dá)的載體的實(shí)例包括pY印Secl(Baldari 1987，Embo J. 6 :229-234)、pMFa(Kurjanl982，Cell 30 :933-943)、pJRY88(Schultz 1987， Gene54 :113-123)和 pYES2 Qnvitrogen Corporation, San Diego, CA)。載體和用于構(gòu)建適用于其他真菌(如絲狀真菌)的載體的方法包括那些在van den Hondel, C. Α. Μ. J. J.， &Punt,P. J. (199丄ノ “Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi,弓I 自Applied Molecular Genetics of fungi, J. F. Peberdy 等人編著，第 1-28 頁，Cambridge University Press :Cambridge,或在More Gene Manipulations in Fungi (J. W. Bennett&L. L. Lasure 編著,第 396-428 頁=Academic Press :San Diego)中詳述的那些。其他的合適酵母載體是例如pAG-1、YEp6、YEp 13或pEMBLYe23。作為備選，可以使用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸?？捎糜谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如 Sf 9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白質(zhì)的桿狀病毒載體包括pAc系列(Smith 1983，Mol. Cell Biol. 3 2156-2165)和 ρVL 系列(Lucklowl989, Virology 170 :3ト39)。前述載體僅是對(duì)根據(jù)本發(fā)明待使用的載體的簡(jiǎn)略概述。其它載體是技術(shù)人員已知的，并且例如在 Cloning Vectors (Pouwels P. H.等人編著，Elsevier，Amsterdam—New York-Oxford, 1985, ISBN O 444 904018)中描述。對(duì)于原核和真核細(xì)胞合適的其它表達(dá)系統(tǒng)，見上文引用的Sambrook的第16和17章。與上文一致，所述載體優(yōu)選地是表達(dá)載體。更優(yōu)選地，本發(fā)明的所述多核苷酸處于本發(fā)明載體中種子特異性啟動(dòng)子的控制下。如本文中所意指的優(yōu)選的種子特異性啟動(dòng)子選自 Conlinin 1、Conlinin 2、油菜籽蛋白、LuFad3、USP、LeB4、Arc、Fae、ACP、LuPXR 和 SBP 的啟動(dòng)子。詳見例如US 2003-0159174。通過使用植物表達(dá)載體，可以在單細(xì)胞植物細(xì)胞(如藻類)(見hlciatore 1999， Marine Biotechnology 1 (3) :239-251及其中引用的參考資料)和來自高等植物的植物細(xì)胞(例如種子植物，如栽培作物)中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。植物表達(dá)載體的實(shí)例包括在本文或在Becker 1992, Plant Mol. Biol. 20 :1195-1197 ；Bevan 1984，Nucl. Acids Res. 12 8711-8721 ；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants,引自Transgenic Plants,弟 1 Engineering and Utilization, Kung 禾ロ R. Wu 編著，Academic Press, 1993,第 15-38 頁中詳細(xì)描述的那些植物表達(dá)載體。植物表達(dá)盒優(yōu)選地包含調(diào)節(jié)序列，例如多聚腺苷化信號(hào)，其中所述調(diào)節(jié)序列能夠控制植物細(xì)胞中基因表達(dá)并且被功能性連接，從而每種序列可以實(shí)現(xiàn)其功能，例如轉(zhuǎn)錄終止。優(yōu)選的多聚腺苷化信號(hào)是從根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) T-DNA 如 Ti 質(zhì)粒 pTiACH5 (Gielen 1984，EMBO J. 3,835)的稱作章魚堿合酶的基因3衍生的那些多腺苷化信號(hào)或它們的功能等同物，不過在植物中功能上有活性的全部其它終止子也是適用的。由于植物基因表達(dá)極經(jīng)常地不限于轉(zhuǎn)錄水平，故植物表達(dá)盒優(yōu)選地包含其他功能性連接的序列，如翻譯增強(qiáng)子，例如包含増加蛋白質(zhì)/RNA比率的煙草花葉病毒5，非翻譯前導(dǎo)序列的過度驅(qū)動(dòng)序列(Gallie 1987，Nucl. Acids Research 15: 8693-8711)。如上文所述，植物基因表達(dá)必須與合適的啟動(dòng)子功能性連接，其中所述啟動(dòng)子以時(shí)間、細(xì)胞特異性或組織特異性方式執(zhí)行基因的表達(dá)?？梢允褂玫膯?dòng)子是組成型啟動(dòng)子(Benfey 1989, EMBO J. 8 :2195-2202)，如源自植物病毒如;35S CAMV (Franck 1980, Cell 21 :285-294) U9S CaMV (見 US 5，352，605 和 WO 84/02913)的那些啟動(dòng)子，或植物啟動(dòng)子， 如在US 4，962,0 中描述的核酮糖ニ磷酸羧化酶-加氧酶小亞基啟動(dòng)子。用于植物基因表達(dá)盒中功能性連接的其他優(yōu)選序列是為引導(dǎo)基因產(chǎn)物至合適細(xì)胞區(qū)室內(nèi)所需要的導(dǎo)引序列(綜述，見 Kermode 1996, Crit. Rev. Plant Sci. 15(4) :285-423 及其中引用的參考文獻(xiàn))，所述細(xì)胞區(qū)室例如是液泡、細(xì)胞核、全部類型的質(zhì)體如淀粉體、葉綠體、色質(zhì)體、胞外空間、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、油體、過氧化物酶體和植物細(xì)胞的其它區(qū)室。如上文描述，植物基因表達(dá)也可以借助化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子促進(jìn)(綜述參見feitz 1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48 :89-108)。如果需要基因以時(shí)間特異性方式表達(dá)，化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是特別適用的。此類啟動(dòng)子的實(shí)例是水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(W0 95/19443)、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Watz 1992,Plant J. 2,397-404]和乙醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。其他合適的啟動(dòng)子是應(yīng)對(duì)生物脅迫或非生物脅迫條件的那些啟動(dòng)子，例如病原體誘導(dǎo)的PRPl基因啟動(dòng)子(Wardl993， Plant Mol. Biol. 22 :361-366)、來自番茄的熱誘導(dǎo)型 hsp80 啟動(dòng)子(US5, 187J67)、來自馬鈴薯的寒冷誘導(dǎo)型α-淀粉酶啟動(dòng)子(W0 96/12814)或傷ロ誘導(dǎo)型pinll啟動(dòng)子(EP 0375091A)。特別優(yōu)選的啟動(dòng)子是引起基因在其中發(fā)生脂肪酸、脂類和油生物合成的組織和器官中、在種子細(xì)胞如胚乳和正在發(fā)育的胚的細(xì)胞中表達(dá)的那些啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子是來自油籽油菜的油菜籽蛋白基因啟動(dòng)子(US 5，608，152)、來自蠶豆的USP啟動(dòng)子 (Baeumlein 1991, Mol. Gen. Genet. 225(3) :459-67)、來自擬南芥的油質(zhì)蛋白啟動(dòng)子(W098/4M61)、來自菜豆的菜豆蛋白啟動(dòng)子(US 5，504，200)、來自蕓苔屬植物的Bce4啟動(dòng)子(W0 91/13980)或豆科植物 B4 啟動(dòng)子(LeB4 ;Baeumlein 1992，Plant Journal, 2 (2) 233-239)和在單子葉植物如玉米、大麥、小麥、黒麥、稻等中引起種子特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。待予以考慮的合適啟動(dòng)子是來自大麥的lpt2或Iptl基因啟動(dòng)子(W0 95/15389和 W095/23230)或在WO 99/16890中描述的那些啟動(dòng)子(來自大麥的大麥醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麥的麥醇溶蛋白基因、小麥的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麥的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因、黒麥的裸麥醇溶蛋白基因中的啟動(dòng)子)。同樣，引起質(zhì)體特異性表達(dá)的啟動(dòng)子尤其是適用的，因?yàn)橘|(zhì)體是其中脂類生物合成的前體和一些終產(chǎn)物合成的區(qū)室。WO 95/16783和W097/06250中描述了合適的啟動(dòng)子如病毒RNA聚合酶啟動(dòng)子，并且W099/46394中描述了來自擬南芥屬植物的 clpP啟動(dòng)子。另外，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明多核苷酸或載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”還意指“宿主細(xì)胞培養(yǎng)物”。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞或植物細(xì)胞培養(yǎng)物，并且更優(yōu)選地是從油籽作物獲得的植物細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述油籽作物選自亞麻(亞麻屬物種(Linum sp.))、油籽油菜(蕓苔屬物種(Brassica sp.))、大豆(大豆屬物種(Glycine sp.))、向日葵(向日葵屬物種(Helianthus sp·))、棉花(棉屬物種(Gossypium sp.))、玉米(玉蜀黍)、橄欖(木犀欖屬物種(Olea sp·))、紅花(紅花屬物種(Carthamus sp·))、可可(可可樹(Theobroma cacoa))、花生(花生屬物種(Arachis sp.))、大麻、亞麻薺屬植物、兩節(jié)薺屬植物、油棕桐、 椰子、落花生、芝麻、蓖麻、雷斯克勒(lesquerella)、烏桕、牛油樹、油桐、木棉果、罌粟籽、霍霍巴籽和紫蘇。還優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞是微生物。更優(yōu)選地，所述微生物是細(xì)菌、真菌或藻類。更優(yōu)選地，它選自假絲酵母屬(Candida)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、油脂酵母屬 (Lipomyces)、紅冬孢酵母屬(lihodosporidium)、耶羅維亞酵母屬(Yarrowia)和裂殖壺菌厲(Schizochytrium)。另外，本發(fā)明的宿主細(xì)胞、宿主細(xì)胞培養(yǎng)物也可以是動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選地，所述動(dòng)物宿主細(xì)胞是魚宿主細(xì)胞或從其獲得的細(xì)胞系。更優(yōu)選地，魚宿主細(xì)胞是來自鯡魚、鮭魚、沙丁魚、紅鈾、鰻魚、鯉魚、鱒魚、比目魚、鮐魚、梭鱸或金槍魚。通常，在LCPUFA產(chǎn)生中(即長鏈不飽和脂肪酸生物合成途徑中)的控制性步驟受膜結(jié)合脂肪酸去飽和酶和延伸酶催化。植物和大部分的其他真核生物具有特化的去飽和酶和延伸酶系統(tǒng)用于導(dǎo)入雙鍵和延長脂肪酸超過C18原子。延伸酶反應(yīng)具有幾個(gè)與脂肪酸合酶復(fù)合體(FAS)共同的重要特征。然而，延伸酶復(fù)合體與FAS復(fù)合體不同在于延伸酶復(fù)合體位于細(xì)胞溶膠內(nèi)并且是膜結(jié)合的，ACP不參與，并且延伸酶3-酮酰基輔酶A合酶催化丙ニ 酸單酰輔酶A與?；锏目s合。延伸酶復(fù)合體由具有不同催化功能的4個(gè)組分組成酮?；厦?丙ニ酸單酰輔酶A至?；o酶A的縮合反應(yīng)，產(chǎn)生2C原子更長的酮?；o酶A脂肪酸)、酮?；€原酶(還原3-酮基團(tuán)成3-羥基)、脫水酶(脫水產(chǎn)生3-烯酰?；o酶A 脂肪酸)和烯酰輔酶A還原酶(還原在位置3的雙鍵，從該復(fù)合體釋放)。對(duì)于LCPUFA (包括ARA、EPA和/或DHA)的產(chǎn)生，除了去飽和反應(yīng)之外，延伸反應(yīng)也是必需的。高等植物沒有產(chǎn)生LCPUFA G個(gè)或更多雙鍵，20個(gè)或更多C原子)的必需酶組。因此，不得不將催化活
20性賦予植物或植物細(xì)胞。本發(fā)明的多核苷酸催化對(duì)形成ARA、EPA和/或DHA必需的去飽和活性及延伸活性。通過輸送新的去飽和酶和延伸酶，產(chǎn)生增加水平的PUFA和LCPUFA。
然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，根據(jù)宿主細(xì)胞，可以將另外的酶促活性賦予宿主細(xì)胞，例如通過重組技術(shù)賦予。因而，所述本發(fā)明優(yōu)選地構(gòu)思了這樣的宿主細(xì)胞，其中除本發(fā)明多核苷酸之外，如根據(jù)選擇的宿主細(xì)胞所需要，所述宿主細(xì)胞還包含編碼此類去飽和酶和/或延伸酶的多核苷酸。應(yīng)當(dāng)存在于該宿主細(xì)胞中的優(yōu)選去飽和酶和/或延伸酶是選自Δ-4-去飽和酶、Δ-5-去飽和酶、Δ-5-延伸酶、Δ-6-去飽和酶、Δ 12-去飽和酶、Δ 15-去飽和酶、ω 3-去飽和酶和Δ-6-延伸酶的至少ー種酶。尤其優(yōu)選的是來自卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)的雙功能 dl2dl5-去飽和酶 dl2dlOTes (Ac) (W02007042510)、來自麥角菌(Clavic^ps purpurea)的 dl2dlOTes (Cp) (W02008006202) 和來自霸王蓮花青螺(Lottia gigantea)的 dl2dlOTes (Lg) 1 (W02009016202)、來自金盞花(Calendula officinalis)的 dl2_ 去飽和酶 dl2Des (Co) (W0200185968)、來自雙色賭蘑(Laccaria bicolor)的 dl2Des (Lb) (W02009016202)、來自領(lǐng)鞭毛蟲(Monosiga brevicollis)的 dl2Des(Mb)(W02009016202)、來自禾生球腔菌(Mycosphaerella graminicola)的 dUDes OMg) _00901620幻、來自血紅叢赤殼(Nectria haematococca) 的 dl2Des(Nh)(W02009016202)> ^ 自 Ostreococcus Iucimarinus 的 dl2Des(01) (W02008040787)、來自布拉克須霉(Phycomyces blakesleeanus)的 dl2Des(Pb) (W02009016202)、來自大豆疫霉(Phytophthora sojae)的 dl2Des(Ps) (W02006100241) 和來自假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana)的 dl2Des(Tp) (W02006069710)、 來自 Helobdella robusta 的 dl5-去飽和酶 dlOTes(Hr) (W02009016202)、來自原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)的 dlOTes(Mc) (W02009016202)、來自纖細(xì)裸藻 (Euglena gracilis)的 dl5Des(Mf) (W02009016202)、來自禾生球腔菌的 dl5Des(Mg) (W02009016202)和來自血紅叢赤殼dlOTes (Nh) 2 (W02009016202)、來自纖細(xì)裸藻的d4_去飽和酶 d4Des (Eg) (W02004090123)、來自破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium sp.) 的 d4Des (Tc) (W02002026946)和來自假微型海鏈藻的 d4Des (Tp) (W02006069710)、來自 Ostreococcus Iucimarinus 的 d5-去飽和酶 dOTes (01) 2 (W02008040787)、來自展葉劍葉蘚(Physcomitrella patens)的 d5Des (Pp) (W02004057001)、來自三角褐指藻的 d5Des(Pt) (W02002057465)、來自破囊壺菌屬物種的 d5Des(Tc) (W02002026946)、來自假微型海鏈藻的dOTes(Tp) (W02006069710)和來自角齒蘚(Ceratodon purpureus)的 d6-去飽和酶 d6Des(Cp) (W02000075341)、來自 Ostreococcus Iucimarinus 的 d6Des(01) (W02008040787)、來自 Ostreococcus tauri 的 d6Des(0t) (W02006069710)、來自粉報(bào)春 (Primula farinosa)的 d6Des(Pf) (W02003072784)、來自畸雌腐霉(Pythium irregulare) 的 d6Des (Pir) _B0 (W02002026946)、來自畸雌腐霉的 d6Des (Pir) (W02002026946)、來自 Primula Iuteola 的 d6Des(Plu)(W02003072784)、來自展葉劍葉蘚的 d6Des(Pp) (W0200102591)、來自三角褐指藻的d6Des(Pt) (W02002057465)、來自高穗花報(bào)春 (Primula vialii)的 d6Des(Pv) (W02003072784)和來自假微型海鏈藻的 d6Des(Tp) (W02006069710)、來自卡氏棘阿米巴的d8_去飽和酶d8Des (Ac) (EP1790731)、來自纖細(xì)裸藻的 d8Des(Eg) (W0200034439)和來自海水派金蟲(Perkinsus marinus)的 d8Des(Pm) (W02007093776)、來自致病疫霉的o3_去飽和酶o3Des(Pi) (W02005083053)、來自畸雌腐霉的 o3Des (Pir) (W02008022963)、來 _ 畸雌腐霉的 o3Des (Pir) 2 (W02008022963)和來目大豆疫霉的 oSDesG^s) (W02006100241)、來自虹鱒(Oncorhynchus mykiss)的雙功能的 d5d6-延伸酶 d5d6Elo(0m)2(W02005012316)、來自金黃色破囊壺菌(Thraustochytrium aureum)的 d5d6Elo(Ta) (W02005012316)和來自破囊壺菌屬物種的 d5d6Elo(Tc) (W02005012316)、來自擬南芥的d5-延伸酶d5Elo (At) (W02005012316)、來自擬南芥的 d5Elo(At)2(W02005012316)、來自玻璃海鞘(Ciona intestinal is)的 d5Elo(Ci) (W02005012316)、來自 Ostreococcus Iucimarinus 的 d5Elo(01)(W02008040787)、來自 Ostreococcus tauri 的 d5Elo(0t) (W02005012316)、來自假微型海鏈藻的 d5Elo(Tp) (W02005012316)和 d5Elo(XI)來自非洲爪蟾(Xenopus laevis) (W02005012316)、來自 Ostreococcus Iucimarinus 的 d6-d6Elo (01) (W02008040787)、ま自 Ostreococcus
tauri 的 d6Elo(0t) (W02005012316)、來自致病疫霉的 d6Elo(Pi) (W02003064638)、來自畸雌腐霉的 d6Elo (Pir) (W02009016208)、來自展葉劍葉蘚的 d6Elo(Pp) (W02001059U8)、來自大豆疫霉的 d6Elo(Ps) (W02006100241)、來自大豆疫霉的 d6Elo (Ps) 2 (W02006100241)、 來自大豆疫霉的d6Elo (1^)3(102006100241)、來自三角褐指藻的d6Elo(Pt) (W02005012316)、來自破囊壺菌屬物種的d6Elo(Tc) (W02005012316)和來自假微型海鏈藻的 d6Elo(Tp)、(W02005012316)、來自球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的 d9_ 延伸酶 d9Elo(Ig) (W02002077213)、來自海水派金蟲的 d9Elo (Pm) (W02007093776)和來自米根霉 (Rhizopus oryzae)的d9Elo (Ro) (W02009016208)。特別地，如果構(gòu)思在高等植物中產(chǎn)生 ARA，則可以在宿主細(xì)胞中組合在下表3中提到的酶(即，額外地，d6-去飽和酶、d6-延伸酶、d5-延伸酶、d5-去飽和酶、dl2-去飽和酶和d6-延伸酶)或基本上具有相同活性的酶。 如果構(gòu)思在高等植物中產(chǎn)生EPA，則可以在宿主細(xì)胞中組合額外具有d6-去飽和酶、d6-延伸酶、d5-去飽和酶、dl2-去飽和酶、d6-延伸酶、ω 3_去飽和酶和dl5_去飽和酶活性的酶或基本上具有相同活性的酶。如果構(gòu)思在高等植物中產(chǎn)生DHA，則可以在宿主細(xì)胞中組合額外具有d6-去飽和酶、d6-延伸酶、d5-去飽和酶、dl2-去飽和酶、d6-延伸酶、ω 3_去飽和酶、dl5-去飽和酶、d5-延伸酶和d4-去飽和酶活性的酶或基本上具有相同活性的酶。本發(fā)明還涉及細(xì)胞，優(yōu)選地如上所述的宿主細(xì)胞或本文其他地方描述的非人生物的細(xì)胞，所述細(xì)胞包含通過點(diǎn)突變、截短、倒位、缺失、添加、置換和同源重組而從本發(fā)明多核苷酸中獲得的多核苷酸。如何對(duì)多核苷酸實(shí)施修飾是技術(shù)人員熟知的并且已經(jīng)本說明書的其他地方詳細(xì)描述。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于制造由本發(fā)明任ー種多核苷酸編碼的多肽的方法，其包括a)在允許產(chǎn)生所述多肽的條件下培育本發(fā)明的宿主細(xì)胞；和b)從步驟a)的宿主細(xì)胞獲得多肽。允許宿主細(xì)胞所包含的本發(fā)明多核苷酸表達(dá)的合適條件取決于該宿主細(xì)胞以及用于掌控所述多核苷酸表達(dá)的表達(dá)控制序列。這些條件和怎樣選擇它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員非常熟知的。表達(dá)的多肽可以例如通過全部常規(guī)純化技術(shù)獲得，包括親和層折、大小排阻層折、高壓液相色譜(HPLC)和沉淀技術(shù)(包括抗體沉淀法)。應(yīng)當(dāng)理解，所述方法可以-雖然是優(yōu)選的-不必然地產(chǎn)生基本上純的多肽制備物。應(yīng)當(dāng)理解，取決于用于前述方法的宿主細(xì)胞，由此產(chǎn)生的多肽可以被翻譯后修飾或加工。
本發(fā)明還包括由本發(fā)明多核苷酸編碼或通過前述方法可獲得的多肽。如本文所用的術(shù)語“多肽”包括基本上純化的多肽或額外包含其他蛋白質(zhì)的多肽制備物。另外，該術(shù)語還涉及至少部分地由上文所提及的本發(fā)明多核苷酸編碼的融合蛋白或多肽片段。另外，它包括化學(xué)修飾的多肽。此類修飾可以是人工修飾或天然存在的修飾如磷酸化、糖基化、肉豆蔻?；?綜述于Mann 2003，Nat. Biotechnol. 21，255-261中，以植物為重點(diǎn)的綜述，見Huber 2004, Curr. Opin. Plant Biol. 7，318-322)。目前，已知多于 300 種翻譯后修飾(見在 http://www. abrf. org/index. cfm/dm. home 的完整 ABFRC Delta mass名單)。本發(fā)明的多肽應(yīng)當(dāng)顯示上文所提及的去飽和酶或延伸酶活性。另外，本發(fā)明構(gòu)思了包含本發(fā)明多核苷酸或載體的非人轉(zhuǎn)基因生物。優(yōu)選地，所述非人轉(zhuǎn)基因生物是植物或植物部分。待用于導(dǎo)入本發(fā)明多核苷酸或載體的優(yōu)選植物是能夠合成脂肪酸的植物，如全部雙子葉或單子葉植物、藻類或苔蘚。應(yīng)當(dāng)理解，源自植物的宿主細(xì)胞也可以用于產(chǎn)生本發(fā)明的植物。優(yōu)選的植物部分是來自所述植物的種子。優(yōu)選的植物選自選自以下植物科Adelotheciaceae、漆樹科(Anacardiaceae)、 胃禾斗(Asteraceae)(Apiaceae)禾斗(Betulaceae)、IH禾斗(Boraginaceae)、+ 乎 ^jC 不4 (Brassicaceae)、鳳梨禾斗(Bromeliaceae)、畨木瓜禾斗(Caricaceae)、大淋禾斗 (しannabaceae)、萬寵イi不斗(しonvolvulaceae)、|禾斗(Cnenopodiaceae)、しrypthecodimaceae、 葫蘆科(Cucurbitaceae)、牛毛蘚科(Ditrichaceae)、胡頹子科(Elaeagnaceae)、杜鵑花科 (Ericaceae)、大卓: 禾斗(Euphorbiaceae)、丑科(Fabaceae)、姚牛兒苗禾斗(Geraniaceae)、木
(Gramineae) >uuglandaceae;(Lauraceae;(Leguminosae)
科(Linaceae)、綠枝藻綱O^rasinophyceae)、蔬菜植物和觀賞植物如萬壽菊?？梢蕴岬降膶?shí)例是選自以下的植物Adelotheciaceae，例如以下屬小立碗蘚屬(Physcomitrella), 和物種展葉劍葉蘚；漆樹科(Anacardiaceae)，例如以下屬黃連木屬(Pistacia)、芒果屬 (Mangifera)、腰果屬(Anacardium)，和物種阿月渾子(Pistacia vera) [pistachio], τ 果(Mangifer indica)[Mango」或腰果(Anacardium occidentale)[cashew]；菊禾斗 (Asteraceae)，例如以下屬金盞花屬(Calendula)、紅藍(lán)花屬(Carthamus)、矢車菊屬 (Centaurea)、菊 Ikノ禺(Cichorium) > 3 ill (Cynara)、|nj 曰葵屬(Helianthus)、離 IhJ 禹 (Lactuca)、新纈草屬(Locusta)、萬壽菊屬、纈草屬(Valeriana)，和物種金盞花 (Calenaula officinalis)[common marigold]、 紅花(Carthamus tinctorius) [saff lower]、矢車菊(Centaurea cyanus; [cornflower」、菊 fe (Cicnorium intybus) [chicory]、洋薊(Cynara scolymus)[球ぜU、artichoke)]、向日葵(Helianthus annus) [sunflower」、豸Ik (Lactuca sativa)、自皮ロ十"^lk (Lactuca crispa) > Lactuca escuienta、
1 ■や〒(Lactuca scario丄已 L· ssp· sativa)ヽしactuca scariola L. var. integrate、 ロ十 ^^禾中(Lactuca scariola L. var. integrifolia) > (Lactuca sativa subsp. romana)、萵苣繳畢(Valeriana locusta)[沙議菜]、杳葉萬壽菊(Tagetes lucida)、萬壽菊(Tagetes erecta)或細(xì)葉萬壽菊(Tagetes tenuifolia)[非洲或法國萬壽菊]；傘形科(Apiaceae)，例如以下屬胡蘿卜屬(Daucus)，和物種胡蘿卜(Daucus carota) [carrot]；樺木科(Betulaceae)，如例如以下屬榛屬(Corylus)，和物種歐洲榛 (Corylus aveliana)或土 J^f 其 fe (Corylus colurna; [hazelnut」；紫草禾斗 (Boraginaceae)，例如以下屬玻璃苣屬(Borago)，和物種玻璃苣(Borago officinalis)[borage]、十字花科，例如以下屬蕓苔屬(Brassica)、黑芥屬(Melmosinapis)、白芥屬 (Sinapis)、擬南芥屬(Arabidopsis)，和物種歐洲油菜(Brassica napus)、蕪青物種 (Brassica rapa ssp. ノ [米幸子 7 ]、里T 歐 I=I ブ f (Sinapis arvensis; λ ^Y M (Brassica junceaノ〒干(Brassica juncea var. juncea)、自皮ロ十:^3 (Brassica juncea var. crispifoliaノ、大口十(Brassica juncea var. foliosa) λΜ^Ρ (Brassica nigra) λM^f (Brassica sinapioides)、M ブ f (Melanosinapis communis)[芥米]、甘監(jiān)(Brassica oleracea)[飼用甜菜(fodder beet)]或擬南芥；鳳梨科，例如以下屬鳳梨屬(Armna)、 Bromelia(菠蘿)禾ロ物禾中鳳梨(Anana comosus)、Ananas ananas 或 Bromelia comosa[菠蘿]；番木瓜科，例如以下屬番木瓜屬(Carica)，和物種番木瓜(Carica papaya) [pawpaw]；大麻科(Cannabaceae)，例如以下屬大麻屬(Cannabis)，和物種大麻 (Cannaois sativa) [hemp」；方寵把不4 (Convolvulaceae)，例如以 fjh 番署) (Ipomea)、萬寵花屬(Convolvulus)，禾ロ 物種甘薯(Ipomoea batatus)、提琴葉牽?；?Ipomoea pandurata)、しonvolvuius oatatasΛ Convolvulus tiliaceus、 甘墓(Ipomoea iastigiataノ、 ipomoea tiliacea、 ニ 裂 ロ十暑(Ipomoea triloba)或しonvolvulus panduratus [甘著、sweet potato)、batate]；參不4 (Chenopodiaceae ノ，例如以 Γ*偶舌甘米偶 (Beta)，禾ロ物禾中甜菜(Beta vulgaris)、甜蘿卜(Beta vulgaris var. altissima)、甜菜原 $禾中(Beta vulgaris var. Vulgaris) Λ(Beta maritima)^MM (Beta
vulgaris var. perennis)、紅舌甘 ^ (Beta vulgaris var. conditiva)或 Beta vulgaris var. esculenta[舌甘采(sugar beet) ] ；Crypthecodini aceae,例如以下屬隱甲藻偶 (Crypthecodinium)，和物種寇氏隱甲藻；葫蘆科，例如以下屬南瓜屬(Cucurbita)，和物禾中尹瓜(Cucurbita maxima)、灰禾子 1 半J瓜(Cucurbita mixtaノ、西苦月/^" (Cucurbita pepo)或 T半Jノ氏(Cucuroita moschata) [pumpkin/squash」橋彎藻目(Cymbellaceae)，1列5ロ以^h 屬 雙眉藻屬(Amphora)、橋彎藻屬(Cymbella)、Okedenia、褐指藻屬(Phaeodactylum)、瑞氏藻屬(Reimeria)，禾ロ 物種三角揭 旨藻(Phaeodactylum tricornutum)；牛毛薛科 (Ditrichaceae)如以下屬牛毛蘚科Ditrichaceae、高地蘚屬(Astomiopsis)、角齒蘚屬 (Ceratodon) 、 Chrysobiastella、牛毛魚羊ノ禹(Ditrichum)、牛毛禱 j^、 Eccremidium、 Lophidion、澤蘚屬(Philibertiella)、叢毛蘚屬(Pleuridium)，石縫蘚屬(Saelania)、毛齒蘇 J禹(Tricnodon)、Skottsbergia,才ロ 物禾中Ceratodon antarcticus、Ceratodon coiumbiae、Ceratoaon heterophyllus、角齒薛(Ceratodon purpureus)、角 fef 蘇、 Ceratodon purpureus ssp. convolutus、Ceratodon、purpureus spp.stenocarpus、圓卩十角 W- (Ceratodon purpureus var. rotundifolius)、Ceratodon ratodon、^!角齒魚羊 (Ceratodon stenocarpus)、Chrysoblasteila chilensis、Ditrichum ambiguum、短兇牛毛蘚(Ditrichum brevisetum)、扭葉牛毛蘚(Ditrichum crispatissimum)、卷葉牛毛蘚 (Ditrichum difficile)、Ditrichum faicifolium、細(xì)牛 ^fe 魚羊(Ditricnum f lexicaule)、 Ditricnum giganteum、 牛毛薛(Ditrichum neteromallum)、Ditrichum lineare、 Ditricnum iineare、Ditrichum montanum、Ditrichum montanum、黃牛 ^iIp (Ditrichum pallidum)、Ditrichum punctulatum、細(xì)ロ十牛毛薛(Ditrichum pus ilium) Λ Ditrichum pusillum var. tortile、Ditrichum rhynchostegium、Ditrichum schimperi、Ditrichum tortile、對(duì)葉蘚(Distichiumcapillaceum)、小對(duì)葉蘚(Distichium hagenii)、斜蒴對(duì)葉蘚(Distichium inclinatum)、Distichium macounii、Eccremidium floridanum、Eccremidium whiteleggei、Lophidion strictus、尖葉叢毛蘚(Pleuridium acuminatum)、Pleuridium alternifolium、Pleuridium holdridgei、Pleuridium mexicanum、Pleuridium raveneliiΛ^ ^ (Pleuridium subulatum)、石縫鮮(Saelania glaucescens)、Trichodon borealis、Trichodon cylindricus 或 Trichodon cylindricus var. oblongus ；古月顏?zhàn)雍潭罚?例如以下屬胡頹子屬(Elaeagnus)，和物種油橄欖(Olea europaea)[橄欖]；杜鵑花科， 例如以下屬山月桂屬(Kalmia)，和物種寬葉山月桂(Kalmia latifolia)、窄葉山月桂 (Kalmia angustifolia)、小葉山月桂(Kalmia microphylla)、沼澤山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、し istus chamaerhodenaros 或 Kalmia Iucida[山月桂 (mountain laurel)]；大戟科，例如以下屬木薯屬(Manihot)、Janipha、麻瘋樹屬 (Jatropha)、茵麻屬(Ricinus)，禾ロ物禾中苦木暮(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatropha manihotΛManihot aipil、manihot dulcis、Maninot manihotΛManihot melanobasis、舌甘木薯(Manihot esculenta) [manihot]或蓖淋[castor-oil plant] ；S禾斗， 例如以下屬 .豌豆屬(Pisum)、合歡屬(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加屬(Inga). 涎樹屬(Pithecolobium)、金合歡屬(Acacia)、含羞草屬(Mimosa)、苜蓿屬(Medicago)、大豆屬(Glycine)、扁豆屬(Dolichos)、菜豆屬(Phaseolus)、野大豆亞屬(Soja)，和物種豌豆(Pisum sativum)、飼料豌豆(Pisum arvense)、早生矮婉豆(Pisum humileフ[豌豆]、 Albizia berteriana、合歡(Albizia julibrissin)、大口十合歡(AlDizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacia littoralis、Aloizia berteriana、Albizzia berteriana、 Cathormion berteriana、Feui 1 lea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizzia berteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea j ulibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda juliDrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、 Mimosa speciosa[silk tree]、紫花苜 fe (Medicago sativa)、野目猜(Medicago falcata)、雜父目宿(Medicago varia)[苜fe」、大S (Glycine max)、Dolichos soja、寬葉蔓 M (Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja nispida 或 Soja max[大豆]；葫蘆蘚科，如以下屬Aphmorrhegma、尖葉梨蒴蘚屬(Entosthodon)、葫蘆蘚屬 (Funaria)、立碗蘚屬(Physcomitrella)、立碗蘚屬(Physcomitrium)，禾ロ 物禾中 Apnanorrhegma serratum、 Entosthodon attenuatus、 Entosthodon boianaeri、 Entosthodon bonplandiιΛEntosthodon callfornicus、Entosthodon arummondii、 Entosthodon jamesonii、Entosthodon leibergii Λ Entosthodon neoscoticus、 Entosthodon rubrisetus、Entosthodon spathulifolius、Entosthodon tucsoni、Funaria americana、Funaria bolanderi、齒葉葫戸鮮(Funaria calcarea)、Funaria californica、 Funaria calvescens、Funaria convoluta、Funaria flavicans、Funaria groutiana、_/^" 鮮(Fnnaria hygrometrica)、Funaria hygrometrica var. arctica、Funaria hygrometrica var. calvescens、Funaria hygrometrica var. convoluta、Funaria hygrometrica var.muralιsΛ Funaria hygrometrica var.utahensis、Funaria microstoma λ Funaria microstoma var. obtusifolia、 剌邊葫戸 鮮(Funariamuhlenoergii) Λ Funaria orcuttii、Funaria plano—convexa、Funaria pol已ris、Funaria ravenel11Λ runaria rubriseta、Funaria serrata、Funaria sonoraeΛ runaria sublimbatus、Funaria tucsoni、小立碗薛カロ 禾Ij 禍尼亞亞禾中(Physcomitrella caiifornica)、展ロ十 ^lJ ロ十負(fù)華、Physcomitrella reaaeri、Physcomitrium australe、 Physcomitrium californicum、Physcomitrium collencnymatum ；^!牛ソL畝禾斗，M以 Γ 屬天竺葵屬(Pelargonium)、椰子屬(Cocos)、Oleum，和物種椰子(Cocos nucifera)、椰杳大竺葵(Pelargonium grossularioides;或 Oleum cocois [椰于」；木本禾斗 (Gramineae)，如例如以下屬甘蔗屬(Saccharum)，和物種甘蔗(Saccharum officinarum)；核桃科(Juglmdaceae)，例如以下屬核桃屬(Juglms)、Wallia，和物種 ^Ml (Jugians regia)、Juglans ailanthifolia、山核(Juglans sieboldianaノ、^c核相ヒ UUglans cmerea)、Wallia cinerea、 Juglans bixbyi、加州黑核(Juglans caiifornica)、印度黑 核杉匕(Juglans hindsii; > Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大核杉匕(juglans major; >Juglans microcarpa、黑核杉匕(Juglans nigra;或 Wallia nigra [walnut]；樟科如，例如以下屬鱷梨屬(Persea)、月桂屬(Laurus)，和物種 月不主(Laurus nobilis) [bay] > ^ (Persea americana> Persea gratissima gk, Persea persea)[鱷梨(avocado)]；豆科，例如以下屬落花生(Arachis hypogaea)，和物種落花生(Arachis hypogaea)[花生]；亞麻科,例如以下屬亞麻屬(Linum)、Adenolinum，和物禾中亞淋(linum usitatissimum)、linum humile、奧地禾亞淋(linum austriacumノ、Iinum bienne、窄葉亞麻(linum angustifolium)、肖亞并木(linum catharticum)、金黃亞麻 (linum flavumノ、大花亞淋(linum grandiflorum> Adenolinum grandiflorumノ、ヌIj易斯亞淋(linum 丄ewisii)、男β芳亞井木(linum narbonenseノ、宿ネ艮亞并木(linum perenneノ、ヌU易其Jf オ百ネ艮亞麻(linum perenne var. Iewisiiノヽlinum pratenseヽlinum trigynum[亞井木」；十ノ出菜科(Lythrarieae)，例如以下屬石榴屬(Punica)，和物種石榴(Punica granatum) [pomegranate]；錦葵科，例如以下屬棉屬(Gossypium)，和物種陸地棉(Gossypium hirsutum) 、 M ^ffl (Gossypium arboreum; > ￠) (Gossypium barbadense;、胃豐帛 (Gossypium herbaceum)或瑟イ白氏棉(Gossypium thurberi)[棉花」；地錢禾斗 (Marchantiaceae),例如以下屬地錢屬(Marchantia),禾口物種:Marchantia berteroana> Marchantia foliacea、Marchantia macropora 廠巴逢不斗(Musaceae),イ列以 r"ノ禹15蕉ノ禹 (Musa)，和物種香蕉、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa acuminata)、芭蕉屬物種 (Musa spp.)[香蕉]；柳葉菜科(Onagraceae)，例如以下屬Camissonia、月見草屬 (Oenothera；，禾ロ物禾甲月見草(Oenothera biennis 或 Camissonia brevipes)[樓草 (primose)、晚櫻草(evening primose)]；棕櫚科(Palmae)，例如以下屬油棕屬(Elacis)， 和物種油棕(Elaeis guineensis)[油棕櫚]；罌粟科(Papaveraceae)，如例如以下屬罌 ^M (ΡειρεινθΓ)，禾ロ 禾中: '!! (Papaver orientale)(Papaver rhoeas)
罌粟(Papaver dubium)[罌粟]；胡麻科(Pedaliaceae)，例如以下屬胡麻屬(Sesamum)， 和物種芝麻(Sesamum indicum)[芝麻]；胡椒科(Piperaceae)，例如以下屬胡椒屬 (Piper)、Artanthe,草胡椒屬(P 印 eromia)、Steffensia,和物種樹胡椒(Piper aduncum) >Piper amalago、ざ夾卩十古月(Piper angustifolium) >Piper auritum>^Bf (Piper betel)、畢澄茄(Piper cubeba)、蓽菝(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假蓽菝(Piper elongatu)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata [Cayenne pepper]；木本禾斗，例如以下屬大麥偶 (Hordeum)、黑麥屬(Secale)、燕麥屬(Avena)、高粱屬(Sorghum)、須芒草屬(Andropogon)、 絨毛草屬(Holcus)、黍?qū)?Panicum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍?qū)?Zea)、小麥屬(Triticum)，和物禾中大麥(Hordeum vulgare)、芒禾J^ 大麥草(Hordeum jubatum ノ、風(fēng)大麥(Horaeum murinum)、■麥狀大麥草(Hordeum secaiinum)、栽培ニ棱大麥(Hordeum disticnon)、ニ又大凌(Hordeum aegiceras)、栽 i, 7、牧大麥(Hordeum hexastichon)、栽培バ梭大凌 (Hordeum hexasticnum)、1て規(guī)貝 Ij 型大麥(Hordeum irregulare)、大麥(Hordeum sativum)、 漂麥狀大麥卓(Hordeum secalinum)[大麥」、漂麥(Secale cereale) [rye]、燕麥(Avena sativa)、里予燕麥(Avena fatua)、比贊燕麥(Avena byzantina)、里予燕麥原變禾中(Avena fatua var. sativa)、雜禾中里予燕麥(Avena hybrida)[燕麥]、兩色蜀條(Sorghum bicolor)、 yR ^ 1 5 (Sorghum halepense)、百甘高梁(Sorghum saccharatum;、高梁(Sorghum vulgare) 、Andropogon arummondiιΛ Holcus bicolor、 Holcus sorghum、 sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛爾 1 (Sorghum caffrorum) λ M ^^ (Sorghum cernuum)、舌甘高梁(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高梁草(Sorghum durraノ、Sorgnum guineense、Sorghum lanceolatum、多脈高梁草(Sorghum nervosum)、舌甘 1 (sorghum saccharatum)、Sorghum subglaorescens、sorghum verticilliflorum、1 梁(Sorghum vulgare)、石 # 高梁(HoIcus halepensis)、黍(Sorghum miliaceum)、稷 (Panicum militaceum)[谷子(millet)]、稻(Oryza sativa)、闊葉野生稻(Oryza latifolia)[稻]、玉蜀黍(Zea mays)[玉米]、普通小麥(Triticum aestivum)、硬粒小麥 (Triticum durum)、柱小麥(Triticum turgidum;、Triticum hybernum、馬卡小麥 ^riticum macha)、普通小麥(Triticum sativum 現(xiàn) Triticum vulgare)[小麥]；紫球藻禾斗 (Porphyridiaceae)，例如以下屬色盒藻屬(Chroothece)、Flintiella^ Petrovanella、紫球藻屬(Porphyridiumフ、小紅藻屬(Rhodella)、紅抱囊藻屬(Rhodosorusフ、Vanhoeffenia， 和物種紫球藻(Porphyridium cruentum)；山龍眼科(ftOteaceae)，例如以下屬澳洲堅(jiān)果屬(Macadamia)，和物種全緣葉澳洲堅(jiān)果(Macadamia intergrifolia) [macadamia]；綠色鞭毛藻綱(Prasinophyceae)，如以下屬腎藻屬(Nephroselmis)、Prasinococcus、 Scherffelia、扁藻屬(Tetraselmis)、Mantoniella、Ostreococcus)禾口物禾中梨形腎藻 (Nepnroselmis olivaceaノ、 Prasinococcus capsuiatus、 Scherifelia dubia、周氏扁藻 (Tetraselmis chui)、亞ンL·、形扁藻(Tetraselmis suecicaノ、 Mantoniella squamata、 Ostreococcus tauri ；茜草科(Rubiaceae)，例如以下屬和物種咖啡屬物種(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[咖啡]；玄參科びcrophulariaceae)，例如以下屬毛蕊花屬(Verbascum)，和物種毛瓣毛藍(lán)花(Verbascum blattaria)、南歐毛藍(lán)花(Verbascum chaixii)、密花毛藍(lán)把(Verbascum densifiorum)、Verbascum IagurusΛ 長葉毛藍(lán) 把(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、漂毛藍(lán)把(Verbascum nigrum)、奧林匹克毛減花 (Verbascum olympicum)、抱系毛癥花(VerDascum phlomoidesノ、紫花書盤花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum 或毛滅把(Verbascum thapsus) [mullein」；為卩禾斗 (Solanaceae)，例如以下屬辣椒屬(Capsicum)、煙草屬(Nicotiana)、茄屬(Solanum)、番茄屬(Lycopersicon)和物種紅辣椒(Capsicum annuum)、朝天椒(Cap sicum annuum var. glabriusculum)、小米椒(Capsicum frutescens)[辣椒]；辣椒[紅辣椒(paprika)]；普通 (Nicotiana tabacum) > 雙]0 胃(Nicotiana alata) > iff ロ十]0 胃(Nicotiana attenuate)、光畑卓(Nicotiana glauca)、郎氏煙草(Nicotiana langsdorffii)> Nicotiana obtusifolia、裂葉煙草(Nicotiana quadrivalvis)、淺波煙草(Nicotiana repanda)(Nicotiana rustica)(Nicotiana sylvestris) [
M [馬鈴署]；カロ子(Solanummelongena)[芳 ロ子]；番 (Lycopersicon esculentum)、番爺 (Lycopersicon lycopersicum)、5 形番安口 (Lycopersicon pyriformeノ、紅另ロ (Solanum integrifolium)或番カロ (Solanum Iycopersicumノ [番カトロ]；梧桐禾斗(Sterculiaceae)，例如以下屬可可屬(Theobroma)，和物種可可樹(Theobroma cacao)[可可]或山茶科 (Theaceae)，例如以下屬山茶屬(Camellia)，和物種大葉茶(Camellia sinensis)[茶]。 特別地，待用作本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選植物是包含大量脂類化合物的油料作物，如花生、 菜籽油菜、卡諾拉油菜、向日葵、紅花、罌粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄欖、芝麻、金盞花 (Calendula)、石榴(Pimica)、月見草、毛蕊花、薊、野玫瑰、榛、扁桃、澳洲堅(jiān)果、鱷梨、月桂屬植物、南瓜、亞麻、大豆、阿月渾子、玻璃苣、樹(油棕櫚、椰子、胡桃樹)或作物如玉米、小麥、 黒麥、燕麥、小黒麥、稻、大麥、棉屬植物、木薯、辣椒、萬壽菊、茄科植物如馬鈴薯、畑草、茄子和番茄、蠶豆屬物種、豌豆、苜蓿或灌叢植物(咖啡、可可、茶)、柳屬物種和多年生牧草和飼用作物。本發(fā)明的優(yōu)選植物是油料作物植物如花生、菜籽油菜、卡諾拉油菜、向日葵、紅花、 罌粟、芥菜、大麻、蓖麻、橄欖、金盞花、石榴、月見草、南瓜、亞麻、大豆、玻璃苣、樹(油棕桐、 椰子)。特別優(yōu)選的是向日葵、紅花、畑草、毛蕊花、芝麻、棉屬植物、南瓜、罌粟、月見草、胡桃、亞麻、大麻、薊或紅花。非常特別優(yōu)選的植物是植物如紅花、向日葵、罌粟、月見草、胡桃、 亞麻或大麻。優(yōu)選的苔蘚是小立碗蘚屬或角齒蘚屬植物。優(yōu)選的藻類是等鞭金藻、 Mantoniella, Ostreococcus或隱甲藻和藻類/硅藻如褐指藻或破囊壺菌。更優(yōu)選地，所述藻類或苔蘚選自:Emiliana、希瓦氏菌(Shewanella)、小立碗蘚屬(Physcomitrella)、 破襲壺菌(Thraustochytrium)、 嚴(yán)孢霉屬(Fusarium)、疫 Ip 屬(Phytophthoraフ、角齒 H 屬(Ceratodon)、 ！ 更 i ■ M (Isochrysis)、Aleurita> Muscarioides>M (Mortierella)、褐指藻屬(Phaeodactylum)、隱甲藻屬(Cryphthecodinium)，特別地來自以下屬和物種假微型海鏈藻、細(xì)小裸藻(Euglena gracilis)、展葉劍葉蘚、致病疫霉、禾谷 嚴(yán)孢ft (Fusarium graminaeum)、寇氏1 甲藻、角齒蘚(Ceratodon purpureus)、球等鞭金藻 (Isochrysis galbana)、Aieurita farinosa、石皮囊亞困ノ眞'ザ勿禾中、Muscarioides viallii>M 山被孢霉、三角褐指藻或秀麗隱桿線蟲或特別有利地來自致病疫霉、假微型海鏈藻和寇氏隱甲藻?？梢酝ㄟ^如本說明書中其他地方那樣的轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選地，可以通過T-DNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因植物。原則上，此類載體系統(tǒng)的特征在干，它們至少含有為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化所需要的vir基因和界定T-DNA的序列(T-DNA邊界)。合適的載體在本說明書中其他地方詳細(xì)描述。還包括包含本發(fā)明載體或多核苷酸的轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物。由本發(fā)明構(gòu)思的優(yōu)選的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是魚類，如鯡魚、鮭魚、沙丁魚、紅鈾、鰻魚、鯉魚、鱒魚、比目魚、鮐魚、梭鱸或金槍魚。然而，可以理解，根據(jù)上文所述的非人轉(zhuǎn)基因生物，可以將酶活性進(jìn)ー步賦予所述生物，例如通過重組技術(shù)賦予。因而，本發(fā)明優(yōu)選地構(gòu)思了上文所述的非人轉(zhuǎn)基因生物，其中除本發(fā)明的多核苷酸之外，如根據(jù)選擇的宿主細(xì)胞所需要，所述非人轉(zhuǎn)基因生物還包含編碼此類去飽和酶和/或延伸酶的多核苷酸。應(yīng)當(dāng)存在于該生物中的優(yōu)選去飽和酶和/或延伸酶是選自本說明書中其他地方特別引用的去飽和酶和/或延伸酶中的至少ー種酶或它們的組合(見上文和表3、4和5)。另外，本發(fā)明包括用于制造多不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括a)在允許在所述宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的條件下培育本發(fā)明的宿主細(xì)胞；b)從所述宿主細(xì)胞獲得所述多不飽和脂肪酸。如本文所用的術(shù)語“多不飽和脂肪酸(PUFA) ”指包含至少2個(gè)、優(yōu)選地3、4、5或6 個(gè)雙鍵的脂肪酸。另外，應(yīng)當(dāng)理解此類脂肪酸在脂肪酸鏈中優(yōu)選地包含18至M個(gè)碳原子。 更優(yōu)選地，該術(shù)語涉及在脂肪酸鏈中具有20至M個(gè)碳原子的長鏈PUFA (LCPUFA)。在本發(fā)明意義范圍內(nèi)的優(yōu)選的不飽和脂肪酸選自DGLA 20:3(8，11，14)、ARA 20:4(5,8,11,14), iARA20:4(8,11，14，17) ,EPA 20:5(5,8,11，14，17) ,DPA 22:5(4,7,10，13，16)、DHA226(4， 7，10，13，16，19)、20:4(8，11，14，17)，更優(yōu)選地花生四烯酸(ARA) 204(5，8，11，14)、二十碳五烯酸(EPA)20:5(5，8，11，14，17)和二十ニ碳六烯酸(DHA) 22 6 (4，7，10，13，16，19)。因而，應(yīng)當(dāng)理解最優(yōu)選地，由本發(fā)明提供的方法涉及ARA、EPA或DHA的產(chǎn)生。另外，還包括在合成期間出現(xiàn)的LCPUFA的中間體。此類中間體優(yōu)選地由本發(fā)明多肽的去飽和酶或延伸酶活性從底物形成。優(yōu)選地，底物包括LA 18:2(9，12)、ALA 18 3 (9，12，15)、二十碳ニ烯酸 20:2(11，14)、二十碳三烯酸 20:3(11，14，17))、DGLA20 3 (8，11，14) ,ARA 20:4(5,8,11， 14)、二十碳四烯酸 20:4(8，11，14，17)、二十碳五烯酸 20 5 (5，8，11，14，17)、二十ニ碳五烯酸 22:5(7，10，13，16，19)。如本文所用的術(shù)語“培育”指在允許細(xì)胞以產(chǎn)生所述多不飽和脂肪酸(即上文所提及的PUFA和/或LCPUFA)的培養(yǎng)條件下維持和培養(yǎng)宿主細(xì)胞。這暗含在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸，從而出現(xiàn)去飽和酶和/或延伸酶活性。在下文更詳細(xì)地描述用于培育宿主細(xì)胞的合適培養(yǎng)條件。如本文所用的術(shù)語“獲得”包括提供細(xì)胞培養(yǎng)物，所述細(xì)胞培養(yǎng)物包括宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基，以及提供純化或部分地純化的其制備物，所述制備物包含游離形式或作為膜磷脂或作為三酰甘油酯以輔酶A結(jié)合形式的多不飽和脂肪酸，優(yōu)選地，ARA、EPA、DHA。更優(yōu)選地， PUFA和LCPUFA將作為甘油三酯形式例如以油形式獲得?？梢栽诒疚钠渌胤秸业疥P(guān)于純化技術(shù)的更多細(xì)節(jié)。根據(jù)宿主生物，以技術(shù)人員熟悉的方式培育或培養(yǎng)在本發(fā)明方法中待使用的宿主細(xì)胞。通常，將宿主細(xì)胞在液體培養(yǎng)基內(nèi)，在o°c和100°C之間、優(yōu)選地10°C和60°C之間的溫度，根據(jù)生物類型在氧氣氛或無氧氣氛下培育，其中所述液體培養(yǎng)基含有通常為糖形式的碳源、通常為有機(jī)氮源(如酵母提取物)形式的氮源或鹽如硫酸銨、微量元素如鐵、錳和鎂的鹽和根據(jù)需要，含有維生素。液體培養(yǎng)基的PH可以保持恒定，也就是說，在培養(yǎng)期間進(jìn)行調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)。培養(yǎng)物可以分批、半分批或連續(xù)地培養(yǎng)。養(yǎng)分可以在發(fā)酵開始時(shí)提供或半連續(xù)地或連續(xù)地施加。產(chǎn)生的PUFA或LCPUFA可以通過技術(shù)人員已知的方法，例如通過提取、蒸餾、結(jié)晶、根據(jù)需要鹽析和/或色譜法，從如上文所述的宿主細(xì)胞分離?？赡芤笤诩兓捌茐乃拗骷?xì)胞。為此目的，可以事先破壞宿主細(xì)胞。待使用的培養(yǎng)基必須適當(dāng)?shù)貪M足所討論宿主細(xì)胞的要求。教材“美國細(xì)菌學(xué)學(xué)會(huì)通用細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)”(Manual of Methods for General Bacteriology) (Washington D. C. ,USA, 1981)中描繪了用于根據(jù)本發(fā)明能用作宿主的多種微生物的培養(yǎng)基。也可以從多個(gè)商業(yè)供應(yīng)者獲得培養(yǎng)基。將全部培養(yǎng)基組分通過加熱或過濾消毒法消毒。全部培養(yǎng)基組分可以在培養(yǎng)開始時(shí)存在，或根據(jù)需要，連續(xù)地或分批地添加。如果已經(jīng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的本發(fā)明多核苷酸或載體還包含可表達(dá)的選擇標(biāo)記如抗生素耐藥性基因，可能需要添加選擇劑至所述培養(yǎng)物，如為維持已導(dǎo)入多核苷酸的穩(wěn)定性的抗生素。繼續(xù)培養(yǎng)直至想要的產(chǎn)物最多地形成。這通常在10至160 小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)。發(fā)酵液可以直接使用或可以進(jìn)一歩加工。根據(jù)要求，生物量可以通過分離方法如例如離心、過濾、潷析法或這些方法的組合完全或部分地從發(fā)酵液取出或完全留在所述發(fā)酵液中。通過本發(fā)明方法獲得的包含作為甘油三酯的所需PUFA或LCPUFA的脂肪酸制備物(例如油)還合適作為化學(xué)合成其他目的產(chǎn)物的原料。例如，它們可以彼此組合地或単獨(dú)地用于藥物或化妝品組合物、食物或動(dòng)物飼料的制備?？梢酝ㄟ^上文所述的方法產(chǎn)生包含所需PUFA或LCPUFA的化學(xué)純的甘油三酷。為此目的，進(jìn)ー步通過提取、蒸餾、結(jié)晶、色譜析法或這些方法的組合純化脂肪酸制備物。為了從甘油三酯釋放脂肪酸部分，也可能需要水解。所述化學(xué)純的甘油三酯或游離脂肪酸尤其適用于在食品エ業(yè)中應(yīng)用或適于化妝品和藥物組合物。另外，本發(fā)明涉及用于制造多不飽和脂肪酸的方法，所述方法包括a)在允許于所述非人轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的條件下培育本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因生物；和b)從所述非人轉(zhuǎn)基因生物獲得所述多不飽和脂肪酸。進(jìn)一歩，隨上文而來的是，本發(fā)明構(gòu)思了用于生產(chǎn)油、脂類或脂肪酸組合物的方法，所述方法包括前述方法中任一方法的步驟和將PUFA或LCPUFA配制為油、脂類或脂肪酸組合物的進(jìn)ー步的步驟。優(yōu)選地，所述油、脂類或脂肪酸組合物將用于飼料、食物、化妝品或藥品。因而，所述PUFA或LCPUFA的配制應(yīng)當(dāng)根據(jù)GMP標(biāo)準(zhǔn)對(duì)構(gòu)思的各個(gè)產(chǎn)品實(shí)施。例如， 可以通過榨油廠從植物種子獲得油。然而，出于產(chǎn)品安全性原因，按照適用的GMP標(biāo)準(zhǔn)，可能需要消毒。相似的標(biāo)準(zhǔn)將適用于待應(yīng)用于化妝品或藥物組合物中的脂類或脂肪酸組合物。用于將油、脂類或脂肪酸組合物配制為產(chǎn)品的全部這些措施均由前述生產(chǎn)法包括在內(nèi)。術(shù)語“油”指包含了酷化成甘油三酯的不飽和和/或飽和脂肪酸的脂肪酸混合物。 優(yōu)選地，在本發(fā)明的油中的甘油三酯包含如上文所提及的PUFA或LCPUFA。酯化的PUFA和 /或LCPUFA的量?jī)?yōu)選地是大約30 %，更優(yōu)選50 %的含量，甚至更優(yōu)選60 %、70 %、80 %或更多的含量。所述油還可以包含游離脂肪酸，優(yōu)選地，上文所提及的PUFA和LCPUFA。為了分折，可以通過轉(zhuǎn)酯反應(yīng)將脂肪酸轉(zhuǎn)化成甲基酯后，例如通過GC分析測(cè)定脂肪酸含量。油或脂肪中多種脂肪酸的含量可以變動(dòng)，尤其根據(jù)來源變動(dòng)。然而，所述油應(yīng)當(dāng)在PUFA和/或 LCPUFA組成和含量方面具有非天然存在的組成。應(yīng)當(dāng)理解，在所述油的甘油三酯中的這種獨(dú)特油組成和獨(dú)特酯化式樣僅應(yīng)當(dāng)是通過采用上文所述的本發(fā)明方法可獲得的。另外，本發(fā)明的油也可以包含其他分子種類。具體而言，它可以包含本發(fā)明多核苷酸或載體的少量雜質(zhì)。然而，此類雜質(zhì)僅可以通過高度靈敏的技術(shù)如PCR檢測(cè)到。另ー個(gè)實(shí)施方案是如上文定義的包含NEENA的多核苷酸或包含所述具NEENA的多核苷酸的重組載體的用途，用于增強(qiáng)植物或其部分中如所定義的多不飽和脂肪酸生物合成途徑的至少ー種酶的表達(dá)，在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上文定義的包含NEENA的多核苷酸或包含所述具NEENA的多核苷酸的重組載體用于植物種子中，其中所述多核苷酸或重組載體用于增強(qiáng)多不飽和脂肪酸生物合成途徑的至少ー種酶的表達(dá)。另ー個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是如上所述的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或非人轉(zhuǎn)基因生物、源自所述轉(zhuǎn)基因非人生物或植物的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物種子用于產(chǎn)生食物、 動(dòng)物飼料、種子、藥物或精細(xì)化學(xué)品的用途。定義縮寫NEENA-增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸，GFP-綠色熒光蛋白，⑶S-β-葡糖醛酸酶， ΒΑΡ-6-芐氨基嘌呤；MS-Murashige和Skoog培養(yǎng)基；Kan 硫酸卡那霉素；GA3-赤霉酸； micro 1 微升。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不限于具體的方法或方案。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖限制本發(fā)明，本發(fā)明將僅受所附權(quán)利要求書限制。必須指出，如本文中和所附權(quán)利要求中所用，単數(shù)形式“ー個(gè)”、“ー種”和“該”包括復(fù)數(shù)指稱，除非上下文另外明確地指明并非如此。因此，例如，對(duì)“ー種載體”的提及是對(duì)ー種或多種載體的提及并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。術(shù)語“約”在本文中用來指大約、大
致、左右和在......范圍內(nèi)。當(dāng)術(shù)語“約”與ー個(gè)數(shù)字范圍聯(lián)合使用時(shí)，它通過擴(kuò)展界限值
高于和低于所述數(shù)值而修飾該范圍。通常而言，術(shù)語“約”在本文中用來通過20%、優(yōu)選地 10%之上或之下(更高或更低)變異而修飾高于和低于所述值的數(shù)值。如本文中所用，詞匯“或”意指特定列出的任何一成員并且還包括該列出的成員的任意組合。在本說明書中及以下權(quán)利要求中使用吋，詞匯“包含”、“包含著”、“包括”、“包括著”和“包括了”意圖指明一個(gè)或多個(gè)所述特征、整數(shù)、組分或步驟的存在，但是它們不排除ー個(gè)或多個(gè)其他特征、整數(shù)、 組分、步驟或其組的存在或添加。為清晰起見，將本說明書中使用的某些術(shù)語如下定義并使用。反平行“反平行”在本文中指經(jīng)互補(bǔ)性堿基殘基之間氫鍵配對(duì)的兩個(gè)核苷酸序列，其中磷酸ニ酯鍵在一個(gè)核苷酸序列中以5’ -3’方向分布并且在另ー個(gè)核苷酸序列中以 3，_5，方向分布。反義術(shù)語“反義”指相對(duì)于其轉(zhuǎn)錄或發(fā)揮作用的正常方向?yàn)榉聪虿⑶覐亩磉_(dá)下述RNA轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列，其中所述的RNA轉(zhuǎn)錄物與宿主細(xì)胞內(nèi)部表達(dá)的靶基因mRNA分子互補(bǔ)(例如，它可以借助Watson-Crick堿基配對(duì)作用與靶基因mRNA分子或單鏈基因組 DNA雜交)或與靶DNA分子(例如宿主細(xì)胞中存在的基因組DNA)互補(bǔ)。編碼區(qū)如本文中所用，術(shù)語“編碼區(qū)”在談及結(jié)構(gòu)基因使用吋，指編碼在作為 mRNA分子翻譯結(jié)果的新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列。在真核生物中，編碼區(qū)在5’ 側(cè)以編碼起始物甲硫氨酸的核苷酸三聯(lián)體“ATG”為界并且在3’側(cè)以指定終止密碼子的3 種三聯(lián)體(即TAA、TAG、TGA)為界。除含有內(nèi)含子之外，基因的基因組形式也可以包含位于 RNA轉(zhuǎn)錄物中存在的序列的5’ -及3’ -端的序列。這些序列稱作“側(cè)翼”序列或“側(cè)翼”區(qū) (這些側(cè)翼序列位于mRNA轉(zhuǎn)錄物上存在的非翻譯序列的5’或3’)。5’ -側(cè)翼區(qū)可以含有控制或影響基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)序列如啟動(dòng)子和增強(qiáng)子。3’ -側(cè)翼區(qū)可以含有指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止、轉(zhuǎn)錄后剪切和聚腺苷酸化的序列?；パa(bǔ)的“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”指包含反平行核苷酸序列的兩個(gè)核苷酸序列，其中一旦在反平行核苷酸序列中的互補(bǔ)性堿基殘基之間形成氫鍵，則所述反平行核苷酸序列能夠相互配對(duì)(通過堿基配對(duì)原則)。例如，序列5，-AGT-3，與序列5，-ACT-3’互補(bǔ)?；パa(bǔ)性可以是“部分的”或“全部的”?！安糠帧被パa(bǔ)性是其中ー個(gè)或多個(gè)核酸堿基根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則未匹配的情況。核酸分子之間的“全部”或“完全”互補(bǔ)性是其中每個(gè)核酸堿基按照堿基配對(duì)規(guī)則與另ー個(gè)堿基匹配的情況。核酸分子鏈之間互補(bǔ)性的程度對(duì)核酸分子鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度具有明顯影響。如本文中所用的核酸序列“互補(bǔ)物”指這樣的核苷酸序列， 其核酸分子顯示與該核酸序列的核酸分子的全部互補(bǔ)性。雙鏈RNA “雙鏈RNA分子”或“dsRNA”分子包含核苷酸序列的有義RNA片段和該核苷酸序列的反義RNA片段，二者均包含彼此互補(bǔ)的核苷酸序列，因而允許有義RNA片段和反義RNA片段配對(duì)并形成雙鏈RNA分子。內(nèi)源的“內(nèi)源的”核苷酸序列指存在于未轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的基因組中的核苷酸序列。增強(qiáng)的表達(dá)“增強(qiáng)”或“増加”核酸分子在植物細(xì)胞中的表達(dá)在本文中同等地使用，并且意指該核酸分子在應(yīng)用本發(fā)明方法之后在植物、植物部分或植物細(xì)胞中的表達(dá)水平比其在應(yīng)用該方法之前的植物、植物部分或植物細(xì)胞中的表達(dá)更高，或與缺少本發(fā)明重組核酸分子的參照植物相比更高。例如，參照植物包含僅缺少相應(yīng)NEENA的相同構(gòu)建體。 如本文中所用的術(shù)語“增強(qiáng)”或“増加”是同義的，并且在本文中意指待表達(dá)的核酸分子的更高、優(yōu)選地顯著更高的表達(dá)。如本文中所用，“增強(qiáng)”或“増加”某物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、mRNA 或RNA)的水平意指相對(duì)于基本上相同條件下培育的、缺少本發(fā)明重組核酸分子(例如缺少本發(fā)明的NEENA分子、重組構(gòu)建體或重組載體)的基本上相同植物、植物部分或植物細(xì)胞， 該水平増加。如本文中所用，“增強(qiáng)”或“増加”某物質(zhì)(例如由靶基因表達(dá)的前RNA、mRNA、 rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或由其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物)的水平意指，相對(duì)于缺少本發(fā)明重組核酸分子的細(xì)胞或生物，該水平増加50%或更多，例如100%或更多，優(yōu)選地200% 或更多，更優(yōu)選地5倍或更多倍，甚至更優(yōu)選地10倍或更多倍，最優(yōu)選地20倍或更多倍，例如50倍。可以通過技術(shù)人員熟悉的方法測(cè)定所述增強(qiáng)或増加。因而，可以例如通過蛋白質(zhì)的免疫學(xué)檢測(cè)法確定核酸或蛋白質(zhì)量的增強(qiáng)或増加。另外，可以使用技術(shù)如蛋白質(zhì)測(cè)定法、熒光法、RNA雜交法、核酸酶保護(hù)測(cè)定法、逆轉(zhuǎn)錄法(定量RT-PCR)、ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法)、蛋白質(zhì)印跡法、放射免疫測(cè)定法(RIA)或其他免疫測(cè)定法和熒光激活的細(xì)胞分折(FACS)來測(cè)量植物或植物細(xì)胞中的特定蛋白質(zhì)或RNA。取決于所誘導(dǎo)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的類型，也可以確定其活性或?qū)ι锘蚣?xì)胞表型的影響。用于確定蛋白質(zhì)數(shù)量的方法是技術(shù)人員已知的?？梢蕴岬降膶?shí)例是微量Biuret法(Goa J(1953) Scand J Clin Lab Invest 5 218-222)、Folin-Ciocalteau 法(Lowry OH 等人(1951)J Biol Chem 193:265-275)或測(cè)量 CBB G-250 的吸光度(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72 :248-254) 作為用于量化蛋白質(zhì)的活性的ー個(gè)實(shí)例，在下文實(shí)施例中描述螢光素酶活性檢測(cè)法。表達(dá)“表達(dá)”指基因產(chǎn)物的生物合成，優(yōu)選地指細(xì)胞中核苷酸序列例如內(nèi)源基因或異源基因的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。例如，在結(jié)構(gòu)基因的情況下，表達(dá)涉及結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄成mRNA 并且任選地隨后mRNA翻譯成ー種或多種多肽。在其他情況下，表達(dá)可以僅指攜帯RNA分子的DNA的轉(zhuǎn)錄。表達(dá)構(gòu)建體如本文中所用的“表達(dá)構(gòu)建體”意指能夠指導(dǎo)特定核苷酸序列在適宜植物部分或植物細(xì)胞中表達(dá)的DNA序列，該DNA序列包含在導(dǎo)入此DNA序列的所述植物部分或植物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子與任選地有效連接至終止信號(hào)的目的核苷酸序列有效連接。如果需要翻譯，該DNA序列一般還包含為正確翻譯所述核苷酸序列所需的序列。編碼區(qū)可以編碼目的蛋白，但也可以以有義或反義方向編碼功能性目的RNA，例如 RNAa, siRNA、snoRNA、snRNA、microRNA、ta-siRNA或任何其他非編碼的調(diào)節(jié)性RNA。包含目的核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體可以是嵌合的，這意指該表達(dá)構(gòu)建體的組件中一者或多者相對(duì)于該表達(dá)構(gòu)建體的其他組件中一者或多者是異源的。該表達(dá)構(gòu)建體也可以是ー種這樣的表達(dá)構(gòu)建體，它天然地存在，但已經(jīng)以用于異源表達(dá)的重組形式獲得。然而，一般而言，該表達(dá)構(gòu)建體相對(duì)于宿主是異源，即，該表達(dá)構(gòu)建體的特定DNA序列不天然存在于宿主細(xì)胞中并且必須已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化事件導(dǎo)入宿主細(xì)胞或該宿主細(xì)胞的祖先中。該表達(dá)構(gòu)建體中的核苷酸序列的表達(dá)可以處于種子特異性啟動(dòng)子或處于僅在宿主細(xì)胞暴露于ー些特定外部刺激時(shí)才啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。在植物的情況下，該啟動(dòng)子也可以是針對(duì)特定組織或器官或發(fā)育階段特異的。外來的術(shù)語“外來的”指任何核酸分子(例如，基因序列)，所述核酸分子通過實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)入細(xì)胞的基因組中并且可以包括該細(xì)胞中存在的序列，只要導(dǎo)入的序列含有ー些修飾(例如，點(diǎn)突變、存在可選擇標(biāo)記基因等)和因此相對(duì)于天然存在序列是不同的。功能性連接將術(shù)語“功能性連接”或“功能性連接的”理解為意指例如調(diào)節(jié)性元件(例如啟動(dòng)子)與待表達(dá)的核酸序列并且根據(jù)需要與其他調(diào)節(jié)性元件(例如，終止子或 NEENA)以如此方式依次排列，從而每種調(diào)節(jié)性元件可以履行其目的功能以允許、修飾、促進(jìn)或影響所述核酸序列的表達(dá)。作為同義詞，可以使用“有效連接”或“有效連接的”?？梢愿鶕?jù)所述核酸序列相對(duì)于有義或反義RNA的排列，產(chǎn)生表達(dá)。為此目的，不是必需要求化學(xué)意義上的直接連接。遺傳控制序列例如增強(qiáng)子序列也能夠從遠(yuǎn)離的位置或甚至從其它DNA分子對(duì)靶序列產(chǎn)生其作用。優(yōu)選的排列是這樣的排列，其中待表達(dá)的核酸序列重組地位于充當(dāng)啟動(dòng)子的序列之后，從而這兩個(gè)序列相互共價(jià)地連接。該啟動(dòng)子序列與待重組表達(dá)的核酸序列之間的距離優(yōu)選地小于200堿基對(duì)、特別地優(yōu)選小于100堿基對(duì)、非常特別優(yōu)選地小于50堿基對(duì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，待轉(zhuǎn)錄的核酸序列以如此方式位于啟動(dòng)子之后，其中轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)與本發(fā)明嵌合RNA的合乎需要的開端相同。功能性連接和表達(dá)構(gòu)建體可以借助如 、1列5ロ，在Maniatis TiFritscn EF才ロSambrook J(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual，‘ニ} κ，Cold Spring Harbor Laboratory, Cola Spring Harbor(NY) ；Silhavy 等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor(NY) ；Ausubel 等人(1987)Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience ；Gelvin 等人(編著)(1990)Plant Molecular Biology Manual ；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands) 所述的慣用重組和克隆技術(shù)產(chǎn)生。然而，其他序列，例如充當(dāng)帶限制性酶特定切割位點(diǎn)的接頭或充當(dāng)信號(hào)肽的序列，也可以位于這兩個(gè)序列之間。序列的插入也可以導(dǎo)致融合蛋白的表達(dá)。優(yōu)選地，由調(diào)節(jié)性區(qū)域例如啟動(dòng)子和待表達(dá)核酸序列的連接組成的表達(dá)構(gòu)建體可以以載體整合的形式存在并且被插入植物基因組，例如通過轉(zhuǎn)化法。
基因術(shù)語“基因”指與能夠以某種方式調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物(例如，多肽或功能性RNA) 表達(dá)的適宜調(diào)節(jié)序列有效連接的區(qū)域。基因包括DNA中位于編碼區(qū)(可讀框，0RF)之前 (上游)和之后(下游)的非翻譯調(diào)節(jié)區(qū)(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、阻抑物等)，以及在適用情況下，在各個(gè)編碼區(qū)(例如外顯子)之間的間插序列(例如內(nèi)含子)。如本文中所用的術(shù)語 “結(jié)構(gòu)基因”意圖指轉(zhuǎn)錄成mRNA的DNA序列，其中所述的mRNA隨后翻譯成作為具體多肽的特征的氨基酸序列。基因組和基因組DNA 術(shù)語“基因組”或“基因組DNA，，指宿主生物的可遺傳信息。 所述基因組DNA包括胞核的DNA(也稱作染色體DNA)，還包括質(zhì)體(例如，葉綠體)和其他細(xì)胞器(例如，線粒體)的DNA。優(yōu)選地，術(shù)語基因組或基因組DNA指胞核的染色體DNA。異源的就核酸分子或DNA而言，術(shù)語“異源的”指這樣的核酸分子，所述核酸分子有效連接于或受到操作以變成有效連接于自然界中不與該核酸分子有效連接或自然界中與該核酸分子在不同位置有效連接的第二種核酸分子。包含核酸分子和與之連接的ー個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)性核酸分子(如啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄終止信號(hào))的異源表達(dá)構(gòu)建體例如是源自實(shí)驗(yàn)操作的構(gòu)建體，在所述構(gòu)建體中，a)所述核酸分子或b)所述調(diào)節(jié)性核酸分子或c) 二者(即 (a)和(b))不位于其天然(原有)遺傳環(huán)境中或已經(jīng)因?qū)嶒?yàn)操作受到修飾，修飾的實(shí)例是一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基的置換、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環(huán)境指源生物中的天然染色體基因座或指存在于基因組文庫中。在基因組文庫的情況下，優(yōu)選地保留，至少部分地保留該核酸分子的序列的天然遺傳環(huán)境。該環(huán)境分布在該核酸序列的至少ー側(cè)并且具有至少50bp、優(yōu)選地至少500bp、特別優(yōu)選地至少lOOObp、非常特別優(yōu)選地至少5000bp序列長度。天然存在的表達(dá)構(gòu)建體例如啟動(dòng)子與相應(yīng)基因的天然存在組合-在通過非天然的合成性“人工”方法例如誘變法修飾時(shí)變成轉(zhuǎn)基因表達(dá)構(gòu)建體。已經(jīng)描述了此類方法(US 5，565，350 ；WO 00/15815)。例如，與啟動(dòng)子有效連接的編碼蛋白質(zhì)的核酸分子相對(duì)于該啟動(dòng)子視為異源，其中所述的啟動(dòng)子不是該核酸分子的天然啟動(dòng)子。優(yōu)選地，異源DNA相對(duì)于導(dǎo)入該異源DNA的細(xì)胞不是內(nèi)源的或不天然與該細(xì)胞相關(guān)，但是已經(jīng)從另ー種細(xì)胞獲得或已經(jīng)合成。異源DNA還包括含有一些修飾的內(nèi)源DNA序列、不天然存在的多拷貝內(nèi)源DNA 序列或這樣的DNA序列，該DNA序列不與同物理連接于所述DNA序列的另ー個(gè)DNA序列天然接合。通常地但不是必需地，異源DNA編碼在細(xì)胞中表達(dá)的RNA或蛋白質(zhì)，而所述RNA或蛋白質(zhì)正常情況下不被所述細(xì)胞產(chǎn)生。高表達(dá)種子特異性啟動(dòng)子如本文中所用的“高表達(dá)種子特異性啟動(dòng)子”意指在植物或其部分中引起種子特異性或種子偏好性表達(dá)的啟動(dòng)子，其中衍生自處于相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子中的RNA積累或合成速率或RNA穩(wěn)定性比缺少本發(fā)明NEENA的啟動(dòng)子所引起的表達(dá)更高，優(yōu)選地顯著更高。優(yōu)選地，相對(duì)于缺少本發(fā)明NEENA的種子特異性或種子偏好性啟動(dòng)子，RNA的量和/或RNA合成速率和/或RNA穩(wěn)定性増加50%或更大，例如100% 或更多，優(yōu)選地200 %或更多，更優(yōu)選地5倍或更多倍，甚至更優(yōu)選地10倍或更多倍，最優(yōu)選地20倍或更多倍，例如50倍。雜交如本文中所用，術(shù)語“雜交”包括“核酸分子的鏈通過堿基配對(duì)作用與互補(bǔ)鏈結(jié)合的任意過程”。(J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York)。雜交和雜交的強(qiáng)度(即，核酸分子之間結(jié)合的強(qiáng)度)受此類因素影響，如核酸分子之間的互補(bǔ)性程度、所涉及條件的嚴(yán)格性、所形成雜合體的Tm和核酸分子內(nèi)部的G C比。如本文中所用，術(shù)語“Tm”用來指“解鏈溫度”。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群體一半解離成單鏈的溫度。用于計(jì)算核酸分子的Tm的等式是本領(lǐng)域熟知的。如標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)所示，當(dāng)核酸分子處于IM NaCl的水溶液中吋，可以通過等式Tm = 81. 5+0. 41 (% G+C)計(jì)算來進(jìn)行 TmflL的fg]單估計(jì)[見例如，Anderson 禾ロ Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]。其他參考文獻(xiàn)包括更復(fù)雜計(jì)算法，這些算法考慮了結(jié)構(gòu)特征及序列特征以計(jì)算Tm。嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且可以在Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons, N. Y. (1989) ,6. 3. 1-6. 3. 6 中找到?！巴恍浴?在比較兩個(gè)或多個(gè)核酸或氨基酸分子使用吋，“同一性”意指所述分子的序列共有某種程度的序列相似性，即所述序列是部分相同的。為確定兩個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)核酸分子的同一性(在本文可互換地使用同源性) 百分?jǐn)?shù)，將所述序列以ー個(gè)序列在另ー個(gè)序列下的方式書寫以最佳比較(例如，可以將空位插入蛋白質(zhì)的序列或核酸的序列，旨在與另ー種蛋白質(zhì)或另ー種核酸產(chǎn)生最佳比對(duì))。隨后在對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處比較氨基酸殘基或核酸分子。當(dāng)ー個(gè)序列中的位置由另ー個(gè)序列中對(duì)應(yīng)位置處的相同氨基酸殘基或相同核酸分子占據(jù)時(shí)，則所述分子在這個(gè)位置處是同源的(即，如本上下文中所用的氨基酸或核酸“同源性”對(duì)應(yīng)于氨基酸或核酸“同一性”。這兩個(gè)序列之間的同一性百分?jǐn)?shù)是所述序列共有的相同位置的數(shù)值的函數(shù)(即同源性百分?jǐn)?shù)=相同位置的數(shù)值/位置總數(shù)X 100)。術(shù)語“同源性”和“同一性”因而視為同義詞。為確定兩個(gè)或多個(gè)氨基酸序列或兩個(gè)或多個(gè)核苷酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)，已經(jīng)開發(fā)了幾個(gè)計(jì)算機(jī)軟件程序。兩個(gè)或更多序列的同一性可以用例如軟件fasta計(jì)算，其中軟件 fasta 已經(jīng)以 fasta 3 版本使用(W. R. Pearson 和 D. J. Lipman, PNAS 85,2444(1988)； W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183,63(1990) ；W. R. Pearson 禾ロ D. J. Lipman，PNAS 85,2444(1988) ；W. R. Pearson, Enzymology 183，63 (1990))。用于計(jì)算不同序列的同一性的另ー種有用程序是標(biāo)準(zhǔn)blast程序，其中該程序包含于Biomax pedant軟件(聯(lián)邦德國慕尼黑Biomax)中。不幸地，該程序有時(shí)產(chǎn)生次優(yōu)結(jié)果，因?yàn)閎last不總是包含主題和查詢對(duì)象的完整序列。然而，由于該程序非常高效，因而它可以用于龐大數(shù)目序列的比較。以下設(shè)置一般用于這樣的序列比較內(nèi)含子指基因內(nèi)部的DNA區(qū)段(間插序列)，該DNA區(qū)段不編碼該基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的部分，并且從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA中在該mRNA從細(xì)胞核輸出之前剪切下來。內(nèi)含子序列指內(nèi)含子的核酸序列。因而，內(nèi)含子是DNA序列的這些區(qū)域，它們隨編碼序列(外顯子)一起轉(zhuǎn)錄但是在成熟mRNA形成期間被除去。內(nèi)含子可以位于實(shí)際編碼區(qū)內(nèi)部或位于前mRNA (未剪接的mRNA)的5’或3’非翻譯前導(dǎo)序列中。初級(jí)轉(zhuǎn)錄物中的內(nèi)含子被切下并且編碼序列同時(shí)且精確地連接以形成成熟的mRNA。內(nèi)含子和外顯子的交界形成剪接位點(diǎn)。 內(nèi)含子的序列始于⑶并止于AG。另夕卜，在植物中，已經(jīng)描述AU-AC內(nèi)含子的兩個(gè)實(shí)例來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的RecA樣蛋白基因第14內(nèi)含子和G5基因第7內(nèi)含子是AT-AC內(nèi)含子。含有內(nèi)含子的前mRNA具有3種短序列，連同其他序列，這些短序列對(duì)于精確剪接內(nèi)含子是必需的。這些序列是5’剪接位點(diǎn)、3’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)。mRNA剪接是除去初級(jí)mRNA轉(zhuǎn)錄物中存在的間插序列(內(nèi)含子)并接合或連接外顯子序列。這又稱作順式剪接作用，所述順式剪接作用將相同RNA上的兩個(gè)外顯子接合，同時(shí)除去間插序列(內(nèi)含子)。內(nèi)含子的功能性元件包含由剪接體的特定蛋白質(zhì)組分(例如其剪接內(nèi)含子末端處的共有序列)識(shí)別并結(jié)合的序列。功能性元件與剪接體的相互作用導(dǎo)致從不成熟mRNA除去內(nèi)含子序列和外顯子序列的再接合。內(nèi)含子具有3種短序列，這些短序列對(duì)于精確剪接內(nèi)含子是必需的，但是并非足夠的。這些序列是5’剪接位點(diǎn)、3’剪接位點(diǎn)和分支點(diǎn)。分支點(diǎn)序列是在植物中剪接過程和剪接位點(diǎn)選擇方面重要的。分支點(diǎn)序列通常位于3’剪接位點(diǎn)上游10-60個(gè)核苷酸處。分離的如本文中所用的術(shù)語“分離的”意指材料已經(jīng)通過人工取出并且離開其原來的天然環(huán)境存在并且因此不是自然界的產(chǎn)物。分離的材料或分子(如DNA分子或酶)可以以純化的形式存在或可以存在于非天然環(huán)境中如例如存在于轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞中。例如，活植物中存在的天然存在多核苷酸或多肽不是分離的，然而與該天然系統(tǒng)中一些或全部共存物質(zhì)分開的相同多核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，和是分離的，因?yàn)檫@種載體或組合物不是其最初環(huán)境的一部分。優(yōu)選地，術(shù)語“分離的”相對(duì)于核酸分子使用時(shí)，如“分離的核酸序列”指被鑒定并且與該核酸序列天然來源中通常與其接合的至少一種雜質(zhì)性核酸分子分開的核酸序列。分離的核酸分子是這樣的核酸分子，其在與自然界中找到該核酸分子的形式或環(huán)境不同的形式或環(huán)境下存在。相反，未分離的核酸分子是以其在自然界中存在的狀態(tài)所找到的核酸分子如DNA和RNA。例如，在宿主細(xì)胞染色體上相鄰基因附近找到給定的DNA序列(例如，基因)；作為與編碼多種蛋白質(zhì)的眾多其他mRNA的混合物，在細(xì)胞中找到RNA序列，如編碼特定蛋白質(zhì)的特定mRNA序列。然而，包含例如SEQ ID NO :1的分離的核酸序列包括例如在細(xì)胞中通常含有SEQ ID NO :1的此類核酸序列，其中所述核酸序列位于不同于天然細(xì)胞的染色體或染色體外位置中，或側(cè)翼分布有不同于自然界中存在的核酸序列。分離的核酸序列可以以單鏈或雙鏈形式存在。當(dāng)分離的核酸序列用來表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，該核酸序列將最少含有有義鏈或編碼鏈的至少一部分(即，該核酸序列可以是單鏈的)。備選地，它可以含有有義鏈和反義鏈(即，該核酸序列可以是雙鏈的)。最小啟動(dòng)子在缺少上游激活情況下無活性或啟動(dòng)子活性大大降低的啟動(dòng)子元件，特別地是TATA元件。在合適的轉(zhuǎn)錄因子存在下，最小啟動(dòng)子發(fā)揮作用以引起轉(zhuǎn)錄。NEENA 參見“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸”。增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)術(shù)語“增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸”指這樣的序列和/或核酸分子，其是具有在與NEENA功能性連接的啟動(dòng)子的控制下增強(qiáng)核酸表達(dá)的內(nèi)在特性的特定序列。不同于啟動(dòng)子序列，NEENA本身不能驅(qū)動(dòng)表達(dá)。為了履行增強(qiáng)與NEENA功能性連接的核酸分子表達(dá)的職能，NEENA本身應(yīng)當(dāng)與啟動(dòng)子功能性連接。與本領(lǐng)域已知的增強(qiáng)子序列的區(qū)別在于，NEENA以順式方式而不以反式方式起作用，并且必需靠近待表達(dá)核酸的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)存在。核酸和核苷酸術(shù)語“核酸”和“核苷酸”指天然存在的或合成的或人工核酸或核苷酸。術(shù)語“核酸”和“核苷酸”包括處于單鏈或雙鏈、有義或反義形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其任何核苷酸類似物和聚合物或雜合體。除非另外說明，特定核酸序列也隱含地包括其保守方式修飾的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子置換)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列。術(shù)語“核酸”在本文中與“基因”、“DNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”互換地使用。核苷酸類似物包括在堿基、糖和/或磷酸酯的化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有修飾的核苷酸，所述修飾包括但不限于5-位置嘧啶修飾、8-位置嘌呤修飾、胞嘧啶環(huán)外胺處的修飾、5-溴-尿嘧啶置換等；和2'-位置糖修飾，包括但不限于糖修飾的核糖核苷酸，其中2' -OH由選自H、OR、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團(tuán)替換。短發(fā)夾RNA(shRNA)也可以包含非天然元件如非天然堿基，例如，肌苷和黃嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然的磷酸二酯鍵，例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽。核酸序列短語“核酸序列”指從5’ -端至3’ -端讀取的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的單鏈或雙鏈聚合物。它包括染色體DNA、自我復(fù)制型質(zhì)粒、DNA或RNA的感染性聚合物、和主要發(fā)揮結(jié)構(gòu)性作用的DNA或RNA?！昂怂嵝蛄小币仓复砗塑账岬目s寫、字母、字符或字的連續(xù)串。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸可以是“探針”，所述探針是相對(duì)短的核酸，通常長度小于100個(gè)核苷酸。經(jīng)常地，核酸探針具有約50個(gè)核苷酸長度至約10個(gè)核苷酸長度。核酸的“靶區(qū)域”是核酸中被鑒定為有目標(biāo)的部分。寡核苷酸術(shù)語“寡核苷酸”指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的低聚物或聚合物，以及具有類似發(fā)揮作用的非天然存在部分的寡核苷酸。此類修飾或取代的寡核苷酸因合乎需要的特性，例如增強(qiáng)的細(xì)胞攝取、增強(qiáng)的核酸靶親和力和在核酸酶存在下增加的穩(wěn)定性而經(jīng)常優(yōu)選地勝過其天然形式。寡核苷酸優(yōu)選地包括通過鍵(例如，磷酸二酯鍵)或取代鍵(substitute linkage)相互共價(jià)偶聯(lián)的兩個(gè)或多個(gè)核苷酸單體(nuc1eomonomer)0植物通常理解為意指能夠光合作用的任何真核單細(xì)胞生物或多細(xì)胞生物或其細(xì)胞、組織、器官、部分或繁殖材料(如種子或果實(shí))。為本發(fā)明的目的，包括植物界(PlantKingdom)的全部屬和物種的高等和低等植物。優(yōu)選地一年生、多年生、單子葉和雙子葉植物。該術(shù)語包括成熟植物、種子、幼苗和籽苗及其衍生部分、繁殖材料(如種子或微孢子)、植物器官、組織、原生質(zhì)體、愈傷組織和其他培養(yǎng)物(例如細(xì)胞培養(yǎng)物)，和歸并成產(chǎn)生功能單元或結(jié)構(gòu)單元的任何其他類型的植物細(xì)胞。成熟植物指在除籽苗之外的任何目的發(fā)育階段的植物。籽苗指在早期發(fā)育階段的年幼不成熟植物。一年生、二年生、單子葉和雙子葉植物是用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的優(yōu)選宿主生物?；虻谋磉_(dá)在全部觀賞植物、用材樹或觀賞樹、花、切花、灌木或草坪草中是更進(jìn)一步有利的?？梢杂门e例方式、但非限制方式提到的植物是被子植物、苔蘚植物例如獐耳細(xì)辛屬(Hepaticae)(地錢類(liverwort))和蘚綱(Musci)(蘚類植物)；蕨類植物如蕨類、木賊類和石松類；裸子植物如松柏類、蘇鐵類、銀杏(ginkgo)和買麻藤科(Gnetaeae)植物；藻類如綠藻綱(Chlorophyceae)、褐藻綱(Phaeophpyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、粘藻綱(Myxophyceae)、黃藻綱(Xanthophyceae) >iiig^ (Bacillariophyceae) (ig^l )禾0 (Euglenophyceae)。優(yōu)選的是用于食物或飼料目的的植物，如豆科(Leguminosae)如豌豆、苜蓿和大豆；禾本科(Gramineae)如稻、玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥、黑小麥或燕麥；傘形科(Umbelliferae)，特別地是胡蘿卜屬(Daucus)(非常特別地是物種胡蘿卜(carota))和芹屬(Apium)(非常特別地是物種旱芹(Graveolens dulce (celery)))及眾多其它植物；茄科(Solanaceae)，特別地是番茄屬(Lycopersicon)，非常特別地是物種番茄(tomato)，和茄屬(Solanum)，非常特別地是物種馬鈴薯(tomato)和茄子(egg plant)和眾多其它植物(如煙草(tcAacco))，和辣椒屬(Capsicum)，非常特別地是物種辣椒(ρ印per)及眾多其它植物；豆科(Leguminosae)，特別地是大豆屬(Glycine)，非常特別地是物種大豆(soybean)、苜蓿、豌豆、紫花苜蓿、菜豆或花生及眾多其它植物；和十字花科(Brassicacae)，特別地是蕓苔屬(Brassica)，非常特別地是物種歐洲油菜(oilseed rape)、蕓苔(beet)、甘藍(lán)(Brassicaoleracea cv Tastie (卷心菜))、花椰菜(Brassica oleracea cv Snowball Y (花椰菜))和花莖甘藍(lán)(oleracea cv Emperor (broccoli))；和擬南芥屬，非常特別地是物種擬南芥及眾多其它植物；菊科(Compositae)，特別地是萵苣屬(Lactuca)，非常特別地是物種萵苣(lettuce)及眾多其它植物；菊科(Asteraceae)如向日葵、萬壽菊、萵苣或金盞花及眾多其它植物；葫蘆科(Cucurbitaceae)如甜瓜、西葫蘆/南瓜或夏南瓜，和亞麻。更優(yōu)選地是棉屬植物、甘蔗、大麻、亞麻、辣椒和多種樹、堅(jiān)果和藤本(wine)物種。多肽術(shù)語“多肽”、“肽”、“寡肽”、“多肽”、“基因產(chǎn)物”、“表達(dá)產(chǎn)物”和“蛋白質(zhì)”在文中互換地使用，用來指連續(xù)氨基酸殘基的聚合物或低聚物。初級(jí)轉(zhuǎn)錄物如本文中所用的術(shù)語“初級(jí)轉(zhuǎn)錄物”指基因的成熟前RNA轉(zhuǎn)錄物?！俺跫?jí)轉(zhuǎn)錄物”例如仍包含內(nèi)含子和/或仍不包含聚腺苷酸尾或帽結(jié)構(gòu)和/或是缺少對(duì)其作為轉(zhuǎn)錄物正常發(fā)揮作用必需的其他修飾，例如修剪或編輯。啟動(dòng)子術(shù)語“啟動(dòng)子”或“啟動(dòng)子序列”是等同物并且如本文中所用的，指與目的核苷酸序列連接時(shí)能夠控制目的核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成RNA的DNA序列。此類啟動(dòng)子可以例如在以下公共數(shù)據(jù)庫中 http//www, grassius. org/grasspromdb. html、http://mendel.cs. rhul. ac. uk/mendel. php ？ topic = plantprom、http: //ppdb. gene. nagoya~u. ac. ip/cRi-bin/index. cgi找到丨。其中所列的啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明的方法并目.在此引用而包括。啟動(dòng)子位于由該啟動(dòng)子控制轉(zhuǎn)錄成mRNA的目的核苷酸序列的5’ (即，上游)，靠近其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，并且為RNA聚合酶和用于轉(zhuǎn)錄起始的其他轉(zhuǎn)錄因子的特異性結(jié)合提供位點(diǎn)。所述啟動(dòng)子包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)例如至少101Λ，例如51Λ或21Λ。它也可以包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至少1500bp，優(yōu)選地至少lOOObp，更優(yōu)選地至少500bp，甚至更優(yōu)選地至少400bp，至少300bp，至少200bp或至少lOObp。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子包含靠近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)至少50bp，例如至少25bp。啟動(dòng)子不包含外顯子和/或內(nèi)含子區(qū)或5’非翻譯區(qū)。啟動(dòng)子可以例如相對(duì)于相應(yīng)植物為異源或同源。如果多核苷酸序列源自外來物種，或如果來自相同物種，但從其原有形式中被修飾，則它相對(duì)于某生物或第二多核苷酸序列為“異源的”。例如，與異源編碼序列有效連接的啟動(dòng)子指編碼序列來自不同于衍生該啟動(dòng)子的物種中，或，如果來自相同物種，該編碼序列與該啟動(dòng)子不天然接合(例如基因修飾的編碼序列或來自不同生態(tài)型或品種的等位基因)。合適的啟動(dòng)子可以源自其中應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)表達(dá)的宿主細(xì)胞的基因或源自該宿主細(xì)胞的病原體(例如，植物或植物病原體如植物病毒)。植物特異性啟動(dòng)子是適于調(diào)節(jié)植物中表達(dá)的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子可以源自植物，也可以源自植物病原體，或它可以是由人設(shè)計(jì)的合成性啟動(dòng)子。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄的速率應(yīng)答于誘導(dǎo)劑而增加。另外，啟動(dòng)子可以以組織特異性或組織偏好的方式受到調(diào)節(jié)，從而它僅僅或優(yōu)勢(shì)地在特定組織類型如葉、根或分生組織中轉(zhuǎn)錄所接合的編碼區(qū)方面有活性。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“組織特異性”指這樣的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)目的核苷酸序列在特定類型的組織(例如，花瓣)中選擇性表達(dá)，同時(shí)相同目的核苷酸序列在不同類型組織(例如，根)中相對(duì)缺少表達(dá)?？梢岳缤ㄟ^這樣的方式評(píng)價(jià)啟動(dòng)子的組織特異性將報(bào)道基因與該啟動(dòng)子序列有效連接以產(chǎn)生報(bào)道構(gòu)建體，將報(bào)道構(gòu)建體導(dǎo)入植物的基因組，從而該報(bào)道構(gòu)建體整合至所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物的每種組織中，并且檢測(cè)報(bào)道基因在轉(zhuǎn)基因植物的不同組織中的表達(dá)(例如，檢測(cè)mRNA、蛋白質(zhì)或由報(bào)道基因編碼的蛋白質(zhì)的活性)。相對(duì)于報(bào)道基因在其他組織中的表達(dá)水平，檢測(cè)到該報(bào)道基因在一種或多種組織中的更大表達(dá)水平表明該啟動(dòng)子對(duì)其中檢測(cè)到更大表達(dá)水平的組織是特異性的。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞類型特異的”指這樣的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)目的核苷酸序列在特定類型的細(xì)胞中選擇性表達(dá)，同時(shí)相同目的核苷酸序列在相同組織內(nèi)部的不同類型細(xì)胞中相對(duì)缺少表達(dá)。用于啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“細(xì)胞類型特異的”還意指能夠促進(jìn)目的核苷酸序列在單一組織內(nèi)部的某區(qū)域中選擇表達(dá)的啟動(dòng)子。使用本領(lǐng)域熟知的方法，例如GUS活性染色法、GFP蛋白法或免疫組織化學(xué)染色法，可以評(píng)估啟動(dòng)子的細(xì)胞類型特異性。談及啟動(dòng)子或源自啟動(dòng)子的表達(dá)時(shí)，術(shù)語“組成型”意指能夠指導(dǎo)有效連接的核酸分子在刺激物(例如，熱休克、化學(xué)品、光等)不存在下在大部分植物組織和細(xì)胞中貫穿植物或植物部分的基本上整個(gè)生活期限轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。一般而言，組成型啟動(dòng)子能夠指導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在基本上任何細(xì)胞和任何組織中的表達(dá)。啟動(dòng)子特異性談及啟動(dòng)子時(shí)，術(shù)語“特異性”意指由相應(yīng)啟動(dòng)子引起的表達(dá)的樣式。特異性描述了植物或其部分的組織和/或發(fā)育狀態(tài)，在其中該啟動(dòng)子引起處于相應(yīng)啟動(dòng)子控制下的核酸分子表達(dá)。啟動(dòng)子的特異性也可以包含環(huán)境條件，在所述環(huán)境條件下可以激活或下調(diào)該啟動(dòng)子，如由生物脅迫或環(huán)境脅迫如寒冷、干旱、受傷或感染誘導(dǎo)或阻遏。純化的如本文中所用，術(shù)語“純化的”指從其天然環(huán)境取出、分離或分開的分子，為核酸序列或氨基酸序列。“基本上純化的”分子至少60%沒有、優(yōu)選地至少75%沒有和更優(yōu)選地至少90%沒有與它們天然結(jié)合在一起的其他組分。純化的核酸序列可以是分離的核酸序列。重組就核酸分子而言，術(shù)語“重組”指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的核酸分子。重組核酸分子也可以包括本身不存在于自然界中但是被人修飾、改變、突變或操縱的分子。優(yōu)選地，“重組核酸分子”是在序列方面與天然存在的核酸分子有至少一個(gè)核酸不同的非天然存在的核酸分子。“重組核酸分子”也可以包括“重組構(gòu)建體”，其包含不天然地以這種順序存在的一系列核酸分子，所述核酸分子優(yōu)選有效地連接。用于產(chǎn)生所述重組核酸分子的優(yōu)選方法可以包括克隆技術(shù)、定向或非定向誘變法、合成或重組技術(shù)?！胺N子特異性啟動(dòng)子”在本發(fā)明的上下文中意指在種子中相應(yīng)啟動(dòng)子控制下調(diào)節(jié)核酸分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中，在所述種子的任意組織或細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄貢獻(xiàn)了多于90%、優(yōu)選地多于95%，更優(yōu)選地多于99%在整株植物中其任意發(fā)育階段期間從所述核酸序列中轉(zhuǎn)錄的RNA的全部量。將據(jù)此理解術(shù)語“種子特異性表達(dá)”和“種子特異性NEENA”。因而，“種子特異性NEENA”以這樣的方式增強(qiáng)種子特異性或種子偏好性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，從而在種子中從功能性連接于相應(yīng)NEENA的所述啟動(dòng)子中獲得的轉(zhuǎn)錄貢獻(xiàn)了多于90%、優(yōu)選地多于95%，更優(yōu)選地多于99%在整株植物中其任意發(fā)育階段期間從功能性連接于NEENA的相應(yīng)啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄的RNA的全部量?！胺N子偏好性啟動(dòng)子”在本發(fā)明的上下文中意指在種子中相應(yīng)啟動(dòng)子控制下調(diào)節(jié)核酸分子轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，其中，在所述種子的任意組織或細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄貢獻(xiàn)了多于50%、優(yōu)選地多于70%，更優(yōu)選地多于80%在整株植物中其任意發(fā)育階段期間從所述核酸序列中轉(zhuǎn)錄的RNA的全部量。將據(jù)此理解術(shù)語“種子偏好性表達(dá)”和“種子偏好性NEENA”。因而“種子偏好性NEENA”以這樣的方式增強(qiáng)種子特異性或種子偏好性啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，從而，在種子中從功能性連接于相應(yīng)NEENA的所述啟動(dòng)子中獲得的轉(zhuǎn)錄貢獻(xiàn)了多于50%、優(yōu)選地多于70%，更優(yōu)選地多于80%在整株植物中其任意發(fā)育階段期間從功能性連接于NEENA的相應(yīng)啟動(dòng)子中轉(zhuǎn)錄的RNA的全部量。有義術(shù)語“有義”理解為意指核酸分子，其具有與靶序列互補(bǔ)或相同的序列，例如與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和參與給定基因表達(dá)的序列。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，該核酸分子包含目的基因和允許表達(dá)該目的基因的元件。顯著的增加或減少大于測(cè)量技術(shù)中固有誤差幅度的增加或減少，例如在酶活性或在基因表達(dá)方面，優(yōu)選地是對(duì)照酶的活性或?qū)φ占?xì)胞中的表達(dá)增加或減少約2倍或更多，更優(yōu)選地增加或減少約5倍或更多，并且最優(yōu)選地增加或減少約10倍或更多?；旧匣パa(bǔ)的在最廣意義上，本文中就核苷酸序列相對(duì)于參比或靶核苷酸序列而言使用時(shí)，術(shù)語“基本上互補(bǔ)的”意指這樣的核苷酸序列，其具有在基本上互補(bǔ)的核苷酸序列和所述參比或靶核苷酸序列的完全互補(bǔ)序列之間至少60%，更希望地至少70%，更希望地至少80%或85%，優(yōu)選地至少90%，更優(yōu)選地至少93%，仍更優(yōu)選地至少95%或96 %，仍舊更優(yōu)選地至少97 %或98 %，依舊更優(yōu)選地至少99 %或最優(yōu)選地100 %的同一性百分?jǐn)?shù)(后者等同于本上下文中的術(shù)語“同一的”)。優(yōu)選地，在至少19個(gè)核苷酸長度、優(yōu)選地至少50個(gè)核苷酸長度、更優(yōu)選地在核酸序列的全部長度范圍內(nèi)針對(duì)所述參比核苷酸序列評(píng)估同一性(如果不是，則在下文另外說明)。使用威斯康辛大學(xué)GCG的默認(rèn)GAP分析，GAP 的 SEQWEB 應(yīng)用，基于 Needleman 和 Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch(1970) J Mol.Biol. 48 :443-453 ；如上文定義)實(shí)施序列比較。與參比核苷酸序列“基本上互補(bǔ)的”核苷酸序列與該參比核苷酸序列在低嚴(yán)格性條件、優(yōu)選地中等嚴(yán)格性條件、最優(yōu)選地高嚴(yán)格性條件(如上文定義)下雜交。轉(zhuǎn)基因如本文中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指通過實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)入細(xì)胞的基因組中的任何核酸序列。轉(zhuǎn)基因可以是“內(nèi)源DNA序列”或“異源DNA序列”(即，“外來DNA”)。術(shù)語“內(nèi)源DNA序列”指這樣的核苷酸序列，其天然存在于導(dǎo)入該核苷酸序列的細(xì)胞中，只要它相對(duì)于天然存在序列不含有一些修飾(例如，點(diǎn)突變、存在可選擇標(biāo)記基因等)。轉(zhuǎn)基因的當(dāng)提及生物時(shí)，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”意指用重組DNA分子轉(zhuǎn)化生物，優(yōu)選地穩(wěn)定轉(zhuǎn)化該生物，其中所述重組DNA分子優(yōu)選地包含與目的DNA序列有效連接的合適啟動(dòng)子。載體如本文中所用，術(shù)語“載體”指能夠運(yùn)輸已經(jīng)與之連接的另一個(gè)核酸分子的核酸分子。一種類型的載體是基因組整合的載體，或“整合的載體”，所述載體可以整合至宿主細(xì)胞的染色體DNA中。另一個(gè)類型的載體是游離型載體，即，能夠進(jìn)行染色體外復(fù)制的核酸分子。本文中將能夠指導(dǎo)與它們有效連接的基因表達(dá)的載體稱作“表達(dá)載體”。在本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”互換地使用，除非從上下文顯而易見并非如此。設(shè)計(jì)旨在體外或體內(nèi)產(chǎn)生如本文所述RNA的表達(dá)載體可以含有被任何RNA聚合酶識(shí)別的序列，所述的RNA聚合酶包括線粒體RNA聚合酶、RNA pol I、RNA pol II和RNA pol III。這些載體可以用來在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄想要的RNA分子。將植物轉(zhuǎn)化載體理解為適用于植物轉(zhuǎn)化過程中的載體。野生型就生物、多肽或核酸序列而言，術(shù)語“野生型”、“天然”或“天然來源”意指所述生物是天然存在的或是在至少一種天然存在生物中可獲得的，其沒有被改變、突變或受人類操作。
遍及本申請(qǐng)書所引用的全部參考資料的內(nèi)容因而通常并相對(duì)于上文所提及的其具體公開內(nèi)容通過引用方式并入。附1 導(dǎo)致ARA、EPA和DHA產(chǎn)生的不同酶活性的示意圖。圖2 用于逐步建立本發(fā)明的植物表達(dá)質(zhì)粒的策略。實(shí)施例4中給出了具體的描述?？s寫=Nco I、Pac I,Kas I,Sfo I,Fse I,Sbf I,Xma I,Not I 表示用于克隆的限制性核酸內(nèi)切酶；attLx和attRx-其中χ是從1至4的數(shù)字-指用于Multisite Gateway 系統(tǒng)(Invitrogen)的位點(diǎn)特異性重組的附著位點(diǎn)；pENTR_A、pENTR_B、pENTR_C是MultisiteGateway 系統(tǒng)-進(jìn)入載體；Kan (卡那霉素)和Mi^p (鏈霉素)指用于克隆的抗生素選擇標(biāo)記；ori-復(fù)制起點(diǎn)。圖 3 植物表達(dá)載體 VC-LJB913-lqcz (SEQ-ID 38)、VC-LJB1327_lqcz (SEQ-ID39)、VC-LJB2003-lqcz(SEQ_ID 40)和 VC-LJB2197_lqcz (SEQ-ID 146)的功能性元件(啟動(dòng)子、NEENA、基因、終止子)的方向和組合。實(shí)施例實(shí)施例1 一般克隆方法如 Sambrook 等人(1989)(Cold Spring Harbor Laboratory Press :ISBN0-87965-309-6)中所述進(jìn)行諸多克隆方法，例如，使用限制性核酸內(nèi)切酶在特定位點(diǎn)切割雙鏈DNA、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段的純化、轉(zhuǎn)移核酸到硝酸纖維素膜和尼龍膜上，連接DNA片段、轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞和細(xì)菌的培養(yǎng)。使用Wmsion 高保真DNA聚合酶(NEB，法蘭克福，德國)，根據(jù)制造商的說明，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。通常，設(shè)計(jì)在PCR中使用的引物，從而該引物3’端的至少20個(gè)核苷酸與模板完美復(fù)性以擴(kuò)增。通過連接識(shí)別位點(diǎn)的相應(yīng)核苷酸至引物5，端來添加限制性位點(diǎn)。使用例如由K. Heckman和L. R. Pease, NatureProtocols (2207) 2，924-932描述的融合PCR作為備選方法以連接兩個(gè)目的片段，例如，連接啟動(dòng)子至基因或連接基因至終止子。實(shí)施例2 重組DNA的序列分析使用激光-熒光DNA 測(cè)序儀(Applied Biosystems Inc, USA)，采用 Sanger 法(Sanger 等人(1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74,5463-5467)進(jìn)行重組 DNA 分子的測(cè)序。將攜帶通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得的片段的表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行測(cè)序，以證實(shí)由啟動(dòng)子、待表達(dá)核酸分子和終止子組成的表達(dá)盒的正確性以避免可能因克隆期間操作DNA所致的突變，例如，歸咎于不正確的引物、因紫外線暴露所致的突變或聚合酶引起的錯(cuò)誤。實(shí)施例3 從具有種子偏好性表達(dá)的基因中鑒定增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)3. 1從擬南芥基因鑒定NEENA分子使用公開可獲得的基因組DNA序列(例如http //www. ncbi. nlm. nih. gov/genomes/PLANTS/PlantList. html)禾口轉(zhuǎn)錄物表達(dá)數(shù)據(jù)(例如 http //www. weiRelworld.orR/resources/microarray/AtGenExpress/)，選出源自具有種子偏好性表達(dá)的擬南芥轉(zhuǎn)錄物中的一組19個(gè)NEENA候選物用于詳細(xì)的分析。候選物命名如下表1 種子特異性NEENA候選物(NEENA)NEENA名稱基因座注釋SEQ IDNONEENAsslAtlg62290天冬氛酰蛋白酶家族蛋白6NEENAss2Atlg65090表達(dá)的蛋白質(zhì)7NEENAssl5At2g27040含有PAZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)9NEENAssl8Atlg01170推定的臭M答性脅到目關(guān)蛋白10
權(quán)利要求
1.ー種多核苷酸，其包含a)編碼具有去飽和酶或延伸酶活性的多肽的至少ー個(gè)核酸序列；b)與a)中定義的所述核酸序列有效連接的至少ー個(gè)種子特異性植物啟動(dòng)子；c)與所述核酸序列有效連接的至少ー個(gè)終止子序列，和d)與所述啟動(dòng)子功能性連接并且與所述啟動(dòng)子和與a)中定義的所述多肽為異源的一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENA)分子。
2.權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其包含e)編碼具有酮酰還原酶活性的多肽的至少ー個(gè)核酸序列；f)編碼具有脫水酶活性的多肽的至少ー個(gè)核酸序列；和/或g)編碼具有烯酰輔酶A還原酶活性的多肽的至少ー個(gè)核酸序列，其中e)至g)中定義的核酸序列相對(duì)于具有去飽和酶或延伸酶活性的所述多肽是異源的。
3.權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸，其包含編碼具有?；D(zhuǎn)移酶活性的多肽的至少ー 個(gè)核酸序列，其中所述核酸序列相對(duì)于具有去飽和酶、延伸酶、β -酮酰還原酶、脫水酶或烯酰輔酶A還原酶活性的所述多肽是異源的。
4.包含權(quán)利要求1至3所述的多核苷酸的載體。
5.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求1至3所述的多核苷酸或權(quán)利要求4所述的載體。
6.一種用于生產(chǎn)由權(quán)利要求1至3所述多核苷酸編碼的多肽的方法，包括a)在允許產(chǎn)生所述多肽的條件下培育權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞；和b)從步驟a)的宿主細(xì)胞獲得多肽。
7.ー種非人轉(zhuǎn)基因生物，其包含權(quán)利要求1至3所述的多核苷酸或權(quán)利要求4所述的載體。
8.權(quán)利要求7所述的非人轉(zhuǎn)基因生物，其是植物或植物部分。
9.一種用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，包括a)在允許在所述宿主細(xì)胞中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的條件下培育權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞；和b)從所述宿主細(xì)胞獲得所述多不飽和脂肪酸。
10.一種用于生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的方法，包括a)在允許于所述非人轉(zhuǎn)基因生物中產(chǎn)生多不飽和脂肪酸的條件下培育權(quán)利要求7或8 所述的非人轉(zhuǎn)基因生物；和b)從所述非人轉(zhuǎn)基因生物獲得所述多不飽和脂肪酸。
11.權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述的多不飽和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)、 二十碳五烯酸(EPA)或二十ニ碳六烯酸(DHA)。
12.ー種用于生產(chǎn)油、脂類或脂肪酸組合物的方法，包括權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)所述方法的步驟和將多不飽和脂肪酸配制為油、脂類或脂肪酸組合物的進(jìn)ー步的步驟。
13.權(quán)利要求1至3中定義的多核苷酸或權(quán)利要求4中定義的包含所述多核苷酸的重組載體的用途，用于增強(qiáng)植物或其部分中權(quán)利要求1至3中定義的多不飽和脂肪酸生物合成途徑的至少ー種酶的表達(dá)。
14.權(quán)利要求5中所述的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞培養(yǎng)物或權(quán)利要求7或8中所述的非人轉(zhuǎn)基因生物、源自所述轉(zhuǎn)基因非人生物或植物的轉(zhuǎn)基因植物、植物部分或植物種子的用途， 用于生產(chǎn)食物、動(dòng)物飼料、種子、藥物或精細(xì)化學(xué)品。
全文摘要
本發(fā)明原則上涉及脂肪酸的重組生產(chǎn)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了新的核酸分子，其包含編碼脂肪酸去飽和酶、延伸酶、酰基轉(zhuǎn)移酶的核酸序列、與所述核酸序列有效連接的終止子序列和高表達(dá)的種子特異性啟動(dòng)子，其中增強(qiáng)核酸表達(dá)的核酸(NEENAs)與所述啟動(dòng)子功能性連接。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102597245SQ201080049255
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月31日
發(fā)明者J·M·庫恩, J·鮑爾, T·森杰 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司