專利名稱：通過抑制針對膠原基因的天然反義轉(zhuǎn)錄物來治療膠原基因相關(guān)的疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請要求保護提交于2009年6月16日的美國臨時專利申請61/187，384、提交于2009年12月16日的美國臨時專利申請第61/286，939號和提交于2009年12月16日的美國臨時專利申請第61/286，965號的優(yōu)先權(quán)，所述申請通過引用以其整體結(jié)合于本文中。本發(fā)明的實施方案包括調(diào)節(jié)膠原基因和相關(guān)分子的表達和/或功能的寡核苷酸。
背景技術(shù)：
DNA-RNA和RNA-RNA雜交對于核酸功能的許多方面(包括DNA復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯)而言為重要的。雜交對于探測特定核酸或者改變其表達的各種技術(shù)而言亦為主要的。反義核苷酸例如通過與靶RNA雜交來擾亂基因表達，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復制。反義DNA具有附加的特征，該特征為DNA-RNA雜合體充當核糖核酸酶H消化的底物，該活·性存在于大多數(shù)細胞類型中。可將反義分子遞送到細胞中，這與寡脫氧核苷酸(ODN)的情況一祥，或者它們?nèi)鏡NA分子ー樣可由內(nèi)源基因表達。FDA最近批準了ー種反義藥物，VITRAVENE (用于治療巨細胞病毒視網(wǎng)膜炎)，這反映了反義物具有治療應用。發(fā)明概述在一個實施方案中，本發(fā)明提供通過使用靶定天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的反義寡核苷酸來抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用，引起相應有義基因的増量調(diào)節(jié)的方法。本文也考慮天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可通過siRNA、核酶和小分子來達到，認為所述siRNA、核酶和小分子在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。—個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中的膠原基因多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補序列具有至少50%的序列同一性，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO 4的核苷酸1-387、SEQ ID NO 5的核苷酸1-561、SEQID NO 6 的核苷酸 1-335、SEQ ID NO 7 的核苷酸 1-613、SEQ ID NO 8 的核苷酸 1-177 和SEQ ID NO 9的核苷酸1-285之內(nèi)的5_30個連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。在另ー個實施方案中，寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸的天然反義序列，例如SEQID NO :4-9所述的核苷酸，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :10-29所述。另ー個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義物的反向互補序列具有至少50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。另ー個實施方案提供在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括使所述細胞或組織與長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與膠原基因反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。在一個實施方案中，組合物包含一·種或多種與有義和/或反義膠原基因多核苷酸結(jié)合的反義寡核苷酸。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經(jīng)修飾或取代的核苷酸。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸包含一個或多個經(jīng)修飾的鍵。在又一個實施方案中，所述修飾核苷酸包含經(jīng)修飾的堿基，其包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’ -0-甲基、氟-或碳、亞甲基或其他鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選地，所述修飾核苷酸為鎖定核酸分子，包括a -L-LNA。在另一個實施方案中，將所述寡核苷酸經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)施用給患者。在另一個實施方案中，將所述寡核苷酸在藥物組合物中施用。治療方案包括至少一次給患者施用反義化合物；然而，可將此治療修改成在一段時間內(nèi)包含多個劑量。所述治療可與一種或多種其它類型的療法組合。在另一個實施方案中，將所述寡核苷酸封裝到脂質(zhì)體中或附著于載體分子(例如膽固醇、TAT肽)。其它方面描述于下文。附圖
簡述圖I為實時PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理IfepG2細胞后Collal mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine2000引入。實時PCR結(jié)果顯示，IfepG2細胞中Collal mRNA的水平在用針對Collal反義物DW440457設計的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加。表示為⑶R-1361至⑶R-1364的條分別對應于用SEQ ID NO :10-13處理的樣品。圖2為實時PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理HUVEC細胞后Colla2 mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine2000引入。實時PCR結(jié)果顯示HUVEC細胞中Colla2 mRNA的水平在用針對Colla2反義物Hs. 571263設計的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加。表示為CUR-0862、CUR-0864、CUR-0863、CUR-0865、CUR-0866 和 CUR-CUR-0867 的條分別對應于用 SEQ ID NO :14-19 處理的樣品。圖3為實時PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理HUVEC細胞后Col7al mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine2000引入。實時PCR結(jié)果顯示HUVEC細胞中Col7al mRNA的水平在用針對Col7al設計為CV425857(CV425857. 1UCV425857. 12)的 siRNA 之一和針對 BU615800. 1(BU615800. 11)的一種 siRNA 處理后 48h 顯著增加。表示為 CUR-0356、CUR-0358、CUR_0360 和 CUR-0362 的條分別對應于用SEQ ID NO 20-23處理的樣品。圖4為實時PCR結(jié)果的圖表，顯示相比于對照，用硫代磷酸寡核苷酸處理IfepG2細胞后Col7al mRNA的倍數(shù)變化+標準偏差，所述硫代磷酸寡核苷酸使用Lipofectamine2000引入。實時PCR結(jié)果顯示，IfepG2細胞中Col7al mRNA的水平在用針對Col7al設計為be 142537和bg998538的兩種寡核苷酸處理后48h顯著增加。表示為CUR-0360和CUR-0856至CUR-0860的條分別對應于用SEQ ID NO 22和SEQID NO 24-28處理的樣品。序列表描述SEQ ID NO 1 :人類(Homo sapiens)膠原，I 型，a I (COLlAl) ,mRNA(NCBI 檢索號NM_000088. 3)。SEQ ID NO 2 :人類膠原，I 型，a 2 (C0L1A2)，mRNA (NCBI 檢索號NM_000089. 3)。SEQ ID NO 3 NM_024013. 11 人類膠原，VII 型，a I (C0L7A1)，mRNA(NCBI 檢索號NM_000094. 3)。SEQ ID NO :4_9 SEQ ID NO 4 :天然 COLlAl 反義序列(DW440457)； SEQ ID NO 5 :天然 C0L1A2 反義序列(Hs. 571263) ；SEQ ID NO 6 :天然 C0L7A1 反義序列(CV425857. I) ；SEQ ID NO 7 :天然 C0L7A1 反義序列(BU615800. I) ；SEQ ID NO 8 天然 C0L7A1 反義序列(BE142537)和 SEQ ID NO 9 :天然 C0L7A1 反義序列(BG998538)。SEQ ID NO 10-29——反義寡核苷酸?！畆’指RNA而*指硫代磷酸酯鍵。SEQ ID NO :30-33分別為反義寡核苷酸SEQ ID NO :20-23的反向互補序列?！畆’指 RNA。發(fā)明詳述參考用于說明的示例應用在下文中描述本發(fā)明的數(shù)個方面。應當理解的是，陳述許多具體細節(jié)、關(guān)系和方法來提供對本發(fā)明的充分理解。然而，在相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認識到，可在不含一個或多個具體細節(jié)的情況下實施本發(fā)明或者可用其他方法來實施本發(fā)明。本發(fā)明不受行為或事件的排序限制，因為一些行為可以不同的順序進行和/或與其他行為或事件同時進行。此外，并非所有說明性的行為或事件對實施本發(fā)明的方法都為必需的。意圖本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物對應于來自任何物種的同源物，對該物種而言本文公開的組合物和方法為適用的。因此，該術(shù)語包括但不限于來自人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。理解的是，當公開來自具體物種的基因或基因產(chǎn)物時，意圖此公開僅為示例性的，并且除非其出現(xiàn)的文段中明確指示，否則不應理解為限制。因此，例如，對于本文公開的在一些實施方案中有關(guān)哺乳動物核酸和氨基酸序列的基因而言，意圖包括來自其他動物(包括但不限于其他哺乳動物、魚類、兩棲動物、爬行動物和鳥類)的同源和/或直向同源基因和基因產(chǎn)物。在實施方案中，所述基因或核酸序列為人的。定義本文所用的術(shù)語僅以描述具體的實施方案為目的而不意圖限制本發(fā)明。除非文段另有明確指示，否則也意圖本文所用的單數(shù)形式“一”、“一個”和“所述”包括復數(shù)形式。此夕卜，就術(shù)語“包括的”、“包括”、“具有的”、“具有”、“含有”或其變型在詳述和/或權(quán)利要求中所用的程度而言，意圖這類術(shù)語以類似于術(shù)語“包含”的方式為包括在內(nèi)的。術(shù)語“約”或“大約”意為在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)，這部分取決于該值是如何測定或確定的，即，測量系統(tǒng)的限制。例如，按照本領(lǐng)域的實踐，“約”可意為在I個或大于I個標準偏差之內(nèi)?；蛘?，“約”可意為高達給定值的20 %，優(yōu)選10 %，更優(yōu)選5 %，和還更優(yōu)選I %的范圍。或者，具體地關(guān)于生物系統(tǒng)或過程，該術(shù)語可意為在值的數(shù)量級之內(nèi)，優(yōu)選在值的5倍之內(nèi)，更優(yōu)選在2倍之內(nèi)。當本申請和權(quán)利要求描述具體值時，除非另作說明，否則應假設術(shù)語“約”意為在具體值的可接受誤差范圍之內(nèi)。本文所用的術(shù)語“mRNA”意為目前已知的靶定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物，以及任何可闡明的其它轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x寡核苷酸”或“反義化合物”意為與另一個RNA或DNA (靶RNA、DNA)結(jié)合的RNA或DNA分子。例如，如果其為RNA寡核苷酸，則其通過RNA-RNA相互作用結(jié)合另一個RNA靶標并改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)特定多核苷酸的表達和/或功能。該定義意在包括從治療、診斷或其他觀點來看有用的任何外源RNA或DNA分子。這類分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘餌RNA分子、siRNA、 酶促RNA、治療用編輯RNA (therapeutic editing RNA)以及激動劑和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接物(alternate splicer)、引物、探針以及其他與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。因此，可將這些化合物以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的文段中，術(shù)語“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的寡聚物或聚合物。術(shù)語“寡核苷酸”，也包括天然和/或經(jīng)修飾單體或鍵(linkage)的線性或環(huán)狀寡聚物，包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和a _異頭物形式、肽核酸(PM)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過單體與單體相互作用的規(guī)律模式(例如沃森-克里克(Watson-Crick)型堿基配對、Ho6gSteen或反HoGgsteen型堿基配對等)特異地結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可為“嵌合的”，即，由不同的區(qū)組成。在本發(fā)明的文段中，“嵌合的”化合物為寡核苷酸，其包含兩個或更多個化學區(qū)，例如，DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等。每個化學區(qū)由至少一個單體單元(即，在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸典型地包含至少一個區(qū)，其中所述寡核苷酸為經(jīng)修飾的以表現(xiàn)出一種或多種所需特性。寡核苷酸的所需特性包括但不限于，例如增強的對核酸酶降解的抗性、增強的細胞攝取和/或增強的對靶核酸的結(jié)合親和力。因此寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同的特性。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種或更多種如上所述的寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結(jié)構(gòu)。寡核苷酸可由可“全符合狀態(tài)(in “register”)”地連接或通過間隔物連接的區(qū)組成，所述“全符合狀態(tài)”地連接即此時單體像在天然DNA—樣連續(xù)地連接。所述間隔物意在構(gòu)成區(qū)之間的共價“橋”，并在一些情況下具有不超過約100個碳原子的長度。所述間隔物可攜帶不同的功能性，例如具有正或負電荷、具有特殊的核酸結(jié)合特性(嵌入劑、溝結(jié)合劑、毒素、熒光團等)、為親脂的、誘導特殊的二級結(jié)構(gòu)如例如誘導a -螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用的“膠原基因”包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用的措詞膠原I型a I ;膠原a-l(I)、C0L1A1、a-1 I型膠原、膠原a-I (I)鏈、014，在文獻中被認為是相同的且在本申請中可交換地使用。本文所用的措詞膠原a -2(1)、“膠原I型a 2”、膠原a 2⑴、a _2 I型膠原、膠原a -2(1)鏈和C0L1A2在文獻中被認為是相同的且在本申請中可交換地使用。
本文所用的措詞膠原a -I (VII)鏈、C0L7A1、EBDl、EBDCT, EBRl、LC膠原、長鏈膠原在文獻中被認為是相同的且在本申請中可交換地使用。本文所用的術(shù)語“對......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復合體，或(ii)能夠與祀定基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。復合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計算和/或體外測定來確定。用于確定雜交復合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測定法描述于下文實施例中。本文所用的術(shù)語“靶核酸”包括DNA、從這類DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前mRNA和mRNA)以及從這類RNA衍生的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾核酸的正常功能。這種通過特異地與靶核酸雜交的化合物對該靶核酸功能的調(diào)節(jié)，一般稱為“反義”。待干擾的DNA功能包括例如復制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的 RNA功能,包括所有的生活機能,例如,RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進的催化活性。對靶核酸功能的這類干擾的整體效果為對編碼產(chǎn)物或寡核苷酸表達的調(diào)節(jié)。RNA干擾“RNAi”由雙鏈RNA (dsRNA)分子介導，該分子具有與其“靶”核酸序列的序列特異性同源性。在本發(fā)明的某些實施方案中，介體為5-25個核苷酸的“小干擾”RNA雙鏈體(siRNA)。siRNA通過稱為切酶的RNA酶對dsRNA的加工得到。siRNA雙鏈體產(chǎn)物募集到叫做RISC(RNA誘導的沉默復合體)的多蛋白siRNA復合體中。不希望受任何具體理論所約束，認為隨后RISC被引向靶核酸(適當?shù)貫閙RNA)，在此處siRNA雙鏈體以序列特異性的方式相互作用來介導催化方式的切割。可依照本發(fā)明使用的小干擾RNA，可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知和普通技術(shù)人員熟悉的程序來合成和使用。用于本發(fā)明的方法中的小干擾RNA適當?shù)匕sI-約50個核苷酸(nt)。在非限制性實施方案的實例中，siRNA可包含約5-約40nt、約5-約30nt、約10-約30nt、約15-約25nt、或約20-25個核苷酸。適當寡核苷酸的挑選通過使用電腦程序來促進，該程序自動比對核酸序列并指出具有同一性或同源性的區(qū)。將這類程序用于比較例如通過搜索諸如GenBank等數(shù)據(jù)庫或通過測序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。對來自一系列物種的核酸序列的比較，允許選擇在物種之間顯示適度同一性的核酸序列。在未測序基因的情況下，進行DNA印跡來確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。如本領(lǐng)域眾所周知的，通過在不同的嚴格程度下進行DNA印跡，可能獲得同一性的近似衡量。這些程序允許選擇以下寡核苷酸，其對待控制的受試者中的靶核酸序列表現(xiàn)出高度的互補性，并且對其他物種中的相應核酸序列表現(xiàn)出較低程度的互補性。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，在挑選用于本發(fā)明的適當?shù)幕騾^(qū)方面具有相當大的自由?！懊复賀NA”意為具有酶活性的RNA分子。酶促核酸(核酶)通過首先結(jié)合靶RNA來起作用。這類結(jié)合通過酶促核酸的靶結(jié)合部分進行，所述靶結(jié)合部分保持緊密靠近進行切割靶RNA的分子的酶部分。因此，酶促核酸首先識別而后通過堿基配對結(jié)合靶RNA，且一旦結(jié)合到正確的位點，即進行酶促切割靶RNA?！罢T餌RNA”意為模擬配體的天然結(jié)合域的RNA分子。因此誘餌RNA與天然結(jié)合靶標競爭結(jié)合特異性配體。例如，已顯示HIV反式激活應答(TAR)RNA的過表達可充當“誘餌”并有效地結(jié)合HIV tat蛋白，從而阻止其結(jié)合到在HIV RNA中編碼的TAR序列。這意指特定的實例。本領(lǐng)域人員將認識到，這只是一個實例，而其他的實施方案可使用本領(lǐng)域一般已知的技術(shù)容易地產(chǎn)生。本文所用的術(shù)語“單體”通常指以下單體，其通過磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小范圍從少量單體單元(例如從約3-4)到約數(shù)百個單體單元的寡核苷酸。磷酸二酯鍵的類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯、氨基磷酸酯等，如下文更充分地描述。術(shù)語“核苷酸”涵蓋天然存在的核苷酸和非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應清楚的是，先前認為“非天然存在”的多種核苷酸后來已在自然中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知的含嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且還包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其他類型的核苷酸的說明性實例為以下分子，其含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮雜黃嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N4, N4-橋亞乙基胞嘧啶(ethanocytosin)、N6, N6-橋亞乙基_2，6_ 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5-(C3-C6)_炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶、2-羥基-5-甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷，和在美國專利第5，432，272號中描述的“非·天然存在的”核苷酸。術(shù)語“核苷酸”意在涵蓋這些實例以及其類似物和互變異構(gòu)體中的每一個和全部。尤其令人關(guān)注的核苷酸為含腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，其被認為是有關(guān)人中的治療和診斷應用的天然存在核苷酸。核苷酸包含天然2，-脫氧和 2，-輕基糖，例如，如 Kornberg 和 Baker,DNA 復制(DNA Replication),第 2 版(Freeman, San Francisco, 1992)中所述的以及其類似物。提及核苷酸的“類似物”包括具有經(jīng)修飾的堿基部分和/或經(jīng)修飾的糖部分的合成核苷酸。這類類似物包括設計以增強結(jié)合特性的合成核苷酸，所述結(jié)合特性為例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等。本文所用的“雜交”意為寡聚化合物的基本上互補鏈的配對。一種配對的機理涉及寡聚化合物的鏈的互補核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵合，其可為沃森-克里克、Hodgsteen或反HoOgsteen氫鍵合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶為互補的核苷酸，其通過形成氫鍵配對。雜交可在各種環(huán)境下進行。反義化合物為“可特異地雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而導致功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補性來避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測定或治療性處理情況中的生理條件下，以及在體外測定情況下進行測定的條件下。本文所用的短語“嚴格雜交條件”或“嚴格條件”是指以下條件，在該條件下本發(fā)明的化合物與其靶序列雜交，但與最少數(shù)量的其他序列雜交。嚴格條件為序列依賴的且在不同環(huán)境下將不同，在本發(fā)明的文段中，在其下寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴格條件”由寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及正在其中研究它們的試驗來確定。一般而言，嚴格雜交條件包括低濃度(< 0. 15M)的含有諸如Na++或K++等無機陽離子的鹽(即，低離子強度)、溫度高于20°C _25°C、低于寡聚化合物靶序列復合體的Tm，以及存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜，或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，雜交率對于每I %甲酰胺減少I. I %。高嚴格雜交條件的實例為0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. 1% (w/v)SDS、60°C下達30分鐘。
本文所用的“互補的”是指在一條或兩條寡聚鏈上兩個核苷酸之間精確配對的能力。例如，如果在反義化合物的某個位置上的核堿基能夠與在靶核酸的某個位置上的核堿基氫鍵合，所述靶核酸為DNA、RNA或寡核苷酸分子，則認為所述寡核苷酸和所述靶核酸之間氫鍵合的位置為互補位置。當可彼此氫鍵合的核苷酸占據(jù)了每個分子中足夠數(shù)量的互補位置時，寡聚化合物和另外的DNA、RNA或寡核苷酸分子為彼此互補的。因此，“可特異性雜交的”和“互補的”為以下術(shù)語，其用于表示在足夠數(shù)量的核苷酸上有足夠程度的精確配對或互補性，使得穩(wěn)定和特異 的結(jié)合發(fā)生在寡聚化合物和靶核酸之間。據(jù)本領(lǐng)域了解，寡聚化合物的序列不需要與其可特異雜交的靶核酸的序列100%互補。此外，寡核苷酸可在一個或多個區(qū)段上雜交，使得間插或鄰近的區(qū)段不涉及雜交事件(例如，環(huán)結(jié)構(gòu)、錯配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明的寡聚化合物包含與其靶定的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%的序列互補性。例如，其中反義化合物的20個核苷酸中有18個與靶區(qū)互補且因而會特異地雜交的反義化合物，表示90%互補性。在此實例中，余下的非互補核苷酸可與互補核苷酸是聚簇或散布的且不需要彼此鄰接或鄰接互補核苷酸。因此，長度為18個核苷酸的反義化合物具有4 (四)個非互補核苷酸，該非互補核苷酸位于與靶核酸完全互補的兩個區(qū)的側(cè)翼，所述反義化合物會具有與靶核酸77. 8%的總互補性，因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸區(qū)的互補性百分比可使用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基本局部比對搜索工具)和PowerBLAST程序常規(guī)地確定。同源性、序列同一性或互補性百分比可通過例如Gap程序(Wisconsin序列分析包，Unix操作系統(tǒng)版本8, GeneticsComputer Group, University Research Park, Madison ffis.)使用默認設置來確定，該程序使用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. AppI. Math.，(1981) 2,482-489)。本文所用的術(shù)語“解鏈溫度(Tm) ”是指以下溫度，在限定的離子強度、pH和核酸濃度下，在該溫度下平衡時50%與靶序列互補的寡核苷酸與靶序列雜交。典型地，嚴格條件為以下條件，其中鹽濃度至少為約0. 01-1. OM Na離子濃度(或其他鹽)，pH 7. 0-8. 3且溫度對于短寡核苷酸(例如，10-50個核苷酸)而言至少為約30°C。嚴格條件也可通過外加諸如甲酰胺等去穩(wěn)定劑來達到。本文所用的“調(diào)節(jié)”意為在基因表達方面的增加(刺激)或減少(抑制)。術(shù)語“變體”，當用于多核苷酸序列的文段中時，可包括有關(guān)野生型基因的多核苷酸序列。此定義也可包括，例如，“等位基因的”、“剪接”、“物種”或“多態(tài)的”變體。剪接變體可具有與參比分子顯著的同一性，但因為在mRNA加工期間外顯子的可變剪接而一般具有更多或更少數(shù)量的多核苷酸。對應的多肽可具有附加的功能域或不存在域。物種變體為在不同物種之間不同的多核苷酸序列。本發(fā)明中尤其實用的是野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可由核酸序列中的至少一個突變產(chǎn)生并可導致產(chǎn)生改變的mRNA或者其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不變的多肽。任何給定的天然或重組基因可不具有、具有一個或許多等位基因形式。產(chǎn)生變體的常見突變變化一般歸因于核苷酸的自然缺失、添加或取代。這些變化類型中的每一個可單獨或與其他類型聯(lián)合發(fā)生，在給定序列中發(fā)生一次或多次。產(chǎn)生的多肽一般將具有相對于彼此的顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體為在給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列的變化。多態(tài)變體也可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單堿基突變，其中多核苷酸序列因一個堿基而不同。SNP的存在可指示例如具有疾病狀態(tài)傾向(即與抗性相對的易感性)的某個群體。衍生多核苷酸包括經(jīng)過化學修飾的核酸，例如用烷基、?；虬被脫Q氫。衍生物(例如，衍生寡核苷酸)可包含非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這些中示例性的是硫代磷酸酯及本領(lǐng)域已知的其他含硫的種類。衍生核酸也可含有標記，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。“衍生的”多肽或肽為經(jīng)修飾的多肽或肽，例如，通過糖基化、聚乙二醇化、磷酸化作用、硫酸鹽化作用、還原/烷基化、酰化、化學偶聯(lián)或溫性福爾馬林處理。也可將衍生物修飾以含有可檢測標記(直接地或間接地)，包括但不限于放射性同位素、熒光和酶標記。本文所用的術(shù)語“動物”或“患者”意在包括例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、紹、哺乳動物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥、雞、爬行動物、魚、昆蟲和蜘蛛類。

“哺乳動物”涵蓋通常在醫(yī)療護理下的溫血哺乳動物(例如，人和馴養(yǎng)動物)。實例包括貓科動物、犬、馬、?？苿游锖腿?，以及僅僅人。“處理”或“治療”涵蓋對哺乳動物中疾病狀態(tài)的治療，并包括(a)防止疾病狀態(tài)出現(xiàn)于哺乳動物中，特別是當這類哺乳動物傾向于疾病狀態(tài)但尚未診斷為患有該疾病狀態(tài)時；(b)抑制疾病狀態(tài)，例如，阻止其發(fā)展；和/或(C)減輕疾病狀態(tài)，例如，引起疾病狀態(tài)的退行直到達到所需的終末點。治療也包括改善疾病的癥狀(例如，減少疼痛或不適)，其中這類改善可直接或可非直接地影響疾病(例如，原因、傳遞、表達等)。本文所用的“癌癥”是指在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥或新生物或惡性腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥自身表現(xiàn)為包含癌癥惡性細胞的“腫瘤”或組織。腫瘤的實例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏腫瘤(Wilms' tumor)、子宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經(jīng)細胞瘤和視網(wǎng)膜母細胞瘤。可通過依照本發(fā)明的公開組合物治療的其它癌癥，包括但不限于，例如，何杰金病(Hodgkin' sDisease)、非何杰金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、成神經(jīng)細胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細胞肺腫瘤、原發(fā)性腦腫瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰腺胰島素瘤(insulanoma)、惡性類癌、膀胱癌、惡化前皮膚病損、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、成神經(jīng)細胞瘤、食管癌、生殖泌尿道癌、惡性高鈣血癥、子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺癌?！吧窠?jīng)疾病或病癥”是指神經(jīng)系統(tǒng)和/或視覺系統(tǒng)的任何疾病或病癥?！吧窠?jīng)疾病或病癥”包括涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦、腦干和小腦)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)(包括腦神經(jīng))和自主神經(jīng)系統(tǒng)(其部分位于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)_■者中)的疾病或病癥。神經(jīng)病癥的實例包括但不限于，頭痛、木僵和昏迷、癡呆、發(fā)作、睡眠障礙、創(chuàng)傷、感染、新生物、神經(jīng)眼科學、運動障礙、脫髓鞘病、脊髓病癥、以及周圍神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌肉接點的病癥。成癮和精神病也包含在神經(jīng)病癥的定義中，包括但不限于，雙相性精神障礙和精神分裂癥。以下為可使用依照本發(fā)明的組合物和方法治療的數(shù)種神經(jīng)病癥、癥狀、體征和綜合征的清單獲得性癲癇樣失語癥；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；年齡相關(guān)性黃斑變性；胼胝體發(fā)育不全；失認癥；艾卡迪綜合征；亞歷山大病；阿爾拍斯病(Alpers’ disease);交叉性偏癱；血管性癡呆；肌萎縮側(cè)索硬化；無腦畸形；Angelma綜合征；血管瘤病；缺氧；失語癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；阿-基氏腦畸形(Anronl-Chiari malformation);動靜脈畸形；阿斯佩各綜合征；共濟失調(diào)毛細血管擴張癥(ataxia telegiectasia);注意不集中的過度反應癥；孤獨癥；自主神經(jīng)功能障礙；背痛；巴滕??；貝切特??；貝爾氏麻痹；良性自發(fā)性瞼痙攣；良性灶；肌萎縮；良性顱內(nèi)高血壓；賓斯旺格??；瞼痙攣；Bloch Sulzberger綜合征；臂叢損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性成膠質(zhì)細胞瘤)；脊髓腫瘤；布朗-塞卡爾綜合征；卡納萬??；腕管綜合征；灼痛；中樞性疼痛綜合征；腦橋中央髓鞘溶解；頭部病癥(cephalic disorder);腦動脈瘤；腦動脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性癱瘓；夏-馬-圖??；化學療法誘導的神經(jīng)病和神經(jīng)性疼痛；Chiari畸形；舞蹈癥；慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)?。宦酝?；慢性區(qū)域性疼痛綜合征；科-勒綜合征；昏迷，包括持續(xù)性植物狀態(tài)；先天性面癱；皮質(zhì)基底節(jié)變性；顱動脈炎；顱縫早閉；克雅?。焕鄯e性創(chuàng)傷障礙(cumulative trauma disorder);庫興綜合征(Cushing, s syndrome);巨細胞包涵體??； 巨細胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈腳綜合征；丹-沃(DandyWalker)綜合征；Dawson??；德摩西埃綜合征；Dejerine-Klumke麻痹；癡呆；皮肌炎；糖尿病神經(jīng)病變；彌漫性硬化；自主神經(jīng)功能異常；書寫困難；誦讀困難；張力失常；早期幼兒癲癇性腦病；空蝶鞍綜合征；腦炎；腦膨出；腦三叉神經(jīng)血管瘤病；癲癇；歐勃麻痹；特發(fā)性震顫；法布里?。环柧C合征；昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性癲癇發(fā)作；費希爾綜合征；弗里德賴希共濟失調(diào)；額顳癡呆和其它“tau蛋白病變(tauopathies)”；高歇?。桓袼固芈C合征；巨細胞動脈炎；巨細胞性包涵體??；細胞性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；格-巴綜合征；HTLV_1相關(guān)性脊髓?。还?斯?。伙B腦損傷；頭痛；偏側(cè)面肌痙攣；遺傳性痙攣性截癱；多神經(jīng)炎型遺傳性共濟失調(diào)；耳部帶狀皰疹；帶狀皰疹；Hirayama綜合征；HIV相關(guān)性癡呆和神經(jīng)病(還是AIDS的神經(jīng)表現(xiàn))；前腦無裂畸形；亨廷頓舞蹈病和其它聚谷氨酰胺重復疾病(polyglutamine repeat disease ；積水性無腦畸形；腦積水；皮質(zhì)醇增多癥；缺氧；免疫介導的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調(diào)癥；嬰兒植烷酸貯積??；嬰兒雷夫敘姆病；嬰兒性痙攣；炎性肌?。伙B內(nèi)囊腫；顱內(nèi)高血壓；Joubert綜合征；基-塞(Keams-Sayre)綜合征；肯尼迪病Kinsboum綜合征；克-費(Klippel Feil)綜合征；克拉伯?。粠?韋病；庫魯??；拉福拉??；朗-愛(Lambert-Eaton)肌無力綜合征；Landau_Kleffner綜合征；側(cè)髓(瓦倫伯格)綜合征；學習無能；利氏??；Lennox-Gustaut綜合征；累-奈綜合征；腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；路易(Lewy)體癡呆；無腦回；閉鎖綜合征；Lou Gehrig病(即，運動神經(jīng)元病或肌萎縮側(cè)索硬化)；椎間盤疾?。蝗R姆病-神經(jīng)后遺癥；馬-約??；巨腦(macrencephaly);巨腦(megalencephaly);梅-羅綜合征；美尼爾癥；腦膜炎；門克斯??；異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良；小頭畸形；偏頭痛；米勒費希爾綜合征；小中風(mini-stroke);線粒體肌??；默比厄斯綜合征；單肢肌萎縮；運動神經(jīng)元?。荒X底異常血管網(wǎng)??；粘多糖癥；多發(fā)性梗塞性癡呆(milti-infarct dementia)；多病灶運動神經(jīng)?。欢喟l(fā)性硬化和其它脫髓鞘病癥；多系統(tǒng)萎縮伴隨直立性低血壓；P肌肉萎縮癥；重癥肌無力；髓鞘脫失(myelinoclastic)彌漫性硬化；嬰兒肌陣攣性腦病；肌陣攣；肌??；先天性肌強直；發(fā)作性睡??；神經(jīng)纖維瘤病；神經(jīng)阻滯劑惡性綜合征；AIDS的神經(jīng)表現(xiàn)；狼瘡的神經(jīng)后遺癥；神經(jīng)性肌強直；神經(jīng)元臘樣脂褐質(zhì)癥；神經(jīng)元遷移障礙；尼曼-皮克??；0’ Sullivan-McLeod綜合征；枕神經(jīng)痛；隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征；大田原(Ohtahara)綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼肌陣痙攣；視神經(jīng)炎；直立性低血壓；過度使用綜合征；感覺異常；神經(jīng)變性疾病或病癥(帕金森病、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默氏病、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、癡呆、多發(fā)性硬化以及其它和神經(jīng)元細胞死亡有關(guān)的疾病和病癥)；先天性副肌強直；類腫瘤性疾??；發(fā)作性發(fā)作(paroxysmal attacks);帕-羅(Parry Romberg)綜合征；佩-梅??；周期性癱瘓；周圍神經(jīng)?。惶弁葱陨窠?jīng)病和神經(jīng)性疼痛；持續(xù)性植物狀態(tài)；全身性發(fā)育遲緩；感光性噴嚏反射；植烷酸貯積?。黄た瞬。簧窠?jīng)挾捏；垂體瘤；多肌炎；腦穿通畸形；小兒麻痹癥后期綜合征；皰疹后神經(jīng)痛；感染后腦脊髓炎；直立性低血壓；普-韋(Prader-Willi)綜合征；原發(fā)性側(cè)索硬化；朊病毒?。贿M行性一側(cè)面萎縮；進行性多灶性白質(zhì)腦??；進行性硬化性灰質(zhì)萎縮；進行性核上性麻痹；腦假瘤；拉姆齊 亨特綜合征(I型和11型)；拉斯馬森(Rasmussen)腦炎；反射性交感神經(jīng)營養(yǎng)不良綜合征；雷夫敘姆病；反復性運動障礙；反復性應激損傷；腿多動綜合征；逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)性脊髓??；雷特綜合征；雷耶綜合征；舞蹈?。簧５禄舴虿?；謝耳德??；腦裂；視隔發(fā)育不 全(septo-optic dysplasia);驚嚇?gòu)雰壕C合征；帶狀皰疫；希-德綜合征；斯耶格倫綜合征；睡眠性呼吸暫停；索托斯綜合征(Soto' s syndrome);痙攣狀態(tài)；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓瘤；脊髓性肌萎縮；僵人綜合征(Stiff-Person syndrome);中風；斯-韋綜合征；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動脈硬化性腦?。晃鞯录{姆舞蹈??；暈厥；脊髓空洞癥；遲發(fā)性運動障礙；泰-薩?。伙D動脈炎；脊髓栓系綜合征(tethered spinal cord syndrome);肌強直性白內(nèi)障；胸廓出口綜合征；三叉神經(jīng)痛；Todd麻痹；圖雷特綜合癥；短暫性腦缺血發(fā)作；傳染性海綿狀腦病；橫貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經(jīng)痛；熱帶痙攣性輕截癱；結(jié)節(jié)性硬化癥；血管性癡呆(多發(fā)梗塞性癡呆)；血管炎，包括顳動脈炎；希-林(VonHippel-Lindau)??；瓦倫伯格綜合征；韋-霍(Werdnig-Hoffman)?。豁f斯特綜合征；急性頸部扭傷(whiplash);威廉斯綜合征；Wildon??；以及澤爾韋格綜合征?！把装Y”是指全身性炎性病況以及局部地與單核細胞、白細胞和/或中性粒細胞的遷移和吸引有關(guān)的病況。炎癥的實例包括但不限于，因以下引發(fā)的炎癥感染致病生物(包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、病毒、真菌、以及寄生物，例如原生動物和蠕蟲)、移植排斥(包括實質(zhì)器官的排斥，例如腎、肝、心、肺或角膜，以及骨髓移植的排斥，包括移植物抗宿主病(GVHD))或者局限性慢性或急性自身免疫反應或變態(tài)反應。自身免疫性疾病包括急性腎小球腎炎；類風濕性或反應性關(guān)節(jié)炎；慢性腎小球腎炎；炎性腸病，例如克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎和壞死性小腸結(jié)腸炎；與粒細胞輸注有關(guān)的綜合征；炎性皮膚病，例如接觸性皮炎、特應性皮炎、銀屑病；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE);自身免疫性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化、以及糖尿病的某些形式、或任何其它自體免疫狀態(tài)(其中受試者自身免疫系統(tǒng)的攻擊導致病理性組織破壞)。變態(tài)反應包括變應性哮喘、慢性支氣管炎、急性和遲發(fā)型超敏反應。全身性炎性疾病狀態(tài)包括與創(chuàng)傷、燒傷、缺血事件(例如在心、腦、腸或外周脈管系統(tǒng)中的血栓形成事件，包括心肌梗死和中風)后的再灌注、膿毒癥、ARDS或多器官功能障礙綜合征相關(guān)的炎癥。炎性細胞募集也在粥樣硬化斑塊中發(fā)生。炎癥包括但不限于，非何杰金淋巴瘤、韋格納肉芽腫病、橋本甲狀腺炎、肝細胞癌、胸腺萎縮、慢性胰腺炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、反應性淋巴樣增生、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、乳頭狀癌、克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、急性膽囊炎、慢性膽囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宮內(nèi)膜異位(adenomyosis)、子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)、急性子宮頸炎、慢性子宮頸炎、淋巴樣增生、多發(fā)性硬化、繼發(fā)于特發(fā)性血小板減少性紫癜的肥大、原發(fā)性IgA腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病、肺氣腫、慢性腎盂腎炎、以及慢性膀胱炎。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶標在一個實施方案中，靶標包括膠原基因的核酸序列，包括但不限于與膠原基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個實施方案中,祀標包括COLlAl的核酸序列,包括但不限于與COLlAl基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個實施方案中,祀標包括C0L1A2的核酸序列,包括但不限于與C0L1A2基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。
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在一個實施方案中，靶標包括C0L7A1的核酸序列，包括但不限于與C0L7A1基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。I型膠原為脈管系統(tǒng)中最豐富的ECM成分且在斑塊中被大量發(fā)現(xiàn)，其水平影響斑塊的易損性且與動脈粥樣硬化的死亡率和發(fā)病率相關(guān)(Libby P.，等(2000) J. Intern.Med. 247 :349-358 ；Rekhter MD.，(1993) Am. J. Pathol. 143 :1634-1648)。它由兩個相當大的基因產(chǎn)生的兩條a I(I)鏈和一條a 2(1)鏈組成，所述基因位于人和小鼠基因組二者的不同染色體上(Myllyharju, J.，等(2001)Ann. Med. 33,7-21)。I型膠原為原纖維膠原家族的成員且占在骨中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的80-90%。其也在諸如皮膚、韌帶和腱等組織中被大量發(fā)現(xiàn)。C0L1A1基因位于17號染色體長(q)臂的21. 3-22. I位置之間，從堿基對45，616，455到堿基對45，633，991。I型膠原為脈管系統(tǒng)中最豐富的ECM成分且在斑塊中被大量發(fā)現(xiàn)，其水平影響斑塊的易損性且與動脈粥樣硬化的死亡率和發(fā)病率相關(guān)(Libby P.，等(2000) J. Intern.Med. 247 :349-358 ；Rekhter MD.，(1993) Am. J. Pathol. 143 :1634-1648)。它由兩個相當大的基因產(chǎn)生的兩條a I(I)鏈和一條a 2(1)鏈組成，所述基因位于人和小鼠基因組二者的不同染色體上(Myllyharju, J. (2001)Ann. Med. 33, 7-21)。膠原 a 2(1)基因(C0L1A2)位于染色體7q22. I。膠原VII型a I (大皰性表皮松解癥，營養(yǎng)不良性，顯性和隱性)，也稱為C0L7AI，為人基因。此基因編碼VII型膠原的a鏈。由三條完全相同的a膠原鏈組成的VII型膠原原纖維局限在復層鱗狀上皮下的基底區(qū)。它充當外部上皮和下面間質(zhì)之間的固著性原纖維。此基因中的突變與所有形式的營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥有關(guān)。然而在沒有突變時，對VII型膠原的自身免疫應答可導致此疾病的獲得性形式，稱為獲得性大皰性表皮松解癥。在視網(wǎng)膜中也發(fā)現(xiàn)VII型膠原；其在此器官中的功能未知。C0L7A1位于人3號染色體的短臂，在表示為3p21. 31的染色體區(qū)中。所述基因大小為約31，000個堿基對并且因為其編碼序列極度斷裂成118個外顯子而值得注意。C0L7A1轉(zhuǎn)錄成9，287個堿基對的mRNA。在皮膚中，VII型膠原蛋白由角質(zhì)形成細胞和真皮成纖維細胞合成。
營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥(DEB)為臨床異質(zhì)性可遺傳皮膚病癥，以輕微創(chuàng)傷之后皮膚和粘膜的起皰為特征，且具有寬范圍的臨床嚴重性。所有形式均由C0L7AI中的突變引起，所述基因編碼膠原VII。此膠原(固著性原纖維的主要成分)在DEB皮膚中減少或缺失，且固著性原纖維在形態(tài)上改變或缺失并在功能上缺陷。值得注意的是，盡管有顯著的科學成果，但基因突變的全譜以及導致這些視覺性和功能性改變的分子機制仍難以捉摸。全世界而言，DEB影響數(shù)千家庭。因此，對于精確診斷、預測、遺傳咨詢和可靠的產(chǎn)前診斷以及重要地鑒定用于未來基因治療試驗的適宜候選者而言，迫切需要有效的C0L7A1突變檢測。C0L7A1位于3p21區(qū)之內(nèi)并跨越超過30. 5kb。其與其它膠原基因共享結(jié)構(gòu)特征且由118個小外顯子和小內(nèi)含子組成。迄今為止，雖然已報道多于200種不同的突變，但是非常少頻發(fā)突變或熱點為已知的。在一些實施方案中，使用反義寡核苷酸預防或治療與膠原基因家族成員有關(guān)的疾病或病癥?？捎糜衫梅戳x化合物獲得的干細胞再生的細胞/組織治療的示例性膠原基因介導的疾病和病癥包括膠原障礙、年齡相關(guān)的膠原降解、成骨不全、耳硬化(OTSC)、 骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、食管鱗狀上皮細胞癌、軟骨發(fā)育不全、非典型馬方綜合征(atypicalMarfan syndrome)、埃-當綜合征(Ehlers-Danlos syndrome) (EDS)、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥(DEB)、卡菲病、動脈瘤(例如顱內(nèi)動脈瘤)、特發(fā)性肺纖維化、肝硬化、腎纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、硬皮病、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩、癌癥、炎癥、遺傳性疾病(例如杜興肌營養(yǎng)不良)、神經(jīng)疾病或病癥(例如帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、戈謝病(Gaucher disease))、代謝病(例如I型糖尿病)、自身免疫性疾病或病癥、創(chuàng)傷(例如脊髓損傷、燒傷等)、缺血，以及其它血管、心臟、皮膚疾病或病癥，皮膚老化、需要皮膚工程的皮膚疾病或病癥或病況、需要移植的肝臟或腎臟疾??；腱、骨或組織再生；骨骼修復、軟骨和骨修復。在另一個實施方案中，所述反義寡核苷酸調(diào)節(jié)患有與膠原基因有關(guān)的疾病或病癥或處于形成與膠原基因有關(guān)的疾病或病癥的風險中的患者中膠原基因的正常表達和/或正常功能。本發(fā)明的一個實施方案提供基于膠原基因的基質(zhì)組合物，所述組合物包含由膠原原纖維組成的三維純化膠原基質(zhì)，其中通過使膠原原纖維細胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)膠原原纖維細胞中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達本發(fā)明的一個實施方案提供體外、離體或體內(nèi)傷口愈合或組織再生或組織工程的方法，所述方法包括給傷口施用本發(fā)明的胞外基質(zhì)組合物。本發(fā)明的一個實施方案提供制備基于膠原基因的基質(zhì)組合物的方法，包括使膠原原纖維細胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。 本發(fā)明的另一個實施方案提供用于支持干細胞的組合物，所述組合物包含含有膠原原纖維的工程改造的、純化的基于膠原基因的基質(zhì)，以及干細胞群?？蓪⒈景l(fā)明工程改造的、純化的基于膠原的基質(zhì)組合物單獨使用或與細胞聯(lián)合使用，作為組織移植構(gòu)建體增強受損或患病組織的修復。
依照一個實施方案，提供了用于培養(yǎng)干細胞的改進方法。所述方法包括制備如本發(fā)明所提供的具有所需特性的經(jīng)增溶的膠原基因組合物，向經(jīng)增溶的膠原基因組合物中加入細胞和在受控條件下使膠原組合物聚合以提供由膠原原纖維形成并具有所需微觀結(jié)構(gòu)的基質(zhì)。在一個實施方案中將細胞加入基于膠原基因的基質(zhì)中，并在適于增殖所述細胞的條件下培養(yǎng)所述細胞。在實施方案中，將基于膠原基因的基質(zhì)組合物用于預防或治療與損失特定細胞類型或組織有關(guān)的疾病或病癥，所述細胞類型或組織可被由多能干細胞再生的新細胞/組織替換。在實施方案中，將基于膠原基因的基質(zhì)組合物與至少一種選自下列的轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合使用0CT4、c-myc、KLF4和/或Sox2、NANOG, LIN28和從給定成體組織誘導多能干細胞所需的其它轉(zhuǎn)錄因子。可將這些細胞進一步引入損傷中并使其在體外或體內(nèi)分化成所需細胞類型。
可用由利用干細胞和反義化合物從基于膠原基因的基質(zhì)組合物中再生的細胞/組織治療的疾病的實例包括癌癥、遺傳性疾病(例如杜興肌營養(yǎng)不良)、神經(jīng)變性疾病(例如帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、戈謝病)、代謝病(例如I型糖尿病)、創(chuàng)傷(例如脊髓損傷、燒傷，等等)、缺血，以及其它需要移植的血管、心臟、肝臟或腎臟疾病。在實施方案中，也可將基于膠原基因的基質(zhì)組合物用于腱、骨或組織再生；骨骼修復、軟骨、骨修復過程、骨質(zhì)疏松、用于關(guān)節(jié)成形術(shù)的假體等，其可原位注入輕微的無連接性骨折或軟骨損傷中，注入骨質(zhì)疏松個體的體循環(huán)中，或?qū)⑵湮皆谶m當生物材料(膠原、羥磷灰石等)中植入以促進損傷中軟骨或骨形成。此外，可將所述組合物吸附在覆蓋用于髖、膝關(guān)節(jié)成形術(shù)的假體的輕磷灰石(periapatite)中，以增強這些假體在宿主中的生物整合，延長它們的壽命。還可將所述組合物用于脊柱關(guān)節(jié)固定術(shù)以促進脊柱融合和改善通過使用自體移植物或骨庫的標準程序進行的這些程序的效率。在本發(fā)明的實施方案中，給需要皮膚治療的受試者或處于形成使他們需要皮膚治療的病況的風險中的受試者，提供治療和/或美容方案及相關(guān)的定制治療。例如可基于受試者的膠原基因狀態(tài)進行診斷。患者的給定組織例如皮膚中的膠原基因表達水平可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文別處所述的方法確定，例如，通過使用PCR或基于抗體的檢測方法分析組織。本發(fā)明的一個實施方案提供用于皮膚治療和/或美容應用的組合物，所述組合物包含膠原基因反義寡核苷酸，例如以增量調(diào)節(jié)皮膚中膠原基因的表達。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :4-29所述。在實施方案中，用本發(fā)明的寡核苷酸在體內(nèi)處理細胞，以增長細胞壽命或防止凋亡。例如，可如本文所述通過處理皮膚(例如上皮細胞)防止皮膚老化，例如形成皺紋。在一個示例性實施方案中，使皮膚與包含如本文所述的膠原基因反義化合物的藥物或美容組合物接觸。示例性皮膚困擾或皮膚病況包括與炎癥、曬傷或自然老化有關(guān)或由它們引發(fā)的疾病或病癥。例如，所述組合物在預防或治療下列中具有效用接觸性皮炎(包括刺激性接觸性皮炎和變應性接觸性皮炎)、特應性皮炎(也稱為變應性濕疹)、光化性角化病、角質(zhì)化病癥(包括濕疹)、大皰性表皮松解癥(包括penfigus)、剝脫性皮炎、脂溢性皮炎、紅斑(包括多形性紅斑和結(jié)節(jié)性紅斑)、由日光或其它光源引發(fā)的損傷、盤狀紅斑狼瘡、皮肌炎、皮膚癌和自然老化的作用。
在本發(fā)明的實施方案中，包含膠原基因反義寡核苷酸的組合物，例如增量調(diào)節(jié)頭皮中膠原基因的表達并抑制雄激素受體信號轉(zhuǎn)導，從而防止雄激素性脫發(fā)(脫發(fā))。在實施方案中，給患脫發(fā)的患者施用局部或全身制劑。在一個實施方案中，將本文所述的反義寡核苷酸摻入到含有局部載體和包含本領(lǐng)域已知的任何這類材料的局部制劑中，所述局部載體一般適于局部藥物施用。所述局部載體可被挑選以便提供所需形式的組合物，例如作為軟膏劑、洗劑、乳膏劑、微乳劑、凝膠劑、油劑、溶液劑等，以及可由天然存在或合成來源的材料組成。優(yōu)選的是，所選載體對局部制劑的活性劑或其它成分沒有不利影響。用于本文的適宜局部載體的實例包括水、醇和其它無毒有機溶劑、甘油、礦物油、硅酮、石油凝膠、羊毛脂、脂肪酸、植物油、對羥基苯甲酸酯類、蠟等。制劑可為無色無臭的軟膏劑、洗劑、乳膏劑、微乳劑和凝膠劑?？蓪⒈景l(fā)明的反義寡核苷酸摻入到軟膏劑中，所述軟膏劑一般為半固體制劑，其典型地基于礦脂或其它石油衍生物。如將被本領(lǐng)域技術(shù)人員所領(lǐng)會，待使用的特定軟膏 基質(zhì)為這樣的軟膏基質(zhì)，其將提供最佳藥物遞送，并且優(yōu)選地還將提供其它的所需特性，例如，潤滑性等。當使用其它載體或溶媒時，軟膏基質(zhì)應當為惰性、穩(wěn)定、無刺激和非致敏的。如在Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.)中所說明，可將軟膏基質(zhì)分成四類油性基質(zhì)；可乳化基質(zhì)；乳劑基質(zhì)；和水溶性基質(zhì)。油性軟膏基質(zhì)包括例如植物油、獲自動物的脂肪和獲自石油的半固體碳氫化合物。可乳化軟膏基質(zhì)也稱為可吸收軟膏基質(zhì)，含很少水或不含水且包括例如硫酸羥基甘油三硬脂酸酯、無水羊毛脂和親水礦脂。乳劑軟膏基質(zhì)為油包水(W/0)乳劑或水包油(0/W)乳劑，且包括例如鯨蠟醇、單硬脂酸甘油酯、羊毛脂和硬脂酸。示例性水溶性軟膏基質(zhì)由不同分子量的聚乙二醇(PEG)制備(參見，例如上述 Remington' s)?？蓪⒈景l(fā)明的反義寡核苷酸摻入到洗劑中，所述洗劑一般為無摩擦施用給皮膚表面的制劑，且典型地為液體或半流體制劑，其中固體顆粒(包括活性劑)存在于水或醇基質(zhì)中。洗劑通常為固體的混懸劑，且可包含水包油型液體油狀乳劑。因為易于施用流動性較高的組合物，洗劑為用于處理大面積身體區(qū)域的優(yōu)選制劑。一般必需的是，將洗劑中的不溶性物質(zhì)細碎。洗劑將典型地含有助懸劑以形成更好的分散體，和含有用于定域和維持活性劑與皮膚接觸的化合物，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉等。用于與本發(fā)明方法聯(lián)合使用的示例性洗劑包含與親水礦脂混合的丙二醇，例如其可以Aquaphor 商標獲自Beiersdorf，Inc. (Norwalk, Conn.)的?？蓪⒈景l(fā)明的反義寡核苷酸摻入到乳膏劑中，所述乳膏劑一般為水包油或油包水的粘性液體或半固體乳劑，。乳膏基質(zhì)可水洗，且包含油相、乳化劑和水相。油相一般由礦脂和例如鯨蠟醇或硬脂醇等脂肪醇組成；盡管非必須，但水相通常體積超過油相，且一般含有濕潤劑。如上述Remington' s中所說明，乳膏制劑中的乳化劑一般為非離子、陰離子、陽離子或兩性表面活性劑?？蓪⒈景l(fā)明的反義寡核苷酸摻入到微乳劑中，所述微乳劑一般為兩種不混溶液體(例如油和水)的熱力學穩(wěn)定的各向同性澄清分散體，其通過表面活性劑分子的界面膜穩(wěn)定(制藥工藝學百科全書(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology) (New York Marcel Dekker, 1992)，第9卷)。對制備微乳劑而言，表面活性劑(乳化劑)、助表面活性劑(助乳化劑)、油相和水相為必需的。適宜表面活性劑包括用于制備乳劑的任何表面活性齊U，例如典型地用于制備乳膏劑的乳化劑。助表面活性劑(或“助乳化劑”)一般選自聚甘油衍生物、甘油衍生物和脂肪醇。盡管非必須，但優(yōu)選的乳化劑/助乳化劑組合一般選自單硬脂酸甘油酯和聚氧乙烯硬脂酸酯；聚乙二醇和硬脂酸棕櫚酸乙二醇酯；以及辛酸和癸酸甘油三酯和油酸聚乙二醇甘油酯。水相不僅包括水，還典型地包括緩沖液、葡萄糖、丙二醇、聚乙二醇、優(yōu)選低分子量聚乙二醇(例如PEG 300和PEG 400)和/或甘油等，而油相將一般包括例如脂肪酸酯、改性植物油、硅酮油、甘油單酯二酯和三酯的混合物、PEG的單酯和二酯(例如，油酸聚乙二醇甘油酯)等。將本發(fā)明的反義寡核苷酸摻入到凝膠制劑中，所述凝膠制劑一般為由小的無機顆粒構(gòu)成的混懸液(兩相系統(tǒng))或在載液各處基本上均勻分布的大的有機分子(單相凝膠)組成的半固體系統(tǒng)?？赏ㄟ^例如使活性劑、載液和適宜膠凝劑(例如西黃蓍膠(在2-5%)、海藻酸鈉(在2-10 %)、明膠(在2-15%)、甲基 纖維素(在3-5% )、羧甲基纖維素鈉(在2-5% )、卡波姆(在0. 3-5% )或聚乙烯醇(在10-20% ))合并在一起并混合直至產(chǎn)生特征性半固體產(chǎn)物來制作單相凝膠。其它適宜膠凝劑包括甲基羥基纖維素、聚氧乙烯-聚氧丙烯、羥乙基纖維素和明膠。盡管凝膠通常使用水性載液，但是也可將醇和油用作載液?？蓪⒈绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種添加劑包含在制劑例如局部制劑中。添加劑的實例包括但不限于增溶劑、皮膚滲透促進劑、遮光劑、防腐劑(例如抗氧化劑)、膠凝劑、緩沖齊U、表面活性劑(特別是非離子和兩性表面活性劑)、乳化劑、軟化劑、增稠劑、穩(wěn)定劑、濕潤劑、著色劑、香料等。特別優(yōu)選連同乳化劑、軟化劑和防腐劑一起包含增溶劑和/或皮膚滲透促進劑。最佳局部制劑包含大約2%重量-60%重量、優(yōu)選2%重量-50%重量的增溶劑和/或皮膚滲透促進劑；2%重量-50%重量、優(yōu)選2%重量-20%重量的乳化劑；2%重量-20%重量的軟化劑；和0. 01-0. 2%重量的防腐劑，而活性劑和載體(例如水)組成制劑的余下部分。皮膚滲透促進劑用來促進治療水平活性劑的通行以通過合理大小面積的未破損皮膚。適宜促進劑在本領(lǐng)域眾所周知且包括例如低級鏈烷醇，例如甲醇、乙醇和2-丙醇；燒基甲基亞諷，例如~■甲基亞諷(DMSO)、癸甲基亞諷(CltlMSO)和十四燒基甲基亞諷；吡咯烷酮，例如2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮和N-(-羥乙基)吡咯烷酮；尿素；N，N- 二乙基-間-甲苯酰胺；C2-C6鏈烷二醇；雜溶劑，例如二甲基甲酰胺(DMF)、N，N- 二甲基乙酰胺(DMA)和四氫糠醇；以及I-取代氮雜環(huán)庚烷-2-酮、具體為1-n-十二烷基環(huán)氮雜環(huán)庚燒_2_麗(月桂氣罩麗；可以商標AzoneR 獲自Whitby Research Incorporated,Richmond, Va.)。增溶劑的實例包括但不限于下列親水性醚，例如二乙烯二醇單乙醚(乙氧基二甘醇，可市購為Transcutol )和二乙烯二醇單乙醚油酸酯(可市購為Soficutol );聚乙烯蓖麻油衍生物，例如聚氧35蓖麻油、聚氧40氫化蓖麻油等；聚乙二醇、特別是低分子量聚乙二醇，例如PEG 300和PEG 400，以及聚乙二醇衍生物，例如PEG-8辛酸/癸酸甘油酯(可市購為Labrasol );烷基甲基亞砜，例如DMSO ;吡咯烷酮，例如2-吡咯烷酮和N-甲基-2-吡咯烷酮；以及DMA。許多增溶劑也可充當吸收促進劑?？蓪为毜脑鋈軇饺氲街苿┲?，或?qū)⒃鋈軇┑幕旌衔飺饺肫渲小＿m宜乳化劑和助乳化劑包括但不限于對微乳劑描述的那些乳化劑和助乳化劑。軟化劑包括例如丙二醇、甘油、肉豆蘧酸異丙酯、聚丙二醇_2(PPG-2)肉豆蘧醚丙酸酯等。
其它活化劑也可包含在制劑中，例如其它抗炎劑、鎮(zhèn)痛劑、抗微生物劑、抗真菌劑、抗生素、維生素、抗氧化劑和通常在防曬制劑中存在的防曬劑，其包括但不限于鄰氨基苯甲酸酯、二苯酮(特別是二苯酮-3)、樟腦衍生物、肉桂酸酯(例如甲氧肉桂酸辛酯)、二苯酰甲烷(例如丁基甲氧基二苯酰甲烷)、對氨基苯甲酸(PABA)及其衍生物和水楊酸酯(例如水楊酸辛酯)。在一個實施方案中，寡核苷酸對于膠原基因(其包括但不限于非編碼區(qū))的多核苷酸而言為特異的。膠原基因靶標包括膠原基因的變體；膠原基因的突變體，包括SNP ;膠原基因的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA分子。依照本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不單獨限于膠原基因多核苷酸，而是擴展到膠原基因的任何同種型、受體、同源物、非編碼區(qū)等。在另一個實施方案中，寡核苷酸靶定膠原基因靶標的天然反義序列(針對編碼和非編碼區(qū)的天然反義物)，所述膠原基因靶標包括但不限于其變體、等位基因、同源物、突變 體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義RNA或DNA分子。在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括變體，其中在所述化合物的一個或多個核苷酸位置上存在不同的堿基。例如，如果第一個核苷酸為腺嘌呤，則可產(chǎn)生在此位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其他天然或非天然核苷酸的變體。這可在所述反義化合物的任何位置上完成。在一些實施方案中，反義化合物與靶標之間的同源性、序列同一性或互補性為約50*%-約60*%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約60% -約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約70% -約80*%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約80% -約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。反義化合物在以下情況時為可特異性雜交的所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起活性損失，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合。這類條件包括，即，在體內(nèi)測定或治療性處理情況中的生理條件，以及在體外測定情況下進行測定的條件。反義化合物，不論DNA、RNA、嵌合的、取代的等等，在以下情況時為可特異性雜交的所述化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用損失，并且在需要特異性結(jié)合的條件下存在足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測定或治療性處理情況中的生理條件下，以及在體外測定情況下進行測定的條件下。在另一個實施方案中，靶定膠原基因調(diào)節(jié)膠原基因的表達或功能，膠原基因包括但不限于使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列、一個或多個如SEQ ID NO :4-9所述的序列等。在一個實施方案中，表達或功能與對照相比為增量調(diào)節(jié)的。在另一個實施方案中，表達或功能與對照相比為減量調(diào)節(jié)的。在另一個實施方案中，寡核苷酸包括如SEQ ID NO :10-29所述的核酸序列，包括使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸、較短或較長的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個實施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無需在此描述。反義物的特異性和靈敏性也被本領(lǐng)域的技術(shù)人員掌握用于治療用途。已將反義寡核苷酸用作在動物和人的疾病狀態(tài)治療中的治療部分。已將反義寡核苷酸安全和有效地施用給人，并且目前正在進行許多臨床試驗。因此已確定寡核苷酸可為有用的治療形式，其可將經(jīng)配置以在用于治療細胞、組織和動物尤其人的治療方案中有用。在本發(fā)明的實施方案中，寡聚反義化合物(具體地寡核苷酸)結(jié)合到靶核酸分子并調(diào)節(jié)由靶基因編碼的分子的表達和/或功能。待干擾的DNA功能包括例如復制和轉(zhuǎn)錄。待干擾的RNA功能包括所有的生活機能,例如RNA向蛋白質(zhì)翻譯位點的易位、蛋白質(zhì)自RNA的翻譯、產(chǎn)生一種或多種mRNA種類的RNA剪接，以及可由RNA參與或促進的催化活性。所述功能可被增量調(diào)節(jié)或受抑制，這取決于所需的功能。

反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接物、引物、探針和與靶核酸的至少一部分雜交的其他寡聚化合物。因此，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的文段中，將反義化合物靶定到特定的核酸分子可為多步過程。所述過程通常以鑒定待調(diào)節(jié)其功能的靶核酸開始。此靶核酸可為，例如其表達與特定病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細胞基因(或從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或來自傳染劑的核酸分子。在本發(fā)明中，所述靶核酸編碼膠原基因。靶定過程通常也包括確定靶核酸內(nèi)的至少一個靶區(qū)、區(qū)段或位點以用于發(fā)生反義相互作用，使得產(chǎn)生所需的效應，例如，表達的調(diào)節(jié)。在本發(fā)明的文段中，術(shù)語“區(qū)”定義為具有至少一個可識別結(jié)構(gòu)、功能或特征的靶核酸的一部分。靶核酸區(qū)內(nèi)為區(qū)段。“區(qū)段”定義為在靶核酸內(nèi)區(qū)的較小或亞部分。本發(fā)明所用的“位點”定義為靶核酸內(nèi)的位置。在一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到膠原基因的天然反義序列并調(diào)節(jié)膠原基因(SEQ ID NO :1-3)的表達和/或功能。反義序列的實例包括SEQ ID NO :4-29。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到膠原基因多核苷酸的一個或多個區(qū)段并調(diào)節(jié)膠原基因的表達和/或功能。所述區(qū)段包含膠原基因有義或反義多核苷酸的至少五個連續(xù)的核苷酸。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸對膠原基因的天然反義序列而言為特異的，其中所述寡核苷酸與膠原基因的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)膠原基因的表達和/或功能。在另一個實施方案中，寡核苷酸化合物包括如SEQ ID NO :10-29所述的序列、使用例如PCR、雜交等鑒定和擴增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個修飾核苷酸、較短或較長的片段、經(jīng)修飾的鍵等。經(jīng)修飾的鍵或核苷酸間鍵的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個實施方案中，所述核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或經(jīng)修飾的磷酸基)，可為單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備，以及它們摻入到核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身也為已知的且無需在此描述。由于如本領(lǐng)域已知，翻譯起始密碼子通常為5' -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在相應的DNA分子中為5' -ATG)，因而翻譯起始密碼子也稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子”或“AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有翻譯起始密碼子，其具有RNA序列5' -GUG、5' -UUG或5' -CUG;以及5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG已顯示在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包括許多密碼子序列，但在每個情況下起始氨基酸通常為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有兩個或更多個備選起始密碼子，其中的任何一個可優(yōu)先地用于在特定細胞類型或組織中或在特定條件組下的翻譯起始。在本發(fā)明的文段中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指這樣的一個或多個密碼子，其在體內(nèi)用于起始由編碼膠原基因的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的翻譯，與這類密碼子的一個或多個序列無關(guān)?；虻姆g終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三個序列中的一個，即，5 ^ -UAA,5/ -UAG和5' -UGA (對應的DNA序列分別為5' -TAA,5' -TAG 和 5' -TGA)。術(shù)語“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”是指從翻譯起始密碼子開始在任一方向上(即，5’或3’)包含約25-約50個連續(xù)的核苷酸的這類mRNA或基因的部分。類似地，術(shù)語“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”是指從翻譯終止密碼子開始在任一方向上(即，5’或3’)包含約25-約50個連續(xù)的核苷酸的這類mRNA或基因的部分。因此，“起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或“翻譯終止密碼子區(qū)”)均為可用本發(fā)明的反義化合物有效地靶定的區(qū)?！け绢I(lǐng)域已知的可讀框(ORF)或“編碼區(qū)”是指在翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)，也為可有效地靶定的區(qū)。在本發(fā)明的文段中，靶定的區(qū)為包含基因可讀框(ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)。另一種靶區(qū)包括本領(lǐng)域已知的5’非翻譯區(qū)(5’UTR)，是指在翻譯起始密碼子的5’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的5’加帽位點和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上對應的核苷酸)。再一種靶區(qū)包括本領(lǐng)域已知的3’非翻譯區(qū)(3' UTR)，是指在翻譯終止密碼子3’方向上的mRNA的部分，因此包括在mRNA的翻譯終止密碼子和3’末端之間的核苷酸(或基因上對應的核苷酸)。mRNA的5’加帽位點包含經(jīng)由5’ -5’三磷酸酯鍵連接到mRNA的5’最末端殘基的N7-甲基化鳥苷殘基。認為mRNA的5’帽區(qū)包括5’帽子結(jié)構(gòu)本身以及鄰近該帽位點的前50個核苷酸。用于本發(fā)明的另一種靶區(qū)為5’帽區(qū)。盡管一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物為直接翻譯的，但是許多包含一個或多個稱為“內(nèi)含子”的區(qū)，其在翻譯前被從轉(zhuǎn)錄物中切除。余下的(且因此翻譯的)區(qū)稱為“外顯子”，并將其剪接在一起形成連續(xù)的mRNA序列。在一個實施方案中，靶定剪接位點(即，內(nèi)含子-外顯子連接處或外顯子-內(nèi)含子連接處)在疾病牽涉異常剪接或疾病牽涉特定剪接產(chǎn)物過度產(chǎn)生的狀況中特別有用。因重排或缺失所致的異常融合連接處為靶位點的另一個實施方案。經(jīng)由來自不同基因來源的兩個(或更多個)mRNA的剪接過程產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為“融合轉(zhuǎn)錄物”。內(nèi)含子可使用靶定到例如DNA或前mRNA的反義化合物來有效地靶定。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到天然反義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合到有義多核苷酸并調(diào)節(jié)靶分子的表達和/或功能。
可變RNA轉(zhuǎn)錄物可產(chǎn)生自DNA的相同基因組區(qū)。這些可變轉(zhuǎn)錄物一般稱為“變體”。更具體地，“前mRNA變體”為產(chǎn)生自相同的基因組DNA的轉(zhuǎn)錄物，其與產(chǎn)生自相同的基因組DNA的其他轉(zhuǎn)錄物在其起始或終止位置上不同且包含內(nèi)含子和外顯子序列二者。當剪接期間切除了一個或多個外顯子或內(nèi)含子區(qū)、或其部分時，前mRNA變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體為經(jīng)加工的前mRNA變體，并且由于剪接所致，每種獨特的前mRNA變體必須總是產(chǎn)生獨特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱為“可變剪接變體”。如果未發(fā)生前mRNA變體的剪接，則前mRNA變體與mRNA變體完全相同。變體可通過使用可變信號啟動或終止轉(zhuǎn)錄來產(chǎn)生。前mRNA和mRNA可具有多于一個起始密碼子或終止密碼子。起源于使用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體稱為該前mRNA或mRNA的“可變起始變體”。使用可變終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物稱為該前mRNA或mRNA的“可變終止變體”?？勺兘K止變體的一個具體類型為“聚腺苷酸變體”，其中所產(chǎn)生的多重轉(zhuǎn)錄物起因于轉(zhuǎn)錄機構(gòu)對其中一種“聚腺苷酸終止信號”的可變選擇，從而產(chǎn)生終止在獨特 的聚腺苷酸位點上的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的文段內(nèi)，本文所述的變體類型也為靶核酸的實施 方案。將反義化合物與之雜交的靶核酸上的位置定義為活性反義化合物靶定的靶區(qū)的至少5個核甘酸長的部分。雖然將某些示例性靶區(qū)段的具體序列列舉于此，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認識至IJ，這些用于說明和描述在本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實施方案。根據(jù)本公開內(nèi)容，其他靶區(qū)段可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易地鑒定。認為以下靶區(qū)段同樣適合靶定，該靶區(qū)段長度為5-100個核苷酸并包含選自說明性靶區(qū)段之內(nèi)的一段至少五(5)個連續(xù)的核苷酸。靶區(qū)段可包括DNA或RNA序列，其包含來自說明性靶區(qū)段之一的5’末端的至少5個連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續(xù)段，其開始于靶區(qū)段5’末端的緊接上游且持續(xù)到該DNA或RNA包含約5-約100個核苷酸為止)。類似的靶區(qū)段由以下DNA或RNA序列表示，該序列包含來自說明性靶區(qū)段之一的3’末端的至少5個連續(xù)核苷酸(余下的核苷酸為相同DNA或RNA的連續(xù)段，其開始于靶區(qū)段3’末端的緊接下游且持續(xù)到該DNA或RNA包含約5-約100個核苷酸為止)。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文所說明的靶區(qū)段，無需過度試驗就能夠鑒定另外的靶區(qū)段。一旦鑒定一個或多個靶區(qū)、區(qū)段或位點，就選出與該靶標足夠互補的反義化合物，所述足夠互補即充分良好且具有足夠的特異性雜交以得到所需的效果。在本發(fā)明的實施方案中，寡核苷酸與特定靶標的反義鏈結(jié)合。所述寡核苷酸長度為至少5個核苷酸且可為合成的，使得每個寡核苷酸靶定重疊的序列，由此將寡核苷酸合成為覆蓋靶多核苷酸的全長。靶標也包括編碼區(qū)以及非編碼區(qū)。在一個實施方案中，通過反義寡核苷酸來靶定特定核酸。將反義化合物靶定到特定核酸為多步過程。該過程通常開始于鑒定其功能待調(diào)節(jié)的核酸序列。這可為，例如其表達與特定的病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細胞基因(或從該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA)，或非編碼多核苷酸，例如非編碼RNA (ncRNA)?？蓪NA歸類為⑴信使RNA(mRNA)，其被翻譯成蛋白，和⑵非編碼蛋白的RNA (ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反義轉(zhuǎn)錄物和包含高密度的終止密碼子并缺少任何廣泛的“可讀框”的其他轉(zhuǎn)錄單元(TU)。許多ncRNA似乎開始于蛋白編碼基因座的3’非翻譯區(qū)(3丨UTR)中的起始位點。ncRNA常常為罕見的且至少一半已由FANTOM協(xié)會測序的ncRNA似乎未聚腺苷酸化。大多數(shù)研究者因為明顯的原因而關(guān)注經(jīng)加工并輸出到細胞質(zhì)的聚腺苷酸化mRNA。近來，已顯示非聚腺苷酸化核RNA的群體可非常巨大，且許多這類轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生于基因內(nèi)區(qū)。ncRNA可調(diào)節(jié)基因表達的機制為通過與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對。通過堿基配對起作用的RNA可分組成⑴順式編碼RNA，其在相同的基因位置、但在其所作用的RNA相反的鏈上編碼，因此顯示對其靶標完美的互補性，和(2)反式編碼RNA，其在與其所作用的RNA不同的染色體位置上編碼，一般不表現(xiàn)出與其靶標完美的堿基配對潛能。不希望受到理論的約束，通過本文所述的反義寡核苷酸來擾亂反義多核苷酸，可改變相應有義信使RNA的表達。然而，此調(diào)節(jié)可為不一致的(反義敲減導致信使RNA上升)或一致的(反義敲減導致伴隨的信使RNA下降)。在這些情況下，可將反義寡核苷酸靶定到反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，引起其敲減或隔離。編碼以及非編碼反義物可以相同的方式來靶定，并且任一種類別均能夠調(diào)節(jié)相應有義轉(zhuǎn)錄物——以一致或不一致的方式。用于鑒定針對靶標使用的新寡核苷酸的策略可基于通過反義寡核苷酸或任何其他調(diào)節(jié)所需靶標的方法對反義RNA轉(zhuǎn)錄物的敲減。 策略I :在不一致調(diào)節(jié)的情況下，敲減所述反義轉(zhuǎn)錄物提升常規(guī)(有義)基因的表達。若后者基因編碼已知或假定的藥物靶標，則其反義配對物的敲減可預料到地模擬受體激動劑或酶刺激劑的作用。策略2 :在一致調(diào)節(jié)的情況下，可伴隨地敲減反義和有義轉(zhuǎn)錄物兩者，從而達到常規(guī)(有義)基因表達的協(xié)同下降。如果例如將反義寡核苷酸用于進行敲減，則此策略可用于應用針對有義轉(zhuǎn)錄物靶定的一種反義寡核苷酸和針對相應反義轉(zhuǎn)錄物的另一種反義寡核苷酸，或同時靶定重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個有力對稱的反義寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)，以及與靶核酸的至少一部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。因此，其可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物且可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或末端突起、錯配或環(huán)。將反義化合物常規(guī)地制備為線性的，但可被連接或者另外制備成環(huán)狀和/或分枝的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交以形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈，或具有足夠自我互補性以允許雜交并形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。可將所述兩條鏈內(nèi)部連接而留下游離的3’或5’末端，或可將其連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在5’或3’末端上包含突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。所述雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進一步的修飾可包括與末端之一、經(jīng)挑選的核苷酸位置、糖位置或與核苷間鍵之一連接的綴合基團?；蛘?，所述兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或連接基團來連接。當僅由一條鏈形成時，dsRNA可呈自我互補的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的?；虮磉_的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細胞系中穩(wěn)定表達dsRNA發(fā)夾來完成，然而，在一些實施方案中，基因表達或功能為增量調(diào)節(jié)的。當形成自兩條鏈，或呈在其自身上對折形成雙鏈體的自身互補發(fā)夾型分子形式的單鏈時，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))為以沃森-克里克模式堿基配對的互補RNA鏈。
一旦弓I入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可經(jīng)由基于占據(jù)的機制來運作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個或多個2’脫氧糖和一般地T而不是U堿基)或“RNA樣”(即，一般具有一個或多個2’羥基或2’修飾的糖和一般U而不是T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最普通地A和B型。據(jù)認為，一般而言，具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“RNA樣”。在一些(嵌合的)實施方案中，反義化合物可包含A和B型區(qū)兩者。在另一個實施方案中，所需的寡核苷酸或反義化合物，包括以下中的至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、包含經(jīng)修飾的鍵的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾RNA(siRNA);微小干擾RNA(miRNA);小時序RNA(stRNA);或短發(fā)夾RNA(shRNA) yj、RNA誘導的基因激活(RNAa);小激活RNA(saRNA)、或其組合。 dsRNA也可激活基因表達，這是已被稱為“小RNA誘導的基因激活”或RNAa的機制。靶定基因啟動子的dsRNA誘導相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。在人細胞中使用合成dsRNA(稱為“小激活RNA” (saRNA))證實RNAa。已發(fā)現(xiàn)小雙鏈RNA (dsRNA)(例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA))是稱為RNA干擾(RNAi)的進化保守機制的觸發(fā)物。RNAi總是導致基因沉默。然而，在下文實施例章節(jié)詳述的例子中，顯示寡核苷酸增加膠原基因多核苷酸和其編碼產(chǎn)物的表達和/或功能。dsRNA也可充當小激活RNA(saRNA)。不希望受理論約束，通過靶定基因啟動子中的序列，saRNA在稱為dsRNA誘導的轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的現(xiàn)象中誘導靶基因表達。在另一個實施方案中，本文鑒定的“靶區(qū)段”可用于篩選調(diào)節(jié)膠原基因多核苷酸表達的另外化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”為以下化合物，其減少或增加編碼膠原基因的核酸分子的表達并包含與靶區(qū)段互補的至少5個核苷酸的部分。篩選方法包括以下步驟使編碼膠原基因有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，以及選擇一種或多種減少或增加編碼膠原基因多核苷酸的核酸分子表達的候選調(diào)節(jié)劑(例如SEQ IDNO :10-29)。一旦顯示一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如減少或增加)編碼膠原基因多核苷酸的核酸分子表達，則可將所述調(diào)節(jié)劑用于膠原基因多核苷酸功能的進一步調(diào)查研究，或用作依照本發(fā)明的研究、診斷或治療劑。靶定天然反義序列調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，膠原基因(例如檢索號NM_000088、NM_000089、NM_000094)。在一個實施方案中，靶標為膠原基因的反義多核苷酸。在一個實施方案中，反義寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸(例如檢索號NM_000088、NM_000089、NM_000094)的有義和/或天然反義序列、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子且所述靶標包括反義和/或有義膠原基因多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)。本發(fā)明的靶區(qū)段也可與本發(fā)明的其各自互補的反義化合物結(jié)合，以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領(lǐng)域中已顯示這類雙鏈寡核苷酸部分經(jīng)由反義機制來調(diào)節(jié)靶表達和調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。此外，所述雙鏈部分可經(jīng)受化學修飾。例如，已顯示這類雙鏈部分通過所述雙鏈體的反義鏈與靶標的典型雜交來抑制該靶標，從而觸發(fā)靶標的酶促降解。在一個實施方案中，反義寡核苷酸祀定膠原基因多核苷酸(例如檢索號NM_000088、NM_000089、NM_000094)、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子。依照本發(fā)明的實施方案，靶核酸分子不單獨限于膠原基因而是擴展到膠原基因分子的任何同種型、受體、同源物等等。在另一個實施方案中，寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸的天然反義序列(例如，如SEQ ID NO :4-9所述的多核苷酸)，以及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補序列。反義寡核苷酸的實例如SEQ ID NO :10-29所述。在一個實施方案中，所述寡核苷酸與膠原基因反義物的核酸序列互補或結(jié)合，并調(diào)節(jié)膠原基因分子的表達和/或功能，所述核酸序列包括但不限于與膠原基因多核苷酸有關(guān)的非編碼有義和/或反義序列。在另一個實施方案中，所述寡核苷酸與如SEQ ID NO :4_9所述的膠原基因天然反 義物的核酸序列互補或結(jié)合，并調(diào)節(jié)膠原基因分子的表達和/或功能。在一個實施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO 10-29的至少5個連續(xù)核苷酸的序列且調(diào)節(jié)膠原基因分子的表達和/或功能。多核苷酸靶標包括膠原基因，包括其家族成員、膠原基因的變體；膠原基因的突變體，包括SNP ;膠原基因的非編碼序列；膠原基因的等位基因；物種變體、片段等等。優(yōu)選所述寡核苷酸為反義分子。在另一個實施方案中，祀定膠原基因多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA、干擾RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA);微小干擾 RNA (miRNA);小時序 RNA (stRNA);或短發(fā)夾RNA(shRNA);小RNA誘導的基因激活(RNAa);或小激活RNA(saRNA)。在另一個實施方案中，膠原基因多核苷酸(例如SEQ ID NO :4_9)的靶定調(diào)節(jié)這些靶標的表達或功能。在一個實施方案中，表達或功能相比于對照為增量調(diào)節(jié)的。在另一個實施方案中，表達或功能相比于對照為減量調(diào)節(jié)的。在另一個實施方案中，反義化合物包括如SEQ ID NO :10-29所述的序列。這些寡核苷酸可包含一個或多個經(jīng)修飾的核苷酸、更短或更長的片段、經(jīng)修飾的鍵等等。在另一個實施方案中，SEQ ID NO 10-29包含一個或多個LNA核苷酸。所需靶核酸的調(diào)節(jié)可以本領(lǐng)域已知的數(shù)個方式來進行。例如，反義寡核苷酸、siRNA等。酶促核酸分子(例如，核酶)為能夠催化一種或多種不同反應(包括以核苷酸堿基序列特異的方式反復切割其他單獨的核酸分子的能力)的核酸分子。這類酶促核酸分子可用于，例如，靶定幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄物。由于反式切割酶促核酸分子的序列特異性，其有望作為用于人類疾病的治療劑?？蓪⒚复俸怂岱肿釉O計成在細胞RNA背景下切割特定的RNA靶標。這類切割事件致使mRNA無功能且終止從該RNA的蛋白表達。以這種方式，可選擇性地抑制與疾病狀態(tài)有關(guān)的蛋白合成。一般而言，帶有RNA切割活性的酶促核酸通過首先與靶RNA結(jié)合來起作用。這類結(jié)合通過酶促核酸的靶結(jié)合部分來進行，該酶促核酸的靶結(jié)合部分保持緊密靠近進行切割靶RNA的分子的酶促部分。因此，所述酶促核酸首先識別而后通過互補的堿基配對與靶RNA結(jié)合，且一旦與正確的位點結(jié)合，即進行酶促地切割靶RNA。這類靶RNA的策略性切割將破壞其指導合成編碼蛋白的能力。在酶促核酸結(jié)合和切割其RNA靶標之后，其從該RNA中釋放以尋找另一個靶標且可反復結(jié)合和切割新靶標。已使用諸如體外選擇(進化)策略等數(shù)種途徑來進化能夠催化各種反應的新核酸催化劑，所述反應為例如磷酸二酯鍵和酰胺鍵的切割和連接。催化活性最佳的核酶的開發(fā)會顯著地有助于以調(diào)節(jié)基因表達為目的而采用RNA切割核酶的任何策略。例如錘頭狀核酶在存在Mg2+輔因子的飽和(IOmM)濃度下，以約Imin-I的催化速率(kcat)起作用。已顯示人造“RNA連接酶”核酶以約IOOmin-I的速率催化相應的自我修飾反應。此外，據(jù)了解具有由DNA組成的底物結(jié)合臂的某些經(jīng)修飾的錘頭狀核酶，以接近IOOmin-I的倍數(shù)轉(zhuǎn)換速率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。最終，用某些核苷酸類似物置換在錘頭的催化核心內(nèi)的特定殘基產(chǎn)生顯示·出在催化速率上多達10倍改進的修飾核酶。這些研究結(jié)果證實核酶可以以顯著高于大多數(shù)天然自我切割核酶展示于體外的催化速率，促進化學轉(zhuǎn)化。那么可能的是，可優(yōu)化某些自我切割核酶的結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生最高的催化活性，或者可制備展示出顯著更快的RNA磷酸二酯切割速率的全新RNA基序。通過符合“錘頭”模型的RNA催化劑來分子間切割RNA底物首先顯示于1987年。將所述RNA催化劑回收并與多種RNA分子反應，證實其為真正催化性的?；凇板N頭”基序設計的催化性RNA已通過在催化性RNA中作出適當?shù)膲A基改變以維持與靶序列的必要堿基配對，來用于切割特定靶序列。這允許使用催化性RNA來切割特定靶序列，并指出根據(jù)“錘頭”模型設計的催化性RNA可能在體內(nèi)切割特定底物RNA。RNA干擾(RNAi)已成為調(diào)節(jié)哺乳動物和哺乳動物細胞中基因表達的強大工具。此方法要求使用表達質(zhì)?；虿《疽约凹庸こ蓅iRNA的小發(fā)夾RNA的編碼序列，將小干擾RNA(siRNA)作為RNA本身或作為DNA遞送。此系統(tǒng)能夠有效將前siRNA轉(zhuǎn)運到它們在其中活躍的細胞質(zhì)中，并允許使用經(jīng)調(diào)節(jié)的和組織特異的啟動子用于基因表達。在一個實施方案中，寡核苷酸或反義化合物包括核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體、或其模擬物、嵌合體、類似物或同源物。此術(shù)語包括由天然存在核苷酸、糖和共價核苷間(骨架)鍵組成的寡核苷酸以及類似地起作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。由于所需性質(zhì)，例如增強的細胞攝取、對靶核酸增強的親和力以及在核酸酶存在時增大的穩(wěn)定性，常常需要這類經(jīng)修飾或取代的寡核苷酸超過天然形式。根據(jù)本發(fā)明，寡核苷酸或“反義化合物”包括反義寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同源物)、核酶、外部指導序列(EGS)寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA以及與靶核酸的至少一部分雜交且調(diào)節(jié)其功能的其他寡聚化合物。因此，它們可為DNA、RNA、DNA樣、RNA樣、或其混合物，或可為這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可為單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾寡聚化合物且可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或末端突起、錯配或環(huán)。將反義化合物常規(guī)地制備成線性但可經(jīng)連接或者另外地制備成環(huán)狀和/或分枝的。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交以形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈，或帶有足夠自我互補性以允許雜交并形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈?？蓪⑺鰞蓷l鏈內(nèi)部連接而留下游離的3’或5’末端或可將其連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可在5’或3’末端上包含突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。雙鏈化合物任選可在末端上包含突出端。進一步的修飾可包括與末端之一、經(jīng)挑選的核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一連接的綴合基團。備選地，所述兩條鏈可經(jīng)由非核酸部分或連接基團來連接。當形成自僅一條鏈時，dsRNA可采取自我互補的發(fā)夾型分子形式，其在其自身上對折形成雙鏈體。因此，所述dsRNA可為完全或部分雙鏈的。基因表達的特異性調(diào)節(jié)可通過dsRNA發(fā)夾在轉(zhuǎn)基因細胞系中的穩(wěn)定表達來完成。當形成自兩條鏈或采取在其自身上對折形成雙鏈體的自身互補的發(fā)夾型分子形式的單鏈時，所述兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))為以沃森-克里克模式堿基配對的互補RNA鏈。 一旦弓丨入系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以實現(xiàn)靶核酸的切割或其他修飾，或可經(jīng)由基于占據(jù)的機制來運作。一般而言，核酸(包括寡核苷酸)可描述為“DNA樣”(即，一般具有一個或多個2’脫氧糖和，一般地，T而不是U堿基)或“RNA樣”(即，一般具有一個或多個2’羥基或2’修飾的糖和，一般U而不是T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最普通地A和B型。據(jù)認為，一般而言，具有B型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“DNA樣”而具有A型樣結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“RNA樣 ”。在一些(嵌合的)實施方案中，反義化合物可包含A和B型區(qū)兩者。依照本發(fā)明的反義化合物可包含約5-約80個核苷酸(即約5-約80個連接核苷)長度的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包含5-約80個核苷酸，而本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如，dsRNA)包含5-約80個核苷酸長度的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，這包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79 或 80 個核苷酸長度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有10-50個核苷酸長度的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，這包括具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49或50個核苷酸長度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分的寡核苷酸。在一些實施方案中，寡核苷酸長度為15個核苷酸。在一個實施方案中，本發(fā)明的反義或寡核苷酸化合物具有12或13-30個核苷酸長度的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認識到，這包括具有12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸長度、或其之內(nèi)任何范圍的反義部分的反義化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物也包括其中不同的堿基存在于化合物中的一個或多個核苷酸位置上的變體。例如，如果第一個核苷酸為腺苷，那么可產(chǎn)生在此位置包含胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可在反義或dsRNA化合物的任何位置上進行。然后使用本文所述的方法來檢測這些化合物以確定其抑制靶核酸表達的能力。在一些實施方案中，反義化合物與靶標之間的同源性、序列同一性或互補性為約40%-約60%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約60% -約70%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約70% -約80*%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約80% -約90%。在一些實施方案中，同源性、序列同一性或互補性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在另一個實施方案中，反義寡核苷酸(例如，SEQ ID NO :4-29中所述的核酸分子)包含一個或多個取代或修飾。在一個實施方案中，將核苷酸用鎖定核酸(LNA)取代。在另一個實施方案中，寡核苷酸靶定與膠原基因有關(guān)的編碼和/或非編碼序列以及如SEQ ID NO :1-9所述的序列有義和/或反義的核酸分子的一個或多個區(qū)。也將寡核苷酸靶定到SEQ ID NO :1-9的重疊區(qū)。本發(fā)明的某些寡核苷酸為嵌合寡核苷酸。“嵌合寡核苷酸”或“嵌合體”，在本發(fā)明的文段中，為包含兩個或更多個化學上不同區(qū)的寡核苷酸，每個區(qū)由至少一個核苷酸組成。這些寡核苷酸典型地包含賦予一種或多種有益特性(例如，對核酸酶的抗性增強、攝入細胞增強、對靶標增強的結(jié)合親和力)的修飾核苷酸的至少一個區(qū)，以及作為能夠切割RNAiDNA或RNA = RNA雜合體的酶底物的區(qū)。作為實例，核糖核酸酶H為細胞核酸內(nèi)切酶，其切割RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈。核糖核酸酶H的活化因此導致RNA靶標的切割，從而大大地增強基因表達的反義調(diào)節(jié)效率。因此，當使用嵌合寡核苷酸時，與雜交到相同靶區(qū)的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸相比，常?？捎幂^短的寡核苷酸獲得相當?shù)慕Y(jié)果。RNA靶標的切割可通 過凝膠電泳和必要時本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)，常規(guī)地檢測。在一個實施方案中，嵌合寡核苷酸包含修飾成增加靶結(jié)合親和力的至少一個區(qū)，并且通常包含充當核糖核酸酶H的底物的區(qū)。寡核苷酸對其靶標(在此情況下，編碼ras的核酸)的親和力通過測定寡核苷酸/靶標對的Tm來常規(guī)地確定，Tm為寡核苷酸與靶標解離的溫度；解離以分光光度法檢測。Tm越高,寡核苷酸對祀標的親和力越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可作為如上所述的兩種或更多種寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡聚核苷和/或寡核苷酸模擬物的復合結(jié)構(gòu)而形成。本領(lǐng)域亦已將這類化合物稱為雜合體或gapmer。教導制備這類雜合結(jié)構(gòu)的代表性美國專利包括但不限于，美國專利第 5，013，830,5, 149，797,5, 220，007,5, 256，775,5, 366，878,5, 403，711,5, 491，133、5，565，350,5, 623，065,5, 652，355,5, 652，356 及 5，700，922 號，每個通過引用結(jié)合于本文中。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的寡核苷酸區(qū)包含在糖的2’位置上修飾的至少一個核苷酸，最優(yōu)選2’ -0烷基、2’ -0-烷基-0-烷基或2’ -氟修飾的核苷酸。在其它實施方案中，RNA修飾包括在RNA 3’末端的嘧啶、脫堿基殘基或反向堿基的核糖上的2’ -氟、2’ -氨基和2’ 0-甲基修飾。將這類修飾常規(guī)地摻入到寡核苷酸中，已顯示這些寡核苷酸具有比2’ -脫氧寡核苷酸對給定靶標更高的Tm(即，更高的靶結(jié)合親和力)。這種增加的親和力的作用大大地增強基因表達的RNAi寡核苷酸抑制。核糖核酸酶H為切割RNA = DNA雙鏈體的RNA鏈的細胞核酸內(nèi)切酶；此酶的活化因此導致RNA靶標的切割，且因此可大大地增強RNAi抑制效率。RNA靶標的切割可通過凝膠電泳來常規(guī)地證實。在另一個實施方案中，也修飾嵌合寡核苷酸以增強核酸酶抗性。細胞包含可降解核酸的各種核酸外切酶和核酸內(nèi)切酶。已顯示許多核苷酸和核苷修飾使摻入有它們的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對核酸酶消化更有抗性。核酸酶抗性通過將寡核苷酸與細胞提取物或分離的核酸酶溶液一起孵育并測定隨時間推移剩余的完好寡核苷酸的程度(通常地通過凝膠電泳)來常規(guī)地測定。已修飾成增強其核酸酶抗性的寡核苷酸比未修飾寡核苷酸保持完好持續(xù)更長時間。已證實多種寡核苷酸修飾增強或賦予核酸酶抗性。包含至少一個硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸為目前更優(yōu)選的。在一些情況下，增強靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾也能夠獨立地增強核酸酶抗性。一些所需的修飾可在 De Mesmaeker 等，(1995)Acc. Chem. Res. ,28 :366-374 中找到。
預想用于本發(fā)明的一些寡核苷酸的具體實例包括包含經(jīng)修飾的骨架的那些，所述經(jīng)修飾的骨架為例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵或者短鏈雜原子或雜環(huán)的糖間鍵。最多的為帶有硫代磷酸酯骨架和帶有雜原子骨架的寡核苷酸，雜原子骨架特別地為CH2—NH—0—CH2、CH, —N(CH3)—0—CH2[稱為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架]、CH2—0—N (CH3) —CH2、CH2_N (CH3) —N (CH3) —CH2 和 0—N (CH3) —CH2—CH2骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示為0-P—0-CH。由De Mesmaeker等，(1995)Acc.Chem. Res. 28 :366-374公開的酰胺骨架也為優(yōu)選的。具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和Weller，美國專利第5，034，506號)亦是如此。在其他實施方案中，將寡核苷酸的例如肽核酸(PM)骨架、磷酸二酯骨架替換為聚酰胺骨架，核苷酸直接或間接地與聚酰胺骨架的氮雜氮原子結(jié)合。寡核苷酸也可包含一個或多個取代的糖部分。寡核苷酸在 2’ 位置上包含下列中的一種0H、SH、SCH3、F、OCN、0CH30CH3、0CH30(CH2)nCH3、0(CH2)nNH2或0(CH2)nCH3，其中n為I-約10 ;C1_C10低級烷基、烷氧基烷氧基、取代的低級烷基、烷芳基或芳烷基；C1 ；Br ；CN ；CF3 ；0CF3 ;0—、S—、或N-烷基；0—、S—、或N-烯基；S0CH3 ；S02CH3 ；0N02 ；N02 ；N3 ；NH2 ;雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基； 取代的甲硅烷基；RNA切割基團；報道基團；嵌入劑；改進寡核苷酸藥代動力學特性的基團；或改進寡核苷酸藥效學特性的基團以及具有類似特性的其他取代基。修飾包括2’ -甲氧乙氧基[2' -0-CH2CH20CH3，也稱為I' -0-(2-甲氧乙基)]。其他修飾包括2’ -甲氧基(2' -0—CH3)、2’ -丙氧基(2' -0CH2CH2CH3)和2’ -氟(2' -F)。類似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進行，具體地在3’末端核苷酸上糖的3’位置和5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模擬物例如取代戊呋喃糖基基團的環(huán)丁基。寡核苷酸也可另外或備選地包含核堿基(本領(lǐng)域常常簡稱為“堿基”)修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”核苷酸包括腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括在天然核酸中僅稀少或短暫地存在的核苷酸，例如，次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-Me嘧啶、特別地5-甲基胞嘧啶(也稱為5-甲基-2’脫氧胞嘧啶且常常在本領(lǐng)域中稱為5-Me-C)、5_羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基HMC,以及合成核苷酸，例如，2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、
2-(氨烷基氨基)腺嘌呤或其他雜取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基甲基尿嘧啶、8-氮雜鳥嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤?？砂ū绢I(lǐng)域已知的“通用的”堿基，例如，肌苷。已顯示5-Me-C取代增強核酸雙鏈體的穩(wěn)定性達0. 6-1. 2V (Sanghvi，Y. S.，載于Crooke，S. T.和Lebleu，B.，編輯，反義研究和應用(Antisense Research and Applications), CRC Press, Boca Raton,1993，276-278頁)且為目前的堿基取代。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及以化學方法使一種或多種增強寡核苷酸的活性或細胞攝取的部分或綴合物與寡核苷酸連接。這類部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽留醇基部分、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇、巰基膽固醇、脂族鏈例如十二烷二醇或十一烷基殘基、磷脂例如二 -十六烷基-消旋-甘油或1，2- 二 -0-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸。包含親脂性部分的寡核苷酸以及用于制備這類寡核苷酸的方法為本領(lǐng)域已知的，例如美國專利第5，138，045、5，218，105 和 5，459，255 號。
無需將給定寡核苷酸中的所有位置一致地修飾，且實際上多于一種上述修飾可摻入到單個寡核苷酸中或甚至在寡核苷酸內(nèi)的單個核苷內(nèi)部。本發(fā)明也包括作為如上文中定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸分子與另一個部分綴合，所述部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物、脂質(zhì)或聚碳氫化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，可將這些分子在糖、堿基或磷酸基的數(shù)個位置上連接到一個或多個構(gòu)成核酸分子的任何核苷酸。依照本發(fā)明使用的寡核苷酸可通過眾所周知的固相合成技術(shù)來便利和常規(guī)地制備。用于這類合成的設備由包括Applied Biosystems在內(nèi)的數(shù)個供應商銷售。也可使用用于這類合成的任何其他方法；寡核苷酸的實際合成完全在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的才能之內(nèi)。亦眾所周知的是使用類似技術(shù)來制備其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生 物。還眾所周知的是使用類似技術(shù)和市購經(jīng)修飾的amidites和可控孔度玻璃(CPG)產(chǎn)品，例如生物素、突光黃、卩丫唳、或補骨脂素修飾的amidites和/或CPG(可從Glen Research,Sterling VA購買)，以合成熒光標記的、生物素化的或其他修飾的寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。依照本發(fā)明，使用修飾(例如使用LNA單體)以增加寡核苷酸的效價、特異性和作用持續(xù)時間并拓寬其施用途徑，所述寡核苷酸由諸如M0E、ANA、FANA、PS等當前的化學物質(zhì)組成。這可通過用LNA單體取代當前寡核苷酸中的一些單體來完成。LNA修飾的寡核苷酸可具有類似于母體化合物的大小或可更大或優(yōu)選更小。這類LNA修飾寡核苷酸包含少于約70%、更優(yōu)選少于約60%、最優(yōu)選少于約50%的LNA單體且其大小在約5_25個核苷酸之間，更優(yōu)選在約12-20個核苷酸之間。修飾的寡核苷酸骨架包括但不限于硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯包括3’烯基膦酸酯和手性膦酸酯、次磷酸酯、氨基磷酸酯包括3’ -氨基氨基磷酸酯和氨烷基氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯，以及具有正常3’ -5’鍵合的硼烷磷酸酯(boranophosphates)、這些的2’ -5’連接類似物，以及具有反極性的那些，其中核苷單元的相鄰對為3’ -5’與5’ -3’或2’ -5’與5’ -2’連接的。也包括各種鹽、混合鹽和游離酸形式。教導制備上述含磷鍵的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第3，687，808、4，469，863,4, 476，301,5, 023，243,5, 177，196,5, 188，897,5, 264，423,5, 276，019、5，278，302,5,286，717,5,321，131,5, 399，676,5, 405, 939,5, 453，496,5, 455，233、5，466，677,5, 476，925,5, 519，126,5, 536, 821,5, 541，306,5, 550, 111,5, 563, 253、5，571，799,5, 587，361和5，625，050號，每個通過引用結(jié)合于本文中。修飾的寡核苷酸骨架(其中不包含磷原子)，具有由短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、或一種或多種短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵形成的骨架。這些包括具有嗎啉代鍵的骨架(部分由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲乙?；?formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亞甲基甲乙?；土虼滓阴；羌?；含烯骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基肼基骨架；磺酸酯和氨磺酰骨架；酰胺骨架；以及具有混合N、O、S和CH2組分部分的其他骨架。
教導制備上述寡聚核苷的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第5，034，506,5, 166，315,5, 185，444,5, 214，134,5, 216，141,5, 235，033,5, 264，562、5，264，564,5, 405，938,5, 434，257,5, 466，677,5, 470，967,5, 489，677,5, 541，307、5，561，225,5,596，086,5,602,240,5,610, 289,5, 602, 240,5, 608, 046,5, 610, 289、5，618，704,5, 623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439 號，每個通過引用結(jié)合于本文中。在其他寡核苷酸模擬物中，將核苷酸單元的糖和核苷間鍵(即骨架)，均用新基團置換。維持堿基單元用于與適當?shù)暮怂岚谢衔镫s交。一種這類寡聚化合物，即已顯示具有優(yōu)秀的雜交特性的寡核苷酸模擬物，稱為肽核酸(PM)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架替換為含酰胺的骨架，具體地氨乙基氨基乙酸骨架。將核堿基保留并直接或間接地與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子結(jié)合。教導制備PNA化合物的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第5，539，082,5, 714，331和5，719，262號，每個通過引用結(jié)合于本文中。PNA化合物的進一步教導可在Nielsen等，(1991) Science 254，1497-1500中找到。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，帶有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和帶有雜原子骨架的寡聚核苷，雜原子骨架具體地為-CH2-NH-0-CH2-、-CH2-N (CH3) -0-CH2-(稱為亞甲基(甲亞氨基)或 MMI 骨架)、-CH2-0-N(CH3)-CH2-、-CH2N (CH3)-N (CH3)CH2-和-O-N (CH3) -CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示為上文引用的美國專利第5，489，677號的-0-P-0-CH2-，以及上文引用的美國專利第5，602，240號的酰胺骨架。具有上文引用的美國專利第5，034，506號的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸亦是如此。修飾寡核苷酸也可包含一個或多個經(jīng)取代的糖部分。寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種0H;F;0-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或0烷基-0-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可為取代或未取代的C到CO烷基或C2到CO烯基和炔基。特別是 0 (CH2) n0mCH3、0 (CH2) n，0CH3、0 (CH2) nNH2、0 (CH2) nCH3、0 (CH2) n0NH2 及0(CH2n0N(CH2)nCH3)2，其中n和m可為I-約10。其他的寡核苷酸在2’位置上包含下列中的一種C到CO、低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基團、報道基團、嵌入劑、用于改進寡核苷酸藥代動力學特性的基團、或用于改進寡核苷酸藥效學特性的基團，以及具有類似特性的其他取代基。修飾包括2’ -甲氧乙氧基(2' -0-CH2CH20CH3，也稱為2’ -0-(2-甲氧乙基)或2' -M0E)，S卩，烷氧基烷氧基基團。另外的修飾包括2’- 二甲基氨基氧基乙氧基，即0(CH2)20N(CH3)2基團，也稱為2' -DMAOE(如下文實施例中所述)，以及2’ -二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域也稱為2’ -0-二甲基氨基乙氧基乙基或2' -DMAE0E)，即2' -0-CH2-0-CH2-N(CH2)2。其他修飾包括2’ -甲氧基(2' -0CH3)、2’ -氨基丙氧基(2' -0CH2CH2CH2NH2)和2’-氟(2' -F)。類似的修飾也可在寡核苷酸的其他位置上進行，具體地在3’末端核苷酸上或2’ -5’連接的寡核苷酸中糖的3’位置以及5’末端核苷酸的5’位置。寡核苷酸也可具有糖模擬物例如取代戊呋喃糖基糖的環(huán)丁基部分。教導制備這類經(jīng)修飾的糖結(jié)構(gòu)的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第4，981，957,5, 118，800,5, 319，080,5, 359，044、5，393，878、5，446，137、5，466，786、5，514，785、5，519，134、5，567，811,5, 576，427、5，591，722、5，597, 909、5，610, 300、5，627, 053、5，639，873、5，646，265、5，658，873、5，670, 633和5，700, 920號，每個通過引用結(jié)合于本文中。寡核苷酸也可包含核堿基(本領(lǐng)域常常簡稱為“堿基”)修飾或取代。本文所用的“未修飾的”或“天然的”核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括其他合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5_羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、
2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其他8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代具體地5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤(methylquanine)和7_甲基腺嘌呤、8_氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮雜鳥嘌呤和7-脫氮雜腺嘌呤以及3-脫氮雜鳥嘌呤和
3-脫氮雜腺嘌呤。此外，核苷酸包括公開于以下文獻中的核苷酸美國專利第3，687，808號、“高分子科學和工程的簡明百科全書(The Concise Encyclopedia of Polymer Science AndEngineering) ”，858-859 頁，Kroschwitz, J. I.，編輯，John ffiley&Sons, 1990、Englisch等，'Angewandle Chemie, International Edition' , 1991, 30,613頁及Sanghvi, Y. S ,第15 章，“反義研究和應用(Antisense Research and Applications) ”，289-302 頁，Crooke，S. T.和Lebleu，B. ea.，CRC Press，1993。這些核苷酸中的某些對于增加本發(fā)明的寡聚化合物的結(jié)合親和力特別地有用。這些包括5-取代嘧啶、6-氮雜嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已顯示5-甲基胞嘧啶取代增加核酸雙鏈體的穩(wěn)定性達0. 6-1. 20C (Sanghvi, Y. S.，Crooke, S. T.和Lebleu，B.，編輯，“反義研究和應用”，CRC Press, Boca Raton，1993，276-278頁)且為目前的堿基取代，更特別地當與2’ -0甲氧基乙基糖修飾組合時。教導制備上述修飾核苷酸以及其他修飾核苷酸的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第 3，687，808、以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273、5，367，066,5, 432，272,5, 457，187,5, 459，255,5, 484，908,5, 502，177,5, 525，711、5，552，540,5, 587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941 號，每個通過引用
結(jié)合于本文中。本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及使所述寡核苷酸與一種或多種部分或綴合物化學連接，該部分或綴合物增強所述寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取。這類部分包括但不限于，脂質(zhì)部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如，己基-S-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如，十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如，二-十六燒基_消旋_甘油或I，2- 二 -0-十六燒基_消旋_甘油-3-H-勝酸二乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-t羥膽固醇部分。教導制備這類寡核苷酸綴合物的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、5，578，717,5, 580, 731,5, 580, 731,5, 591，584,5, 109, 124,5, 118，802,5, 138，045、5，414，077,5, 486，603,5, 512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、4，667，025,4,762，779,4,789，737,4,824，941,4, 835，263,4, 876，335,4, 904，582、4，958，013,5, 082，830,5, 112，963,5, 214，136,5, 082，830,5, 112，963,5, 214，136、5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552,5,567，810,5, 574，142,5,585，481,5, 587，371,5,595，726,5,597，696、5，599，923,5, 599, 928和5,688,941號，每個通過引用結(jié)合于本文中。藥物開發(fā)本發(fā)明的化合物也可應用于藥物開發(fā)和靶標驗證的領(lǐng)域。本發(fā)明包括本文所鑒定的化合物和靶區(qū)段在闡明存在于膠原基因多核苷酸和疾病狀態(tài)、表型或病況之間的關(guān)系的藥物開發(fā)努力中的應用。這些方法包括檢測或 調(diào)節(jié)膠原基因多核苷酸，包括使本發(fā)明的化合物與樣品、組織、細胞或生物體接觸；在處理后的某個時間測定膠原基因多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)的表型或化學終末點，以及任選將該測定值與未處理樣品或與用本發(fā)明的另一種化合物處理的樣品比較。這些方法也可與其他試驗平行或組合進行以確定未知基因的功能用于靶標驗證過程，或確定特定基因產(chǎn)物作為用于治療或預防特定疾病、病況或表型的靶標的有效性。評價基因表達的增量調(diào)節(jié)或抑制外源核酸到宿主細胞或生物體中的轉(zhuǎn)移可通過直接檢測細胞或生物體中核酸的存在情況來評價。這類檢測可通過本領(lǐng)域眾所周知的數(shù)種方法來完成。例如，外源核酸的存在情況可通過DNA印跡或通過聚合酶鏈式反應(PCR)技術(shù)使用以下引物來檢測，該引物特異地擴增與所述核酸相關(guān)的核苷酸序列。外源核酸的表達也可使用包括基因表達分析在內(nèi)的常規(guī)方法來測定。例如，由外源核酸產(chǎn)生的mRNA可使用RNA印跡和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)來檢測和定量。來自外源核酸的RNA表達也可通過測定酶活性或報道蛋白活性來檢測。例如，反義調(diào)節(jié)活性可根據(jù)靶核酸表達的減少或增加間接地測定，靶核酸表達的減少或增加作為外源核酸正在產(chǎn)生效應物RNA的指示。基于序列保守性，可設計和使用引物來擴增靶基因的編碼區(qū)。最初，可使用來自每個基因的最高表達的編碼區(qū)來建立模型對照基因，但任何編碼或非編碼區(qū)均可使用。每個對照基因通過將每個編碼區(qū)插入報道基因編碼區(qū)和其聚腺苷酸信號之間來裝配。這些質(zhì)?？僧a(chǎn)生在基因的上游部分具有報道基因以及在3’非編碼區(qū)中具有潛在RNAi靶標的mRNA。各個反義寡核苷酸的有效性可通過調(diào)節(jié)報道基因來測定?？捎糜诒景l(fā)明的方法中的報道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)半乳糖苷酶(LacZ)葡糖醛酸酶(GUS)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、螢光素酶(Luc)、胭脂堿合酶(NOS)、章魚堿合酶(OCS)以及其衍生物。多重選擇標記為可利用的，其賦予對氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、草丁膦(phosphinothricin)、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。確定報道基因調(diào)節(jié)的方法為本領(lǐng)域眾所周知的，包括但不限于，熒光法(例如熒光光譜法、熒光激活細胞分選術(shù)(FACS)、熒光顯微法)、抗生素抗性測定。COLlAl、C0L1A2、C0L7A1蛋白和mRNA表達可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知和本文別處所描述的方法測定。例如，免疫測定法(例如ELISA)可用來測定蛋白水平。用于ELISA的膠原基因抗體可市購，例如，從 R&D Systems (Minneapolis, MN), Abeam, Cambridge, MA。在實施方案中，使用本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品(例如，體內(nèi)或體外細胞或組織)中的COLlAl、C0L1A2、C0L7A1表達(例如，mRNA或蛋白)通過與對照樣品中的膠原基因表達相比較來評價。例如，蛋白或核酸表達可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，與模擬處理或未處理樣品中的蛋白或核酸表達相比較?；蛘?，與用對照反義寡核苷酸(例如，具有已改變或不同序列的反義寡核苷酸)處理的樣品的比較可根據(jù)所需信息來進行。在另一個實施方案中，可將已處理樣品對比未處理樣品在膠原基因蛋白或核酸表達方面的差異，與已處理樣品對比未處理樣品在不同核酸(包括研究者認為適當?shù)娜魏螛藴?，例如，持家基?表達方面的差異相比較?？蓪⒂^察到的差異根據(jù)需要例如以比例或分數(shù)的形式表達，用于與對照比較。在實施方案中，膠原基因mRNA或蛋白水平，在用本發(fā)明反義寡核苷酸處理的樣品中，相對于未處理樣品或用對照核酸處理的樣品增加至約I. 25倍-約10倍或更多或者減少至約1/1. 25-約1/10或更少。在實施方案中，膠原基因mRNA或蛋白水平增加或減少至至少約 I. 25倍、至少約I. 3倍、至少約I. 4倍、至少約I. 5倍、至少約I. 6倍、至少約I. 7倍、至少約I. 8倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約3. 5倍、至少約4倍、至少約4. 5倍、至少約5倍、至少約5. 5倍、至少約6倍、至少約6. 5倍、至少約7倍、至少約7. 5倍、至少約8倍、至少約8. 5倍、至少約9倍、至少約9. 5倍、或至少約10倍或更多。試劑盒、研究試劑、診斷和治療本發(fā)明的化合物可用于診斷、治療和預防，并作為研究試劑和試劑盒的組分。此夕卜，能夠靈敏特異地抑制基因表達的反義寡核苷酸，常常被普通技術(shù)人員用于闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑的各個成員的功能。對于用于試劑盒和診斷和各種生物系統(tǒng)，本發(fā)明的化合物(單獨的或與其他化合物或治療劑組合)可用作在差異和/或組合分析中的工具，以闡明在細胞和組織內(nèi)表達的基因的一部分或全部互補序列的表達模式。本文所用的術(shù)語“生物系統(tǒng)”或“系統(tǒng)”定義為表達或使得能夠表達膠原基因產(chǎn)物的任何生物體、細胞、細胞培養(yǎng)物或組織。這些包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動物、細胞、細胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植物及其組合。作為一個非限制性實例，將在用一種或多種反義化合物處理的細胞或組織內(nèi)的表達模式與未用反義化合物處理的對照細胞或組織相比較，并針對基因表達的差異水平分析產(chǎn)生的模式，因為它們有關(guān)于，例如，所檢測基因的疾病相關(guān)、信號傳導途徑、細胞定位、表達水平、大小、結(jié)構(gòu)或功能。這些分析可對受刺激或未受刺激的細胞以及在影響表達模式的其他化合物存在或不存在時進行。本領(lǐng)域已知的基因表達分析方法的實例包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo，(2000) FEBS Lett.，480，17-24 ;Celis 等，(2000) FEBS Lett.，480，2-16)、SAGE (基因表達的系列分析)(Madden 等，(2000) Drug Discov. Today, 5,415-425)、READS (已消化 cDNA 的限制酶擴增)(Prashar 和 Weissman, (1999)Methods Enzymol. ,303,258-72)、TOGA (總基因表達分析)(Sutcliffe 等，(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ,97,1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(Celis 等,(2000)FEBS Lett. ,480,2-16 ;Jungblut 等,Electrophoresis,1999，20，2100-10)、已表達序列標志(EST)測序(Celis 等，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480，2-16 ;Larsson 等,J. Biotechnol. , 2000,80,143-57)、消減 RNA 指紋法(subtractive RNAfingerprinting, SuRF) (Fuchs 等，(2000)Anal. Biochem. 286,91-98 ；Larson 等，(2000)Cytometry 41, 203-208)、消減克隆(subtractive cloning)、差異顯不(DD) (Jurecic和 Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21) > 比較基因組雜交(Carulli 等，(1998) J. Cell Biochem. Suppl.，31，286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35,1895-904)和質(zhì)譜分析法(To, Comb. (2000) Chem. HighThroughput Screen,3,235-41)。本發(fā)明的化合物對于研究和診斷而言為有用的，因為這些化合物與編碼膠原基因的核酸雜交。例如，作為有效的膠原基因調(diào)節(jié)劑以本文公開的這類效率和這類條件下雜交的寡核苷酸，在有利于基因擴增或檢測的條件下分別為有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要對編碼膠原基因的核酸分子特異檢測的方法中，和可用于擴增所述核酸分子，以用于檢測或用于進一步研究膠原基因。本發(fā)明的反義寡核苷酸(具體地，引物和探 針)與編碼膠原基因的核酸的雜交，可通過本領(lǐng)域已知的方法來檢測。這類方法可包括使酶與所述寡核苷酸綴合、放射性標記所述寡核苷酸或任何其他適當?shù)臋z測方法。也可制備使用這類檢測方法來檢測樣品中膠原基因水平的試劑盒。反義物的特異性和靈敏性也由本領(lǐng)域技術(shù)人員掌握用于治療用途。已將反義化合物在動物(包括人)的疾病狀態(tài)的治療中用作治療部分。反義寡核苷酸藥物已安全和有效地施用給人且許多臨床試驗目前正在進行。因此確立的是，反義化合物可為有用的治療形式，可將其經(jīng)配置以在用于治療細胞、組織和動物、尤其是人的治療方案中有用。對于治療而言，將懷疑具有可通過調(diào)節(jié)膠原基因多核苷酸的表達來治療的疾病或病癥的動物(優(yōu)選人)，通過施用依照本發(fā)明的反義化合物來治療。例如，在一個非限制性實施方案中，所述方法包括給需要治療的動物施用治療上有效量的膠原基因調(diào)節(jié)劑的步驟。本發(fā)明的膠原基因調(diào)節(jié)劑有效地調(diào)節(jié)膠原基因的活性或調(diào)節(jié)膠原基因蛋白的表達。在一個實施方案中，動物中膠原基因的活性或表達與對照相比抑制了約10%。優(yōu)選地，將動物中膠原基因的活性或表達抑制約30%。更優(yōu)選地，將動物中膠原基因的活性或表達抑制50%或更多。因此，與對照相比，寡聚化合物將膠原基因mRNA的表達調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一個實施方案中，與對照相比，在動物中膠原基因的活性或表達增加約10%。優(yōu)選地，在動物中膠原基因的活性或表達增加約30%。更優(yōu)選地，在動物中膠原基因的活性或表達增加50%或更多。因此，與對照比較，寡聚化合物使膠原基因mRNA的表達調(diào)節(jié)至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。例如，膠原基因表達的下降可在動物的血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其他體液、組織或器官中測定。優(yōu)選地，包含于待分析的所述液體、組織或器官之內(nèi)的細胞包含編碼膠原基因肽的核酸分子和/或膠原基因蛋白本身。本發(fā)明的化合物可通過向合適的藥學上可接受的稀釋劑或載體中添加有效量的化合物來用于藥物組合物。本發(fā)明的化合物和方法的應用也可為預防上有用的。綴合物本發(fā)明的寡核苷酸的另一種修飾涉及以化學方法將一種或多種增強寡核苷酸的活性、細胞分布或細胞攝取的部分或綴合物與寡核苷酸連接。這些部分或綴合物可包含與官能團(例如伯羥基或仲羥基)共價結(jié)合的綴合基團。本發(fā)明的綴合基團包括嵌入齊U、報道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強寡聚體藥效學特性的基團，以及增強寡聚體藥代動力學特性的基團。典型的綴合基團包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光黃、羅丹明、香豆素和染料。增強藥效學特性的基團，在本發(fā)明的文段中，包括改善攝取、增強對降解的抗性和/或加強與靶核酸的序列特異性雜交的基團。增強藥代動力學特性的基團，在本發(fā)明的文段中，包括改善本發(fā)明的化合物的攝取、分布、代謝或分泌的基團。代表性的綴合基團在提交于1992年10月23日的國際專利申請?zhí)朠CT/US92/09196和美國專利第6，287，860號中公開，所述文獻通過弓I用結(jié)合于本文中。綴合部分包括但不限于，脂質(zhì)部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如，己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代膽固醇、脂族鏈(例如，十二烷二醇或十一烷基殘基)、磷脂(例如，二-十六烷基-消旋-甘油或1，2- 二 -O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸三乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八胺或己基氨基-羰基-羥膽固醇部分。也可將本發(fā)明的寡核苷酸與活性藥物物質(zhì)綴合，例如，阿司匹林、華法林、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)_(+)普拉洛芬、卡洛芬、丹酰肌氨酸、2，3，5_三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮雜草、11引哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸鹽、頭孢菌素、磺胺 類藥物、抗糖尿病藥、抗菌劑或抗生素。教導制備這類寡核苷酸綴合物的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、5，578，717,5, 580, 731,5, 580, 731,5, 591，584,5, 109, 124,5, 118，802,5, 138，045、5，414，077,5, 486，603,5, 512，439,5, 578，718,5, 608，046,4, 587，044,4, 605，735、4，667，025,4,762，779,4,789，737,4,824，941,4,835，263,4,876，335,4,904，582、4，958，013、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5, 254，469,5, 258，506,5, 262，536,5, 272，250,5, 292，873,5, 317，098、5，371，241、5，391，723、5，416，203、5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481,5, 587，371,5, 595，726、5，597，696、5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941 號。制劑本發(fā)明的化合物也可與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、封裝、綴合或以其他方式締合，作為例如，脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服的、直腸的、局部的或其他制劑，用于有助于攝取、分布和/或吸收。教導制備這類攝取、分布和/或吸收輔助制劑的代表性的美國專利包括但不限于，美國專利第5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127、5，521，291、5，543，165、5，547，932、5，583，020、5，591，721、4，426，330、4，534，899、5，013，556、5，108，921、5，213，804、5，227，170、5，264，221,5,356，633、5，395，619、5，416，016,5, 417，978,5, 462，854,5, 469，854,5, 512，295,5, 527，528,5, 534，259、5，543，152,5, 556，948,5, 580，575和5，595，756號，每個通過引用結(jié)合于本文中。盡管，反義寡核苷酸不需要在載體的情況中施用以便調(diào)節(jié)靶表達和/或功能，但是本發(fā)明的實施方案涉及用于反義寡核苷酸表達的表達載體構(gòu)建體，包括啟動子、雜合啟動子基因序列并且擁有強組成型啟動子活性，或可在所需情況下誘導的啟動子活性。在一個實施方案中，本發(fā)明實施涉及用適合的核酸遞送系統(tǒng)施用至少一種前述反義寡核苷酸。在一個實施方案中，該系統(tǒng)包含與多核苷酸可操作連接的非病毒載體。這類非病毒載體的實例包括單獨的寡核苷酸(例如，SEQ ID NO :10-29中的任一個或多個)或與適合的蛋白、多糖或脂質(zhì)制劑組合的寡核苷酸。其他適合的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，典型地來自腺病毒、腺病毒伴隨病毒(AAV)、依賴輔助病毒的腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或仙臺病毒-脂質(zhì)體(HVJ)復合體中的至少一種的序列。優(yōu)選地，所述病毒載體包含與多核苷酸可操作連接的強真核啟動子，例如，巨細胞病毒(CMV)啟動子。另外的載體包括病毒載體、融合蛋白和化學綴合物。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種基于HIV的病毒載體包括至少兩種載體,其中g(shù)ag基因和pol基因來自HIV基因組而env基因來自另一種病毒。DNA病毒載體為優(yōu)選的。這些載體包括痘病毒載體(例如正痘病毒或禽痘病毒載體)、皰疹病毒載體(例如單純皰疹I(lǐng)病毒(HSV)載體、腺病毒載體和腺伴隨病毒載體。
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本發(fā)明的反義化合物包括任何藥學上可接受的鹽、酯、或這類酯的鹽、或任何其他化合物，其在施用給動物包括人后，能夠提供(直接地或間接地)生物學活性的代謝物或其殘留物。術(shù)語“藥學上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的生理上和藥學上可接受的鹽SP，保留母體化合物的所需生物活性且不對其賦予非所需的毒理學作用的鹽。對于寡核苷酸而言，藥學上可接受的鹽的實例和其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中，其通過引用結(jié)合于本文中。本發(fā)明也包括包含本發(fā)明的反義化合物的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以以若干方式來施用，這取決于是否需要局部或全身治療以及待治療的區(qū)域。施用可為局部的(包括眼的和至黏膜包括陰道和直腸遞送)、肺的(例如，通過吸入或吹入散劑或氣霧劑，包括通過噴霧器)、氣管內(nèi)的、鼻內(nèi)的、表皮的和經(jīng)皮的、□服的或胃腸外的。胃腸外施用包括靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌肉注射或輸注；或顱內(nèi)例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)施用。對于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的組織而言，可通過例如注射或輸注進入腦脊液進行施用。施用反義RNA進入腦脊液已在例如美國專利申請公開第2007/0117772號，“Methodsfor slowing familial ALS disease progression(減緩家族性 ALS疾病進展的方法)”中描述，該申請通過引用以其整體結(jié)合于本文中。如果意圖將本發(fā)明的反義寡核苷酸施用給中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞，可與一種或多種能夠促進主題反義寡核苷酸滲透穿過血腦屏障的物質(zhì)一起施用。注射可在例如內(nèi)嗅皮質(zhì)或海馬中進行。通過施用腺病毒載體遞送神經(jīng)營養(yǎng)因子至肌肉組織中的運動神經(jīng)元描述于，例如，美國專利第 6，632，427 號，“Adenoviral-vector-mediated gene transfer intomedullary motor neurons (腺病毒載體介導基因轉(zhuǎn)移進入髓質(zhì)運動神經(jīng)元)”,其通過引用結(jié)合于本文中。直接遞送載體至腦(例如，紋狀體、丘腦、海馬或黑質(zhì))為本領(lǐng)域已知且描述于例如美國專利第6，756，523號，“Adenovirus vectors for the transfer of foreigngenes into cells of the central nervous system particularly in brain(用于轉(zhuǎn)移外源基因進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)細胞(具體地腦中)的腺病毒載體)”，其通過引用結(jié)合于本文中。施用可快速，如通過注射，或在一段時間內(nèi)進行，如通過緩慢輸注或施用緩釋制劑。主題反義寡核苷酸也可與提供所需藥學或藥效學特性的物質(zhì)連接或綴合。例如，反義寡核苷酸可與本領(lǐng)域已知的促進滲透或轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障的任何物質(zhì)(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體)偶聯(lián)，并通過靜脈注射施用。反義化合物可與例如使反義化合物更有效和/或增加反義化合物轉(zhuǎn)運穿過血腦屏障的病毒載體連接。滲透性血腦屏障破壞也可通過例如輸注糖或氨基酸來完成，所述糖包括但不限于，內(nèi)消旋赤蘚醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D(+)乳糖、D(+)木糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纖維二糖、D(+)麥芽糖、D(+)蜜三糖、L(+)鼠李糖、D⑴蜜二糖、D(-)核糖、側(cè)金盞糖醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)巖藻糖、L(-)巖藻糖、D(-)來蘇糖、L(+)來蘇糖和L(-)來蘇糖，所述氨基酸包括但不限于，谷氨酰胺、賴氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和?；撬?。用于增強血腦屏障滲透的方法和材料描述于，例如，美國專利第 4，866，042 號，“Method for the delivery of genetic material acrossthe blood brain barrier (用于遞送遺傳物質(zhì)穿過血腦屏障的方法)”,第6，294，520號，“Material for passage through the blood-brain barrier (用于通過血腦屏障的材料)，，，和第6，936，589號，“Parenteral delivery systems (胃腸外遞送系統(tǒng))”，全部通過引用以其整體結(jié)合于本文中。
主題反義化合物可與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物混合、封裝、綴合或以其他方式締合，作為例如脂質(zhì)體、受體靶向分子、口服的、直腸的、局部的或其他制劑，用于有助于攝取、分布和/或吸收。例如，陽離子脂質(zhì)可包含在制劑中以促進寡核苷酸攝取。一種顯示出促進攝取的這類組合物為LIP0FECTIN (可從GIBCO-BRL，Bethesda, MD獲得)。認為帶有至少一個2’ -0-甲氧基乙基修飾的寡核苷酸對于口服施用而言為特別有用的。用于局部施用的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠齊IJ、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體劑和散劑。常規(guī)藥物載體、水性、粉末或油性基質(zhì)、增稠劑等可為必要的或所需的。包被的避孕套、手套等也可為有用的?？蛇m宜地以單位劑型存在的本發(fā)明藥物制劑，可根據(jù)藥學工業(yè)中眾所周知的常規(guī)技術(shù)來制備。這類技術(shù)包括使活性成分與藥物載體或賦形劑組合的步驟。一般而言，制劑如下制備通過使活性成分與液體載體或細碎的固體載體或兩者均勻和緊密地組合，隨后在需要時使產(chǎn)物成形?？蓪⒈景l(fā)明的組合物制成任何許多可能劑型，例如但不限于，片劑、膠囊劑、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑和灌腸劑。也可將本發(fā)明的組合物在水性、非水性或混合介質(zhì)中制成混懸劑。水性混懸劑可進一步包含增加混懸劑粘度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨醇和/或葡聚糖。所述混懸劑也可包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于，溶液劑、乳劑、泡沫劑和含脂質(zhì)體的制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可包含一種或多種滲透促進劑、載體、賦形劑或其他活性或非活性成分。乳劑典型地為一種液體以通常直徑超過0. I y m的液滴形式分散在另一種液體中的非均質(zhì)體系。乳劑可包含除分散相之外的其他組分，以及可作為在水相、油相中的溶液或其本身作為單獨相存在的活性藥物。將微乳劑包括為本發(fā)明的一個實施方案。乳劑及其使用為本領(lǐng)域眾所周知的且進一步描述于美國專利第6，287，860號中。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明所用的術(shù)語“脂質(zhì)體”意為由排列在一個或多個球形雙層中的兩親脂質(zhì)組成的囊泡。脂質(zhì)體為具有由親脂材料形成的膜和包含待遞送組合物的水性內(nèi)部的單層或多層囊泡。陽離子脂質(zhì)體為帶正電的脂質(zhì)體，認為其與帶負電的DNA分子相互作用以形成穩(wěn)定的復合體。認為pH敏感的或帶負電的脂質(zhì)體誘捕DNA而不是與其復合。陽離子和非陽離子脂質(zhì)體均已用來遞送DNA到細胞。脂質(zhì)體也包括“空間上穩(wěn)定的”脂質(zhì)體，該術(shù)語如本文所用是指包含一種或多種特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體。當摻入到脂質(zhì)體中時，這些特化脂質(zhì)給脂質(zhì)體帶來相對于缺乏這類特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體增長的循環(huán)生命期。空間上穩(wěn)定的脂質(zhì)體的實例為以下脂質(zhì)體，其中脂質(zhì)體形成囊泡的脂質(zhì)部分的部分包含一種或多種糖脂或衍生有一種或多種親水聚合物，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂質(zhì)體及其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中。本發(fā)明的藥物制劑和組合物也可包含表面活性劑。表面活性劑在藥物產(chǎn)品、制劑和乳劑中的使用為本領(lǐng)域眾所周知的。表面活性劑及其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中，其通過引用結(jié)合于本文中。

在一個實施方案中，本發(fā)明使用各種滲透促進劑來實現(xiàn)核酸特別是寡核苷酸的有效遞送。除了有助于非親脂性藥物穿過細胞膜的擴散之外，滲透促進劑還增加親脂性藥物的滲透性?？蓪B透促進劑歸類為屬于五大類的一種，五大類即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑。滲透促進劑及其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號，其通過引用結(jié)合于本文中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，根據(jù)其預期用途(即給藥途徑)來常規(guī)地設計制劑。用于局部給藥的制劑包括以下制劑，其中本發(fā)明寡核苷酸與局部遞送劑(例如，脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、留類化合物、螯合劑和表面活性劑)混合。脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油?；?磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蘧?；字Ｄ憠ADMPC、二硬脂?；字Ｄ憠A)、陰性的(例如二肉豆蘧?；字８视虳MPG)和陽離子的(例如二油酰基四甲基氨丙基DOTAP和二油?；?磷脂?；掖及稤0TMA)。對于局部或其他給藥而言，可將本發(fā)明的寡核苷酸封裝在脂質(zhì)體內(nèi)或可與其(特別是與陽離子脂質(zhì)體)形成復合體?；蛘撸蓪⒐押塑账崤c脂質(zhì)(特別是陽離子脂質(zhì))復合。脂肪酸和酯類、其藥學上可接受的鹽以及它們的使用進一步描述于美國專利第6，287，860 號中。用于口服給藥的組合物和制劑包括散劑或顆粒劑、微粒、納米粒子、在水或非水性介質(zhì)中的混懸劑或溶液劑、膠囊劑、凝膠膠囊、小藥囊、片劑或小片。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可為所需的。口服制劑為以下制劑，其中將本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種滲透促進劑、表面活性劑和螯合劑協(xié)同施用。表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。膽汁酸/鹽和脂肪酸及其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中，其通過引用結(jié)合于本文中。滲透促進劑的組合亦是如此，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽的組合。具體地組合為月桂酸的鈉鹽、癸酸和UDCA。另外的滲透促進劑包括聚氧化乙烯-9-月桂醚、聚氧化乙烯-20-鯨蠟醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以以包括噴霧干燥顆粒的顆粒形式口服地遞送，或絡合以形成微米或納米粒子。寡核苷酸絡合劑及其使用進一步描述于美國專利第6，287，860號中，其通過引用結(jié)合于本文中。用于胃腸外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥的組合物和制劑可包括無菌水性溶液劑，其也可含有緩沖液、稀釋劑和其他適合的添加劑，例如但不限于，滲透促進劑、載體化合物和其他藥學上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的某些實施方案提供藥物組合物，所述藥物組合物包含一種或多種寡聚化合物和一種或多種其他通過非反義機制來起作用的化學治療劑。這類化學治療劑的實例包括但不限于癌癥化學治療藥物，例如柔紅霉素、道諾霉素、更生霉素、多柔比星、表柔比星、伊達比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、胞嘧啶阿拉伯糖苷、雙氯乙基-亞硝基脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝基脲、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-巰鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氮雜胞苷、羥基脲、脫氧考福霉素、4-羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5_氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素、長春新堿、長春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、拓泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當與本發(fā)明的化合物一起使用時，這類化學治療劑可單獨地(例如，5-FU和寡核苷酸)、序貫地(例如，5-FU和寡核苷酸持續(xù)一段時 間，接著MTX和寡核苷酸)、或與一種或多種其他的這類化學治療劑組合(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或5-FU、放射療法和寡核苷酸)使用?？寡姿?包括但不限于非留體抗炎藥和皮質(zhì)類固醇)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)也可組合到本發(fā)明的組合物中。反義化合物和其他非反義藥物的組合也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。兩種或更多種組合的化合物可一起或序貫使用。在另一個相關(guān)的實施方案中，本發(fā)明的組合物可包含靶定到第一核酸的一種或多種反義化合物(特別是寡核苷酸)，以及靶定到第二核酸靶標的一種或多種其他反義化合物。例如，第一靶標可為膠原基因的特定反義序列，第二靶標可為來自另一個核苷酸序列的區(qū)域?；蛘?，本發(fā)明的組合物可包含靶定到相同膠原基因核酸靶標的不同區(qū)域的兩種或更多種反義化合物。本文舉例說明了許多反義化合物的實例而其他的可選自本領(lǐng)域已知的適合化合物。兩種或更多種組合化合物可一起或序貫使用。給藥認為治療組合物的制劑和其隨后的施用(給藥)在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)之內(nèi)。給藥取決于要治療的疾病狀態(tài)的嚴重性和應答性，而療程從數(shù)天持續(xù)到數(shù)月，或直到完成治愈或達到疾病狀態(tài)的減輕。最佳給藥方案可根據(jù)患者體內(nèi)藥物蓄積的測定來計算。普通技術(shù)人員可容易地確定最適劑量、給藥方法和重復率。最適劑量可根據(jù)單獨寡核苷酸的相對功效而不同，一般可基于發(fā)現(xiàn)在體外和體內(nèi)動物模型中有效的EC50來評價。一般而言，劑量為0. 01 u g-100g/kg體重,且可每天、每周、每月或每年給藥一次或多次,或甚至每2-20年一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可基于測定體液或組織中藥物的停留時間和濃度來容易地評價給藥的重復率。成功治療之后，可能需要使患者進行維持療法以預防疾病狀態(tài)的復發(fā)，其中所述寡核苷酸以維持劑量來施用，范圍為0. 01 Ii g-100g/kg體重,每天一次或多次到每20年一次。在實施方案中，使用下列劑量的藥物治療患者，所述劑量為至少約I、至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、至少約90、或至少約100mg/kg體重。反義寡核苷酸的某些注射劑量描述于，例如，美國專利第7，563，884號,“Antisense modulation of PTPlB expression(PTP1B表達的反義調(diào)節(jié))”通過引用以其整體結(jié)合于本文中。雖然上文已描述了本發(fā)明的各種實施方案，但是應理解的是，其僅以實例的方式提供，而并非限制。對公開的實施方案的許多改變可依照本文的公開內(nèi)容來進行，而不會背離本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明的廣度和范圍不應受到任何上述的實施方案所限制。本文提及的所有文件都通過引用結(jié)合到本文中。本申請引用的所有出版物和專利文件都為所有目的而通過引用結(jié)合，引用程度如同單獨地指出各個出版物或?qū)＠募粯?。至于申請人在本文件中對不同參考文獻的引用，申請人并不承認任何具體參考文獻對其發(fā)明而言為“現(xiàn)有技術(shù)”。本發(fā)明的組合物和方法的實施方案舉例說明于下列實施例中。
實施例下列非限制性的實施例用于舉例說明本發(fā)明的經(jīng)挑選的實施方案。應理解的是，所示組分的比例變化和要素備選對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言為顯而易見的且在本發(fā)明的實 施方案的范圍之內(nèi)。實施例I :對膠原基因的反義核酸分子和/或膠原基因多核苷酸有義鏈特異的反義寡核苷酸的設計如上指出的術(shù)語“對......特異的寡核苷酸”或“靶定......的寡核苷酸”是指具
有以下序列的寡核苷酸，該序列(i)能夠與靶定基因的一部分形成穩(wěn)定的復合體，或(ii)能夠與祀定基因mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。適當寡核苷酸的挑選通過使用計算機程序來促進，該計算機程序自動比對核酸序列并指出同一性或同源性區(qū)域。這類程序用于比較例如通過搜索諸如GenBank等數(shù)據(jù)庫或通過測序PCR產(chǎn)物而獲得的核酸序列。來自一系列物種的核酸序列的比較允許挑選顯示出物種之間適當同一性程度的核酸序列。在未測序基因的情況下，進行DNA印跡來確定在靶物種和其他物種的基因之間的同一性程度。通過在各種嚴格程度下進行DNA印跡，如本領(lǐng)域眾所周知的，可獲得同一性的近似測量。這些程序允許挑選這樣的寡核苷酸，其對在待控制的受試者中的靶核酸序列表現(xiàn)高度的互補性而對在其他物種中的相應核酸序列表現(xiàn)較低程度的互補性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，在挑選用于本發(fā)明的適當?shù)幕騾^(qū)域上具有相當大的自由。反義化合物為“可特異雜交的”，如果所述化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能，導致功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并且在需要特異性結(jié)合的條件下具有足夠程度的互補性以避免所述反義化合物與非靶核酸序列的非特異性結(jié)合，所述條件即在體內(nèi)測定或治療處理情況中的生理條件下，以及在體外測定情況中進行測定的條件下。本文所述的寡核苷酸的雜交特性可通過本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測定法來確定。例如，本文所述的寡核苷酸的特性可通過使用解鏈曲線測定法確定靶天然反義物和潛在藥物分子之間的結(jié)合強度來獲得。靶天然反義物和潛在藥物分子(Molecule)之間的結(jié)合強度，可使用任何已建立的測定分子間相互作用強度的方法例如解鏈曲線測定法來評價。解鏈曲線測定法確定這樣的溫度，在該溫度下天然反義物/Molecule復合體發(fā)生從雙鏈構(gòu)象到單鏈構(gòu)象的迅速轉(zhuǎn)變。此溫度被廣泛認可為兩個分子之間相互作用強度的可
靠衡量。
解鏈曲線測定法可使用實際的天然反義RNA分子的cDNA拷貝或?qū)狹olecule的結(jié)合位點的合成DNA或RNA核苷酸來進行。包含進行此測定的所有必需試劑的多種試劑盒為可得的(例如Applied Biosystems Inc. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包含含有雙鏈DNA(dsDNA)結(jié)合染料(例如ABI HRM染料、SYBR GreeruSYTO等)之一的適宜的緩沖溶液。dsDNA染料的特性為，其在游離形式幾乎不發(fā)出熒光，但當與dsDNA結(jié)合時為高度熒光的。為進行所述測定，將所述cDNA或相應寡核苷酸以由具體制造商的方案限定的濃度與Molecule混合。將所述混合物加熱到95°C以解離所有預先形成的dsDNA復合體，然后緩慢冷卻到室溫或由試劑盒制造商確定的其他較低的溫度以使DNA分子退火。隨后將新形成的復合體緩慢加熱到95°C，同時連續(xù)地收集由反應產(chǎn)生的熒光量的數(shù)據(jù)。熒光強度反比于反應中存在的dsDNA量。數(shù)據(jù)可使用與所述試劑盒相配的實時PCR儀器(例如ABI’sStepOne Plus Real Time PCR System或LightTyper儀器,Roche Dia gnostics,Lewes,UK)來收集。解鏈峰通過使用適當軟件(例如LightTyper (Roche)或SDS DissociationCurve, ABI)對溫度(x_軸)繪制熒光關(guān)于溫度的負導數(shù)(在y_軸上的_d (熒光)/dT)的圖形來構(gòu)建。分析數(shù)據(jù)以確定從dsDNA復合體迅速轉(zhuǎn)變到單鏈分子的溫度。此溫度稱為Tm且正比于兩個分子之間的相互作用強度。典型地，Tm將超過40°C。實施例2 :膠原基因多核苷酸的調(diào)節(jié)用反義寡核苷酸處理IfepG2細胞使來自ATCC的IfepG2細胞(目錄號HB-8065)在37 °C和5 % CO2下生長于生長培養(yǎng)基(MEM/EBSS(Hyclone 目錄號 SH30024 或 Mediatech 目錄號 MT-10-010-CV)+10 %FBS (Mediatech 目錄號 MT35-011-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號 MT30-002-CI))。試驗的前一天將所述細胞以密度I. 5XlOVml再接種到6孔板，并在37°C和5% CO2下培養(yǎng)。在試驗當天將6孔板中的培養(yǎng)基換成新鮮的生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 u M的濃度。將2 ill此溶液與400 u I Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號31985-070)和4 u I Lipofectamine2000 (Invitrogen 目錄號 11668019)在室溫下孵育 20min,然后施用到具有H印G2細胞的6孔板的每個孔。含有2 Ul水代替所述寡核苷酸溶液的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5% CO2下培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基換成新鮮的生長培養(yǎng)基。添加反義寡核苷酸48h后,將培養(yǎng)基移出，并遵循制造商的說明書使用Promega的SV TotalRNA Isolation System(目錄號 Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試劑盒(目錄號74181)從細胞中提取RNA。向如制造商的方案中所述使用Thermo Scientific的 Verso cDNA 試劑盒(目錄號 AB1453B)或 High Capacity cDNA Reverse TranscriptionKit(目錄號4368813)進行的反轉(zhuǎn)錄反應中，添加600ng RNA。將來自此反轉(zhuǎn)錄反應的cDNA用于通過使用 ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號 4369510)和由 ABI (AppliedBiosystems Taqman Gene Expression Assay :Hs00164004_ml、Hs00164310_ml, AppliedBiosystems Inc. , Foster City CA)設計的引物/探針的實時PCR,來監(jiān)控基因表達。使用下面的 PCR 循環(huán)50°C,2min ；95°C, IOmin ;40 個循環(huán)的(95。。，15 秒;60°C，Imin)，使用Mx4000 熱循環(huán)儀(Stratagene)。用反義寡核苷酸處理后基因表達的倍數(shù)變化基于處理和模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間18S-標準化的dCt值的不同來計算。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，HepG2細胞中Collal mRNA的水平在用針對Collal反義物DW440457設計的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加(圖I)。實時PCR結(jié)果顯示，HepG2細胞中Col7al mRNA的水平在用針對Col7al設計為bel42537和bg998538的兩種寡核苷酸處理后48h顯著增加(圖4)。用反義寡核苷酸處理HUVEC細胞使來自ATCC 的 HUVEC 細胞(Promo Cell 目錄號 C-12253)在 37°C 和 5 % CO2 下生長于上皮生長培養(yǎng)基(Epithelial Growth Media) (Promo Cell目錄號C-22010)。試驗的前一天使用Promo Cell Detach Kit(目錄號C-41200)將所述細胞以密度I. 5X 105/ml 再接種到6孔板，并在37°C和5% CO2下培養(yǎng)。在試驗當天將6孔板中的培養(yǎng)基換成新鮮的上皮生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋到20 ii M的濃度。將2 ill此溶液與400 u IOpti-MEM 培養(yǎng)基(Gibco 目錄號 31985-070)和 4 u ILipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號11668019)在室溫下孵育20min，然后施用到具有HUVEC細胞的6孔板的每個孔。含有2 U I水代替所述寡核苷酸溶液的類似混合物用于模擬轉(zhuǎn)染的對照。在37°C和5% CO2下培養(yǎng)3-18h后，將培養(yǎng)基換成新鮮的生長培養(yǎng)基。添加反義寡核苷酸48h后，將培養(yǎng)基移出，并遵循制造商的說明書使用Promega的SV Total RNA Isolation System(目錄號Z3105)或Qiagen的RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號74181)從細胞中提取RNA。向如制造商的方案中所述使用Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號AB1453B)進行的反轉(zhuǎn)錄反應中，添加600ng RNA。將來自此反轉(zhuǎn)錄反應的cDNA用于通過使用ABITaqman Gene Expression Mix (目錄號 4369510)和由 ABI (Applied Biosystems TaqmanGene Expression Assay :Hs01028970_ml和 Hs00164310_ml, Applied Biosystems Inc.,Foster City CA)設計的引物/探針的實時PCR，來監(jiān)控基因表達。使用下面的PCR循環(huán)50°C，2min ;95°C，IOmin ;40 個循環(huán)的(95°C，15 秒；60°C，Imin)，使用 St印One Plus RealTime PCR Machine (Applied Biosystems Inc.)或 Mx4000 熱循環(huán)儀(Stratagene)。用反義寡核苷酸處理后基因表達的倍數(shù)變化基于處理和模擬轉(zhuǎn)染的樣品之間18S-標準化的dCt值的不同來計算。結(jié)果實時PCR結(jié)果顯示，HUVEC細胞中Colla2 mRNA的水平在用針對Colla2反義物Hs. 571263設計的寡核苷酸之一處理后48h顯著增加(圖2)。實時PCR結(jié)果顯示，HUVEC細胞中Col7al mRNA的水平在用針對Col7al設計為CV425857(CV425857. 1_1、CV425857. 1_2)的 siRNA 之一和針對 BU615800. 1(BU615800. 1_1)的一種siRNA處理后48h顯著增加(圖3)。盡管已就一個或多個實現(xiàn)舉例說明并描述本發(fā)明，但在閱讀和理解本說明書和附圖后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將想到等價改變和修飾。此外，雖然本發(fā)明的具體特征可能已就幾個實現(xiàn)中的唯一一個公開，但這類特征可與其他實現(xiàn)的一個或多個其他特征組合，因為對于任何給定或具體應用而言可為所需和有利的。本公開內(nèi)容的摘要將允許讀者快速確定本技術(shù)公開內(nèi)容的性質(zhì)。在理解以下的情況下將其提出其將不用于解釋或限制隨附權(quán)利要求的范圍或含義。
權(quán)利要求
1.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括 使所述細胞或組織與至少ー種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少ー種寡核苷酸與以下多核苷酸的反向互補序列具有至少50%序列同一'丨生,所述多核苷酸包含在 SEQ ID SEQ ID NO :4 的核苷酸 1_387、SEQ ID NO :5 的核苷酸 1_561、SEQ ID SEQID NO 6 的核苷酸 1-335、SEQ ID NO 7 的核苷酸 1-613、SEQ ID NO 8 的核苷酸 1-177 和SEQ ID NO 9的核苷酸1-285之內(nèi)的5_30個連續(xù)核苷酸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。
2.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括 使所述細胞或組織與至少ー種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述至少ー種寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的天然反義物的反向互補序列具有至少50%序列同一性；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。
3.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括 使所述細胞或組織與至少ー種長度為5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一'注；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。
4.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達的方法，所述方法包括 使所述細胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少ー種反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。
5.權(quán)利要求4的方法，其中膠原基因的功能和/或表達在體內(nèi)或體外相對于對照増加。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定包含膠原基因多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶定膠原基因多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法,其中所述至少一種反義寡核苷酸包含ー種或多種選自以下的修飾至少ー種經(jīng)修飾的糖部分、至少ー種經(jīng)修飾的核苷間鍵、至少ー種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述ー種或多種修飾包括至少ー種選自以下的經(jīng)修飾糖部分2’ -O-甲氧基こ基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、ニ環(huán)糖部分及其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述ー種或多種修飾包括至少ー種選自以下的經(jīng)修飾核苷間鍵硫代磷酸酷、2’ -O-甲氧基こ基(MOE)、2’ -氟、烷基膦酸酯、ニ硫代磷酸酷、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酷、碳酸酯、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酯及其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述ー種或多種修飾包括至少ー種選自以下的經(jīng)修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其類似物、衍生物及組合。
13.權(quán)利要求I的方法，其中所述至少ー種寡核苷酸包含至少ー個如SEQID NO 10-29所述的寡核苷酸序列。
14.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中膠原基因的功能和/或表達的方法，所述方法包括 使所述細胞或組織與至少ー種長度為5-30個核苷酸的短干擾RNA (SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少ー種siRNA寡核苷酸對膠原基因多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少ー種siRNA寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中膠原基因的功能和/或表達。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與至少約五個連續(xù)核酸的序列具有至少80%序列同一性，所述序列與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補。
16.ー種在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中膠原基因的功能和/或表達的方法，所述方法包括 使所述細胞或組織與至少ー種長度為約5-30個核苷酸的反義寡核苷酸接觸，所述反義寡核苷酸對膠原基因多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異，其中所述至少一種反義寡核苷酸與至少ー個如SEQ ID NO :1-9所述的核酸序列具有至少50%序列同一性；和，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動物細胞或組織中膠原基因的功能和/或表達。
17.ー種合成的、經(jīng)修飾的寡核苷酸，所述寡核苷酸包含至少ー種修飾，其中所述至少ー種修飾選自至少ー種經(jīng)修飾的糖部分；至少ー種經(jīng)修飾的核苷酸間鍵；至少ー種經(jīng)修飾的核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸為與正常對照相比在體內(nèi)或體外與膠原基因雜交并調(diào)節(jié)所述基因的功能和/或表達的反義化合物。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、ニ硫代磷酸酷、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酷、碳酸酷、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酯及其組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少ー種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵的骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少ー種經(jīng)修飾的核苷酸，所述經(jīng)修飾的核苷酸選自肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物及組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸硫代磷酸酷、烷基膦酸酷、ニ硫代磷酸酷、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酷、碳酸酯、磷酸三酷、氨基こ酸酷、羧甲基酯及其組合。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、其類似物、衍生物及組合。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少ー種選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -O-甲氧基こ基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、ニ環(huán)糖部分及其組合。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸包含多種修飾,其中所述修飾包括選自以下的經(jīng)修飾的糖部分2’ -O-甲氧基こ基修飾的糖部分、2’ -甲氧基修飾的糖部分、2’ -O-烷基修飾的糖部分、ニ環(huán)糖部分及其組合。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸,其中所述寡核苷酸長度為至少約5-30個核苷酸且與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約20%序列同一'注。
27.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與膠原基因多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個連續(xù)核酸的互補序列具有至少約80%序列同一性。
28.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與正常對照相比在體內(nèi)或體外與至少一種膠原基因多核苷酸雜交并調(diào)節(jié)所述多核苷酸的表達和/或功能。
29.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含如SEQIDNO 10-29所述的序列。
30.一種組合物，所述組合物包含對ー種或多種膠原基因多核苷酸特異的ー種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQID NO : 10-29所述核苷酸序列中的任ー個相比,具有至少約40 %序列同一性。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO : 10-29所述的核苷酸序列。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中如SEQID NO :10-29所述的寡核苷酸包含ー種或多種修飾或取代。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述ー種或多種修飾選自硫代磷酸酷、甲基膦酸酷、肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預防或治療與至少ー種膠原基因多核苷酸和/或至少ー種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括 給患者施用治療有效劑量的至少ー種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與所述至少一種膠原基因多核苷酸的天然反義序列結(jié)合，并調(diào)節(jié)所述至少一種膠原基因多核苷酸的表達；從而預防或治療與至少ー種膠原基因多核苷酸和/或至少ー種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病。
36.權(quán)利要求35的方法,其中與至少ー種膠原基因多核苷酸有關(guān)的疾病選自膠原障礙、年齡相關(guān)的膠原降解、成骨不全、耳硬化(OTSC)、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎、食管鱗狀上皮細胞癌、軟骨發(fā)育不全、非典型馬方綜合征、埃-當綜合征(EDS)、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥(DEB)、卡菲病、動脈瘤(例如顱內(nèi)動脈瘤)、特發(fā)性肺纖維化、肝硬化、腎纖維化、肝纖維化、心臟纖維化、硬皮病、肥厚性瘢痕、瘢痕疙瘩、癌癥、炎癥、遺傳性疾病(例如杜興肌營養(yǎng)不良)、神經(jīng)疾病或病癥(例如帕金森病、阿爾茨海默氏病、亨廷頓舞蹈病、戈謝病)、代謝病(例如I型糖尿病)、自身免疫性疾病或病癥、創(chuàng)傷(例如脊髓損傷、燒傷等)、缺血，以及其它血管、心臟、皮膚疾病或病癥，皮膚老化、需要皮膚工程的皮膚疾病或病癥或病況、需要移植的肝臟或腎臟疾?。浑?、骨或組織再生；骨骼修復、軟骨和骨修復。
37.ー種鑒定和選擇用于體內(nèi)施用的至少ー種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)有關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個連續(xù)核苷酸的至少ー種寡核苷酸，所述連續(xù)核苷酸與所選的靶多核苷酸或與所選靶多核苷酸的反義多核苷酸互補；在嚴格雜交條件下，測定反義寡核苷酸與靶多核苷酸或所選靶多核苷酸的反義多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；以及基于獲得的信息選擇用于體內(nèi)施用的至少ー種寡核苷酸。
38.一種預防或治療與至少ー種膠原基因多核苷酸和/或至少ー種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的皮膚病況的方法，所述方法包括 給具有皮膚病況或處于形成皮膚病況的風險中的患者施用治療有效劑量的至少ー種反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸與所述至少一種膠原基因多核苷酸的天然反義序列結(jié)合并調(diào)節(jié)所述至少一種膠原基因多核苷酸的表達；從而預防或治療與至少ー種膠原基因多核苷酸和/或至少ー種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病性皮膚病況。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述皮膚病況由炎癥、光損傷或老化引發(fā)。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述皮膚病況為形成皺紋、接觸性皮炎、特應性皮炎、光化性角化病、角質(zhì)化病癥、大皰性表皮松解癥、剝脫性皮炎、脂溢性皮炎、紅斑、盤狀紅斑狼瘡、皮肌炎、皮膚癌或自然老化的作用。
41.ー種基于膠原基因的基質(zhì)組合物，所述組合物包含由膠原原纖維組成的三維純化膠原基質(zhì)，其中通過使膠原原纖維細胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少ー種反義寡核苷酸接觸，在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)膠原原纖維細胞中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。
42.權(quán)利要求41的組合物，其中所述寡核苷酸與如SEQID NO :10-29所述核苷酸序列中的任ー個相比,具有至少約40 %序列同一性。
43.權(quán)利要求41的組合物，其中所述寡核苷酸包含如SEQID NO : 10-29所述的核苷酸序列。
44.權(quán)利要求41的組合物，其中所述組合物支持干細胞。
45.ー種體外、離體或體內(nèi)傷ロ愈合或組織再生或組織工程的方法，所述方法包括給傷ロ施用如權(quán)利要求41所定義的胞外基質(zhì)組合物。
46.一種制備基于膠原基因的基質(zhì)組合物的方法，所述方法包括使膠原原纖維細胞或組織與靶定膠原基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少ー種反義寡核苷酸接觸；從而在體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細胞或組織中膠原基因多核苷酸的功能和/或表達。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，具體而言，其通過靶定膠原基因的天然反義多核苷酸，來調(diào)節(jié)膠原基因的表達和/或功能。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與膠原基因表達有關(guān)的疾病和病癥中的用途。
文檔編號C12N15/113GK102695797SQ201080037030
公開日2012年9月26日 申請日期2010年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月16日
發(fā)明者J·科拉德, O·霍爾科瓦謝爾曼 申請人:歐科庫爾納有限責任公司