MiR-17-5p惡性血液病輔助診斷試劑及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于血液病輔助診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種MiR?17?5p惡性血液病輔助診斷試劑及應(yīng)用，包括MiR?17?5p的qPCR上游引物，序列為：5’?GCCGCCAAAGTGCTTACA?3’以及MiR?17?5p的qPCR下游引物，序列為：5’?CAGAGCAGGGTCCGAGGTA?3’；還包括擴(kuò)增內(nèi)參U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列為5’?ATTGGAACGATACAGAGAAGATT?3’；以及U6的qPCR反向引物，序列為5’?GGAACGCTTCACGAATTTG?3’。本發(fā)明作為一種輔助診斷試劑，靈敏度強(qiáng)，特異性高，目的是通過快速檢測(cè)MiR?17?5p預(yù)估患者是否有惡性血液疾病的可能，對(duì)臨床惡性血液病的診療和預(yù)后提供分子檢測(cè)依據(jù)，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】
M i R-17-5p惡性血液病輔助診斷試劑及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于血液病輔助診斷試劑領(lǐng)域，具體設(shè)及一種MiR-17-5p惡性血液病輔助 診斷試劑及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 血液系統(tǒng)腫瘤已成為威脅人類生命的主要疾病之一，惡性血液病是一類難治性血 液系統(tǒng)腫瘤，其特點(diǎn)在于治療棘手，生存期短，預(yù)后差，且具體發(fā)病機(jī)制至今尚未明了。在對(duì) 惡性血液病的干預(yù)治療中，如果能對(duì)疾病做出早期診斷并達(dá)到良好的評(píng)估，對(duì)于改善患者 的臨床緩解率及預(yù)后評(píng)估提供有效的幫助，提高生存與治愈率。
[0003] MicroRNAs (miRNAs)是一類長(zhǎng)度約19-24nt的非編碼單鏈RNA，通過堿基互補(bǔ)配對(duì) 的方式與祀基因3'UTR區(qū)部分或完全互補(bǔ)，剪切祀基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或者抑制轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的翻 譯，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后祀基因的表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs與血細(xì)胞分化調(diào)控及血液腫瘤 的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療等密切相關(guān)，運(yùn)也提示我們從miRNAs入手可能為惡性血液病的診 斷和治療提供新的思路和手段。
[0004] 惡性血液病包括骨髓異常增生綜合征(MDS)、急性髓細(xì)胞白血病(AML)、慢性髓性 白血病(CML)、多發(fā)性骨髓瘤(MM) W及再生障礙性貧血(AA)等。MiR-17在基因組水平上定位 于人類染色體13q31.3，本研究主要WMDS、AML W及CML為例，闡明MiR-17-5p表達(dá)量的檢測(cè) 對(duì)于惡性血液病早期診斷的意義。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)與正常人樣本相比，MiR-17-5p在惡性血 液病患者中表達(dá)明顯上調(diào)，提示MiR17-5p可能作為惡性血液病診療的有效祀點(diǎn)。
[0005] 目前越來越多的研究表明miRNAs在惡性血液病的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著 重要的作用，目前針對(duì)惡性血液病的診斷尚無明確的分子標(biāo)記物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的之一是提供一種靈敏度強(qiáng)、特異性高、能快速檢測(cè) MiR-17-5pW預(yù)估患者是否有惡性血液疾病的MiR-17-5p惡性血液病輔助診斷試劑。
[0007] 本發(fā)明的目的之二是提供MiR-17-5p在制備惡性血液病輔助診斷試劑中的應(yīng)用。 [000引為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:MiR-17-5p惡性血液病輔助診斷試 劑，其特征在于，包括MiR-17-5p的qPCR上游引物，序列為:5' -GCCGCCAAAGTGCTTACA-3 ' W及 MiR-17-5p的qPCR下游引物，序列為：5 ' -CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3 ' ；還包括擴(kuò)增內(nèi)參U6的 qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正向引物，序列為5 ' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' ； W及U6的qPCR反向引物，序列為5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。
[0009] 還包括MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物和U6逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄引物均具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。上述 逆轉(zhuǎn)錄引物是采用CN200610027217.7的專利的原理設(shè)計(jì)而成的。
[0010] 所述的MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物和U6逆轉(zhuǎn)錄引物為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的一部分，MiR-17-5P逆轉(zhuǎn)錄引物和U6逆轉(zhuǎn)錄引物膽存液均為lOuM，使用時(shí)將MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物和U6逆 轉(zhuǎn)錄引物膽存液等比例（同體積)混合，稀釋10倍制成濃度為IuM的逆轉(zhuǎn)錄引物混合液。上述 膽存液的溶劑為蒸饋水。U6是一類核小分子RNA，U6逆轉(zhuǎn)錄引物W運(yùn)類小分子RNA為模版逆 轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，在qPCR體系中作為內(nèi)參。值得一提的是，逆轉(zhuǎn)錄引物不局限于本發(fā)明的逆 轉(zhuǎn)錄引物，任意能擴(kuò)增出MiR-17-5p或U6的cDNA(后續(xù)用于MiR-17-5p或U6的qPCR)的逆轉(zhuǎn)錄 引物均能實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，該部分引物的設(shè)計(jì)為現(xiàn)有技術(shù)，不再寶述。
[0011] 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積是20ul，具體如下：
[0012]
[0013] 另：5 X反應(yīng)緩沖液包括 250mM IYis-HCl pH 8.3、250mM KClJOmM MgCbSOmT DDT; X為RNA模板的體積。
[0014] 還包括分離單核細(xì)胞W及總RNA提取試劑;分離單核細(xì)胞所需試劑:淋己細(xì)胞分離 液和1640培養(yǎng)基;RNA提取所需試劑:① PBS緩沖液，濃度為0.0IM，pH7.4;②氯仿，純度為 99.7 % ;③異丙醇，純度為99.7 % ;④乙醇，濃度為95 %，其中含5 %的0.1 %DEPC溶液;⑤ DPEC溶液，0陽口農(nóng)度為0.1 %。
[0015] qPCR反應(yīng)體系如下，每個(gè)反應(yīng)管總體積是20ul:
[0016]
[0017] 若是MiR-17-5p反應(yīng)管，則qPCR引物是MiR-17-5p qPCR上游引物和下游引物;逆轉(zhuǎn) 錄反應(yīng)產(chǎn)物為采用MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物得到的反應(yīng)產(chǎn)物；
[001引若是內(nèi)參U6反應(yīng)管，則qPCR引物是U6qPCR上游引物和下游引物;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 為采用U6逆轉(zhuǎn)錄引物得到的反應(yīng)產(chǎn)物。
[0019] 本發(fā)明作為一種輔助診斷試劑，靈敏度強(qiáng)，特異性高，目的是通過快速檢測(cè)MiR-17-5P預(yù)估患者是否有惡性血液疾病的可能，對(duì)臨床惡性血液病的診療和預(yù)后提供分子檢 測(cè)依據(jù)，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)擬采用細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、流式分析、基因忍片、 雙巧光素報(bào)告酶基因等體外研究手段，掲示MiR-17-5p在惡性血液病中發(fā)揮的功能和調(diào)控 機(jī)制，W及作為相關(guān)輔助診斷的依據(jù)。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明的惡屯、血液病輔助診斷試劑的使用流程圖；
[0021] 圖2為MiR-17-5p擴(kuò)增曲線圖；
[0022] 圖3為MiR-17-5p溶解曲線圖；
[0023] 圖4為MDS樣本與正常人樣本MiR-17-5p的檢測(cè)對(duì)比圖；
[0024] 圖 5 為MDS 相對(duì)高危組(MDS-RA ?。┡c低危組(MDS-U/RAS/RA/RARS/RCMD)之間 MiR-17-5P的檢測(cè)對(duì)比圖；
[0025] 圖6為AML樣本與正常人樣本MiR-17-5p的檢測(cè)對(duì)比圖；
[0026] 圖7為惡性血液病(MDS/AML/CML)之間MiR-17-5p的檢測(cè)對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0027] W下將結(jié)合附圖和實(shí)施例詳細(xì)地說明本發(fā)明所設(shè)及實(shí)施例的技術(shù)方案。
[0028] MiR-17在基因組水平上定位于人類染色體13q31.3，MiR17-5p的具體位置為X染色 體：1391350605-1391350688。
[0029] 實(shí)驗(yàn)流程
[0030] 根據(jù)圖1，惡性血液病輔助診斷試劑的使用流程如下:特異的莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物與定 量PCR引物的設(shè)計(jì)及合成;骨髓樣品通過Ficoll密度梯度離屯、法提取單核細(xì)胞;單核細(xì)胞總 RNA的提取;RNA定量及質(zhì)量檢測(cè)；使用莖環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RNA: 500ng/體系）；qRT-PCR檢 測(cè)分析。
[0031] 采用化noDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及OD值，0D260/280值在1.8~ 2.0之間；莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物是一種專口設(shè)計(jì)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，"莖"部分的堿基的互補(bǔ)和堆積 能增加 RNA-DNA雜交復(fù)合物的熱穩(wěn)定性，莖環(huán)結(jié)構(gòu)的空間約束力相比于傳統(tǒng)的線性逆轉(zhuǎn)錄 引物來說，更有助于提高反應(yīng)的特異性，MiR17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物與MiR17-5p 3 '端特異性結(jié)合 后，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0032] 一、引物設(shè)計(jì)和合成
[0033] 實(shí)驗(yàn)中所設(shè)及的逆轉(zhuǎn)錄引物和qPCR引物均委托蘇州吉瑪基因公司合成，MiR-17-5p及內(nèi)參U6 qPCR引物序列（均為DM)如表1:
[0034] 表1 MiR-17-5p及內(nèi)參U6 qPCR引物序列
[0035]
[0036]
[0037]
[003引二、分離單核細(xì)胞W及總RNA的提取
[0039] 通過Ficoll密度梯度離屯、法從骨髓樣本中分離出單核細(xì)胞，并從單核細(xì)胞提取總 RNA;具體如下：
[0040] 單核細(xì)胞分離步驟：
[0041] ①在試管中加入5-6ml淋己細(xì)胞分離液，在上層緩慢地加入骨髓或外周血，使骨髓 或外周血與淋己細(xì)胞分離液形成一層清晰的分界，220化pm/min離屯、20min;
[0042] ②使用吸管吸取白膜層。加入IOml 1640培養(yǎng)基（即RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基）吹打洗 涂后1000 rpm離屯、，棄上清，再次加入適量1640培養(yǎng)基將沉淀的細(xì)胞吹打混勻。
[0043] ③顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度到2 X lO^ml。加入等量的"凍存保護(hù)液"，使細(xì)胞 終濃度為1 X lO^ml。將細(xì)胞吹打混勻后分裝到凍存管中，凍存管放入程控降溫盒中，最后 將程控降溫盒置于-80°C冰箱中過夜。凍存保護(hù)液由9份小牛血清或細(xì)胞培養(yǎng)液與1份DMSO 混合而成，份數(shù)為體積份數(shù)。
[0044] RNA提取所需試劑：
[0045] ① PBS緩沖液，濃度為0.0 lM，pH7.4
[0046] ②氯仿，純度為99.7 %
[0047] ③異丙醇，純度為99.7 %
[004引④乙醇，濃度為95 %(其中含5%的0.1% DEPC溶液）
[0049] ⑤DPEC溶液，濃度為0.1 %，W上百分比為溶劑占總?cè)芤旱捏w積百分?jǐn)?shù)。
[0050] 氯仿和異丙醇的純度指的是氯仿或異丙醇占整個(gè)溶液的體積百分比；乙醇的濃度 指乙醇占整個(gè)溶液的體積百分比，整個(gè)溶液還含體積百分比為5%的DEPC溶液，其中DEPC溶 液中DEPC的體積百分比為0.1 % ,DEPC溶液的溶劑為水。
[0化1] 總RNA提取步驟：
[0052] 1、將凍存管中體積為Iml的單核細(xì)胞W 1300化pm離屯、8分鐘，棄去上清，用Iml 0.OlM PBS(pH 7.4)吹打懸浮后再W13000巧m離屯、8分鐘，收集沉淀；
[0化3] 2、用Iml TRIzol充分吹打懸浮沉淀，直至沉淀溶解，加入200ul純度為99.7%的氯 仿溶液，上下?lián)u晃30S，不要太劇烈，完全混合后靜置2min，13000巧m離屯、Smin;
[0054] 3、離屯、后吸取上清液，盡量避免吸到下層液體，再加入同等體積的濃度為99.7% 的異丙醇，吸打混合后靜置2min，13000巧m離屯、Smin;
[005引 4、盡量吸棄上清，加入500ul 95%乙醇（含5%體積的0.1%DEPC)吹打后再 13000rpm離屯、Smin，倒掉乙醇，待EP管中乙醇揮發(fā)后用含0.1 % DEPC溶液溶解，-80攝氏度凍 存。
[0056] S、反轉(zhuǎn)錄
[0057] WmRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄50化g RNA合成第一鏈。
[005引 20ul逆轉(zhuǎn)錄體系，反應(yīng)條件：
[0061 ]另：5 X反應(yīng)緩沖液包括 250mM IYis-HCKpH 8.3)、250mM KClJOmM MgCl 巧 OmT DDT。
[00日9] ^前恍苗/太玄("位而咎巧/太壬口具、*n了.
[0060：
[0062] 反應(yīng)條件：
[0063] 1、65°C 5分鐘
[0064] 2、25°C 5分鐘 [00化]3、42°C 60分鐘
[0066] 4、70°C 5分鐘
[0067] 四、SYBR巧光定量檢測(cè)
[0068] W逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行q-PCR反應(yīng)
[0069] qPCR反應(yīng)體系如下(每個(gè)反應(yīng)管總體積是20ul):
[0070]
[0071] 若是MiR-17-5p反應(yīng)管，則qPCR引物是MiR-17-5p qPCR上游引物序列：5'-GCCGCCAAAGTGCTTACA-3 ' 和下游引物序列：5 ' -CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3 ' ；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 為采用MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物得到的反應(yīng)產(chǎn)物。
[0072] 若是內(nèi)參U6反應(yīng)管，則qPCR引物是U6qPCR上游引物序列：
[0073] 5 ' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ' 和下游引物序列：
[0074] 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為采用U6逆轉(zhuǎn)錄引物得到的反應(yīng) 產(chǎn)物。
[00巧]qPCR反應(yīng)條件如下：
[0076] Stepl:50°C 2分鐘
[0077] Step2:95°C 10 分鐘
[0078] 循環(huán)數(shù):40,包括W下2個(gè)步驟：
[00 巧]St邱3:95 °C 15秒
[0080] 6(TC 1 分鐘。
[0081] 五、本發(fā)明的檢測(cè)效果
[0082] 從擴(kuò)增曲線（圖2)看出，本發(fā)明的擴(kuò)增體系及條件應(yīng)用合理;溶解曲線（圖3)中單 一的溶解峰也表明產(chǎn)物單一特異性較好。其中擴(kuò)增曲線橫坐標(biāo)表示qPCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)，縱 坐標(biāo)表示隨著循環(huán)數(shù)的增加 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增量。
[0083] 溶解曲線橫坐標(biāo)表示溶解分析的溫度區(qū)間，縱坐標(biāo)表示擴(kuò)增產(chǎn)物與染料結(jié)合的一 個(gè)溶解峰值，是一個(gè)巧光信號(hào)值。在定量PCR實(shí)驗(yàn)中，常用溶解曲線來進(jìn)一步分析反應(yīng)產(chǎn)物 的特異性。通常是在整個(gè)反應(yīng)結(jié)束后，加設(shè)一段升溫降溫程序，由于SYBR GREEN是一種非特 異性結(jié)合DNA雙鏈的染料，擴(kuò)增后也可能和反應(yīng)中的引物二聚體或雜帶非特異性結(jié)合，而釋 放巧光信號(hào)，會(huì)導(dǎo)致儀器檢測(cè)的信號(hào)不僅僅是目的基因，所W需要在反應(yīng)結(jié)束后設(shè)定一個(gè) 升溫過程，然后慢慢把溫度降下來，由于不同DNA片段的解鏈溫度不同，運(yùn)時(shí)若PCR產(chǎn)物純， 則只會(huì)出現(xiàn)一個(gè)巧光溶解峰，因?yàn)橹粚?duì)應(yīng)一個(gè)溫度值;若有引物二聚體或其他非特異性條 帶，則會(huì)在其他溫度處出現(xiàn)另外的溶解峰，運(yùn)是一種PCR擴(kuò)增特異性的檢測(cè)方法。分析時(shí)并 不是將擴(kuò)增產(chǎn)物溶解在溶液中，直接是qPCR程序擴(kuò)增完后在儀器上添加的一個(gè)溶解分析。
[0084] 六、MiR-17-5p在各類樣本中的表達(dá)
[00化](I)MDS樣本與正常人樣本MiR-17-5p的檢測(cè)對(duì)比，結(jié)果見圖4。
[0086] 20例正常人樣本，27例確診的MDS樣本，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P<0.001，表明MDS樣本中MiR-17-5P表達(dá)量與正常人相比，顯著上調(diào)。
[0087] (2)MDS 相對(duì)高危組(MDS-RAEB)與低危組(MDS-U/RAS/RA/RARS/RCMD)之間MiR-17-5p的檢測(cè)對(duì)比，結(jié)果見圖5。
[008引 20例正常人樣本，27例確診的MDS樣本，其中11例MDS-RA邸高危患者，16例MDS-U/ RAS/RA/RARS/RCMD型患者，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析P<0.0 l，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明MDS高危患者中，MiR-17-5p表 達(dá)量相較于低危組也有明顯上調(diào)。
[0089] (3)AML樣本與正常人樣本MiR-17-5p的檢測(cè)對(duì)比，結(jié)果見圖6。
[0090] AML樣本共19例，其中Ml型7例，M2型3例，M2a型3例，M5型1例，M化型5例;AML患者與 正常人相比，MiR-17-5p平均上調(diào)4倍。
[0091] (4)惡性血液病(MDS/AML/CML)之間MiR-17-5p的檢測(cè)對(duì)比，結(jié)果見圖7。
[0092] 圖7表示在MDS、AML、CML群體樣本中，MiR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量高于正常樣本群體， P<0.0 l，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4-7縱坐標(biāo)表示MiR-17-5p的相對(duì)表達(dá)量。
[0093] W上數(shù)據(jù)均顯示，在惡性血液病如急性髓細(xì)胞白血病(AML)、骨髓異常增生綜合征 (MDS)患者和慢性髓性白血病(CML)樣本中，MiR-17-5p均呈現(xiàn)出異常上調(diào)趨勢(shì)。
[0094] MicroRNA在惡性血液病中的研究逐年增多，其在生物體內(nèi)的調(diào)控功能也越來越凸 顯，由于目前生物標(biāo)志物主要是功能蛋白和特定基因或SNP，起重要調(diào)控作用的MicroRNA作 為診斷標(biāo)記物研究相對(duì)較少，導(dǎo)致其在臨床診斷中的作用被忽略。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在惡性 血液疾病中，MiR-17-5p均有明顯上調(diào)趨勢(shì)，明顯高于正常人群，同時(shí)MDS不同類型之間有一 定差異，我們的結(jié)果中看出高危組樣本平均表達(dá)量也高于低危組樣本，提示MiR-17-5p的表 達(dá)可能對(duì)推斷MDS的病程有潛在的指導(dǎo)意義，而MDS較之AML上調(diào)倍數(shù)更為明顯；同時(shí)，針對(duì) 惡性血液病細(xì)胞中的功能實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了 MiR-17-5p可能參與調(diào)控細(xì)胞增殖、周期和分化等 重要的生物學(xué)過程。因此，在對(duì)惡性血液病有一定的早期診斷作用的研究基礎(chǔ)上，鑒于MiR-17-5P可能成為惡性血液病的早期診斷的輔助診斷指標(biāo)，本發(fā)明從實(shí)際應(yīng)用出發(fā)，我們?cè)噲D 運(yùn)一操作簡(jiǎn)單、靈敏度高且特異性強(qiáng)的檢測(cè)MiR-17-5p表達(dá)的手段引入惡性血液病的輔助 診斷中，對(duì)臨床惡性血液病的診療和預(yù)后提供分子檢測(cè)依據(jù)，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。
[0095] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可W做出若干改進(jìn)和變形，運(yùn)些改進(jìn)和變形 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. MiR-17-5p惡性血液病輔助診斷試劑，其特征在于，包括MiR-17-5p的qPCR上游引物， 序列為：5 ' -GCCGCCAAAGTGCTTACA-3 ' 以及MiR-17-5p的qPCR下游引物，序列為：5 ' -CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3 ' ；還包括擴(kuò)增內(nèi)參U6的qPCR引物，U6的qPCR引物包括U6的qPCR正 向引物，序列為5 ' -ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3 ' ；以及U6的qPCR反向引物，序列為5 ' -GGAACGCTTCACGAATTTG-3'。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MiR-17-5p惡性血液病輔助診斷試劑，其特征在于，還包括 MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物和U6逆轉(zhuǎn)錄引物，逆轉(zhuǎn)錄引物均具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MiR-17-5p惡性血液病輔助診斷試劑，其特征在于，所述的 MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物和U6逆轉(zhuǎn)錄引物為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系的一部分，MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物 和U6逆轉(zhuǎn)錄引物貯存液均為10uM，使用時(shí)將MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物和U6逆轉(zhuǎn)錄引物貯存液 等比例混合，稀釋10倍制成濃度為IuM的逆轉(zhuǎn)錄引物混合液。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的MiR-17-5p惡性血液病輔助診斷試劑，其特征在于，逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)體系總體積是20ul，具體如下： 濃度 加樣體積/用量 MiR-；1.7-5p、物iii!合液 IuM 1.2ul RNA 投板 500ng(xul) dNTP IOmM 2ul 反轉(zhuǎn)錄酶 200U/ul Iul RNA 酶抑制劑 200U/ul Iul 5 X反應(yīng)緩沖液 4u_l 無核酸酶蒸饋水 （10·8-χ)υΙ 另：5Χ 反應(yīng)緩沖液包括250mM Tris-HCl pH 8.3、250mM KCl、20mM MgCl2 50mT DDT;x 為RNA模板的體積。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MiR-17-5p惡性血液病輔助診斷試劑，其特征在于，還包括分 離單核細(xì)胞以及總RNA提取試劑；分離單核細(xì)胞所需試劑:淋巴細(xì)胞分離液和1640培養(yǎng)基； RNA提取所需試劑:①PBS緩沖液，濃度為0.0IM，pH7.4;②氯仿，純度為99.7 % ;③異丙醇，純 度為99.7 % ;④乙醇，濃度為95 %，其中含5 %的0.1 %DEPC溶液;⑤DPEC溶液，DPEC濃度為 0.1%〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的MiR-17_5p惡性血液病輔助診斷試劑，其特征在于，qPCR反應(yīng) 體系如下，每個(gè)反應(yīng)管總體積是20ul: 加樣體積/用量 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物 〇.5ul Taq 1? (SYBR Premix Ex Taq 2 X) IOui 炎)bi；.丨 1;:?料（ROX Reference 50X} 0.4ul qPCR上游引物和下游引物的混合物(IOuIVI) 0.4ul 無核酸酶蒸餾水 8.7ul; 若是MiR-17_5p反應(yīng)管，則qPCR引物是MiR-17_5p qPCR上游引物和下游引物;逆轉(zhuǎn)錄反 應(yīng)產(chǎn)物為采用MiR-17-5p逆轉(zhuǎn)錄引物得到的反應(yīng)產(chǎn)物； 若是內(nèi)參U6反應(yīng)管，則qPCR引物是U6qPCR上游引物和下游引物;逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為采 用U6逆轉(zhuǎn)錄引物得到的反應(yīng)產(chǎn)物。 7 .MiR-17-5p在制備惡性血液病輔助診斷試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105838804SQ201610319085
【公開日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月16日
【發(fā)明人】宋耀華, 吳德沛, 何楊, 楊舒婷
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)