專利名稱：革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌全細(xì)胞分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及全細(xì)胞分析領(lǐng)域，并且在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)涉及抗甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus) (MRSA)和/或抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(staphylococci) (MR-CNS)的分析。2.引言通常通過(guò)表型方法、基因型方法或基于免疫學(xué)的方法鑒定臨床樣品(例如，鼻或傷口拭樣、血液或尿液樣品/培養(yǎng)物等)中的細(xì)菌。某些類型的細(xì)菌，例如抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)，在世界范圍的醫(yī)院快速傳播，并且最近在社區(qū)內(nèi)快速傳播，并因而對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。諸如金黃色葡萄球菌(S. aureus)的細(xì)菌對(duì)甲氧苯青霉素(和所有β -內(nèi)酰胺抗生素)的抗性主要與編碼青霉素結(jié)合蛋白^(PBPh，也稱為ΡΒΡ2')的 mecA基因的獲取相關(guān)。PBP2a蛋白參與細(xì)菌細(xì)胞壁合成(參見Pinho et al.，“An acquired and a native penicillin-binding protein cooperate in building the cell wall of drug-resistant staphylococci (獲取的和天然的青霉素結(jié)合蛋白協(xié)同構(gòu)建抗藥葡萄菌屬的細(xì)胞壁)，，· PNAS，98(19) :10886-10891 (Sept. 2001))?？焖偾覝?zhǔn)確鑒定MRSA在預(yù)防和治療由金黃色葡萄球菌弓丨起的疾病中被認(rèn)為是重要的。表型分析通常包括在抗生素的存在下培養(yǎng)生物體以及檢測(cè)細(xì)菌生長(zhǎng)。為了獲得結(jié)果，該檢測(cè)通常需要至少兩天(一天用于分離，一天用于敏感度檢測(cè))。因?yàn)槟承┍硇吞卣?(例如MRSA藥物抗性)需通過(guò)復(fù)雜的機(jī)制來(lái)驗(yàn)證，所以培養(yǎng)條件(鹽分、溫度、接種物大小等)可以顯著地影響結(jié)果。在一些情況下，這會(huì)延誤診斷，甚至?xí)?dǎo)致誤診?；诿庖邔W(xué)的PBP2a蛋白檢測(cè)方法已有描述(例如Cavassini et al.， "Evaluation of MRSA-Screen,a Simple Anti-PBP 2a Slide Latex Agglutination Kit, for Rapid Detection of Methicillin Resistance in Staphylococcus aureus(MRSA 篩查的評(píng)價(jià)，一種用于快速檢測(cè)抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌的簡(jiǎn)易抗PBP加載玻片 Latex Agglutination 試劑盒)”，J. Clinical Microbiology, 37 (5) 1591-1594 (May, 1999))。該無(wú)細(xì)胞分析能快速檢測(cè)細(xì)胞裂解物樣品中的PBPh蛋白，并進(jìn)而確認(rèn)所述樣品的至少一些生物體的甲氧苯青霉素抗性。然而，該分析常用于分析培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的生物體 (這需要一天或兩天的生長(zhǎng))，并且不是很敏感(可靠的鑒定需要大約IO7集落形成單位)。最快速且敏感的基因型鑒定方法聯(lián)合利用細(xì)菌的核酸分析和核酸擴(kuò)增技術(shù)。 例如，幾種分析利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或其它靶標(biāo)擴(kuò)增方法(例如，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。適用于MRSA檢測(cè)的PCR分析的一些實(shí)例可見于US 5，702，895 (Matsunaga et al.)、6，156，507 (Hiramatsu et al.)和 7，074，599 (UhI et al.)中。這些 PCR 分析是無(wú)細(xì)胞分析。用于確定MRSA和MSSA的PCR分析還見于Gr5bner et al.，“Evaluation of the BD GeneOhm StaphSR Assay for Detection of Methicillin-Resistant and Methicillin-Susceptible Staphylococcus aureus Isolates from Spiked Positive Blood Culture Bottles (對(duì)用于檢測(cè)來(lái)自接種的陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶的抗甲氧苯青霉素抗性和甲氧苯青霉素敏感性金黃色葡萄球菌分離物的BD GeneOhm MaphSR分析的評(píng)價(jià))”. J. Clin. Microbiol. ,47(6) :1689-1694(2009)中。無(wú)細(xì)胞測(cè)定分析的一個(gè)缺點(diǎn)是喪失了細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)在細(xì)菌鑒定中通常是有價(jià)值的。而且無(wú)細(xì)胞分析不太可能用于確定(或至少牽涉更復(fù)雜的設(shè)計(jì)來(lái)確定)混合的生物群體(參見=Grobneret al. (2009)，第 1691 頁(yè)第 1 欄，第二段標(biāo)題“Analysis of blood culture bottles spiked with mixtures of staphylococcal isolates(對(duì)接禾中有葡萄球菌分離物混合物的血培養(yǎng)瓶的分析)”下的對(duì)分析混合群體的PCR分析缺陷的討論)。保護(hù)形態(tài)以及更容易鑒定樣品中的混合細(xì)菌群體和/或消除由于混合群體而導(dǎo)致的假陽(yáng)性結(jié)果的潛在風(fēng)險(xiǎn)的一個(gè)途徑是進(jìn)行全細(xì)胞分析，例如原位(細(xì)胞內(nèi))分析。為了通過(guò)全細(xì)胞分析確定細(xì)菌內(nèi)的性狀(例如甲氧苯青霉素抗性)，通常分析細(xì)菌的染色體脫氧核糖核酸(DNA)、mRNA或細(xì)胞蛋白。一些性狀還與天然的質(zhì)粒相關(guān)。本文公開的發(fā)明不涉及細(xì)胞蛋白分析來(lái)確定性狀。盡管有很多報(bào)道關(guān)于真核細(xì)胞中mRNA的原位雜交(ISH)分析，但是對(duì)細(xì)菌中mRNA 或染色體DNA的基于ISH分析的報(bào)道似乎并不常見。至少在一定程度上是由于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的細(xì)胞壁的特性，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的基于ISH的分析被證實(shí)有很多問(wèn)題(參見例如 Furakawa et al. ，“Comprehensive Analysis of Cell Wall-Permeabilizing Conditions for Highly Sensitive Fluorescence In Situ Hybridization (對(duì)高敏感性焚光原位雜交的細(xì)胞壁透化條件的綜合分析)”，Microbes Environ.，21 (4) :227-234 (2006))。而且，對(duì)mRNA和染色體DNA的基于ISH的分析也由于細(xì)菌中mRNA的低拷貝數(shù)和不穩(wěn)定性而變得復(fù)雜(參見例如 Coleman et al.的弓|言，“mRNA—targeted fluorescent in—situ hybridization(FISH)of Gram-negative bacteria without template amplification or tyramide signal amplification(不用模板擴(kuò)增或酪胺信號(hào)放大的靶向革蘭氏陰性細(xì)菌 mRNA 的熒光原位雜交(FISH)) ”，J. Microbiological Methods, 71 :246-255 (2007)) 至少有三篇報(bào)道關(guān)于對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中mRNA的成功的基于ISH的分析 (參見Hahn et al. , "Detection of mRNA in Streptomyces Cells by Whole-Cell Hybridization with Digoxigenin-Labeled Probes (通過(guò)利用地高辛標(biāo)記的探針的全細(xì)胞雜交檢測(cè)鏈霉菌細(xì)胞中的 mRNA)，，，Applied and Environmental Microbiology, 59 (8) 2753-2757(Aug. 1993) ；Wagner et al. , “In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria(對(duì)利斯塔氏菌屬中的毒力因子mRNA和16S rRNA的原位檢測(cè))”，F(xiàn)EiWS Microbiol. Lett, 160(1) :159-168 (Mar. 1998)；和H6nerlage et al.， "Detection of mRNA of nprM in Bacillus meqaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridization(通過(guò)全細(xì)胞雜交檢測(cè)土壤中生長(zhǎng)的巨大芽孢桿菌ATTC 14581 中的 nprM mRNA) ”，Arch. Microbiol.，163 :235-241 (1995))。在 Hahn et al. ψ, Streptomyces violacelatus (S. violacelatus)經(jīng)基因工程而含有插入的質(zhì)粒(質(zhì)粒Pl J673)，該質(zhì)粒包含允許核糖體RNA (rRNA)和信使RNA (mRNA ；插入的質(zhì)粒產(chǎn)生高拷貝數(shù)的mRNA)成為靶標(biāo)的硫鏈絲菌素抗性(tsr)基因(摘要)(參見第 2753頁(yè)，第2欄)。因此，所述細(xì)菌不是天然存在的。然而，天然細(xì)菌(即未插入質(zhì)粒的細(xì)菌)沒(méi)有表現(xiàn)出任何雜交信號(hào)(參見第2755-2756頁(yè)，連接段落)。對(duì)樣品進(jìn)行酶學(xué)處理， 以透化革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。與針對(duì)mRNA的探針的雜交反應(yīng)進(jìn)行超過(guò)16小時(shí)(參見第27M 頁(yè)，第2欄，底部)。還需要注意的是，除了通過(guò)使用質(zhì)粒增加細(xì)菌的mRNA含量之外，仍需進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增。具體而言，將由抗地高辛抗體偶聯(lián)的堿性磷酸酶的活性產(chǎn)生的水不溶性染料用于對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色來(lái)進(jìn)行ISH分析，所述抗地高辛抗體通過(guò)與多個(gè)地高辛標(biāo)簽(每個(gè)探針)相互作用與轉(zhuǎn)錄物探針連接(參見，第27M-2755頁(yè)，連接段落)。Wagner et al.與上文所述相似，對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行酶學(xué)消化以透化細(xì)菌。還值得注意的是，使用四種單標(biāo)記的針對(duì)iap-mRNA的探針和很亮的熒光染料檢測(cè)mRNA靶標(biāo)的嘗試沒(méi)有成功(參見第166頁(yè)，第1-2欄，連接段落)。并且，聯(lián)合使用單一酶(辣根過(guò)氧化物酶)標(biāo)記的探針和熒光素酪胺(一種信號(hào)擴(kuò)增技術(shù))檢測(cè)mRNA靶標(biāo)的嘗試被證實(shí)是不令人滿意的(參見第166-167頁(yè))。然而，包含與偶聯(lián)有辣根過(guò)氧化物酶(一種信號(hào)擴(kuò)增技術(shù))的抗地高辛抗體片段結(jié)合的多個(gè)地高辛標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄物探針被用于通過(guò)熒光素酪胺的催化沉積來(lái)檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌細(xì)胞中的iap(侵襲相關(guān)蛋白)-mRNA(參見摘要和第167頁(yè))。與地高辛標(biāo)記的針對(duì)mRNA的探針的雜交反應(yīng)進(jìn)行超過(guò)5小時(shí)(參見第 162頁(yè)，第2欄，最后一段)。同樣地，在H&ierlageet al.中，對(duì)巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)細(xì)胞進(jìn)行酶學(xué)處理以透化該細(xì)菌(參見第237頁(yè)，標(biāo)題“全細(xì)胞雜交”下的第1欄)。同樣地，包含與偶聯(lián)有堿性磷酸酶(一種信號(hào)擴(kuò)增技術(shù))的抗地高辛抗體片段結(jié)合的多個(gè)地高辛標(biāo)簽 (參見第236頁(yè)第2欄的“探針”)的轉(zhuǎn)錄物探針(與硝基藍(lán)四氮唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽聯(lián)合)用于產(chǎn)生染色的細(xì)胞和檢測(cè)巨大芽孢桿菌中nprM的mRNA。與轉(zhuǎn)錄物探針的雜交進(jìn)行16小時(shí)。從前述可以清楚地了解到，為了成功分析革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中的mRNA，Hahn et al.、Wagner et al和H0nerlage et al.均利用1)酶學(xué)處理以透化細(xì)菌細(xì)胞；2)具有多個(gè)地高辛標(biāo)簽的轉(zhuǎn)錄物探針(通常較長(zhǎng)(即長(zhǎng)度大于IOObp)) ；3)通過(guò)基于酶的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)間接檢測(cè)所述多個(gè)地高辛標(biāo)簽；和4)相當(dāng)長(zhǎng)的探針雜交步驟(即5-16小時(shí))。似乎沒(méi)有任何文獻(xiàn)報(bào)道在不使用包含多個(gè)標(biāo)簽的標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物探針和/或應(yīng)用擴(kuò)增技術(shù)(例如，信號(hào)擴(kuò)增和/或諸如原位PCR的原位核酸擴(kuò)增)進(jìn)行間接檢測(cè)的條件下能明確檢測(cè)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌全細(xì)胞中的mRNA。此外，似乎沒(méi)有任何報(bào)道是關(guān)于如何檢測(cè)葡萄球菌全細(xì)胞中的mRNA?？萍嘉墨I(xiàn)中這種明顯的欠缺可能至少在一定程度上是由于上文提到的mRNA(以及染色體DNA)的低拷貝數(shù)及其在細(xì)菌中的不穩(wěn)定性，以及與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞壁的透化相關(guān)的難題，該難題使得全細(xì)胞(例如ISH和熒光原位雜交(FISH))分析技術(shù)復(fù)雜化。3.定義為了解釋本說(shuō)明書和所附的權(quán)利要求書的目的，將應(yīng)用以下定義，并且只要合適， 以單數(shù)形式使用的術(shù)語(yǔ)也包括復(fù)數(shù)形式，且反之亦然。在下文列出的任何定義與任何其它文件中該詞的使用產(chǎn)生矛盾的情況下，以下文列出的定義為準(zhǔn)來(lái)解釋本說(shuō)明書及其相關(guān)的權(quán)利要求書的范圍和意圖。盡管如此，通過(guò)引用并入本文的任何文件的范圍和含義不應(yīng)為下文所提供的定義所改變。而且，所述并入的文件應(yīng)當(dāng)按照本領(lǐng)域技術(shù)人員基于其內(nèi)容和公開并參照本文提供的說(shuō)明書內(nèi)容進(jìn)行解釋。使用“或”表示“和/或”，除非另外指明或使用“和/或”明顯不合適時(shí)。使用“a” 表示“一個(gè)或多個(gè)”，除非另外指明或使用“一個(gè)或多個(gè)”明顯不合適時(shí)?！鞍?comprise) ”、 “包含(comprises) ”、“包含(comprising) ”、“包括(include) ”、“包括(includes) ” 和“包括(including)”可互換使用，并且并非意圖限制。此外，當(dāng)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的描述使用術(shù)語(yǔ)“包含(comprising)”時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在一些具體的情況下，也可以
使用表述“基本由......組成(consisting essentially of)”和/或“由......組成
(consisting of) ”描述所述實(shí)施方案。本文所用的“抗體”是指免疫球蛋白或能參與抗體/抗原結(jié)合相互作用的免疫球蛋白片段或衍生物。對(duì)抗體、抗體片段以及抗體/抗體片段檢測(cè)方法以及相關(guān)主題的技術(shù)特征的討論可見于Pierce Catalog and Handbook，1994 (Τ章)中。抗體包括例如，免疫球蛋白的各種類別和同種型，例如IgA、IgD、IgE、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM0抗體片段包括諸如Fab、SCFV、F(ab'分子?？贵w衍生物包括具有添加或取代的抗體或其
片段，例如嵌合抗體?？梢酝ㄟ^(guò)重組方法或本領(lǐng)域已知的任何其它方式從人或動(dòng)物來(lái)源、從雜交瘤得到抗體。本文所用的“細(xì)胞透化劑”是指用于處理細(xì)菌細(xì)胞從而改變細(xì)胞壁/外膜使得其它分析試劑(例如，探針、檢測(cè)試劑、抗體等)能穿透(并因而能進(jìn)入)所述細(xì)菌細(xì)胞的一種試劑、兩種或更多種試劑、試劑混合物或制劑?？捎米骷?xì)胞透化劑的酶的一些實(shí)例包括下列酶溶葡萄球菌素、溶菌酶和蛋白酶(例如蛋白酶-K和/或無(wú)色肽酶)。當(dāng)使用多種試劑來(lái)透化細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，透化劑可以被依次添加、同時(shí)添加、或使用一些試劑被依次添加且一些被同時(shí)添加的組合。簡(jiǎn)單而言，對(duì)試劑與細(xì)菌接觸的方式?jīng)]有限制，只要該過(guò)程足以透化細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)使樣品與細(xì)胞透化劑接觸來(lái)實(shí)施本文所公開的方法。本文所用的“嵌合體”是指包含兩類或更多類不同子單元的子單元的寡聚物。例如，嵌合體可以包含脫氧核糖核酸(DNA)和鎖核酸(LNA)的子單元、可以包含DNA和核糖核酸(RNA)的子單元、可以包含DNA和肽核酸(PNA)的子單元、可以包含DNA、LNA和PNA的子單元、或者可以包含RNA和LNA的子單元等。應(yīng)當(dāng)理解，文獻(xiàn)中稱為L(zhǎng)NA探針的通常是嵌合體(按照該定義)，因?yàn)樗觥癓NA探針”通常將僅一種或數(shù)種LNA核苷酸并入寡聚物中。 其余的核苷酸通常是標(biāo)準(zhǔn)DNA或RNA核苷酸。本文所用的“針對(duì)染色體DNA、針對(duì)mRNA和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針”是指每一種都用一種或多種標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記的探針(在一些實(shí)施方案中，探針僅包含一種標(biāo)簽)，其中所述探針被選擇為與分析中待確定的細(xì)菌(例如選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)的染色體DNA、 mRNA和/或天然質(zhì)粒中的靶標(biāo)以高度的特異性結(jié)合。之所以選擇染色體DNA、mRNA和/或天然質(zhì)粒靶標(biāo)，是因?yàn)槠渚幋a分析中待確定的選定性狀(和/或與選定的性狀相關(guān))。本文所用的“確定”是指基于研究、數(shù)據(jù)、推理和/或計(jì)算而作出決定。根據(jù)本文中該術(shù)語(yǔ)的上下文/用法，確定的一些實(shí)例視情況包括檢測(cè)、鑒定和/或定位(細(xì)菌和/或性狀)。本文所用的“固定”是指能使細(xì)胞核酸(DNA和RNA)的完整性和細(xì)胞形態(tài)基本保持的樣本保存和/或滅菌?？梢允褂煤幸环N或多種固定劑的一種或多種溶液通過(guò)化學(xué)方法進(jìn)行固定，和/或可以通過(guò)機(jī)械方法進(jìn)行固定，例如通過(guò)在顯微鏡載玻片上制備涂片，隨后通過(guò)將載玻片穿過(guò)火焰或?qū)⑤d玻片置于加熱儀上來(lái)加熱涂片。本文所用的“固定劑”是指用來(lái)處理細(xì)菌細(xì)胞從而保存和/或制備用于顯微鏡分析的細(xì)菌細(xì)胞的一種試劑、兩種或更多種試劑、試劑混合物、制劑或者甚至是過(guò)程(與試劑 (包括混合物或制劑)的使用有關(guān)或無(wú)關(guān))。固定劑的一些實(shí)例包括多聚甲醛、戊二醛、甲醇和乙醇。當(dāng)使用多種試劑來(lái)固定細(xì)菌時(shí)，所述試劑可以被依次添加、同時(shí)添加、或利用一些試劑被依次添加且一些被同時(shí)添加的組合。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)使樣品與固定劑接觸來(lái)實(shí)施本文所公開的方法。本文所用的“異質(zhì)的”和“同質(zhì)的”是針對(duì)細(xì)菌菌株而言，并且是指相同菌株的部分或所有細(xì)菌是否表現(xiàn)出選定性狀的表達(dá)(或相同表達(dá)程度)。具體而言，同質(zhì)菌株的細(xì)菌表現(xiàn)出所述性狀的表達(dá)(或大體上相同的表達(dá)程度)，而異質(zhì)菌株則不是這樣。本文所用的“總體上”是指將相關(guān)主題視為整體而不是零散的。本文所用的“標(biāo)簽”是指組合物(例如，雜交探針)的結(jié)構(gòu)單元(或視具體情況為多個(gè)結(jié)構(gòu)單元)，所述結(jié)構(gòu)單元使得可以通過(guò)儀器和/或方法檢測(cè)所述組合物。標(biāo)簽的非限制性實(shí)例包括熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、半抗原、放射性同位素和量子點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，可以聯(lián)合使用兩種或更多種上述標(biāo)簽，以便使得所述組合物可被檢測(cè)或可被獨(dú)立地(唯一地)檢測(cè)。與“標(biāo)簽(label)，，同義的(即可互換的)一些詞語(yǔ)是“可檢測(cè)的部分”、“標(biāo)簽(tag)，， 和“標(biāo)記”。本文所用的“mRNA誘導(dǎo)劑”是指當(dāng)與(例如培養(yǎng)物中的)活的革蘭氏陰性細(xì)菌或革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌接觸時(shí)，能誘導(dǎo)所述細(xì)菌產(chǎn)生mRNA并因而升高所述細(xì)菌細(xì)胞中的mRNA濃度的一種試劑、兩種或更多種試劑、試劑混合物或制劑。通過(guò)提高細(xì)菌中mRNA的濃度，全細(xì)胞分析中探針/mRNA復(fù)合物(和相關(guān)的細(xì)菌染色)的形成可大大提高，并從而增強(qiáng)確定。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)使樣品與mRNA誘導(dǎo)劑接觸來(lái)實(shí)施本文所公開的方法?！癿RNA誘導(dǎo)劑”的實(shí)例是抗生素。本文所用的“混合群體”是指兩種或更多種不同的細(xì)菌菌株的混合物。本文所用的“天然質(zhì)粒”是指存在于天然狀態(tài)的細(xì)菌(即，細(xì)菌是從環(huán)境和/ 或天然來(lái)源(例如諸如人的宿主生物)獲得的)中的質(zhì)粒。天然質(zhì)粒與通過(guò)人為干預(yù)/操作而被有意插入細(xì)菌中的質(zhì)粒有區(qū)別(參見例如，Hahn et al. , Applied and Environmental Microbiology, 59 (8) :2753-2757 (Aug. 1993)所描述的具有插入質(zhì)粒的工程化的 S. Violacelatus 細(xì)菌)。本文所用的“核酸”是指由核苷酸子單元形成的含有核堿基的聚合物，所述核苷酸子單元由核堿基、核糖或2’-脫氧核糖和磷酸酯基團(tuán)組成。核酸的一些實(shí)例是DNA和RNA。本文所用的“核酸類似物”是指由子單元形成的含有核堿基的聚合物，其中所述子單元包含核堿基和不是核糖或2’ -脫氧核糖的糖部分和/或不是磷酸酯基團(tuán)的連接 (在糖單元之間)。核酸類似物的非限制性實(shí)例是鎖核酸(LNA 參見例如，US 6，043，060、 7，053，199、7，217，805 和 7，427，672)。參見Janson and During, "Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules (月太核酸、嗎琳代禾口相關(guān)的反義生物分子)，，，Chapter 7,"Chemistry of Locked Nucleic Acids(LNA)(鎖核酸(LNA)化學(xué))，，，Springer Science & Business，2006 對(duì) LNA 化學(xué)的綜述。本文所用的“核酸模擬物”是指由子單元形成的含有核堿基的聚合物，其中所述子單元包含核堿基和主鏈結(jié)構(gòu)，所述主鏈結(jié)構(gòu)不是糖部分(或包含糖部分)，但是能與核酸序列特異地結(jié)合。核酸模擬物的實(shí)例是肽核酸(PNA 參見例如，5，539，082,5, 527，675、 5，623，049、5，714，331、5，718，262、5，736，336、5，773，571、5，766，855、5，786，461、 5，837，459,5, 891，625,5, 972，610,5, 986，053,6, 107，470、W092/20702 和 W092/20703)。 核酸模擬物的另一實(shí)例是嗎啉代寡聚物。(參見Janson and During, "Peptide Nucleic Acids, Morpholinos and Related Antisense Biomolecules (月太核酸、嗎琳代禾口相關(guān)的反義生物分子)”，Chapter 6，“Morpholinos and PNAs Compared(嗎啉代與 PNA 的比較)，，， Springer Science & Business，2006對(duì)PNA與嗎啉代之間差異的討論。核酸模擬物的另一實(shí)例是吡咯烷基聚酰胺(PP)。如美國(guó)專利第6，403，763號(hào)、第6，713，603號(hào)、第6，716，961 號(hào)和第 7，098，321 號(hào)以及 Vilaivan et al. ,"Hybridization of Pyrrolidinyl Peptide Nucleic Acids and DNA-Selectivity, Base-Pairing Specificity and Direction of Binding(吡咯烷基肽核酸和DNA的雜交選擇性、堿基配對(duì)特異性和結(jié)合的方向)”， Organic Letters, 8 (9) :1897-1900(2006)中所描述的，PP是包含核堿基和聚酰胺主鏈的寡聚物。本文所用的“核堿基”是指天然存在的核堿基和制備能序列特異地結(jié)合核酸的聚合物的技術(shù)人員公知的非天然存在的雜環(huán)部分。合適的核堿基的非限制性實(shí)例包括腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、2-硫代-5-丙基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假異胞嘧啶、2-硫尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2，6- 二氨基嘌呤)、次黃嘌呤、N9-(7-脫氮-鳥嘌呤)、N9_(7_脫氮-8-氮-鳥嘌呤)和N8-(7-脫氮-8-氮-腺嘌呤)。合適的核堿基的其它非限制性實(shí)例包括Buchardt et al. (W092/20702或W092/20703)的圖2(A)和2 (B)中所列出的那些核堿基。本文所用的“一種或多種探針/染色體DNA、探針/mRNA和/或探針/質(zhì)粒復(fù)合物”是指通過(guò)以下形成的復(fù)合物1)探針與樣品的細(xì)菌細(xì)胞的染色體DNA分子中的靶標(biāo)的結(jié)合；2)探針與樣品的細(xì)菌細(xì)胞的mRNA分子中的靶標(biāo)的結(jié)合；和/或3)探針與樣品的細(xì)菌細(xì)胞的天然質(zhì)粒核酸分子中的靶標(biāo)的結(jié)合。通常，本文中用探針/染色體DNA、探針/mRNA 和/或探針/質(zhì)粒復(fù)合物的形成來(lái)確定樣品的細(xì)菌中的選定性狀。本文所用的“一種或多種探針/rRNA復(fù)合物”是指由探針(例如雜交探針)與樣品的細(xì)菌細(xì)胞的rRNA的結(jié)合所形成的復(fù)合物。本文中可以用探針/rRNA復(fù)合物的形成來(lái)確定樣品中的選定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。本文中還可以用探針/rRNA復(fù)合物的形成來(lái)確定樣品中的其它細(xì)菌，無(wú)論這些細(xì)菌是否為革蘭氏陽(yáng)性的。本文所用的“一種或多種第二探針/rRNA復(fù)合物”是指由第二探針(即與之前提到的探針不同的探針)與樣品的細(xì)菌細(xì)胞的rRNA分子中的靶標(biāo)的結(jié)合所形成的復(fù)合物。 通常，本文用第二探針/rRNA復(fù)合物的形成來(lái)確定樣品中另一種(或第二種)選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或另一種細(xì)菌(例如革蘭氏陰性細(xì)菌)。應(yīng)當(dāng)理解，在本文所述的任何分析方法中，可以使用針對(duì)(目的細(xì)菌)的rRNA的第三、第四、第五、第六(等)探針，其中每一種不同的針對(duì)rRNA的探針可以選擇用于確定樣品中可能存在的不同的選定細(xì)菌(其中的一些可以不是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)。通常，第二、第三、第四、第五、第六(等)探針中的每一種均可以獨(dú)立于實(shí)施方法中所用的其它探針而進(jìn)行檢測(cè)，使得所述方法可作為多元方法來(lái)實(shí)施。還應(yīng)當(dāng)理解，第三探針可以形成第三探針/rRNA復(fù)合物，第四探針可以形成第四探針/ rRNA復(fù)合物、第五探針可以形成第五探針/rRNA復(fù)合物、第六探針可以形成第六探針/rRNA 復(fù)合物等。本文所用的“一種或多種洗滌試劑”是指用來(lái)從樣品和/或樣品的細(xì)菌細(xì)胞去除不同試劑和/或組分的一種試劑、兩種或更多種試劑、試劑混合物或制劑。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)將樣品與一種或多種洗滌試劑接觸的一個(gè)或多個(gè)步驟來(lái)實(shí)施本文所公開的方法。本文所用的“預(yù)雜交步驟”是指在用含有雜交探針的雜交緩沖液處理樣品(例如接觸)之前，用缺少雜交探針的雜交緩沖液處理所述樣品(例如接觸)一段時(shí)間的過(guò)程。在一些實(shí)施方案中，實(shí)施本文所公開的方法可以包括預(yù)雜交步驟，也可以不包括預(yù)雜交步驟。本文所用的“探針，，或“雜交探針，，是指能與選定的靶標(biāo)結(jié)合的組合物?！半s交探針”是能通過(guò)雜交與其對(duì)應(yīng)靶標(biāo)結(jié)合的探針。探針的非限制性實(shí)例包括核酸寡聚物(例如 DNA、RNA等)、核酸類似物寡聚物(例如鎖核酸(LNA))、核酸模擬物寡聚物(例如肽核酸 (PNA))、嵌合體、抗體和抗體片段。本文所用的“量子點(diǎn)”是指無(wú)機(jī)微晶體，其直徑為約Inm至約IOOOnm或者約Inm至約IOOOnm之間的任何整數(shù)和小數(shù)，通常為約2nm至約50nm或約2nm至約50nm之間的任何整數(shù)和小數(shù)，或者更通常為約2nm至約20nm(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19或20nm)。半導(dǎo)體納米晶體受激發(fā)時(shí)能發(fā)射電磁輻射(即半導(dǎo)體納米晶體發(fā)光)，且包含一種或多種第一半導(dǎo)體材料的“核心”，并且可被第二半導(dǎo)體材料的“外殼”包圍。由半導(dǎo)體外殼包圍的半導(dǎo)體納米晶體核心被稱為“核心/外殼”半導(dǎo)體納米晶體。包圍的“外殼”材料的帶隙能通常大于核心材料的帶隙能，并且可以被選擇為與“核心”基底具有接近的原子間隔。核心和/或外殼可以是包括但不限于以下的半導(dǎo)體材料II-vi族 (ZnS > ZnSe > ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe > SrS > SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe 等)禾口 III-V 族(GaN, GaP, GaAs, GaSb, InN, InP, InAs, InSb 等)以及IV族(Ge、Si等)材料以及以上材料的合金或混合物。在科技和專利文獻(xiàn)中，術(shù)語(yǔ)“半導(dǎo)體納米晶體”、“量子點(diǎn)”、“Qdot 納米晶體”或“納米晶體”可互換使用。為了本說(shuō)明書的目的，這些術(shù)語(yǔ)還是上文定義的“量子點(diǎn)”的等同詞。本文所用的“針對(duì)rRNA的探針”是指選擇為能與rRNA分子中的靶標(biāo)結(jié)合的探針。 針對(duì)rRNA的探針可以用可檢測(cè)的部分進(jìn)行標(biāo)記或者可以是無(wú)標(biāo)記的。如果是無(wú)標(biāo)記的，則由rRNA探針與其細(xì)菌中靶標(biāo)的結(jié)合所形成的復(fù)合物可以例如利用探針/rRNA復(fù)合物的標(biāo)記抗體進(jìn)行檢測(cè)(參見例如=Hyldig-Nielsen的美國(guó)專利第5，612，458號(hào))。通常，所選的rRNA靶標(biāo)應(yīng)能區(qū)分開樣品中的細(xì)菌，并進(jìn)而允許確定樣品中的選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(或其它細(xì)菌)。使用針對(duì)細(xì)菌rRNA中的靶標(biāo)的探針來(lái)區(qū)分(并進(jìn)而確定)樣品中的細(xì)菌已長(zhǎng)期用于基于ISH和FISH的分析中(參見例如=Amarm, R.， "Methodological Aspects of Fluorescence In Situ Hybridization(焚光原位雜交的方法方面)，，，Bioscience Microflora, 19(2) :85-91(2000)和 Pernthaler et al.， "Fluorescence in situ Hybridization(FISH)with rRNA-targeted Oligonucleotide Probes (利用靶向于rRNA的寡核苷酸探針的熒光原位雜交(FISH)) ”，Methods in Microbiology, 30 :207-226 (2001))。關(guān)于針對(duì)rRNA的PNA和LNA探針在FISH中的應(yīng)用可參見:Cerqueira et al. ,"DNA Mimics for the Rapid Identification of Microorganisms by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)(用于通過(guò)熒光原位雜交(FISH)快速鑒定微生物的 DNA 模擬物)”，Int. J. Mol. Sci.，9 :1944-1960(2008)。關(guān)于針對(duì) rRNA 的 PNA 探針在確定血液樣品中的葡萄球菌的應(yīng)用可參見Forrest et al. ,"Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures (快速原位雜交檢測(cè)對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌陽(yáng)性的血液培養(yǎng)物的影響)”，Journal of Antimicrobial Chemotherapy，58 :154-158 (2006)。本文所用的“第二針對(duì)rRNA的探針”是指能與rRNA分子中的不同(即第二)靶標(biāo)選擇性地結(jié)合的第二探針。第二 rRNA靶標(biāo)可以與分析中所用的另一(第一)探針的靶標(biāo)存在于相同細(xì)菌中，但是更通常，第二針對(duì)rRNA的探針將針對(duì)不同目的細(xì)菌中的靶標(biāo)， 以便第二探針/rRNA復(fù)合物的形成和確定可用于確定樣品中的第二(不同的)選定細(xì)菌。 所述第二選定細(xì)菌可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。本文所用的“選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，，是指可以通過(guò)實(shí)施本文所述方法來(lái)確定的目的細(xì)菌(例如待通過(guò)實(shí)施本文所述方法來(lái)確定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)。通常，選擇所述革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌用于分析是因?yàn)樗黾?xì)菌可能具有選定的性狀。例如，選定的性狀可以具有臨床意義。選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌可以是例如，特定種的、特定亞種的或特定屬的細(xì)菌。選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌還可以是例如，諸如凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)或革蘭氏陽(yáng)性球菌的公認(rèn)群體。在一些實(shí)施方案中，選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌是金黃色葡萄球菌，并且選定的性狀是甲氧苯青霉素抗性。本文所用的“選定的性狀”是指通過(guò)實(shí)施本文所述方法來(lái)確定的目的性狀。在一些實(shí)施方案中，選定的性狀是甲氧苯青霉素抗性。本文所用的“信號(hào)擴(kuò)增”是針對(duì)于(直接或間接地)與探針相聯(lián)的標(biāo)簽來(lái)討論， 并且是指使用特定的檢測(cè)方法將每種與探針相聯(lián)的標(biāo)簽的信號(hào)增強(qiáng)至少兩倍。信號(hào)擴(kuò)增通常(但未必)涉及酶的使用。信號(hào)擴(kuò)增的一些非限制性實(shí)例包括酪胺信號(hào)擴(kuò)增(TSA， 也稱為催化信使沉積(CARD))、酶標(biāo)記的熒光(ELF-97-產(chǎn)品和信息可從Invitrogen， Carlsbad，CA 獲取)、分支 DNA(bDNA)信號(hào)擴(kuò)增(參見Collins et al.，“A branched DNA signal amplification assay for quantification of nucleic acid targets below lOOmolecules/ml (用于對(duì)低于100個(gè)分子/ml的核酸靶標(biāo)進(jìn)行定量的分支DNA信號(hào)擴(kuò)增)”，Nucl. Acids Res. ,25(15) :2979-2984(1997)和 Zheng et al. ,"Direct mecA Detection from Blood Culture Bottles by Branched-DNA Signal Amplification(M 過(guò)分支DNA信號(hào)擴(kuò)增從血液培養(yǎng)瓶進(jìn)行直接的mecA檢測(cè))”，J. Clin. Microbiol.，37 (12) 4192-4193(1999)、以及滾環(huán)擴(kuò)增(RCA-參見Maruyama et al. ,"Visualization and Enumeration of Bacteria Carrying a Specific Gene Sequence by In Situ Rolling Circle Amplification(通過(guò)原位滾環(huán)擴(kuò)增對(duì)攜帶特定基因序列的細(xì)菌的觀察和計(jì)數(shù))”， Applied and Environmental Microbiology, 71 (12) :7933-7940 (2005 年 12 月)和 Smolin et al. , "Detection of Low-Copy-Number Genomic DNA Sequences in Individual Bacterial Cells by Using Peptide Nucleic Acid-Assisted Rolling-Circle Amplification and Fluorescence In Situ Hybridization(通過(guò)在滾環(huán)擴(kuò)增和熒光原位雜交的輔助下，使用肽核酸對(duì)單個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中的低拷貝數(shù)基因組DNA序列的檢測(cè))”， Applied and Environmental Microbiology,73(7) :2324-2328(2007))。本文所用的“染色的”表示細(xì)菌細(xì)胞直接或間接標(biāo)記了標(biāo)簽以進(jìn)行檢測(cè)。例如，可以用一種或多種熒光標(biāo)記的雜交探針對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，使得可以例如按US 6，664，045 (具體參見圖3和實(shí)施例10第M-25欄中相關(guān)的討論(US 6，664，045))中所述利用熒光顯微鏡來(lái)檢測(cè)細(xì)菌細(xì)胞。US 6，664，045的圖3的各圖中可清楚觀察到可以用可獨(dú)立檢測(cè)的標(biāo)簽(獨(dú)立標(biāo)簽的組合)對(duì)樣品的不同細(xì)菌進(jìn)行染色，使得樣品中不同類型的細(xì)菌例如呈現(xiàn)不同的顏色(或具有不同的可檢測(cè)性質(zhì))。例如，具體參照US 6，664，045的圖3，金黃色葡萄球菌的特征為(僅)紅色染色、大腸桿菌的特征為綠色和紅色染色、銅綠假單胞菌 (P. aeruginosa)的特征為(僅)綠色染色，鼠傷寒沙門菌(S. typimurium)的特征為藍(lán)色染色。因此在US 6，664，045的圖3中，使用不同的針對(duì)rRNA的標(biāo)記探針確定了四種不同的細(xì)菌，其中用獨(dú)特的標(biāo)簽或標(biāo)簽組合標(biāo)記每種不同細(xì)菌的探針。本申請(qǐng)的圖2和3也顯示出包含獨(dú)特的可獨(dú)立檢測(cè)的(熒光)染色的不同類型的細(xì)菌。本文所用的“靶標(biāo)”或“選定的靶標(biāo)”可互換使用，并且是指細(xì)菌中被設(shè)計(jì)的探針特異性結(jié)合的分子(或分子的一部分，例如選定的核酸序列)，例如rRNA、mRNA、染色體DNA、 質(zhì)粒DNA和抗原。本文所用的“性狀”是指可通過(guò)分析細(xì)菌的染色體DNA、mRNA和/或天然質(zhì)粒DNA 來(lái)確定的所述細(xì)菌的任何特征或性質(zhì)。一種這類性狀的實(shí)例是甲氧苯青霉素抗性。所述性狀依賴于mecA基因(即染色體DNA)的存在和所述基因的表達(dá)(例如通過(guò)從所述基因產(chǎn)生 mRNA)ο本文所用的“在適于探針與靶標(biāo)結(jié)合的條件下”是指在這樣的條件下，探針以特異性方式與其各自的靶標(biāo)結(jié)合，使得探針與非靶標(biāo)部分的非特異性結(jié)合被最小或消除。還應(yīng)當(dāng)理解，視具體情況“該(the)”可以被“所述(said)”替代(本說(shuō)明書的上文和其它地方) 以表示/承認(rèn)先前基礎(chǔ)。本文所用的短語(yǔ)“可獨(dú)特鑒別的”是指兩個(gè)或更多個(gè)目的狀態(tài)是可區(qū)別的情況。例如，在包含至少兩種細(xì)菌的樣品中，一種細(xì)菌可以包含紅色熒光標(biāo)記，而另一種細(xì)菌可以包含綠色熒光標(biāo)記。因此，例如使用合適配備的顯微鏡，所述兩種細(xì)菌是“可獨(dú)特鑒別的”(即被獨(dú)特染色)(參見例如上述US 6，664，045的圖3)，因?yàn)榭梢允褂蔑@微鏡區(qū)分兩種細(xì)菌。細(xì)菌可以是由于其它原因而可獨(dú)特鑒別，例如形態(tài)。例如，一種類型的細(xì)菌可以是桿狀的，而另一種是球狀的。在一些實(shí)施方案中，可以使用顏色和形態(tài)來(lái)區(qū)分/確定樣品中可獨(dú)特鑒別的細(xì)菌。本文所用的“全細(xì)胞”是指形態(tài)上可識(shí)別形式的細(xì)胞(例如細(xì)菌)?！叭?xì)胞”并非意圖表示細(xì)胞包含其全部的初始組分，因?yàn)楣氖牵?dāng)細(xì)胞被透化時(shí)，它們“泄露”細(xì)胞成分(參見Hoshino et al. , Applied and Environmental Microbiology, 74(16) 5068-5077(2008)的第 5074 頁(yè)第 1 欄禾口 Maruyama et al. , Applied and Environmental Microbiology, 71 (12) :7933-7940 (2005 年 12 月)的第 7937 頁(yè)第 1 欄)。這種“泄露”并非意圖表示用已經(jīng)發(fā)生泄露的細(xì)胞進(jìn)行的分析就不是本文所討論的全細(xì)胞分析。恰恰相反，“全細(xì)胞”意圖表示基本完整的細(xì)胞，從而它們保留形態(tài)上可識(shí)別的形式。例如，球菌是球狀的，而其它細(xì)菌可以是桿狀的。本文所用的“細(xì)菌內(nèi)(within bacteria) ” 或細(xì)菌內(nèi)(within the bacteria)”是指全(完整)細(xì)菌的任何結(jié)構(gòu)(包括多個(gè)結(jié)構(gòu))內(nèi)，例如外膜、核膜、細(xì)胞壁、細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞核。例如，樣品的細(xì)菌內(nèi)的一種或多種探針/rRNA復(fù)合物的形成可以指所述細(xì)菌的外膜內(nèi)、核膜內(nèi)、細(xì)胞壁內(nèi)和/或細(xì)胞核內(nèi)的一種或多種探針/rRNA復(fù)合物的形成。同樣，探針/rRNA復(fù)合物可以在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成，并且它們的存在可以用于從樣品的其它細(xì)菌確定選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如金黃色葡萄球菌)(參見例如圖3和實(shí)施例3中對(duì)圖3的討論)。然而，視具體情況，本文所用的“細(xì)菌內(nèi)，，還意圖包括與完整細(xì)菌的外表面接觸的結(jié)構(gòu)。例如，“細(xì)菌內(nèi)”還意圖包括，例如，與細(xì)菌外表面連接(例如由于與表面蛋白的結(jié)合) 的抗體探針，其中所述抗體探針例如可用于確定樣品中選定的細(xì)菌。4.概述
應(yīng)當(dāng)理解，以下在該“概述”部分中所闡述的討論可涉及本文所描述的多個(gè)發(fā)明實(shí)施方案中的一些或全部。核酸和核酸類似物的合成、修飾和標(biāo)記核酸寡聚物(寡核苷酸和寡核糖核苷酸)合成是常規(guī)的。對(duì)核酸合成的詳細(xì)描述，請(qǐng)參見 Gait, M. J. , "Oligonucleotide Synthesis :a Practical Approach (寡核苷酸合成實(shí)踐方法)” IRL Press, Oxford England (1984) 0本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，標(biāo)記的和未標(biāo)記的寡核苷酸(DNA、RNA及其合成類似物)是容易得到的?？梢杂蒙藤?gòu)的設(shè)備和試劑合成它們，或者可以從定制寡核苷酸的商家購(gòu)買它們。PNA合成和標(biāo)記PNA的化學(xué)組裝方法是公知的(參見美國(guó)專利第5，539，082號(hào)、第5，527，675號(hào)、 第 5，623，049 號(hào)、第 5，714，331 號(hào)、第 5，718，262 號(hào)、第 5，736，336 號(hào)、第 5，773，571 號(hào)、 第 5，766，855 號(hào)、第 5，786，461 號(hào)、第 5，837，459 號(hào)、第 5，891，625 號(hào)、第 5，972，610 號(hào)、第 5，986，053和第6，107，470號(hào)；通過(guò)引用將所有專利中涉及肽核酸合成、修飾和標(biāo)記的信息并入本文。標(biāo)記PNA的一些非限制性方法描述于美國(guó)專利第6，110，676號(hào)、W099/22018、 W099/2188UW099/49293和W099/37670中，其它方法在PNA合成領(lǐng)域內(nèi)是公知的。用于肽核酸固相自動(dòng)化學(xué)組裝的化學(xué)品和設(shè)備是可以買到的。同樣，標(biāo)記的和未標(biāo)記的PNA寡聚物可從定PNA 寡聚物的商家獲得(#JAL :www. panagene. com/pna-oligomers. php、www. biosyn. com/pna_custom. aspx 或 www. crbdiscovery. com/pna/)。PNA合成禾口標(biāo)記的其它信息可見于 Peter Ε. Nielsen, "Peptide Nucleic Acids (月太核酸)”，Taylor and Francis, (2004)中。因?yàn)镻NA是聚酰胺，所以其具有C-末端(羧基末端)和N-末端(氨基末端)。為了設(shè)計(jì)適于與靶標(biāo)反向平行(優(yōu)選的方向)結(jié)合的雜交探針，PNA寡聚物的N-末端與等同 DNA或RNA寡核苷酸的5' _羥基末端是等同的。 嵌合體合成和標(biāo)記/修飾嵌合體是包含不同單體類型子單元的寡聚物。通常，適合于所用單體類型的標(biāo)記技術(shù)也可用于構(gòu)建嵌合體(進(jìn)行或不進(jìn)行改動(dòng))。多種標(biāo)記的和未標(biāo)記的嵌合分子在科技文獻(xiàn)中有報(bào)道或可從商業(yè)來(lái)源獲得(參見US 6, 316, 230, www. biosyn. com/PNA_ Synthesis. aspx> W02001/027326> www. sigmaaldrich. com/life-science/custom-oligos/ dna-probes/product-lines/lna-probes. html)。因此,本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備標(biāo)記的嵌合分子或者可以從易獲取的來(lái)源購(gòu)買它們。標(biāo)簽適用于標(biāo)記本發(fā)明實(shí)踐中的探針的標(biāo)簽(即可檢測(cè)的部分或標(biāo)記物)的非限制性實(shí)例包括發(fā)色團(tuán)、熒光團(tuán)、自旋標(biāo)簽、放射性同位素、酶、半抗原、化學(xué)發(fā)光化合物、量子點(diǎn)或以上兩種或更多種的組合。半抗原的一些實(shí)例包括5(6)-羧基熒光素、2，4- 二硝基苯、地高辛和生物素。熒光染料(熒光團(tuán))的一些實(shí)例包括5 (6)-羧基熒光素(Flu)、6-((7_氨基-4-甲基香豆素-3-乙?；?氨基)己酸(Cou)、5 (和6)-羧基-X-若丹明(Rox)、青色素2 (Cy2)染料、青色素3(Cy3)染料、青色素3. 5(Cy3. 5)染料、青色素5(Cy5)染料、青色素5. 5 (Cy5. 5) 染料、青色素7(Cy7)染料、青色素9(Cy9)染料(青色素染料2、3、3. 5、5和5. 5可以NHS酯的形式從 GE Healthcare, Life Sciences, Piscataway, NJ 購(gòu)得)、JOE、Tamara 或 Alexa 染料系歹ll (Life Technologies, Carlsbad, CA)。酶的一些實(shí)例包括聚合酶(例如Taq聚合酶、Klenow PNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、 測(cè)序酶、DNA聚合酶1和phU9聚合酶)、堿性磷酸酶(AP)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和大豆過(guò)氧化物酶(SBP)。放射性同位素的一些實(shí)例包括14C、32P、129I和"Tc。在一些實(shí)施方案中，自旋標(biāo)簽可用作標(biāo)簽。自旋標(biāo)簽是具有未配對(duì)的自旋電子的有機(jī)分子，所述未配對(duì)的自旋電子通常在氮原子上。例如，可以按照美國(guó)專利申請(qǐng)第 7，494，776號(hào)中所述用自旋標(biāo)簽標(biāo)記探針。然后，所述標(biāo)記的探針可以例如用于對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色，以用于確定。可獨(dú)立檢測(cè)的標(biāo)簽/多元分析在一些實(shí)施方案中，進(jìn)行多元方法(分析)。在多元分析中，可同時(shí)或相繼檢測(cè)多種目的狀態(tài)。多元分析依賴于在完成分析期間或完成分析之后將樣品成分或與之相關(guān)的數(shù)據(jù)分類的能力。(本文所用的)多元分析通常依賴于使用兩種或更多種可獨(dú)特鑒別的探針。在多元分析中，一種或多種不同的可獨(dú)立檢測(cè)的標(biāo)簽(通常每種不同的標(biāo)簽(或不同的標(biāo)簽組合)與不同的探針連接)用來(lái)獨(dú)特地標(biāo)記(即染色)兩種或更多種不同的目的細(xì)菌。在一些情況下，兩種(或更多種)獨(dú)特的標(biāo)簽可針對(duì)相同的細(xì)菌，進(jìn)而產(chǎn)生由于細(xì)菌中存在兩種(或更多種)獨(dú)特標(biāo)簽而導(dǎo)致的獨(dú)特染色。區(qū)分每一種獨(dú)特染色的細(xì)菌和/ 或?qū)γ恳环N獨(dú)特染色的細(xì)菌進(jìn)行定量的能力提供了使分析多元化的手段，因?yàn)榕c每種獨(dú)特標(biāo)記的(即染色的)細(xì)菌相關(guān)的數(shù)據(jù)可以與待確定的狀態(tài)(例如選定的細(xì)菌或選定的性狀)相關(guān)。在實(shí)施本文所述的方法中，獨(dú)特地標(biāo)記細(xì)菌是可能的，這使得可以確定樣品的細(xì)菌的兩種(或更多種)目的狀態(tài)。例如，在一些實(shí)施方案的實(shí)施中，可以使用獨(dú)特的標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記樣品中的金黃色葡萄球菌以及使用獨(dú)特的標(biāo)簽來(lái)標(biāo)記樣品中抗甲氧苯青霉素的細(xì)菌。 因此，通過(guò)分析樣品，則能確定該樣品是否含有1)金黃色葡萄球菌(非甲氧苯青霉素抗性的)；2)抗甲氧苯青霉素的非金黃色葡萄球菌(例如MR-CNS)；和/或3)抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌。在一些實(shí)施方案中，對(duì)于這三種狀態(tài)，樣品的特征可以是異質(zhì)的或同質(zhì)的。在一些實(shí)施方案中，可以估計(jì)、定量或鑒定每組中的細(xì)菌數(shù)量，以樣品細(xì)菌的具體百分比表示?？梢砸院芏喾绞绞狗椒ǘ嘣⑶叶嘣瘍H受分析中可使用或檢測(cè)的可獨(dú)立檢測(cè)的標(biāo)簽(或可獨(dú)立檢測(cè)的探針)的數(shù)量的限制。例如，一些分析可以被設(shè)計(jì)成檢測(cè)并鑒定樣品中數(shù)種(例如2種、3種、4種、5種、6種或更多種)不同細(xì)菌(在一些實(shí)施方案中，都為革蘭氏陽(yáng)性，并且在一些實(shí)施方案中，是革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌的混合物)的存在， 以及確定是否那些細(xì)菌的任意一種具有兩種(或更多種)不同目的性狀中的一種或兩種。 例如，對(duì)于5種細(xì)菌和2種性狀的多元分析需要至少7種(5+2)獨(dú)特的標(biāo)記探針(或7種獨(dú)特的標(biāo)簽組合)和區(qū)分至少10種(5X》或多至20種(5X4)可能的不同類型的染色細(xì)菌的能力。結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施方案的上下文，所述方法可以使用5種獨(dú)特標(biāo)記的針對(duì)rRNA 的探針來(lái)確定5種不同細(xì)菌的每一種并使用2種獨(dú)特標(biāo)記的針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針來(lái)確定每種不同的性狀。
一些代表性的多元分析在實(shí)施例3中描述，并且參照?qǐng)D3可以看見代表性細(xì)菌的可獨(dú)特鑒別的特性。全細(xì)胞分析本文所述的方法涉及全細(xì)胞分析。在完整或基本完整的細(xì)胞上進(jìn)行全細(xì)胞分析。 全細(xì)胞分析的一些實(shí)例是原位雜交(ISH)、熒光原位雜交(FISH)和免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)分析。在一些實(shí)施方案中，全細(xì)胞分析嚴(yán)格地說(shuō)不是ISH、FISH或ICC分析。例如，全細(xì)胞分析可以涉及兩種或更多種這些不同的分析形式的組合(參見=Goldbard et al.，美國(guó)專利第6，524，798 號(hào)，名禾爾為“High Efficiency Methods For Combined Immunocytochemistry And In-Situ Hybridization (用于聯(lián)合免疫細(xì)胞化學(xué)和原位雜交的高效方法)”)。更具體而言，本發(fā)明的一些實(shí)施方案考慮聯(lián)合使用寡聚物(雜交)探針和例如抗體探針。只要分析形式和/或所述分析中使用的成分相互不會(huì)不相容，本發(fā)明考慮聯(lián)合全細(xì)胞分析形式的任何組合。如下文更詳細(xì)地討論，將分析聯(lián)合起來(lái)可以為實(shí)施方法步驟中使用不同的類型探針的結(jié)合條件帶來(lái)一定程度的協(xié)調(diào)?；蛘?，還可以使用樣品的再探測(cè)循環(huán)，其中一種探針類型的條件被固定，以便用所述類型探針完成再探測(cè)循環(huán)(第一循環(huán)實(shí)際上是探測(cè)循環(huán))， 并用第二(不同的)類型探針進(jìn)行新的再探測(cè)循環(huán)(參見Williams et al.，美國(guó)專利第 2005/0123959號(hào)對(duì)于使用相繼的分析步驟進(jìn)行全細(xì)胞分析的討論-本文所用的“再探測(cè)循環(huán)”)。根據(jù)所用方法，可以在每個(gè)再探測(cè)循環(huán)之后、在一些再探測(cè)循環(huán)之后或者在所有再探測(cè)循環(huán)之后確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物。ISH 本文所用的“原位雜交(ISH) ”是指利用針對(duì)核酸靶標(biāo)的雜交探針實(shí)施的方法。探針可以是核酸(例如RNA、DNA)、核酸類似物(例如LNA)、諸如PNA、嗎啉代或PP的核酸模擬物或嵌合體(例如，DNA-RNA嵌合體、PNA-DNA嵌合體、PNA-RNA嵌合體、LNA-DNA嵌合體等)。最廣泛使用的ISH方法是“熒光原位雜交”或“FISH”，其中探針包含一種或多種熒光標(biāo)簽。簡(jiǎn)單而言，傳統(tǒng)的原位雜交分析通常包括以下步驟中的一步或多步(1)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)雜交處理以增加靶標(biāo)DNA或RNA的可及性(例如加熱變性或堿變性和/或用細(xì)胞透化劑處理)；(2)降低非特異性結(jié)合的步驟(例如通過(guò)使用人類基因組DNA阻斷重復(fù)序列的雜交能力，)；(3)包括使樣品與不含雜交探針的雜交溶液接觸的預(yù)雜交；(4) 一種或多種雜交探針與細(xì)菌中的核酸進(jìn)行雜交；( 洗滌去除沒(méi)有與其各自的靶標(biāo)結(jié)合的探針；以及(6) 檢測(cè)/確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物(例如通過(guò)確定染色的細(xì)菌)。這些步驟中的每一步所用的試劑和它們的使用條件都根據(jù)具體的應(yīng)用而不同。可以使用能與細(xì)胞核酸序列雜交的各種可檢測(cè)的或可檢測(cè)地標(biāo)記的探針(例如， mS標(biāo)記的探針、熒光標(biāo)記的探針、酶標(biāo)記的探針)進(jìn)行ISH。當(dāng)使用熒光標(biāo)記的探針時(shí)，該技術(shù)稱為FISH?？芍苯?例如，通過(guò)使用共價(jià)連接的熒光標(biāo)簽)或間接(例如，通過(guò)配體-標(biāo)記的抗配體體系)標(biāo)記ISH探針。免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)本文所用的免疫細(xì)胞化學(xué)是指通過(guò)抗體探針(或抗體片段探針)與細(xì)菌內(nèi)抗原的相互作用，使用抗體或抗體片段對(duì)樣品的細(xì)菌進(jìn)行染色?？梢詢H通過(guò)使用一抗而發(fā)生染色， 或者染色可以涉及使用(標(biāo)記的)二抗。然而，為了避免任何不確定性，本發(fā)明不涉及使用
18針對(duì)細(xì)菌內(nèi)蛋白抗原的一抗，其中所述蛋白抗原與選定的性狀相關(guān)，并且其中確定所述抗體/抗原復(fù)合物是用于確定所選定的性狀。本文所用的免疫細(xì)胞化學(xué)(如果使用)通常涉及確定樣品中選定的細(xì)菌。因此， 抗體(或抗體片段)探針可以針對(duì)選定細(xì)菌特異性的抗原靶標(biāo)?？贵w探針可以是標(biāo)記的 (即直接檢測(cè))，或者可以通過(guò)使用能與抗體探針/抗原靶標(biāo)復(fù)合物結(jié)合的標(biāo)記的二抗來(lái)確定由抗體探針與細(xì)菌內(nèi)其各自的抗原靶標(biāo)的結(jié)合而形成的抗體探針/抗原靶標(biāo)復(fù)合物(即間接檢測(cè))。盡管如此，免疫細(xì)胞化學(xué)還可用于確定細(xì)菌內(nèi)的性狀。然而，關(guān)于性狀的確定，抗體探針是針對(duì)于探針/靶標(biāo)復(fù)合物，該探針/靶標(biāo)復(fù)合物由針對(duì)染色體DNA、mRNA或天然質(zhì)粒的探針與細(xì)菌內(nèi)其各自的抗原靶標(biāo)的結(jié)合所形成。因此，在這種情況下，免疫細(xì)胞化學(xué)用于與細(xì)菌性狀相關(guān)的所述探針/靶標(biāo)復(fù)合物的間接染色。無(wú)論靶標(biāo)是什么，用至少一種可檢測(cè)的部分標(biāo)記至少一種抗體，使得當(dāng)所述標(biāo)記的抗體結(jié)合時(shí)，細(xì)菌被染色。此外，ICC可以與ISH或FISH法聯(lián)合，從而按照本文所公開的方法確定選定的細(xì)菌和/或選定的性狀。樣品細(xì)菌無(wú)處不在。含有細(xì)菌的樣品可以來(lái)自任何來(lái)源。樣品的來(lái)源并非意圖限制本文所公開的任何方法的實(shí)施。樣品可以是環(huán)境樣品，例如來(lái)自土壤或水的樣品。樣品可以來(lái)自諸如食品、飲料或化妝品的消費(fèi)品。樣品可以來(lái)自犯罪現(xiàn)場(chǎng)(例如為了法醫(yī)分析)。樣品可以來(lái)自戰(zhàn)區(qū)或來(lái)自嫌疑恐怖分子攻擊的地點(diǎn)(例如，為了檢驗(yàn)致病菌，包括武器化細(xì)菌(例如炭疽芽孢桿菌 (B. anthracis)).樣品可以來(lái)自臨床來(lái)源。臨床來(lái)源的樣品可以來(lái)自諸如人、植物、魚或動(dòng)物的任何來(lái)源。(來(lái)自臨床來(lái)源)臨床樣品的一些非限制性實(shí)例包括血液、膿、痰、脊髓液、 羊水、糞便、尿液、鼻拭樣、喉拭樣等。樣品(包括臨床樣品)可以包括細(xì)菌培養(yǎng)物和亞培養(yǎng)物或其一部分。樣品可以包括制備用于或部分制備用于特定分析的樣品。例如，樣品可以是已經(jīng)固定和/或保存一段時(shí)間的樣本。探針除非本文的表述或討論做出明確限制，可用于選擇期望的目的狀態(tài)(例如選定的細(xì)菌或選定的性狀)的任何探針均可用于實(shí)施本發(fā)明的實(shí)施方案，所述選擇是基于所述探針與其各自靶標(biāo)的選擇性結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，探針可以是抗體或抗體片段。在一些實(shí)施方案中，探針可以是肽或蛋白。用于實(shí)施本發(fā)明實(shí)施方案的探針可以是核酸(例如DNA 或RNA)、核酸類似物(例如LNA)、核酸模擬物(例如PNA、PP或嗎啉代)或嵌合體。在一些實(shí)施方案中，探針長(zhǎng)度為10至20個(gè)核堿基子單元。本文中以“核堿基子單元長(zhǎng)度”描述探針是因?yàn)橹挥泻怂岚塑账?，而所有這些不同的寡聚物類型的每個(gè)子單元都包含一個(gè)核堿基?？梢酝ㄟ^(guò)重頭合成或其它方法來(lái)制備本發(fā)明實(shí)施方案中所用的探針。應(yīng)當(dāng)理解，在生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)存在很多用于檢測(cè)特定細(xì)菌或性狀的探針。因此，除非本文明確公開，探針的性質(zhì)(為了本發(fā)明的目的)并非意圖受限。在一些實(shí)施方案中，用于實(shí)施本發(fā)明的探針可以是未標(biāo)記的，只要具有能有可利用的機(jī)制來(lái)確定由探針與其各自靶標(biāo)的結(jié)合所形成的探針/靶標(biāo)復(fù)合物。例如，可通過(guò)使用能與未標(biāo)記的(一級(jí))基于抗體的探針結(jié)合的第二可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體來(lái)確定所述未標(biāo)記的(一級(jí))基于抗體的探針(參見例如US 6，524，798第3欄，第觀_40行和US 7，455，985第12欄，第12-63行)。例如，所述未標(biāo)記的(一級(jí))基于抗體的探針可用于確定選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。因此，可以通過(guò)確定二抗的標(biāo)簽來(lái)確定所有分子結(jié)合所形成的復(fù)合物(即標(biāo)記的二抗/ 一抗/靶標(biāo)復(fù)合物)(并因此確定選定的細(xì)菌)?？梢酝ㄟ^(guò)使用標(biāo)記的分子來(lái)相似地確定其它類型的未標(biāo)記的探針，所述標(biāo)記的分子與所述未標(biāo)記的探針選擇性結(jié)合或者與所述未標(biāo)記的探針與其各自的靶標(biāo)的結(jié)合所形成的復(fù)合物選擇性結(jié)合 (參見例如=Hyldig-Nielsen的美國(guó)專利第5，612，458號(hào)，其討論了抗PNA-DNA復(fù)合物的抗體的引用等)。在一些實(shí)施方案中，可用至少一種可檢測(cè)的部分(即至少一種標(biāo)簽)標(biāo)記探針。在一些實(shí)施方案中，每種探針僅包含一種標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，用來(lái)確定選定的性狀(例如甲氧苯青霉素抗性)的探針僅包含一種標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，使用探針混合物(例如針對(duì)mRNA的探針混合物)，其中每種探針包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽(即單標(biāo)記探針和/或雙標(biāo)記探針的混合物)。在一些實(shí)施方案中，每種探針可以包含多種標(biāo)簽(例如2種標(biāo)簽、 3種標(biāo)簽、4種標(biāo)簽、5種標(biāo)簽、6種標(biāo)簽等)。在一些實(shí)施方案中，一種或多種探針可以包含單一標(biāo)簽，以及一種或多種探針可以包含多種標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，一種或多種探針可以是未標(biāo)記的，并且一種或多種探針可以包含一種或多種標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，可直接確定標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，可間接確定標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，可直接確定一些標(biāo)簽，可間接確定一些標(biāo)簽。直接確定標(biāo)簽涉及在不使用另一種分子/化合物的條件下確定所述標(biāo)簽的性質(zhì)。 例如，確定熒光標(biāo)簽可以涉及使用熒光顯微鏡、使用載玻片掃描儀或使用流式細(xì)胞儀來(lái)觀察經(jīng)處理的樣品。因?yàn)樵陲@微鏡、掃描儀或細(xì)胞儀中所觀察/所檢測(cè)到的是標(biāo)簽自身的熒光，所以這種確定被認(rèn)為是直接的。相比較而言，間接確定涉及使用能識(shí)別標(biāo)記探針的標(biāo)簽的輔助分子/化合物，從而以確定標(biāo)記探針的標(biāo)簽的替代方式來(lái)確定所述輔助分子/化合物(或其上的標(biāo)簽)。例如，標(biāo)簽可以是半抗原，例如地高辛。下文第8部分列舉的數(shù)篇參考文獻(xiàn)描述了確定地高辛的間接方法。通常，這些方法涉及使用偶聯(lián)了第二標(biāo)簽(例如，諸如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶的酶或者諸如熒光素的熒光團(tuán))的抗地高辛分子(抗體)。因?yàn)樗_定的是輔助分子(即抗地高辛分子)的第二標(biāo)簽的性質(zhì)，所以這是間接確定方法的特征。在實(shí)踐中，本發(fā)明實(shí)施方案中所用的一些探針被選擇為能確定樣品中選定的細(xì)菌。我們將這些探針?lè)Q為“針對(duì)細(xì)菌的”探針?！搬槍?duì)細(xì)菌的”是指能特異性發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)、選定的細(xì)菌內(nèi)或選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌內(nèi)的靶標(biāo)的探針。此外，所述針對(duì)細(xì)菌的探針被認(rèn)為 “能確定樣品中選定的細(xì)菌”，因?yàn)樗鲠槍?duì)細(xì)菌的探針與細(xì)菌內(nèi)的靶標(biāo)選擇性結(jié)合，使得可以基于探針/靶標(biāo)復(fù)合物的形成來(lái)確定所述選定的細(xì)菌(例如通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀)。因此，所述針對(duì)細(xì)菌的探針用于確定所述樣品中所述選定的細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，選定的細(xì)菌是選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如金黃色葡萄球菌)，并且所述針對(duì)細(xì)菌的探針被認(rèn)為“能確定樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌”，或者更具體地對(duì)于金黃色葡萄球菌來(lái)說(shuō)，“能確定樣品中的金黃色葡萄球菌”。在一些實(shí)施方案中，還可以選擇其它選定的細(xì)菌(視具體情況，包括一種或多種革蘭氏陰性細(xì)菌)進(jìn)行確定。在這種情況下，對(duì)于每種待通過(guò)實(shí)施本方法來(lái)確定的其它選定的細(xì)菌來(lái)說(shuō)，樣品還與一種或多種其它針對(duì)細(xì)菌的探針接觸。通常，通過(guò)使用多元分析來(lái)實(shí)現(xiàn)樣品中多種選定的細(xì)菌的確定， 其中用獨(dú)特的染色、染色組合和/或染色與細(xì)胞形態(tài)的獨(dú)特組合對(duì)每種不同類型的細(xì)菌進(jìn)行染色。選擇用于確定選定細(xì)菌的探針(即針對(duì)細(xì)菌的探針)可以是針對(duì)rRNA的探針。所述針對(duì)rRNA的探針與選定細(xì)菌的rRNA中的靶標(biāo)特異性地結(jié)合。然而，針對(duì)細(xì)菌的探針不需要是針對(duì)rRNA的。相反，它們可以是例如針對(duì)mRNA的?！搬槍?duì)mRNA的，，是指能與mRNA 中的靶標(biāo)特異性地結(jié)合的探針。針對(duì)細(xì)菌的探針還可以針對(duì)所述細(xì)菌特異性的其它調(diào)節(jié)性 RNA (例如小 RNA (sRNA)或反義 RNA (aRNA))。此外，針對(duì)細(xì)菌的探針不需要是雜交探針。例如，針對(duì)細(xì)菌的探針可以是例如基于抗體的(參見例如=US 6，231,857和US 7，455，985)，因?yàn)橐阎贵w可以用來(lái)將一種細(xì)菌與另一種細(xì)菌或其它細(xì)菌區(qū)別開來(lái)。選擇用于確定選定的性狀的探針是針對(duì)以下靶標(biāo)樣品中可能存在的細(xì)菌的1) 染色體DNA內(nèi)的靶標(biāo)；2)mRNA內(nèi)的靶標(biāo)；和/或3)天然質(zhì)粒內(nèi)的靶標(biāo)，其中所述靶標(biāo)與選定的性狀相關(guān)。因此，基于靶標(biāo)的性質(zhì)，所述探針被認(rèn)為是“針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA 的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的”。此外，所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針被認(rèn)為“能確定與選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/或質(zhì)粒核酸”，因?yàn)樗鲠槍?duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針與所述選定的性狀相關(guān)的各自的靶標(biāo)選擇性地結(jié)合。因此，所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針用于確定所述樣品的細(xì)菌中的選定的性狀。在一些實(shí)施方案中，所選定的性狀是甲氧苯青霉素抗性。然而，應(yīng)當(dāng)理解，所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針不是針對(duì)[結(jié)合]與性狀相關(guān)的靶標(biāo)蛋白。相反，所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和 /或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針的靶標(biāo)通常位于染色體DNA、mRNA和/或天然質(zhì)粒的DNA的核酸序列內(nèi)。從以上的論述可以推斷，用來(lái)確定選定性狀的探針并不需要針對(duì)1)染色體DNA、 2)mRNA和幻天然質(zhì)粒的全部。相反，用來(lái)確定選定性狀的探針可以僅針對(duì)1)染色體DNA、 2)mRNA和幻天然質(zhì)粒中的一種、兩種或更多種的任意組合。例如，在一些實(shí)施方案中，用來(lái)確定選定性狀的探針是針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的。在一些實(shí)施方案中，用來(lái)確定選定性狀的探針是針對(duì)mRNA的。此外，在一些實(shí)施方案中，可以以多元方式實(shí)施本文所述的方法，進(jìn)而可以確定單一樣品的細(xì)菌的多種性狀(例如2種性狀、3種性狀、4種性狀等)。對(duì)于不同性狀的探針并不需要都針對(duì)相同的靶標(biāo)類型。盡管允許對(duì)于不同性狀的探針針對(duì)相同的靶標(biāo)類型(例如 1)染色體DNA、2)mRNA或3)天然質(zhì)粒中的一種)，但是也允許對(duì)于不同性狀的探針針對(duì)不同的靶標(biāo)類型。還允許在同一分析中，對(duì)于不同性狀的一些探針針對(duì)相同的靶標(biāo)類型，且對(duì)于不同性狀的一些探針針對(duì)不同的靶標(biāo)類型。事實(shí)上，對(duì)于不同靶標(biāo)類型的探針的任何可能組合都是允許的。針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針可以是核酸、核酸類似物、核酸模擬物或嵌合體。針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針可以是未標(biāo)記的?？梢园辞拔乃龃_定用未標(biāo)記的探針形成的探針/靶標(biāo)復(fù)合物。然而，針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針通常標(biāo)記有一種或多種標(biāo)簽。 在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針僅包含一種標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的探針可以包含多種標(biāo)簽。在同一分析中將單一標(biāo)記的探針與多重標(biāo)記的探針混合起來(lái)也是允許的。正如之前已經(jīng)數(shù)次提到的，可以以多元方式實(shí)施本文所述的方法，進(jìn)而例如1) 確定單個(gè)樣品中兩種或更多種選定的細(xì)菌；幻確定單個(gè)樣品中兩種或更多種選定的性狀； 或3)確定單個(gè)樣品中兩種或更多種選定的細(xì)菌和兩種或更多種選定的性狀。通常，通過(guò)將樣品與確定其它選定細(xì)菌和/或選定性狀所需的其它探針接觸來(lái)進(jìn)行這類多元分析。在一些實(shí)施方案中，所述接觸可以同時(shí)進(jìn)行，以便在一個(gè)過(guò)程結(jié)束時(shí)可以確定所有不同的細(xì)菌和/或性狀。對(duì)于該實(shí)施方案，可獨(dú)立地檢測(cè)針對(duì)每種不同的選定細(xì)菌和/或不同的選定性狀的探針。通常，用于實(shí)施本方法的多種探針的標(biāo)簽被選擇為能產(chǎn)生基于細(xì)菌和/或性狀類型的不同染色的細(xì)菌。然而在一些情況下，可以具有一些相同染色的細(xì)菌，因而基于細(xì)菌的形態(tài)(可能與染色的確定聯(lián)合)來(lái)確定一種或多種選定的細(xì)菌和/或性狀。除了具有不同(可獨(dú)立檢測(cè)的)標(biāo)簽(獨(dú)特染色的細(xì)菌)的多元分析之外，還可以通過(guò)使用再探測(cè)循環(huán)方法來(lái)獲得多元結(jié)果(參見=Williams et al.的公開的美國(guó)專利申請(qǐng)第2005/0123959號(hào))。在再探測(cè)循環(huán)方法中，獲取一個(gè)結(jié)果，然后對(duì)樣品進(jìn)行再分析， 用于確定第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)、第五個(gè)結(jié)果等。通常，在再探測(cè)循環(huán)方法中，在處理樣品之前去除(清除)先前的結(jié)果以獲得下一結(jié)果。就本文所公開的方法而言，可以通過(guò)再探測(cè)循環(huán)方法而使用相同的標(biāo)簽類型(例如熒光素)來(lái)確定兩種或更多種選定的細(xì)菌和/或兩種或更多種選定的性狀。在一些實(shí)施方案中，可以在同一再探測(cè)循環(huán)中確定選定的細(xì)菌和選定的性狀。在一些實(shí)施方案中，可以在不同的再探測(cè)循環(huán)中確定選定的細(xì)菌和選定的性狀。通常，通過(guò)選擇在特定的再探測(cè)循環(huán)期間施加于樣品的探針，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇在所述再探測(cè)循環(huán)中將確定哪種選定的細(xì)菌和/或選定的性狀。靶標(biāo)通常，靶標(biāo)可以是細(xì)菌(或酵母)內(nèi)存在的、在全細(xì)胞分析過(guò)程中可用各自的探針進(jìn)行確定的任何靶標(biāo)分子(或其一部分)。靶標(biāo)的一些非限制性實(shí)例包括存在于細(xì)菌的任何核酸內(nèi)的核酸序列(例如rRNA、mRNA、染色體DNA或質(zhì)粒DNA內(nèi)的選定序列)、抗原、抗體、蛋白、肽和/或激素。在一些實(shí)施方案中，利用以下來(lái)實(shí)施本文所公開的方法1)能確定樣品中可能存在的選定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的針對(duì)細(xì)菌的探針；以及幻能確定與樣品的細(xì)菌中可能存在的選定性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/或天然質(zhì)粒的針對(duì)性狀的探針(該性狀可以存在于所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中也可以不存在于所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中)。然而，為了避免不確定性，本發(fā)明并不涉及使用用于確定性狀的蛋白靶標(biāo)。應(yīng)當(dāng)理解，本文所公開的方法可用于確定其它靶標(biāo)(例如通過(guò)多元法或再探測(cè)循環(huán))，所述其它靶標(biāo)可能是樣品的目的靶標(biāo)并且可能在本文所公開的方法的實(shí)施過(guò)程中確定。例如，通過(guò)將樣品與一種或多種針對(duì)其它靶標(biāo)的其它探針接觸，可以從所述樣品獲取其它信息，樣品的細(xì)菌(或酵母)中其它靶標(biāo)的存在指示另一種目的狀態(tài)(例如用于正確診斷患者的另一種臨床目的狀態(tài))。所述其它目的狀態(tài)可以是樣品中另一種細(xì)菌的存在(該細(xì)菌可以是革蘭氏陽(yáng)性或者革蘭氏陰性)。所述其它目的狀態(tài)可以是樣品中酵母的存在。 所述其它目的狀態(tài)可以是樣品的選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或其它細(xì)菌中的質(zhì)粒的存在。 所述其它目的狀態(tài)可以是樣品的細(xì)菌(包括選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)中其它性狀的存在。 本文所公開的方法可以與用于多個(gè)靶標(biāo)的多種探針聯(lián)合使用。因此，可以基于對(duì)靶標(biāo)(和每種靶標(biāo)各自的探針)的合適選擇，通過(guò)實(shí)施本文所公開的方法來(lái)確定一種或多種其它目的狀態(tài)，可以包括，例如確定1)其它細(xì)菌、幻質(zhì)粒、幻酵母、4)性狀或幻以上兩種或更多種的任何可能的組合。使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)和可商購(gòu)的材料和/或信息，本領(lǐng)域技術(shù)人員能設(shè)計(jì)選定的合適靶標(biāo)(并設(shè)計(jì)對(duì)所述合適靶標(biāo)的合適的探針)。例如，ISH常用于確定選定的細(xì)菌(參見Amann, R. , "Methodological Aspects of Fluorescence In Situ Hybridization (熒光原位雜交的方法方面)”，Bioscience Microflora, 19(2) 85-91 (2000)禾口 Pernthaler et al. , "Fluorescence in situ Hybridization(FISH)with rRNA-targeted Oligonucleotide Probes (利用靴向于rRNA的寡核苷酸探針的熒光原位雜交(FISH)) "Methods in Microbiology，30 :207-2 Q001))，包括金黃色葡萄球菌(參見美國(guó)專利第6，664，045號(hào)圖3和美國(guó)專利申請(qǐng)第2008/0008994號(hào)；Cerqueira et al.， "DNA Mimics for the Rapid Identification of Microorganisms by Fluorescence in situ Hybridization(FISH)(用于通過(guò)熒光原位雜交(FISH)快速鑒定微生物的DNA模擬物)，，，Int. J. MoUci.，9 :1944-196(K2008)；和 Forrest et al. ,"Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-陰j"生 staphylococci positive blood cultures (快速原位雜交檢測(cè)對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌陽(yáng)性的血液培養(yǎng)物的影響)”，Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58 : 1M-158 Q006))。如之前所指出的(參見上文中標(biāo)題為“探針”的部分)，這類確定的靶標(biāo)可以是例如rRNA。然而，這并非是意圖限制，因?yàn)橛糜谶x擇細(xì)菌的靶標(biāo)可以是例如表面抗原(參見US 7，455，985)。形成探針/靶標(biāo)復(fù)合物通過(guò)確定樣品的細(xì)菌內(nèi)適當(dāng)?shù)奶结?靶標(biāo)復(fù)合物的形成來(lái)確定選定的細(xì)菌(例如選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)和選定的性狀。簡(jiǎn)單而言，通過(guò)將樣品與探針接觸，適當(dāng)?shù)奶结? 靶標(biāo)復(fù)合物將在樣品的細(xì)菌內(nèi)形成，所述探針是根據(jù)其對(duì)各自的靶標(biāo)的親和力選擇的，所述靶標(biāo)已知與選定的細(xì)菌和/或性狀相關(guān)(和對(duì)選定的細(xì)菌和/或性狀是特異性的)。通過(guò)探針及其各自的靶標(biāo)的性質(zhì)來(lái)確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物的性質(zhì)。需考慮不同類型的探針/靶標(biāo)復(fù)合物。例如，用于確定細(xì)菌的雜交探針可以是針對(duì)rRNA的或針對(duì)mRNA 的。因此，通過(guò)探針與其靶標(biāo)的結(jié)合而形成的每種復(fù)合物分別是探針/rRNA復(fù)合物或探針 /mRNA復(fù)合物。同樣，用于確定性狀的雜交探針可以是針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的或針對(duì)天然質(zhì)粒的。因此，通過(guò)探針與其各自靶標(biāo)的結(jié)合而形成的每種復(fù)合物分別是探針/染色體 DNA復(fù)合物、探針/mRNA復(fù)合物或探針/質(zhì)粒復(fù)合物。就抗體探針而言，抗體與其抗原靶標(biāo)的結(jié)合產(chǎn)生抗體/抗原復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，細(xì)菌中的探針/靶標(biāo)復(fù)合物是在合適的結(jié)合條件 (或更準(zhǔn)確地稱為雜交探針的“合適的雜交條件”)下形成的。每種探針/靶標(biāo)復(fù)合物的合適的結(jié)合條件是根據(jù)探針和靶標(biāo)的性質(zhì)而確定的。可以這樣說(shuō)，合適的結(jié)合條件反映了探針與其各自靶標(biāo)的相互作用是特異性的的條件。而且，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定形成多種探針/靶標(biāo)復(fù)合物的合適的結(jié)合條件。實(shí)際上，用于各種分析形式中的多種雜交緩沖液 (參見例如為原位雜交程序進(jìn)行優(yōu)化的即用型雜交溶液，例如廁.sigmaaldrich. com/ catalog/ProductDetail. do ？ N4 = H7782 | SIGMA&N5 = SEARCH_C0NCAT_PN01 BRAND_KEY&F =SPEC)和/或結(jié)合緩沖液(參見例如如以下所描述的從Thermc^cientific購(gòu)買的即用型抗體結(jié)合緩沖液:WWW. piercenet. comProducts/Browse. cfm ？ fldID = 01010401&WT. mc_id = go_AbPur_Bind_pf&gclid = CNyJ-4uxgJoCFdxM5QodlVt5Fw)是可以購(gòu)買到的。應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)合條件不需要進(jìn)行完全優(yōu)化，只要該條件適合于探針與其各自靶標(biāo)的特異性結(jié)合，使得分析能產(chǎn)生準(zhǔn)確且可重復(fù)的結(jié)果。此外，如果在同一接觸步驟中使用不同類型的探針(例如雜交探針和基于抗體的探針)，那么結(jié)合條件應(yīng)當(dāng)適合于每種類型探針與其各自靶標(biāo)的結(jié)合。對(duì)于該問(wèn)題的更為詳細(xì)的論述，參見下文中標(biāo)題為“協(xié)調(diào)全細(xì)胞分析中的結(jié)合條件”的部分。確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物探針/靶標(biāo)復(fù)合物一旦形成就可以進(jìn)行確定?？梢允褂门c每種不同的(或不同類型的)探針/靶標(biāo)復(fù)合物相關(guān)的標(biāo)簽來(lái)確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，與不同的(或不同類型的)探針/靶標(biāo)復(fù)合物相關(guān)的所有標(biāo)簽是相同的。在一些實(shí)施方案中， 不同的標(biāo)簽(或標(biāo)簽的組合)與每種不同的(或不同類型的)探針/靶標(biāo)復(fù)合物相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，利用與不同的(或不同類型的)探針/靶標(biāo)復(fù)合物中的一些相關(guān)(例如針對(duì)細(xì)菌的探針，其中細(xì)胞形態(tài)可用于區(qū)別細(xì)菌種類)的相同標(biāo)簽和與不同的(或不同類型的)探針/靶標(biāo)復(fù)合物中的另外一些相關(guān)的(例如用于確定不同性狀的探針)不同標(biāo)簽的混合物?？梢灾苯踊蜷g接確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物?！爸苯拥亍北硎咎结?靶標(biāo)復(fù)合物的探針包含連接的標(biāo)簽，該標(biāo)簽是基于其自身的性質(zhì)而確定的(參見上文中標(biāo)題為“探針”的部分中的涉及直接和間接確定標(biāo)簽的論述)?！伴g接地”表示使用第二組合物(例如標(biāo)記的抗體)來(lái)確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物，所述第二組合物包含標(biāo)簽并且能與所述探針/靶標(biāo)復(fù)合物 (或與探針/靶標(biāo)復(fù)合物連接的標(biāo)簽)結(jié)合(或相互作用)，其中所述標(biāo)簽的確定(Id.)指示探針/靶標(biāo)復(fù)合物。無(wú)論怎樣，確定標(biāo)簽與確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物相關(guān)。在全細(xì)胞分析中，在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)檢查細(xì)胞(即細(xì)菌)的染色情況來(lái)確定探針/靶標(biāo)復(fù)合物。簡(jiǎn)單而言，不管標(biāo)記是直接的還是間接的，細(xì)胞都被染色，因?yàn)榕c探針/靶標(biāo)復(fù)合物(直接地或間接地)相聯(lián)的標(biāo)簽被攝入完整的細(xì)胞(即細(xì)菌)內(nèi)(或至少在細(xì)胞表面上)。如上文所指出的，對(duì)于不同的細(xì)菌和/或性狀，可以使用獨(dú)特的標(biāo)簽和 /或獨(dú)特的標(biāo)簽組合。因此，能確定樣品中染色細(xì)菌的任何方法都可以用來(lái)確定選定的細(xì)菌和/或選定的性狀。例如，可以基于顯微鏡下的視覺(jué)觀察來(lái)確定選定的細(xì)菌和/或性狀。在一些實(shí)施方案中，該過(guò)程可以是自動(dòng)化的，以便可以使用計(jì)算機(jī)和算法來(lái)確定結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，可以使用載玻片掃描儀來(lái)確定選定的細(xì)菌和/或性狀。同樣， 載玻片掃描儀可以是自動(dòng)化的，以便可以使用計(jì)算機(jī)和算法來(lái)確定結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，可以使用流式細(xì)胞儀來(lái)確定選定的細(xì)菌和/或性狀。同樣，流
24式細(xì)胞儀可以是自動(dòng)化的，以便可以使用計(jì)算機(jī)和算法來(lái)確定結(jié)果。此外，適于確定染色細(xì)胞的任何其它裝置或方法均可以用來(lái)確定用本文所公開的創(chuàng)造性的方法所形成的探針/靶標(biāo)復(fù)合物。細(xì)胞形態(tài)本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于多種細(xì)菌類型具有獨(dú)特的形態(tài)。除了用于標(biāo)記細(xì)菌的標(biāo)簽(例如染色)之外，細(xì)胞的形態(tài)也可以用來(lái)確認(rèn)細(xì)菌種類或可能例如在多元分析中引進(jìn)二級(jí)區(qū)分。例如，桿菌多為桿狀，而鏈球菌多為球狀(參見www.en.wikipedia.org/wiki/ Bacterial_cell_structure#Cell_morphology 禾口 www.en.wikipedia.org/wiki/File Bacterial_morphology_diagram. svg)。在一些分析中，例如，確定黃色染色的桿狀細(xì)胞可以確認(rèn)樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的存在、位置和/或數(shù)量。在這種情況下，細(xì)菌的形狀用于，例如，區(qū)別分析中的信號(hào)(選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)和噪聲(其它細(xì)菌)。在一些(例如多元)分析中，例如，可以使用多種細(xì)胞類型，其中至少兩種不同形態(tài)的細(xì)菌染上例如黃色標(biāo)記。在這種情況下，可以基于例如是否被染成黃色和形狀是桿狀還是球狀來(lái)確定所述兩種選定細(xì)菌的存在、位置和/或數(shù)量。當(dāng)然，還可以使用具有其它已知且可區(qū)別的形態(tài)的細(xì)菌來(lái)進(jìn)一步開發(fā)利用該方法的分析(進(jìn)一步多元化)。與形態(tài)相關(guān)(但未必是嚴(yán)格意義上細(xì)胞形態(tài)的實(shí)例)的是，在一些實(shí)施方案中，染色過(guò)程的特征還可以用來(lái)確認(rèn)或確定結(jié)果。例如，如果抗體探針與表面抗原相互作用，從而將細(xì)菌表面染色(例如使用基于抗體的針對(duì)細(xì)菌的探針)，并且第二獨(dú)特標(biāo)記的針對(duì)靶標(biāo)的探針(例如針對(duì)mRNA的探針)與細(xì)菌內(nèi)(例如細(xì)胞質(zhì)內(nèi))的靶標(biāo)相互作用，從而將細(xì)菌內(nèi)染色，則可以產(chǎn)生獨(dú)特的染色模式。例如，如果抗體探針是紅色的且靶標(biāo)探針是綠色的， 則當(dāng)用顯微鏡觀察時(shí)，細(xì)菌將會(huì)呈現(xiàn)出紅色的覆蓋(或環(huán))包圍綠色的主體。因此，基于它們是否表現(xiàn)出該特定的染色模式來(lái)確認(rèn)或確定樣品的細(xì)菌。從上述可明顯看出，細(xì)胞形態(tài)(和染色模式)是本發(fā)明特征，并且可用來(lái)確定選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或在本文所公開的任何方法中待確定的其它選定的細(xì)菌。相比較而言， 在無(wú)細(xì)胞分析中無(wú)法應(yīng)用細(xì)胞形態(tài)，因?yàn)榧?xì)菌遭到破壞。性狀如上文定義的，性狀(為本發(fā)明的目的)是指可通過(guò)分析細(xì)菌的染色體DNA、mRNA 和/或天然質(zhì)粒來(lái)確定的所述細(xì)菌的任何特性或?qū)傩??！斑x定的性狀”是在具體分析中選擇進(jìn)行確定的性狀?？蓪⒎治鲈O(shè)計(jì)成用于確定多種選定的性狀。因?yàn)樾誀钍腔诩?xì)菌的遺傳組成，所以細(xì)菌被認(rèn)為是具有性狀(即特性或?qū)傩?， 不管所述細(xì)菌是否表達(dá)(例如表現(xiàn)出)該性狀(即所述性狀是固有屬性)。因此，性狀的具有與性狀的表達(dá)的不同之處在于細(xì)菌可以具有性狀，但是不表現(xiàn)出與所述性狀相關(guān)的特性或性質(zhì)，因?yàn)楸磉_(dá)是指當(dāng)細(xì)菌表現(xiàn)出與所述性狀相關(guān)的特性或?qū)傩?即表型)時(shí)。因而應(yīng)當(dāng)清楚，如果細(xì)菌表現(xiàn)出性狀，則其具有該性狀(即含有表現(xiàn)所述形狀所需的遺傳物質(zhì))， 但是細(xì)菌也可以具有性狀而不表現(xiàn)出該性狀?？梢允褂帽疚乃_的方法來(lái)確定很多細(xì)菌性狀。可確定的性狀的一些非限制性實(shí)例包括1)抗生素抗性、幻毒素產(chǎn)生和/或幻毒力。在一些實(shí)施方案中，可以分別使用細(xì)菌的DmecA基因或vanA或vanB基因、2) tcbD基因和/或3) IukF和IukS基因中的靶標(biāo)確定性狀的實(shí)例。因?yàn)樾誀钆c染色體DNA、mRNA和天然質(zhì)粒相關(guān)，所以選定的細(xì)菌中一些性狀的靶標(biāo)分子產(chǎn)生的拷貝數(shù)可以非常低。在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌相關(guān)的科技文獻(xiàn)中，通常通過(guò)聯(lián)合使用包含多種標(biāo)簽的探針和間接標(biāo)簽的信號(hào)擴(kuò)增來(lái)解決這一問(wèn)題(參見例如Hahn et al.，Applied and Environmental Microbiology,59 (8) :2753-2757 的第 2754 頁(yè) M 2 ^ ；Wagner et al. , “ In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria (對(duì)利斯塔氏菌屬中的毒力因子mRNA和16S rRNA的原位檢測(cè))”， FEMS Microbiol. Lett. , 160(1) 159-168 (Mar. 1998)；和 Honerlage et al. ,"Detection of mRNA of nprM in Bacillus meqaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridiZati0n(通過(guò)全細(xì)胞雜交檢測(cè)土壤中生長(zhǎng)的巨大芽孢桿菌ATTC 14581中的nprM mRNA)”，Arch. Microbiol.，163 :235-241(1995)關(guān)于革蘭氏陰性細(xì)菌的分析也可參見 Coleman et al. , J. Microbiological Methods，71 :246-255(2007))。 $ Coleman et al.中，使用包含單標(biāo)簽的針對(duì)mRNA的探針，只要所述標(biāo)簽是近紅外線熒光染料并利用長(zhǎng)的照相曝光時(shí)間)。但是，本申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，在全細(xì)胞分析形式中，僅使用單標(biāo)記的探針(其中所述標(biāo)簽不是近紅外線熒光染料)而不用擴(kuò)增技術(shù)(例如信號(hào)擴(kuò)增或核酸擴(kuò)增)就可能確定性狀，所述性狀例如與革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中低拷貝數(shù)mRNA靶標(biāo)的確定相關(guān)。在一些情況下，通過(guò)在進(jìn)行全細(xì)胞分析之前誘導(dǎo)(活)細(xì)菌中相關(guān)mRNA的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)(更多細(xì)節(jié)請(qǐng)參見下文標(biāo)題“誘導(dǎo)mRNA產(chǎn)生”下的內(nèi)容)。特異性如上文指出的，探針/靶標(biāo)復(fù)合物在允許特異性結(jié)合的條件下形成。雜交的特異性(即對(duì)雜交探針與核酸靶標(biāo)的序列特異性結(jié)合)是與嚴(yán)緊性和/或封閉策略相關(guān)的多種因子的函數(shù)。結(jié)合的特異性還適用于抗體結(jié)合或任何其它類型的配體-配體對(duì)中成員的結(jié)合。與雜交特異性類似，抗體與抗原結(jié)合(或配體對(duì)中一個(gè)成員與另一個(gè)成員的結(jié)合)的特異性也是條件依賴性的。原則上，選擇的條件能優(yōu)化特異性，以便最小化或消除非特異性結(jié)合。然而，應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)合的特異性是一個(gè)相對(duì)的術(shù)語(yǔ)，其還取決于多種因素，包括形成結(jié)合復(fù)合物的組分的性質(zhì)(例如親和力)。以下是對(duì)各種條件/考慮因素的非限制性的討論。僅用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)并聯(lián)合本文所提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員能獲得合適的條件，而使得具體探針與其各自靶標(biāo)的結(jié)合(或雜交)是特異性的(使得本方法的實(shí)施能產(chǎn)生準(zhǔn)確且可重復(fù)的結(jié)果)。在很多情況下，可以使用商購(gòu)的緩沖液來(lái)實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。封閉探針在雜交反應(yīng)中，封閉探針(由核酸、核酸類似物、核酸模擬物或嵌合體制成)可用來(lái)抑制探針與非靶標(biāo)的結(jié)合，進(jìn)而提高探針/靶標(biāo)復(fù)合物形成的特異性。特別有效的封閉探針是PNA寡聚物(參見Coull et al.，美國(guó)專利第6，110，676號(hào)，通過(guò)引用并入本文，以及 Fiandaca et al. "PNA Blocker Probes Enhance Specificity In Probe Assays (PNA封閉探針提高探針?lè)治鲋械奶禺愋?”，Peptide Nucleic Acids protocols and Applications, pp. 129-141, Horizon Scientific Press, ffymondham,UK,1999)).雜交條件/嚴(yán)緊性本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識(shí)到，常用于限制或控制雜交嚴(yán)緊性的因素包括甲酰胺濃度(或其它化學(xué)變性劑)、鹽濃度(即離子強(qiáng)度)、雜交溫度、去垢劑濃度、PH和是否存在促溶劑。封閉探針(參考上文對(duì)封閉探針的討論部分)也可以作為一種手段來(lái)使辨別力高于僅利用嚴(yán)緊性因素的優(yōu)化可能達(dá)到的極限。通常通過(guò)公知技術(shù)來(lái)確定形成探針/靶標(biāo)復(fù)合物的最佳嚴(yán)緊性，即，固定幾種上述嚴(yán)緊性因素，然后確定改變單一嚴(yán)緊性因素的影響?？梢哉{(diào)整同一嚴(yán)緊性因素，從而控制核酸模擬物、核酸類似物或嵌合體與核酸靶標(biāo)(例如rRNA、mRNA或染色體DNA內(nèi)的序列)的雜交嚴(yán)緊性，但是對(duì)于這些修飾的寡聚物(例如 PNA)中的一些而言，雜交可以完全不依賴于離子強(qiáng)度?？梢酝ㄟ^(guò)實(shí)驗(yàn)確定分析的最佳或合適的嚴(yán)緊性，其中檢驗(yàn)每個(gè)嚴(yán)緊性因素直到達(dá)到所需的辨別力。然而，最佳的嚴(yán)緊性不是必須的。恰恰相反，所需要的是能在分析中將探針與非各自靶標(biāo)的對(duì)象的非特異性結(jié)合最小化至獲得準(zhǔn)確且可重復(fù)的結(jié)果所必需的程度。在下文所提供的實(shí)施例中，使用雜交緩沖液進(jìn)行雜交。如同所指出的，各種雜交緩沖液都可以購(gòu)買到。這種緩沖液與溫度控制的聯(lián)合通常能提供合適的雜交條件。能否快速得到結(jié)果是重要的因素，對(duì)于臨床樣品尤其如此。以下實(shí)施例中進(jìn)行的雜交反應(yīng)與Hahn et al.、Wagner et al.和H0nerlage et al.等中的雜交反應(yīng)的顯著不同之處在于雜交反應(yīng)進(jìn)行了 2小時(shí)內(nèi)而不是5-16小時(shí)(對(duì)于針對(duì)mRNA的探針而言)。合適的抗體結(jié)合條件合適的抗體結(jié)合條件包括適于抗體與其抗原特異性結(jié)合的條件。影響抗體與其抗原特異性結(jié)合(或配體-配體復(fù)合物中配體的結(jié)合)的因素與上面提到的那些影響雜交的因素基本類似，并且可以以相似的方式進(jìn)行優(yōu)化。各種抗體的合適的抗體結(jié)合條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。對(duì)于那些非已知的條件，可以確定它們。如上文所指出的，合適的結(jié)合緩沖液也是可購(gòu)買到的。因此，在進(jìn)行或不進(jìn)行其它常規(guī)實(shí)驗(yàn)的條件下，利用本文所提供的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定合適的抗體結(jié)合條件。借助本領(lǐng)域技術(shù)人員的其它通用指導(dǎo)，制備和使用抗體的方法可在很多參考文獻(xiàn)中找到，包括Molecular Probes Of The Nervous System, Volume 1,"Selected Methods For Antibody and Nucleic Acid Probes (選擇用于抗體和核酸探針的方法)”，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993 S. Hockfield et al。協(xié)調(diào)全細(xì)胞分析中的結(jié)合條件當(dāng)實(shí)施本文所公開的方法時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)發(fā)現(xiàn)協(xié)調(diào)雜交條件、抗體結(jié)合條件和其它分析條件(例如配體-配體結(jié)合的條件)是有用的。例如，在一些實(shí)施方案中， 用一種或多種雜交探針對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色可以與抗體結(jié)合事件同時(shí)進(jìn)行、在抗體結(jié)合事件之前進(jìn)行或在抗體結(jié)合事件之后進(jìn)行。因?yàn)橥蛔兞?PH、鹽濃度等)的調(diào)整是常常涉及的， 所以僅需借助于常規(guī)的實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員就能容易地協(xié)調(diào)條件，使得分析能產(chǎn)生滿意的結(jié)果。關(guān)于單一分析中協(xié)調(diào)使用抗體探針和雜交探針的條件的一些問(wèn)題和相關(guān)解決辦法的討論可見于 Goldbard et al. (US 6, 524, 798)禾口 A^mus et al. ,"Improved In Situ Tracking of Rhizosphere Bacteria Using Dual Staining with Fluorescence-Labeled Antibodies and rRNA-Targeted Oligonucleotides (使用焚光標(biāo)記抗體和靴向于 rRNA 的寡核苷酸的雙重染色提高對(duì)根際細(xì)菌的原位追蹤)”，Microb. Ecol. ,33 =32-40(1997)中。 另外值得注意的是，使用非核酸探針，優(yōu)選使用PNA探針，可以簡(jiǎn)化協(xié)調(diào)過(guò)程，因?yàn)镻NA探針能在寬泛的條件范圍下與互補(bǔ)核酸結(jié)合(與核酸/核酸相互作用相比)，從而允許技術(shù)人員將條件調(diào)整為更接近適于抗體-抗原結(jié)合和/或其它配體-配體結(jié)合的條件。無(wú)RNA酶試劑RNA酶是自然界中能降解RNA的酶。細(xì)菌含有RNA酶。在細(xì)菌死亡(例如通過(guò)固定)之后，這些RNA酶可以長(zhǎng)時(shí)間地保持活性。當(dāng)用于確定選定的細(xì)菌或選定的性狀的靶標(biāo)是RNA分子時(shí)，全細(xì)胞分析中檢測(cè)的細(xì)菌中的殘留RNA酶活性能活躍地降解所述靶標(biāo)分子。如果靶標(biāo)分子是低拷貝數(shù)的分子，那么對(duì)所述靶標(biāo)分子的任何破壞都會(huì)顯著降低分析的信號(hào)?？少?gòu)買到多種使RNA酶滅活的試劑。這些試劑通常被稱為RNA酶抑制劑。其中一種可購(gòu)買到的RNA酶抑制劑是三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP，來(lái)自Thermo Scientific, Rockford, II，產(chǎn)品號(hào) 77720)?？墒褂肦NA酶抑制劑來(lái)處理樣品，使細(xì)菌細(xì)胞中的RNA酶活性被抑制，從而預(yù)先阻止了 RNA靶標(biāo)的降解。RNA酶抑制劑可被添加到實(shí)施本發(fā)明所用的任何試劑、混合物、制劑和/或溶液中，從而抑制所述試劑、混合物、制劑和/或溶液中的RNA酶活性，并在細(xì)菌與所述試劑、混合物、制劑和/或溶液接觸時(shí)進(jìn)一步抑制細(xì)菌中靶標(biāo)分子的任何降解。所述試劑被認(rèn)為是無(wú)RNA酶的。然而，應(yīng)當(dāng)理解，使用RNA酶抑制劑并非是實(shí)施所公開的方法的絕對(duì)必要的條件。誘導(dǎo)mRNA產(chǎn)生文獻(xiàn)已經(jīng)指出，如果細(xì)菌內(nèi)的mRNA是靶標(biāo)，則其不易被確定(參見例如=C0Ieman et al. , "mRNA-targeted fluorescent in-situ hybridization (FISH)of Gram-negative bacteria without template amplification or tyramide signal amplification(對(duì)不用模板擴(kuò)增或酪胺信號(hào)放大的革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行的靶向于mRNA的熒光原位雜交 (FISH))，，，J. Microbiological Methods, 71 :246-255 (2007))) 這似乎在一定程度上是由于細(xì)菌內(nèi)的低拷貝數(shù)以及mRNA固有的不穩(wěn)定性。增加靶標(biāo)mRNA分子拷貝數(shù)的一個(gè)方法是誘導(dǎo)活細(xì)菌中mRNA的產(chǎn)生。因此，在一些實(shí)施方案中，在用針對(duì)mRNA的探針處理活細(xì)菌之前，用mRNA誘導(dǎo)劑處理所述活細(xì)菌一段時(shí)間來(lái)誘導(dǎo)所述細(xì)菌內(nèi)mRNA的產(chǎn)生?？梢栽诠潭?xì)菌之前進(jìn)行mRNA 誘導(dǎo)劑的處理。mRNA誘導(dǎo)劑的處理可以與其它方法(例如使用無(wú)RNA酶的試劑)聯(lián)合，以便在按照本文所公開的方法確定細(xì)菌和/或性狀之前，細(xì)菌中的mRNA靶標(biāo)基本不會(huì)降解。 應(yīng)當(dāng)理解，在一些情況下，(即使不誘導(dǎo))細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生足夠的可檢測(cè)的mRNA。因此，mRNA誘導(dǎo)并非是實(shí)施所公開的方法的絕對(duì)必要的條件。mRNA 穩(wěn)定化還可以使用mRNA穩(wěn)定劑來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞mRNA。因此，mRNA穩(wěn)定劑可用于實(shí)施本文所公開的方法。mRNA穩(wěn)定劑與mRNA誘導(dǎo)劑的不同之處在于mRNA穩(wěn)定劑保護(hù)細(xì)胞中存在的 mRNA,而mRNA誘導(dǎo)劑致使活細(xì)胞產(chǎn)生更多的mRNA。然而應(yīng)當(dāng)理解，這些作用并不是互相排斥的。也就是說(shuō)，一種試劑可能既是mRNA誘導(dǎo)劑又是mRNA穩(wěn)定劑。例如，某些抗生素可以既是mRNA誘導(dǎo)劑又是mRNA穩(wěn)定劑。然而，應(yīng)當(dāng)理解，使用mRNA穩(wěn)定劑不是實(shí)施所公開的方法的絕對(duì)必要的條件。固定細(xì)菌可以利用固定的細(xì)菌進(jìn)行全細(xì)胞分析。固定細(xì)菌是處理細(xì)菌細(xì)胞從而保存和/或制備用于顯微鏡分析的細(xì)菌細(xì)胞的過(guò)程。固定的細(xì)菌在分析之前可保存一段時(shí)間。常用的固定劑是多聚甲醛。其它常用的固定劑包括乙二醛、戊二醛、鋅鹽、加熱、醇 (甲醇和乙醇)、酸性溶液和以上中任何兩種或更多種的組合。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)將樣品與固定劑接觸來(lái)實(shí)施本文所公開的方法。用于固定細(xì)胞的常用過(guò)程被稱為火焰固定，該過(guò)程可以(或者也可以不)伴隨細(xì)菌與試劑的接觸。因此，利用可以(或可以不)包括樣品與試劑的接觸的固定步驟可以實(shí)施本文所公開的方法。任何固定劑均可以包含并非與固定嚴(yán)格相關(guān)的其它組分。例如，在一些實(shí)施方案中，可以向固定劑添加一種或多種探針。按照這樣的方式，可以同時(shí)進(jìn)行固定和探針/靶標(biāo)的形成。試劑的任何組合都是允許的，只要所述組合能像各種試劑在未組合時(shí)一樣實(shí)現(xiàn)預(yù)期目的。透化細(xì)菌通過(guò)細(xì)菌的透化過(guò)程，細(xì)胞膜/細(xì)胞壁被改變，使得進(jìn)行分析所需的試劑能穿入 (和穿出)所述細(xì)菌。細(xì)胞透化不同于固定，并且對(duì)于很多細(xì)菌種類而言，不需要進(jìn)行細(xì)胞透化。細(xì)胞透化劑的一些非限制性實(shí)例包括含有一種或多種酶的溶液/制劑，所述酶例如溶葡萄球菌素、溶菌酶和蛋白酶(例如蛋白酶K和/或無(wú)色肽酶)。為了透化細(xì)菌，可以將所述酶與樣品接觸，并由此部分消化細(xì)胞膜和/或細(xì)胞壁。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞透化劑是化學(xué)品、化學(xué)品與酶的混合物或用化學(xué)品和酶以任何順序相繼進(jìn)行的處理。因此，在一些實(shí)施方案中，可以將革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(例如葡萄球菌)與細(xì)胞透化劑接觸，從而允許正常情況下被細(xì)菌排斥(或緩慢穿入細(xì)菌)的試劑更自由地穿入細(xì)菌， 并進(jìn)而便于本文所描述的全細(xì)胞分析。透化的程度取決于為了實(shí)施特定的分析而必須穿入細(xì)胞的試劑的性質(zhì)。通常，隨著必須穿過(guò)細(xì)胞膜/細(xì)胞壁的分子的大小增加，必須進(jìn)行更高程度的透化。太低的細(xì)胞穿透性可能會(huì)導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果(參見=Pernthaler et al. ,"Simultaneous Fluorescence In Situ Hybridization of mRNA and rRNA in Environmental Bacteria (對(duì)環(huán)境細(xì)菌中的mRNA和rRNA同時(shí)進(jìn)行熒光原位雜交)”， Applied and Environmental Microbiology, 70(9) :5426-5433(2004 ^ 9 ^ ), H 5429 M 第2欄)。然而，細(xì)胞透化劑的過(guò)度處理可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的破壞(參見=Furukawa et al.，Microbes Environ.第231頁(yè)第1_2欄)。在下文第8部分列舉的幾篇參考文獻(xiàn)中討論了透化細(xì)菌細(xì)胞的各種方案。利用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)與本文所提供的公開內(nèi)容的聯(lián)合，技術(shù)人員能確定任何特定分析中透化細(xì)菌的合適條件。洗滌在全細(xì)胞分析中，通常在方法的一步或多步(或子步驟)之間進(jìn)行洗滌步驟，以去除在前面的步驟(或子步驟)中施加于樣品的一種或多種成分(或過(guò)量的成分)，從而準(zhǔn)備用于下一方法步驟(或子步驟)的樣品。洗滌試劑通常是包含鹽和/或去垢劑的緩沖溶液。在實(shí)踐中，洗滌試劑常被稱為洗滌緩沖液或洗滌溶液。多種洗滌試劑都可以購(gòu)買到。通常在樣品與探針接觸之后進(jìn)行洗滌步驟，以便未與其各自靶標(biāo)選擇性結(jié)合的過(guò)量探針被洗掉。然而，也有關(guān)于不用洗滌的基于ISH分析的報(bào)道(參見美國(guó)專利第 6，905，824號(hào))。是否需要洗滌步驟在一定程度上取決于分析中所用的固定劑以及探針的性質(zhì)和進(jìn)行確定的方式。
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擴(kuò)增技術(shù)本文所用的“擴(kuò)增技術(shù)”是指通過(guò)增加分析中可被確定的靶標(biāo)分子的數(shù)量或者通過(guò)增加來(lái)自標(biāo)簽的信號(hào)輸出來(lái)提高檢測(cè)方法的方法/技術(shù)。這些特定的擴(kuò)增技術(shù)因而分別被稱為靶標(biāo)擴(kuò)增或信號(hào)擴(kuò)增。靶標(biāo)擴(kuò)增如同所指出的，在靶標(biāo)擴(kuò)增中，靶標(biāo)分子的數(shù)量增加。常用靶標(biāo)擴(kuò)增技術(shù)是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其中例如通過(guò)使用引物對(duì)、熱穩(wěn)定聚合酶、三磷酸核苷酸以及使靶標(biāo)分子 (及其拷貝)變性和退火的熱循環(huán)過(guò)程使靶標(biāo)核酸(或其一部分)以指數(shù)方式復(fù)制。靶標(biāo)擴(kuò)增方法的其它非限制性實(shí)例包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、鏈置換擴(kuò)增(SDA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增(TMA)。信號(hào)擴(kuò)增在一些實(shí)施方案中，用標(biāo)簽的信號(hào)擴(kuò)增來(lái)提高方法的檢測(cè)限。簡(jiǎn)單而言，當(dāng)細(xì)胞 (即細(xì)菌)具有低拷貝數(shù)的特定靶標(biāo)并因而得到各自探針/靶標(biāo)復(fù)合物的數(shù)量較少時(shí)，通常會(huì)使用信號(hào)擴(kuò)增。尤其是當(dāng)確定(例如選定細(xì)菌或性狀的確定)是基于細(xì)菌染色時(shí)，如果細(xì)菌中探針/靶標(biāo)復(fù)合物的數(shù)量太低，可能不會(huì)產(chǎn)生足夠的信號(hào)。然而，如果與探針/靶標(biāo)復(fù)合物相聯(lián)的單標(biāo)簽的信號(hào)可被增加或擴(kuò)增多倍，則即便是細(xì)菌細(xì)胞中靶標(biāo)的拷貝數(shù)低， 也能進(jìn)行確定。有幾種可利用的信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)。信號(hào)擴(kuò)增可應(yīng)用于直接標(biāo)記技術(shù)和間接標(biāo)記技術(shù)。信號(hào)擴(kuò)增的一些非限制性實(shí)例包括酪胺信號(hào)擴(kuò)增(TSA，也被稱為催化信使沉積(CARD))、酶標(biāo)記熒光(ELF-97，產(chǎn)品和信息可獲自Invitrogen, Carlsbad, CA)、分支 DNA(bDNA)信號(hào)擴(kuò)增和滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)。使用這些信號(hào)擴(kuò)增技術(shù)來(lái)檢測(cè)細(xì)菌中低拷貝數(shù)靶標(biāo)的具體方法在下文第8部分列舉的數(shù)篇參考文獻(xiàn)中有更詳細(xì)的論述。5.本發(fā)明的各實(shí)施方案應(yīng)當(dāng)理解，步驟的順序或進(jìn)行某些操作的順序并不重要，只要本發(fā)明仍然是可實(shí)施的或者除非另行規(guī)定。而且，在一些實(shí)施方案中，兩個(gè)或多個(gè)步驟或操作可以同時(shí)進(jìn)行， 只要本發(fā)明仍然是可實(shí)施的或者除非另行規(guī)定。本發(fā)明尤其涉及確定樣品的細(xì)菌中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和選定的性狀的方法。 所述性狀可見于樣品的任何細(xì)菌中，包括選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌?？梢源_定樣品的革蘭氏陰性細(xì)菌中的所述性狀。然而通常，所選定的性狀通常與所選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有關(guān)的性狀(但是所述性狀也可見于革蘭氏陰性細(xì)菌中)。同樣，應(yīng)當(dāng)理解，本文所描述的方法并不限于確定每種樣品的一種選定的細(xì)菌和一種選定的性狀。恰恰相反，所述方法可用來(lái)確定樣品中的多種細(xì)菌和/或與樣品的細(xì)菌有關(guān)的多種性狀。在一些實(shí)施方案中，用多元分析確定所述多種細(xì)菌和/或多種性狀。所述多元分析可以涉及使用細(xì)菌的差異性染色，從而所述細(xì)菌表現(xiàn)出的不同染色可用來(lái)確定細(xì)菌類型和/或性狀。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的方法包括a)將樣品與i)能確定樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的針對(duì)細(xì)菌的探針和ii)能確定與選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、 mRNA和/或質(zhì)粒核酸的針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針接觸，其中所述樣品中的選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或其它細(xì)菌可具有所述選定的性狀。通常情況是懷疑樣品包含一種或多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。應(yīng)當(dāng)理解，所述樣品與子步驟i)和 )中的所述組分的接觸可以以任何順序來(lái)實(shí)施，或者所述接觸可以同時(shí)發(fā)生，所述接觸的順序并非意圖成為限制。所述方法還包括b)確定樣品中一種或多種選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌；和C)確定樣品中具有選定性狀的細(xì)菌。i)所述方法在全細(xì)胞(即完整的細(xì)胞)上實(shí)施；ii)步驟(b)和(C)以任意順序或同時(shí)進(jìn)行(即實(shí)施)；并且iii)針對(duì)染色體DNA的、 針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針中的每一種都包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽(即每種探針是單標(biāo)記探針或雙標(biāo)記探針)。在一些實(shí)施方案中，重點(diǎn)是確定樣品中具有選定性狀的細(xì)菌。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的方法包括將含有細(xì)菌的樣品與能確定與選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、 mRNA和/或質(zhì)粒核酸的針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針接觸，其中所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或其它細(xì)菌可具有所述選定的性狀。所述方法還包括確定所述樣品中具有所述選定性狀的細(xì)菌，其中i)所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施； 并且ii)所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA-和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針中的每一種都包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽。所述方法還包括將樣品與能確定所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的針對(duì)細(xì)菌的探針接觸，并確定所述樣品中一種或多種所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。按照這些不同的方法，選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或選定的性狀的確定分別涉及確定針對(duì)細(xì)菌的探針和針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針的探針/靶標(biāo)復(fù)合物的形成。在合適的結(jié)合條件下(或視具體情況為合適的雜交條件)完成探針/靶標(biāo)復(fù)合物的形成。在一些實(shí)施方案中，由于細(xì)菌染色的性質(zhì)，各自的探針/靶標(biāo)復(fù)合物的形成是明顯的。因此，對(duì)于這些實(shí)施方案，通過(guò)分析個(gè)體細(xì)菌的染色可以確定選定的細(xì)菌和/或選定的性狀。例如，可以用顯微鏡、載玻片掃描儀或流式細(xì)胞儀來(lái)監(jiān)測(cè)(確定) 個(gè)體細(xì)菌的染色?？梢栽诓皇褂脭U(kuò)增技術(shù)(例如與針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針連接的標(biāo)簽的信號(hào)擴(kuò)增或諸如原位PCR的靶標(biāo)擴(kuò)增技術(shù))的條件下實(shí)施這些方法?？梢栽诓粚悠放c細(xì)胞透化劑接觸的條件下實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方案中， (與針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針中的每種連接的)所述單標(biāo)簽包含最大發(fā)射小于650nm的熒光標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，可以僅用針對(duì)mRNA的探針實(shí)施這些方法，其中所述探針能確定選定的性狀。在一些實(shí)施方案中，僅使用單一針對(duì)mRNA的探針來(lái)確定性狀，或者使用單一針對(duì)mRNA的探針來(lái)確定每一種目的性狀(即每種性狀一種探針，從而如果有三種目的性狀，則使用三種探針)。在一些實(shí)施方案中，可以用針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的混合物實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)mRNA的探針都包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽(即每種探針是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針)。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽是最大發(fā)射小于650nm 的熒光標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針都包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽(即每種探針是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針)。在一些實(shí)施方案中，在沒(méi)有對(duì)所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針的標(biāo)簽進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施所述方法。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)染色體 DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針都包含單一標(biāo)簽，并且在沒(méi)有對(duì)所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針的所述單一標(biāo)簽進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施所述方法。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是基于抗體的。因此，每種探針的靶標(biāo)是存在于選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的表面上或內(nèi)部的抗原。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)rRNA的。因此，每種探針的靶標(biāo)是存在于選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的rRNA內(nèi)的核堿基序列。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)mRNA的。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)調(diào)節(jié)性RNA的(例如sRNA或aRNA)。因此，每種探針的靶標(biāo)分別是mRNA或調(diào)節(jié)性RNA(例如sRNA或aRNA)的(或內(nèi)部的)核堿基序列。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是用標(biāo)簽標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)細(xì)菌的探針是用單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽標(biāo)記的(即每種探針是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針)。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽是發(fā)熒光的，并且最大發(fā)射小于650nm。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽中的一種或多種是發(fā)熒光的，并且最大發(fā)射為650nm或更高。在一些實(shí)施方案中，上文所述第一種方法的實(shí)施還包括根據(jù)步驟(b)和(C)中的分析來(lái)確定樣品中也具有選定性狀的任何選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌?！安襟E(b)和(C)的分析”是指分析步驟(b)和(c)中所做的確定，在這種情況下，通過(guò)運(yùn)用推理，所述確定可以引導(dǎo)技術(shù)人員識(shí)別出樣品中哪種選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌也具有所述選定的性狀。應(yīng)當(dāng)理解，并非樣品中的所有選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌都具有選定的性狀(實(shí)際上可能選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌都不具有選定的性狀)。例如，樣品可以是混合群體，因此既包含具有選定性狀的選定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌也包含不具有選定性狀的選定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，所有或幾乎所有選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有選定的性狀。在一些實(shí)施方案中，可以在利用或不利用各種其它步驟和/或試劑的條件下實(shí)施這些方法。例如，可以通過(guò)將樣品與一種或多種洗滌試劑接觸來(lái)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。 在一些實(shí)施方案中，將樣品與固定劑接觸。在一些實(shí)施方案中，將樣品與細(xì)胞透化劑接觸。 在一些實(shí)施方案中，將樣品與mRNA誘導(dǎo)劑接觸。在一些實(shí)施方案中，mRNA誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)與選定的性狀相關(guān)的非表面蛋白的產(chǎn)生，所述非表面蛋白能提高所述選定性狀的分析的靈敏度和和/或準(zhǔn)確性。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，可以將兩種或更多種上述試劑應(yīng)用于同一樣品，每種試劑與樣品接觸一次或多次?？梢砸匀魏雾樞?或同時(shí))進(jìn)行樣品與各種試劑的接觸，只要能允許準(zhǔn)確確定選定的細(xì)菌和/或性狀。在一些實(shí)施方案中，可以以無(wú)RNA酶的分析形式進(jìn)行這些方法。通常，這涉及用抑制RNA酶活性的試劑處理用來(lái)與樣品接觸的所有試劑。同樣，樣品本身可以與抑制RNA酶活性的相同或不同的試劑接觸。在一些實(shí)施方案中，省略了一個(gè)或多個(gè)常用步驟。例如，在雜交分析中，在將樣品與雜交探針接觸之前通常進(jìn)行預(yù)雜交步驟。在本發(fā)明中使用一種或多種雜交探針的一些實(shí)施方案中，所述方法在沒(méi)有預(yù)雜交步驟的條件下進(jìn)行。當(dāng)使用抗體探針時(shí)，在將樣品與所述抗體探針接觸之前通常進(jìn)行(或不進(jìn)行)封閉步驟，但是該步驟可以省略。在一些實(shí)施方案中，省略了細(xì)胞透化步驟。在一些實(shí)施方案中，省略了洗滌步驟。實(shí)際上，任何常用步驟都可以省略，只要省略后不會(huì)導(dǎo)致所述方法不能產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，所有探針都是標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，所有的標(biāo)簽都是熒光標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，可以以原位雜交(ISH)分析的形式進(jìn)行這些方法，因?yàn)樗械奶结樁际请s交探針(即它們與其各自的靶標(biāo)雜交)。在一些實(shí)施方案中，所有的探針都是雜交探針，并且所有的標(biāo)簽都是熒光標(biāo)簽。在這種情況下，所述方法是熒光原位雜交(FISH) 分析的形式。在一些實(shí)施方案中，所述選定的性狀可以與1)抗生素抗性、幻毒素產(chǎn)生和/或3) 毒力相關(guān)。例如，所述選定的性狀可以分別與細(xì)菌的l)mecA基因或vanA或vanB基因、2) tcdB基因和/或;3)lukF和IukS基因的存在相關(guān)。因此，可以通過(guò)分別確定選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(或樣品的其它細(xì)菌)中DmecA基因或vanA或vanB基因、2)tcdB基因和/或 3) IukF和IukS基因的存在來(lái)確定選定的性狀。在一些實(shí)施方案中，可以確定多種選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或選定的性狀。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)多元化來(lái)實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)對(duì)樣品進(jìn)行再探測(cè)循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，可以通過(guò)多元化和對(duì)樣品進(jìn)行再探測(cè)循環(huán)來(lái)實(shí)現(xiàn)這點(diǎn)。因此，在一些實(shí)施方案中，這些方法還包括將樣品與以下接觸1)能確定樣品中第二選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的第二針對(duì)細(xì)菌的探針；和/或幻能確定與第二選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/或質(zhì)粒核酸的第二針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針，所述樣品的任何細(xì)菌(包括(第一)選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或第二選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)可具有所述第二選定的性狀。在一些實(shí)施方案中，更具體而言，本發(fā)明涉及確定樣品中的一種或多種抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNQ和/或甲氧苯青霉素敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)。如在上文的“引言”中提出的，特別是能有效確定臨床樣品中的抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)以及任選的其它抗甲氧苯青霉素的細(xì)菌(例如抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNS)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA))在很多病患醫(yī)療領(lǐng)域內(nèi)是至關(guān)重要的。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的方法包括a)將樣品與i)能確定樣品中的金黃色葡萄球菌的針對(duì)細(xì)菌的探針和ii)能確定樣品中細(xì)菌的甲氧苯青霉素抗性的針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針接觸。通常的情況是懷疑樣品包含一種或多種抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)。應(yīng)當(dāng)理解，所述的樣品與步驟a)中所述組分的接觸，即子步驟i)和ii)，可以以任何順序來(lái)實(shí)施，或者所述接觸可以同時(shí)發(fā)生，所述接觸的順序并非意圖成為限制。所述方法還包括b)確定樣品中的一種或多種金黃色葡萄球菌(即選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)；以及c)確定樣品中具有甲氧苯青霉素抗性(即性狀)的一種或多種細(xì)菌?？梢酝ㄟ^(guò)確定在合適的結(jié)合條件(或者視具體情況為合適的雜交條件) 下，探針與細(xì)菌中其各自靶標(biāo)之間探針/靶標(biāo)復(fù)合物的形成來(lái)做出所述確定。所述方法i)在全細(xì)胞(即完整的細(xì)胞)上實(shí)施，并且ii)步驟(b)和(C)以任意順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。每種針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針包含單一標(biāo)簽或雙重標(biāo)簽(即每種探針都是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針)不是所述方法的必要條件(但是可以是任選的限制)。在一些實(shí)施方案中，重點(diǎn)在于確定樣品中具有選定性狀(即甲氧苯青霉素抗性) 的細(xì)菌。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的方法包括將樣品與能確定樣品中細(xì)菌的甲氧苯青霉素抗性的針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針接觸，并確定所述樣品中具有甲氧苯青霉素抗性的一種或多種細(xì)菌，其中，所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施。所述細(xì)菌可以是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。所述方法還可以包括將樣品與能確定樣品中的金黃色葡萄球菌的針對(duì)細(xì)菌的探針接觸，并確定所述樣品中的一種或多種金黃色葡萄球菌?？梢栽跊](méi)有對(duì)與針對(duì)染色體DNA-和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針連接的標(biāo)簽進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施這些方法。然而，如果針對(duì)染色體DNA-和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的每一種都包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽，則所述標(biāo)簽可以是發(fā)熒光的，并且最大發(fā)射可以小于、等于或大于650nm。在一些實(shí)施方案中，可以在不使用任何擴(kuò)增技術(shù)的條件下實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方案中，可以在不將樣品與細(xì)胞透化劑接觸的條件下實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方案中，可以僅用針對(duì)mRNA的探針實(shí)施這些方法，其中所述探針能確定與甲氧苯青霉素抗性相關(guān)的mRNA。在一些實(shí)施方案中，僅使用一種針對(duì)mRNA的探針來(lái)確定甲氧苯青霉素抗性。在一些實(shí)施方案中，使用兩種或更多種針對(duì)mRNA的探針來(lái)確定甲氧苯青霉素抗性(即針對(duì)mRNA的探針的混合物，該探針的每種都可以用一種或兩種標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記)。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)mRNA的探針包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽(即每種探針是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針)。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽是發(fā)熒光的，并且最大發(fā)射小于、等于或大于650nm。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽(即每種探針是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針)。在一些實(shí)施方案中，可以在沒(méi)有對(duì)所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的標(biāo)簽進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽(即每種探針是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針)，并且在沒(méi)有對(duì)所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的單一標(biāo)簽進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施所述方法。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針包含一種或多種標(biāo)簽，并且在沒(méi)有對(duì)所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的標(biāo)簽進(jìn)行(直接或間接的)信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施這些方法。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是基于抗體的。因此，每種探針的靶標(biāo)是存在于選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的表面上或內(nèi)部的抗原。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)rRNA的。因此，每種探針的靶標(biāo)是存在于選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的rRNA內(nèi)的核堿基序列。適用于確定臨床樣品中的金黃色葡萄球菌的針對(duì)rRNA的探針是可購(gòu)買到的，并且描述其用途的研究在Rarest et al. , “Impact of rapid in situ hybridization testing on coagulase-negative staphylococci positive blood cultures (快速原位雜交檢測(cè)對(duì)凝固酶陰性葡萄球菌陽(yáng)性的血液培養(yǎng)物的影響)”，Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58 :154-158(2006) 中進(jìn)行了論述。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)mRNA的或針對(duì)其它調(diào)節(jié)性 RNA (例如sRNA或aRNA)。因此，每種探針的靶標(biāo)分別是mRNA或調(diào)節(jié)性RNA (例如sRNA或 aRNA)的(或其內(nèi)部的)核堿基序列。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針是用標(biāo)簽標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，每種針對(duì)細(xì)菌的探針是用單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽標(biāo)記的(即每種探針都是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針)。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽是發(fā)熒光的，并且最大發(fā)射小于650nm。在一些實(shí)施方案中，所述標(biāo)簽的一種或多種是發(fā)熒光的，并且最大發(fā)射為650nm或更高。在一些實(shí)施方案中，特別涉及甲氧苯青霉素抗性確定的第一種公開方法的實(shí)施還包括根據(jù)步驟(b)和(c)的分析來(lái)確定樣品中的任何抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌。 “步驟(b)和(c)的分析”是指分析步驟(b)和(c)中所做的確定，在這種情況下，通過(guò)運(yùn)用推理，所述確定可以引導(dǎo)技術(shù)人員識(shí)別出樣品中哪些金黃色葡萄球菌是抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)。應(yīng)當(dāng)理解，在一些樣品中，并不是樣品中所有的金黃色葡萄球菌都具有甲氧苯青霉素抗性。例如，樣品可以是混合群體，并且因而包含抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌 (MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNQ和/或甲氧苯青霉素敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)。如同GrSbneret al.在第1691頁(yè)第1欄所指出的，BD GeneOhm StaphSR分析無(wú)法區(qū)別包含MRSA和MSSA混合群體的樣品。而這正是本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)榭梢源_定個(gè)體細(xì)菌的類型和性狀，利用本文所公開的全細(xì)胞方法可以正確地表征混合群體 (參見例如實(shí)施例10)。在一些實(shí)施方案中，樣品中所有或幾乎所有的細(xì)菌都是抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)。在一些實(shí)施方案中，樣品中的細(xì)菌都不是抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)，在這種情況下，可以改變患者(樣品來(lái)源)的治療方案，以降低住院費(fèi)用(還參見 Forrest et al.)。在一些實(shí)施方案中，可以在利用或不利用各種其它步驟和/或試劑的條件下實(shí)施這些方法。例如，通過(guò)將樣品與一種或多種洗滌試劑接觸可能進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。在一些實(shí)施方案中，將樣品與固定劑接觸。在一些實(shí)施方案中，將樣品與細(xì)胞透化劑接觸。在一些實(shí)施方案中，將樣品與mRNA誘導(dǎo)劑接觸。在一些實(shí)施方案中，mRNA誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)與選定的性狀相關(guān)的非表面蛋白的產(chǎn)生，所述非表面蛋白能提高所述選定性狀的分析的靈敏度和和/或準(zhǔn)確性。應(yīng)當(dāng)理解，在一些實(shí)施方案中，可以將兩種或更多種上述試劑應(yīng)用于同一樣品，每種試劑與樣品接觸一次或多次?？梢砸匀魏雾樞?或同時(shí))進(jìn)行樣品與各種試劑的接觸，只要允許準(zhǔn)確確定選定的細(xì)菌和/或性狀。在一些實(shí)施方案中，可以以無(wú)RNA酶的分析形式進(jìn)行這些方法。通常，這涉及用抑制RNA酶活性的試劑處理用來(lái)與樣品接觸的所有試劑。同樣，樣品本身也可以與抑制RNA 酶活性的相同或不同的試劑接觸。在一些實(shí)施方案中，省略了一個(gè)或多個(gè)常用步驟。例如，在雜交分析中，在將樣品與雜交探針接觸之前通常進(jìn)行預(yù)雜交步驟。在本發(fā)明中使用一種或多種雜交探針的一些實(shí)施方案中，所述方法在沒(méi)有預(yù)雜交步驟的條件下進(jìn)行。當(dāng)使用抗體探針時(shí)，在將樣品與所述抗體探針接觸之前通常進(jìn)行(或不進(jìn)行)封閉步驟，但是該步驟可以省略。在一些實(shí)施方案中，省略了細(xì)胞透化步驟。在一些實(shí)施方案中，省略了洗滌步驟。實(shí)際上，任何常用步驟都可以省略，只要省略后不會(huì)導(dǎo)致所述方法不能產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果。在一些實(shí)施方案中，所有探針都是標(biāo)記的。在一些實(shí)施方案中，所有的標(biāo)簽都是熒光標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，可以以原位雜交(ISH)分析的形式進(jìn)行這些方法，因?yàn)樗械奶结樁际请s交探針(即它們與其各自的靶標(biāo)雜交)。在一些實(shí)施方案中，所有的探針都是雜交探針，并且所有的標(biāo)簽都是熒光標(biāo)簽。在這種情況下，所述方法是熒光原位雜交(FISH) 分析的形式。
在一些實(shí)施方案中，特別涉及甲氧苯青霉素抗性確定的第一種公開方法的實(shí)施還包括α)將樣品與能確定所述樣品中的凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)的第二針對(duì)細(xì)菌的探針接觸，其中所述第二針對(duì)細(xì)菌的探針可獨(dú)立于與能鑒定所述樣品中的金黃色葡萄球菌的針對(duì)細(xì)菌的標(biāo)記探針進(jìn)行檢測(cè)；β)確定所述樣品中的凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)(例如， 常見的皮膚細(xì)菌表皮葡萄球菌(S.印idermidis)，其是一種不同于金黃色葡萄球菌的葡萄球菌)；以及X)根據(jù)步驟(β)和(c)及任選的步驟(b)的分析，確定所述樣品中的抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNS)?！安襟E(β)和(c)及任選的步驟(b)的分析”是指分析步驟(β)和(c)及任選的步驟(b)所做的確定，在這種情況下，通過(guò)運(yùn)用推理，所述確定可以引導(dǎo)技術(shù)人員識(shí)別出樣品中哪些細(xì)菌是抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNS)。在一些實(shí)施方案中，在同一樣品中確定抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA) 和抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNS)。在一些實(shí)施方案中，在同一樣品中確定抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌 (MR-CNS)或甲氧苯青霉素敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)。在一些實(shí)施方案中，確定樣品中抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌 (MR-CNS)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)的混合群體(參見實(shí)施例 10)。在一些實(shí)施方案中，該確定可以同時(shí)進(jìn)行。(以多元形式進(jìn)行的)這類分析的一個(gè)實(shí)例可見實(shí)施例3。利用圖3(如實(shí)施例3中論述)中的圖像對(duì)細(xì)菌和性狀的確定可以是自動(dòng)化的，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言應(yīng)當(dāng)是顯而易見的。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括根據(jù)步驟(b)、(β)、(C)和(X)的分析，將樣品表征為對(duì)抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)和/或抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNS)是異質(zhì)的還是同質(zhì)的?！安襟E(b)、(β)、(c)和(χ)的分析”是指分析步驟(b)、(β)、(C)和(χ)中所做的確定，在這種情況下，通過(guò)運(yùn)用推理，所述確定可以引導(dǎo)技術(shù)人員識(shí)別出樣品中抗甲氧苯青霉素的細(xì)菌對(duì)于甲氧苯青霉素抗性性狀而言是異質(zhì)的還是同質(zhì)的。在實(shí)踐中，可以通過(guò)確定樣品中選定細(xì)菌所表現(xiàn)出的染色量(例如強(qiáng)度)，而在選定性狀的發(fā)面與樣品中其它選定的細(xì)菌進(jìn)行比較。如果不同選定的細(xì)菌在選定性狀方面的染色強(qiáng)度基本相同，則樣品的不同細(xì)菌中性狀的表達(dá)是同質(zhì)的。然而，如果樣品的不同細(xì)菌之間各選定的細(xì)菌相對(duì)于選定性狀方面的染色強(qiáng)度不同，則樣品的不同細(xì)菌中性狀的表達(dá)是異質(zhì)的。此外，在一些實(shí)施方案中，確定樣品對(duì)于MRSA而言是異質(zhì)的還是同質(zhì)的需要(或者至少可優(yōu)選地)參考其它測(cè)試，例如，樣品的細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)，其中每種不同的培養(yǎng)基包含不同濃度的抗生素。以這種方式，可以基于培養(yǎng)基中不同抗生素水平時(shí)的集落數(shù)而確定樣品的選定細(xì)菌表現(xiàn)出不同水平的甲氧苯青霉素抗性性狀的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，這些方法還可以包括將所述樣品與mRNA誘導(dǎo)劑接觸。在一些實(shí)施方案中，這些方法還可以包括用RNA酶抑制劑處理所述樣品。在一些實(shí)施方案中，不進(jìn)行預(yù)雜交步驟。在一些實(shí)施方案中，所有的標(biāo)簽都是熒光標(biāo)簽，且所述方法是熒光原位雜交 (FISH)分析。在一些實(shí)施方案中，直接確定所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針是PNA。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的長(zhǎng)度為10至20個(gè)核堿基子單元。在一些實(shí)施方案中，使用信號(hào)擴(kuò)增來(lái)直接或間接對(duì)所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì) mRNA的標(biāo)記探針的標(biāo)簽的信號(hào)進(jìn)行擴(kuò)增。申請(qǐng)人:驚奇地發(fā)現(xiàn)，在不進(jìn)行細(xì)胞透化步驟的情況下就可以實(shí)施本文所公開的各種方法。因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的方法包括a)將樣品與以下接觸i)能確定所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的針對(duì)細(xì)菌的探針和ii)能確定與選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/或質(zhì)粒核酸的針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針，所述樣品中所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或其它細(xì)菌可具有所述選定的性狀。所述方法還包括b)確定所述樣品中一種或多種所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，以及 c)確定所述樣品中具有所述選定性狀的細(xì)菌；其中，i)所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施；ii)步驟 (b)和(c)以任意順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行；以及iii)在不用細(xì)胞透化劑處理樣品的情況下實(shí)施所述方法。在一些實(shí)施方案中，在不進(jìn)行任何信號(hào)擴(kuò)增的情況下實(shí)施所述方法。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)細(xì)菌的探針和針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針中的每一種包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽，并且通過(guò)直接檢測(cè)所述標(biāo)簽進(jìn)行所述確定。在一些實(shí)施方案中，可以實(shí)施所述方法來(lái)確定金黃色葡萄球菌和甲氧苯青霉素抗性。因此，步驟(a)更具體涉及a)將樣品與以下接觸i)能確定所述樣品中的金黃色葡萄球菌的針對(duì)細(xì)菌的探針和ii)能確定所述樣品中細(xì)菌的甲氧苯青霉素抗性的針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針。同樣地，步驟(b)和(c)更具體涉及b)確定所述樣品中的一種或多種金黃色葡萄球菌；以及c)確定所述樣品中具有甲氧苯青霉素抗性的一種或多種細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，所述方法集中于確定樣品中細(xì)菌的性狀。因此，在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將含有細(xì)菌的樣品與能確定與選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/ 或質(zhì)粒核酸的針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針接觸，所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或其它細(xì)菌可具有所述選定的性狀；以及確定所述樣品中具有所述選定性狀的細(xì)菌，其中，i)所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施；以及ii)在沒(méi)有用細(xì)胞透化劑處理樣品的情況下實(shí)施所述方法。本發(fā)明的實(shí)施方案還涉及用于確定選定的性狀和/或選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的探針混合物、組合物和/或制劑。在一些實(shí)施方案中，所述混合物中每種所述針對(duì)mRNA的探針是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針。例如，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含兩種或更多種針對(duì)mRNA的探針的混合物、組合物和/或制劑，所述針對(duì)mRNA的探針能確定已知存在于樣品的選定細(xì)菌中、選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中和/或其它細(xì)菌中的選定性狀。所述針對(duì) mRNA的探針能與所述細(xì)菌的mRNA分子內(nèi)與所述選定的性狀相關(guān)的靶標(biāo)特異性地結(jié)合。所述混合物還可以包含一種或多種針對(duì)細(xì)菌的探針(例如能確定樣品中的選定細(xì)菌的針對(duì) rRNA的針對(duì)細(xì)菌的探針)。針對(duì)mRNA的探針和/或針對(duì)細(xì)菌的探針可以是PNA探針。所述混合物、組合物和/或制劑可以例如用在本文所公開的方法的雜交(接觸)步驟中，使得樣品與所述混合物、組合物或制劑的接觸產(chǎn)生能被確定的探針/靶標(biāo)復(fù)合物，從而視具體情況能指示細(xì)菌的類型和性狀。
6.本發(fā)明實(shí)施方案的其它優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明的一些實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)是可以利用全細(xì)胞分析形式來(lái)有效確定單一樣品中的選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和細(xì)菌中的選定的性狀(無(wú)論選定的性狀與選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌是否相關(guān))。通過(guò)利用全細(xì)胞分析形式，尤其能夠1)保持細(xì)胞形態(tài)的信息并進(jìn)而確認(rèn)諸如細(xì)菌種類的信息(即確認(rèn)所確定的選定細(xì)菌具有預(yù)期的細(xì)胞形態(tài))；幻確定樣品是否包含目的細(xì)菌的混合群體，3)確定樣品對(duì)于選定的細(xì)菌或選定的性狀是異質(zhì)的還是同質(zhì)的；和/或4)對(duì)樣品中各種類型的細(xì)菌進(jìn)行定量(絕對(duì)定量或相對(duì)于樣品中的其它細(xì)菌進(jìn)行定量)。例如，可以基于分析中待確定的特征而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行差異性染色，從而在多元形式中實(shí)現(xiàn)以上情況。所述方法還允許確定步驟的自動(dòng)化(包括多元實(shí)施模式的自動(dòng)化)，從而通過(guò)運(yùn)行算法來(lái)獲得結(jié)果。申請(qǐng)人:已經(jīng)證實(shí)，在一些實(shí)施方案中，利用單標(biāo)記的探針和/或雙標(biāo)記的探針(該探針可以是通過(guò)從頭合成方法產(chǎn)生的短探針(長(zhǎng)度為10-20個(gè)子單元))而不利用1)酶處理的細(xì)胞透化、幻擴(kuò)增技術(shù)(例如信號(hào)擴(kuò)增或靶標(biāo)擴(kuò)增)和/或幻最大發(fā)射至少為650nm 的熒光標(biāo)簽就能確定完整革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中的mRNA。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)mRNA的探針的混合物可用來(lái)增強(qiáng)信號(hào)，其中預(yù)計(jì)細(xì)菌中的mRNA靶標(biāo)的數(shù)量非常低。另外的優(yōu)點(diǎn)是，在一些實(shí)施方案中，可以利用通過(guò)從頭合成制備的短探針(與通過(guò)酶學(xué)方法制備的轉(zhuǎn)錄物探針相比)來(lái)確定細(xì)菌中的mRNA靶標(biāo)。此外，在一些實(shí)施方案中，與下文列出的多篇參考文獻(xiàn)所述的5-16小時(shí)相比，可以將探針雜交步驟縮短至少于2 小時(shí)。實(shí)際上，科技文獻(xiàn)已經(jīng)承認(rèn)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中檢測(cè)mRNA的難度(參見上文“引言”部分中以下文章的相關(guān)論述Hahn et al. ,"Detection of mRNA in Streptomyces Cells by Whole-Cell Hybridization with Digoxigenin-Labeled Probes (通過(guò)利用地高辛標(biāo)記的探針的全細(xì)胞雜交檢測(cè)鏈霉菌細(xì)胞中的mRNA) ”，Applied and Environmental Microbiology,59(8) :2753-2757 (Aug. 1993) ；Wagner et al. ,"In situ detection of a virulence factor mRNA and 16S rRNA in Listeria(對(duì)利斯塔氏菌屬中的毒力因子 mRNA 和 16S rRNA 的原位檢測(cè))”，F(xiàn)EMS Microbiol. Lett.，160(1) 159-168 (Mar. 1998)；禾口 Honerlage et al. ,"Detection of mRNA of nprM in Bacillus megaterium ATTC 14581 grown in soil by whole-cell hybridization(通過(guò)全細(xì)胞雜交檢測(cè)土壤中生長(zhǎng)的巨大芽孢桿菌 ATTC 14581 中的 nprM mRNA) Arch. Microbiol.，163 :235-241 (1995)) 盡管所述文獻(xiàn)涵蓋了關(guān)于對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌進(jìn)行全細(xì)胞分析的普遍難題的多篇報(bào)道(以及盡管確定抗甲氧苯青霉素的細(xì)菌(例如MRSA)具有臨床意義)，但是似乎還沒(méi)有任何用于確定MRSA和/或MR-CNS的全細(xì)胞分析的實(shí)例。其原因可能在于，在完整的金黃色葡萄球菌中確定甲氧苯青霉素抗性性狀的證據(jù)是非常難的。盡管如此，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能在全細(xì)胞分析形式中，利用針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針(與用于選定細(xì)菌的探針聯(lián)合)確定樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌(視具體情況包括MRSA和MR-CNS)中的甲氧苯青霉素抗性性狀?？紤]到具有MRSA的患者在醫(yī)院中的傳播和治療，本方法作為臨床分析可以發(fā)揮很大的功效。全細(xì)胞分析形式的優(yōu)點(diǎn)是能基于對(duì)樣品的肉眼檢查分析而確定樣品中細(xì)菌的異質(zhì)性/同質(zhì)性。因此，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是能通過(guò)實(shí)施本文所公開的方法而確定樣品中細(xì)菌性狀的異質(zhì)性/同質(zhì)性。對(duì)于其在患者醫(yī)療方面的臨床意義而言，本優(yōu)點(diǎn)在確定樣品中細(xì)菌的甲氧苯青霉素抗性的異質(zhì)性/同質(zhì)性方面被證實(shí)是特別有用的。
7.實(shí)施例根據(jù)以下的實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的各個(gè)方面，這些實(shí)施例不應(yīng)當(dāng)解釋為以任何方式限制本說(shuō)明書的范圍。實(shí)施例1 :MRSA的確定除非另外指出，所有的步驟都在室溫(RT)下進(jìn)行。雜交緩沖液(HB)、洗滌緩沖液 (WB)、多聚甲醛(PAF)、無(wú)RNA酶的透化溶液(PS)、封片劑(MM)的組成以及對(duì)各種細(xì)菌菌株 (例如金黃色葡萄球菌和其它葡萄球菌菌株)、在實(shí)施例1-4中所用的PNA探針和熒光顯微鏡(FM)的描述提供在附錄I (下文)中。細(xì)胞生長(zhǎng)、固定和透化將金黃色葡萄球菌接種于胰酶大豆肉湯(TSB)中，并于37°C過(guò)夜生長(zhǎng)(16小時(shí))。 然后用0. 5 μ g/mL苯唑西林在用TSB稀釋(10倍)的過(guò)夜培養(yǎng)物中誘導(dǎo)MecA mRNA產(chǎn)生。 將苯唑西林誘導(dǎo)的細(xì)胞在無(wú)菌的2%葡萄糖溶液中稀釋(20倍)，并通過(guò)細(xì)胞離心使其沉降于玻璃載玻片上。將沉降的細(xì)胞用10%多聚甲醛(PAF)固定30分鐘(min)。然后，用含有0. IM甘氨酸的磷酸鹽緩沖溶液(PBS，IOmM磷酸鹽，pH = 7. 4，0.9% NaCl)將自由醛基封閉30分鐘。然后用含有0.05%吐溫20 (PBS-吐溫)的PBS漂洗載玻片，并風(fēng)干。然后將 0. 075mL無(wú)RNA酶的透化溶液(PS)加到沉積的細(xì)胞上，并孵育30分鐘。孵育之后，用70% 的甲醇漂洗細(xì)胞，并風(fēng)干。熒光原位雜交和熒光顯微鏡然后將25 μ L含有PNA探針(探針濃度參見下文)的雜交緩沖液(HB)加到載玻片上，并蓋上蓋玻片。然后使細(xì)胞在雜交室內(nèi)于55°C下雜交2小時(shí)。雜交之后，在55°C下用洗滌緩沖液(WB)將載玻片洗滌30分鐘。將一滴含有1 μ g/mL 4'-6- 二脒-2-苯基吲哚 (DAPI)的封片劑(MM)和一個(gè)蓋玻片加到干燥的樣本上，然后利用FM檢驗(yàn)沉降在載玻片的細(xì)胞。探針濃度1) 5種熒光素標(biāo)記的PNA探針的混合物(探針1、2、3、4和5 (參見以下的表1)，濃度分別為220、觀0、120、95和79碰)。探針的總濃度是794nM。(載玻片A和C)2)單一熒光素標(biāo)記的、大腸桿菌特異性的、針對(duì)rRNA的探針(探針6，濃度為 750nM)。其用作對(duì)照探針。(載玻片B)3)單一熒光素標(biāo)記的PNA探針(探針2，濃度為750nM)。(載玻片D)4)單一熒光素標(biāo)記的PNA探針(探針2，濃度為300nM)混合生物素標(biāo)記的*PNA探針(探針7，濃度為5000nM)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中使用16. 6倍過(guò)量的未標(biāo)記探針，以證明雜交的特異性。(載玻片E)*在這種情況下，探針被附帶地標(biāo)記上生物素。因?yàn)樗龇治鍪且訤ISH分析的形式來(lái)進(jìn)行，并且生物素是不發(fā)熒光的，所以該探針未標(biāo)記探針的功能等同物。從FM分析獲取的圖像提供在

圖1中，該圖含有從5個(gè)載玻片(載玻片A_E)獲取的圖像。載玻片中一些(但不是所有)可見的集落被圓圈圈住(參見載玻片C和D的被圓圈圈住的部分)。當(dāng)提供的圖是黑白版本而不是彩色版本時(shí)，這應(yīng)當(dāng)有助于對(duì)載玻片的分析。在圖1中進(jìn)行檢查的每個(gè)載玻片的條件如下A)MSSA 29213，用 5 種 PNA 探針(探針 1-5)探測(cè)；B) MRSA 43300，用針對(duì)大腸桿菌的探針(探針6)探針；OMRSA 43300，用 5 種 PNA 探針(探針 1-5)探測(cè)；D) MRSA 43300，用單一 PNA 探針(探針 2)探測(cè)；E)MRSA 43300，在16. 6倍過(guò)量的生物素標(biāo)記的探針2 (即探針7)存在下，用單一 PNA探針(探針2)探測(cè)。結(jié)果參照?qǐng)D1來(lái)討論本實(shí)施例的結(jié)果。在載玻片C和D中觀察到綠色熒光細(xì)菌。該結(jié)果符合用一種PNA探針(載玻片D)或多種PNA探針(載玻片C)處理的(接觸的)MRSA細(xì)菌的存在。在載玻片A中沒(méi)有觀察到細(xì)菌，其中葡萄球菌的細(xì)菌菌株(MSSA)不含有MecA基因(載玻片A)。用針對(duì)rRNA靶標(biāo)的探針處理的MRSA細(xì)菌沒(méi)有觀察到信號(hào)，已知所述rRNA 靶標(biāo)與大腸桿菌相關(guān)(載玻片B)。用標(biāo)記的針對(duì)mRNA的探針(探針2、和遠(yuǎn)遠(yuǎn)過(guò)量的生物素標(biāo)記(在功能上為未標(biāo)記的)的相同探針(探針7)處理的MRSA細(xì)菌沒(méi)有觀察到信號(hào) (參見載玻片E)。實(shí)施例2 金黃色葡萄球菌的PNA FISH除了以下指出的之外，細(xì)胞生長(zhǎng)、固定和細(xì)胞透化按照實(shí)施例1中所描述的進(jìn)行。熒光原位雜交和熒光顯微鏡將25yL HB加到載玻片上，并蓋上蓋玻片，所述HB含有一種四甲基羅丹明 (TAMRA)-標(biāo)記的、金黃色葡萄球菌特異性的、針對(duì)rRNA的探針(探針8，濃度為500nM)以及5種熒光素標(biāo)記的PNA探針(探針1-5，濃度如實(shí)施例1所述)。其余步驟按實(shí)施例1中所述進(jìn)行。從FM分析獲取的圖像提供在圖2的載玻片A1、A2、B1和B2中。載玻片中一些 (但不是所有)可見的集落用圓圈(載玻片A)或方框(載玻片B)圈住。當(dāng)提供的圖是黑白版本而不是彩色版本時(shí)，這應(yīng)當(dāng)有助于對(duì)載玻片的分析。在圖像A-I和A-2中，相同的集落被圈在一起以簡(jiǎn)化比較。在圖2中進(jìn)行檢查的每個(gè)載玻片的條件如下A-DMRSA 43300，雙帶濾光片B-DMSSA四213，雙帶濾光片A-2) MRSA 43300，F(xiàn)ITC 濾光片B-2) MSSA 四213，F(xiàn)ITC 濾光片結(jié)果參照?qǐng)D2來(lái)討論本實(shí)施例的結(jié)果。根據(jù)TAMRA標(biāo)記的探針8與其rRNA靶標(biāo)的雜交，載玻片A-I和B-I中紅色熒光染色的細(xì)菌證實(shí)金黃色葡萄球菌的存在。該結(jié)果是預(yù)期到的，因?yàn)镸RSA和MSSA都是葡萄球菌。根據(jù)探針1-5與其各自靶標(biāo)的雜交，載玻片A-2中綠色熒光染色的細(xì)菌提示MRSA的存在。A-I和A-2中的圖像來(lái)自同一載玻片(使用不同的濾光片設(shè)置，即紅色或綠色)，并且?guī)缀鮼?lái)自該載玻片的同一截面，這可以通過(guò)可見集落的排列看出。載玻片B-2中綠色熒光染色的細(xì)菌的缺少表明該細(xì)菌不具有甲氧苯青霉素抗性。該(陰性)結(jié)果符合該分析中所用的MSSA細(xì)菌的性質(zhì)，MSSA細(xì)菌不具有甲氧苯青霉素抗性。圖像B-I和B-2是利用不同的濾光片設(shè)置(分別為紅色或綠色)觀察的同一載玻
40片的不同截面。實(shí)施例3 通過(guò)PNA FISH對(duì)金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的同時(shí)雙重(多元) 確定在本實(shí)施例中，制備MRSA 43300和MRSE 51625的混合物，并按下文所述用三種熒光濾光片進(jìn)行檢查。金黃色葡萄球菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和苯唑西林誘導(dǎo)按照實(shí)施例1所述進(jìn)行。 但是，不用苯唑西林誘導(dǎo)表皮葡萄球菌細(xì)胞，因?yàn)檫@些細(xì)胞mRNA中的MecA mRNA是組成型表達(dá)。表皮葡萄球菌的生長(zhǎng)基本按照實(shí)施例1中對(duì)金黃色葡萄球菌的描述。MRSA 43300和 MRSE 51625的細(xì)胞固定和透化按照實(shí)施例1所述進(jìn)行。熒光原位雜交和熒光顯微鏡將雜交緩沖液加到具有MRSA 43300和MRSE 51625混合物的載玻片上，并蓋上蓋玻片，所述雜交緩沖液含有5種熒光素標(biāo)記的PNA探針(探針1-5，濃度如實(shí)施例1所描述)、一種TAMRA標(biāo)記的、金黃色葡萄球菌特異性的、針對(duì)rRNA的探針(探針8，濃度如實(shí)施例2所描述)和一種I^acific Blue標(biāo)記的、表皮葡萄球菌特異性的、針對(duì)rRNA的探針(探針9，濃度為500nM)。其余步驟按實(shí)施例1中所述進(jìn)行。從FM分析獲取的圖像提供在圖3 的圖像A-C中。這些圖像是載玻片的同一截面。在每種情況下，僅改變熒光濾光片。這是多元分析的實(shí)例，因?yàn)楠?dú)立確定了兩種不同的選定細(xì)菌，并且還確定了單一樣品中細(xì)菌的一種性狀(甲氧苯青霉素抗性)。在這些圖像中，視情況而定，一些(但未必是全部)可見的集落用圓圈(MRSA細(xì)菌)或方框(MRSE)圈住。當(dāng)提供的圖是黑白版本而不是彩色版本時(shí)，這應(yīng)當(dāng)有助于對(duì)載玻片的分析。在圖像A中，MRSA細(xì)菌(圓圈內(nèi)的)是橙色的，而MRSE細(xì)菌(方框內(nèi)的)是綠色的。在圖像B中，看不到MRSA細(xì)菌，而MRSE細(xì)菌(方框內(nèi)的)是藍(lán)色的。在圖像C中， MRSA (圓圈內(nèi)的)和MRSE細(xì)菌(方框內(nèi)的)都是綠色的。結(jié)果參照?qǐng)D3來(lái)討論本實(shí)施例的結(jié)果。在圖像A(雙帶濾光片)中，可觀察到橙色染色的細(xì)菌和綠色染色的細(xì)菌。在該圖像中，MRSA由于探針1-5 (Flu標(biāo)記的探針1-5)的綠色熒光和探針8 (TAMRA標(biāo)記的、針對(duì)rRNA的、金黃色葡萄球菌特異性探針)的紅色熒光的組合而呈現(xiàn)橙色。MRSE細(xì)菌只是綠色，因?yàn)樗鼈儾皇墙瘘S色葡萄球菌(即無(wú)TAMRA信號(hào))。該圖像(與圖像C組合)提示，所有可見的細(xì)菌都是抗甲氧苯青霉素的。在圖像B中，使用DAPI (藍(lán)色)濾光片。在該圖像中可觀察到藍(lán)色染色的MRSE細(xì)菌，探針9是用I^cific Blue標(biāo)記的并且探測(cè)表皮葡萄球菌的rRNA靶標(biāo)。在圖像C中，使用FITC(綠色)濾光片。在該圖像中，MRSA和MRSE細(xì)菌都呈現(xiàn)為綠色熒光染色。兩種細(xì)菌都是綠色染色。如上文指出，圖像A-C來(lái)自同一樣品并且是大致相同的視野。因此，可以比較每幅圖像中的細(xì)菌來(lái)直接確定它們?cè)诹硪环鶊D像中是否能觀察到。這允許根據(jù)簡(jiǎn)單的觀察分析就能容易(并且有可能是自動(dòng)化)地確定細(xì)菌及其性狀。實(shí)施例4 利用PNA FISH和酪胺信號(hào)擴(kuò)增(TSA)來(lái)增強(qiáng)對(duì)MRSA的確定熒光原位雜交和熒光顯微鏡MRSA 33591細(xì)胞的生長(zhǎng)和苯唑西林誘導(dǎo)按實(shí)施例1所述進(jìn)行。細(xì)胞固定和透化也按實(shí)施例1所述進(jìn)行，但是在雜交之前，用75 μ L的TE緩沖液(Tris-HCl IOOmM, EDTA、IOmM, pH 8. 0)在80°C下處理載玻片5分鐘。關(guān)于雜交，將25 μ L含有5種生物素標(biāo)記的 PNA探針(探針11、12、13、14和15 (每種探針的濃度為ΙΟΟηΜ，總濃度為500ηΜ)的HB**加到一個(gè)載玻片上。在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，用一種生物素標(biāo)記的、白色念珠菌(C. albicans)特異性的、針對(duì)rRNA的探針(探針10，濃度為500nM)來(lái)探測(cè)另一個(gè)載玻片。雜交和洗滌按實(shí)施例1所述進(jìn)行。然后用從Molecular Probes (TSA Kit #25，Eugene, OR)購(gòu)買的試劑按照生廠商的操作流程處理載玻片。具體而言，首先將載玻片上沉降的細(xì)胞與0. 075mL的封閉緩沖液(BB)孵育30分鐘，然后與0. ImL稀釋于BB中的鏈霉親和素-HRP孵育30分鐘。用 PBS-吐溫洗滌(3 X 5分鐘洗滌)之后，將細(xì)胞與0. 075mLAlexaFluor 594-標(biāo)記的酪胺溶液孵育10分鐘，并再次洗滌(3X5分鐘洗滌)。然后將一滴MM和蓋玻片加到風(fēng)干的載玻片上，并通過(guò)FM來(lái)檢查細(xì)胞。在圖4中進(jìn)行檢查的每個(gè)載玻片的具體條件如下A) MRSA 33591，用1種針對(duì)rRNA的、白色念珠菌特異性的、生物素標(biāo)記的PNA探針 (探針10)B)MRSA 33591，用5種生物素標(biāo)記的PNA探針(探針11-15)"僅針對(duì)本實(shí)施例而言，將來(lái)自面包酵母的SigmaP/N R5636 (Iml)核糖核酸和 Trevigen, P/N 9600-5-D小牛胸腺DNA稀釋(20 X)在雜交緩沖液中。結(jié)果參照?qǐng)D4來(lái)討論本實(shí)施例的結(jié)果。圖像中的一些(而不是全部)可見集落用圓圈 (圖像B)圈住。當(dāng)提供的圖是黑白版本而不是彩色版本時(shí)，這應(yīng)當(dāng)有助于對(duì)載玻片的分析。圖像B中強(qiáng)紅色熒光染色的細(xì)菌證實(shí)使用探針11-15可以間接確定偶聯(lián)有信號(hào)擴(kuò)增的生物素標(biāo)簽。圖像A中的樣品是對(duì)照，其利用該樣品中不存在的細(xì)菌的針對(duì)rRNA的探針。因此，圖像A中觀察不到細(xì)菌(與圖像B的結(jié)果相比)表明MecA檢測(cè)是特異性的， 并且正確擴(kuò)增了信號(hào)。附錄I細(xì)菌菌株的描述金黃色葡萄球菌ATCC 43300 (MRSA 43300)，抗甲氧苯青霉素的菌株；金黃色葡萄球菌ATCC 29213 (MSSA 29213)，甲氧苯青霉素敏感性菌株；表皮葡萄球菌ATCC 51625 (MRSE 51625)，抗甲氧苯青霉素的菌株；金黃色葡萄球菌ATCC 33591 (MRSA 33591)，抗甲氧苯青霉素的菌株。[ATCC 表示美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collections)，它是多禾中生物體的來(lái)源-參見查看 www. atcc. org/CulturesandProducts/Microbiology/ BacteriaandPhages/tabid/176/Default. aspx]緩沖液/溶液的組成雜交緩沖液(HB):50mM Tris-HCl pH = 7. 6 ；0. 1% (w/v)焦磷酸鈉；IOmM NaCl ； 5mM 乙二胺四乙酸 EDTA)，10%硫酸葡聚糖 MW 500, 000 ；0. 2% (w/v)Ficoll 400K ；30% 甲酰胺；(v/v) Triton X-100 ；0. 2% (w/v)聚乙烯吡咯烷酮MW 360 000 ；用水補(bǔ)足至 100%。洗滌緩沖液(WB):5mM Tris-HCl pH = 10. 0 ； 15mM NaCl ；0. 1 % (v/v)Triton X-100 ；用水補(bǔ)足至100%。無(wú)RNA 酶的透化溶液(PS) :50mM Tris-HCl pH = 7. 6 ；5mM MgS04 ；0. lmg/ml 溶葡萄球菌素；5mM TCEP (來(lái)自 Thermo Scientific，Rockford，II，產(chǎn)品號(hào) 77720)。溶液為新鮮制備。使用前，將溶液于65°C加熱15分鐘，并冷卻至室溫。10%多聚甲醛(PAF)將5g多聚甲醛分散于25ml去離子水中。添加^iil 2M的 NaOH之后，將溶液于55°C孵育，直到所有多聚甲醛粉末都溶解(偶爾手動(dòng)攪拌)。然后通過(guò)添加 IOml 的 10XPBS 濃縮物(Sigma-Aldrich，Louis 的產(chǎn)品，Μ0，Ρ/Ν P7059)將溶液制成1 XPBS，并且量足夠使總體積達(dá)到50ml。用2M HCl將溶液的pH調(diào)至3. 5。封閉緩沖液(BB)由Molecular Probes, Eugene, OR 的 TSA Kit#25 提供。封片劑(MM)=AdvanDx, Inc.，Woburn, MA ；產(chǎn)品號(hào) CP 0023。PNA 探針PNA探針獲自Panagene，Daejeon, Korea。所有的探針(除了探針7)都包含單一標(biāo)簽(參見表1的標(biāo)簽類型)。表1列舉了使用的PNA探針的特征。通過(guò)化學(xué)重頭合成的方法(不是通過(guò)轉(zhuǎn)錄)制備所有PNA探針(包括本文所公開的其它表格中列舉的其它PNA 探針)。表 權(quán)利要求
1.方法，包括a)將包含細(xì)菌的樣品與針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針接觸，所述標(biāo)記探針能確定與選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/或質(zhì)粒核酸，所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或其它細(xì)菌可以具有所述選定的性狀。b)確定所述樣品中具有所述選定性狀的細(xì)菌；其中，i)所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施，并且ii)所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針中的每一種都用單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽進(jìn)行標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，還包括將所述樣品與能確定所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的針對(duì)細(xì)菌的探針接觸，并確定所述樣品中一種或多種所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中僅用針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針實(shí)施步驟(a)。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中用針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的混合物實(shí)施所述方法。
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在不對(duì)所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和 /或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針的標(biāo)簽進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施所述方法。
6.如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)rRNA的。
7.如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針是基于抗體的。
8.如權(quán)利要求2-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)mRNA的。
9.如權(quán)利要求2-8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針是用標(biāo)簽標(biāo)記的。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中每種針對(duì)細(xì)菌的探針都是用單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽標(biāo)記的。
11.如權(quán)利要求2-10中任一項(xiàng)所述的方法，還包括確定所述樣品中也具有所述選定性狀的選定革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在進(jìn)行步驟(a)之前，將所述樣品與 mRNA誘導(dǎo)劑接觸。
13.如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其中所有的標(biāo)簽都是熒光標(biāo)簽，并且所述方法是熒光原位雜交(FISH)分析。
14.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的方法，其中不進(jìn)行預(yù)雜交步驟。
15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在進(jìn)行步驟(a)之前，用RNA酶抑制劑處理所述樣品。
16.如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述選定的性狀與1)抗生素抗性、2) 毒素產(chǎn)生和/或幻毒力相關(guān)。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中通過(guò)確定分別具有以下基因的細(xì)菌來(lái)確定所述選定的性狀=DmecA基因或vanA或vanB基因、2) tcdB基因和/或3) IukF或IukS基因。
18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中在不將所述樣品與細(xì)胞透化劑接觸的條件下實(shí)施所述方法。
19.如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括將所述樣品與以下接觸1)能確定所述樣品中第二選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的第二針對(duì)細(xì)菌的探針，和/或2)能確定與第二選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/或質(zhì)粒核酸的第二針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針，所述第二選定的性狀可存在于所述樣品的任何細(xì)菌內(nèi)。
20.如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的方法，其中直接確定所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì) mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針的標(biāo)簽。
21.如權(quán)利要求1-2和5-20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì) mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針是PNA。
22.如權(quán)利要求1-2和5-21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì) mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針的長(zhǎng)度為10至20個(gè)核堿基子單元。
23.方法，包括a)將樣品與以下接觸i)能確定所述樣品中的金黃色葡萄球菌的針對(duì)細(xì)菌的探針，和 )能確定所述樣品中細(xì)菌的甲氧苯青霉素抗性的針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針；b)確定所述樣品中的一種或多種金黃色葡萄球菌；以及c)確定所述樣品中具有甲氧苯青霉素抗性的一種或多種細(xì)菌；其中，i)所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施，并且ii)步驟(b)和(c)以任意順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中僅用能確定與甲氧苯青霉素抗性相關(guān)的mRNA的針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針實(shí)施步驟a-ii)。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，其中用針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的混合物實(shí)施所述方法。
26.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針中的每一種都是用單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽標(biāo)記的。
27.如權(quán)利要求23或沈所述的方法，其中在不對(duì)所述針對(duì)染色體DNA的和/或mRNA 的標(biāo)記探針的任何標(biāo)簽進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施所述方法。
28.如權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)rRNA的。
29.如權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針是基于抗體的。
30.如權(quán)利要求23-27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針是針對(duì)mRNA的。
31.如權(quán)利要求23-30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針是用標(biāo)簽標(biāo)記的。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中每種針對(duì)細(xì)菌的探針都是用單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽標(biāo)記的。
33.如權(quán)利要求23-32中任一項(xiàng)所述的方法，還包括根據(jù)步驟(b)和(c)中所做的確定，確定所述樣品中的抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)。
34.如權(quán)利要求23-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中在不將所述樣品與細(xì)胞透化劑接觸的條件下實(shí)施所述方法。
35.如權(quán)利要求23-34中任一項(xiàng)所述的方法，還包括α)將所述樣品與能確定所述樣品中的凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)的第二針對(duì)細(xì)菌的探針接觸，其中所述第二針對(duì)細(xì)菌的探針可獨(dú)立于能鑒定所述樣品中的金黃色葡萄球菌的針對(duì)細(xì)菌的標(biāo)記探針而進(jìn)行檢測(cè)；β)確定所述樣品中的一種或多種凝固酶陰性葡萄球菌(CNS)；以及X)任選地，根據(jù)步驟(β)和(c)及任選的步驟(b)中所做的確定，確定所述樣品中抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNQ，如果存在該細(xì)菌的話。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中確定所述樣品中的抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)和抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNS)。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中同時(shí)確定所述樣品中的抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)和抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CNS)。
38.如權(quán)利要求23-37中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括將所述樣品表征為包含抗甲氧苯青霉素的金黃色葡萄球菌(MRSA)、抗甲氧苯青霉素的凝固酶陰性葡萄球菌 (MR-CNS)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)的混合群體。
39.如權(quán)利要求23-38中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在進(jìn)行步驟(a)之前，將所述樣品與mRNA誘導(dǎo)劑接觸。
40.如權(quán)利要求23-39中任一項(xiàng)所述的方法，其中所有的標(biāo)簽都是熒光標(biāo)簽，并且所述方法是熒光原位雜交(FISH)分析。
41.如權(quán)利要求23-40中任一項(xiàng)所述的方法，其中不進(jìn)行預(yù)雜交步驟。
42.如權(quán)利要求23-41中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在進(jìn)行步驟a-ii)之前，用RNA酶抑制劑處理所述樣品。
43.如權(quán)利要求23和沈-42中任一項(xiàng)所述的方法，其中直接確定所述針對(duì)染色體DNA 和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的標(biāo)簽。
44.如權(quán)利要求23和沈-43中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針是PNA。
45.如權(quán)利要求23和沈-44中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的長(zhǎng)度為10至20個(gè)核堿基子單元。
46.如權(quán)利要求23和沈-45中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用信號(hào)擴(kuò)增來(lái)直接地或間接地?cái)U(kuò)增所述針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針的標(biāo)簽的信號(hào)。
47.方法，包括a)將包含細(xì)菌的樣品與針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針接觸，所述標(biāo)記探針能確定與選定的性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/或質(zhì)粒核酸，所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/或其它細(xì)菌可以具有所述選定的性狀；以及b)確定所述樣品中具有所述選定性狀的細(xì)菌；其中，i)所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施，并且ii)在不用細(xì)胞透化劑處理所述樣品的條件下實(shí)施所述方法。
48.如權(quán)利要求47所述的方法，還包括將所述樣品與能確定所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的針對(duì)細(xì)菌的探針接觸，并確定所述樣品中一種或多種所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
49.如權(quán)利要求47或48所述的方法，其中在不進(jìn)行任何信號(hào)擴(kuò)增的條件下實(shí)施所述方法。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述針對(duì)細(xì)菌的探針和所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針中的每一種都用單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽標(biāo)記，并且通過(guò)直接檢測(cè)所述標(biāo)簽來(lái)進(jìn)行所述確定。
51.包含能確定已知存在于細(xì)菌中的選定性狀的針對(duì)mRNA的探針的混合物。
52.如權(quán)利要求51所述的混合物，其中所述混合物中針對(duì)mRNA的探針中的一種或多種是PNA探針。
53.如權(quán)利要求51所述的混合物，其中每種所述針對(duì)mRNA的探針與所述細(xì)菌的mRNA 分子內(nèi)的靶標(biāo)特異性結(jié)合，所述靶標(biāo)與所述選定的性狀相關(guān)。
54.如權(quán)利要求51所述的混合物，其中所述混合物中的每種所述針對(duì)mRNA的探針是單標(biāo)記的探針或雙標(biāo)記的探針。
55.方法，包括a)將樣品與針對(duì)染色體DNA和/或針對(duì)mRNA的標(biāo)記探針接觸，所述標(biāo)記探針能確定所述樣品中細(xì)菌的甲氧苯青霉素抗性；以及b)確定所述樣品中具有甲氧苯青霉素抗性的一種或多種細(xì)菌；其中，所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。
57.如權(quán)利要求55或56所述的方法，其中所述方法還包括將樣品與能確定所述樣品中的金黃色葡萄球菌的針對(duì)細(xì)菌的探針接觸，并確定所述樣品中的一種或多種金黃色葡萄球菌。
58.方法，包括a)將樣品與以下接觸i)能確定所述樣品中選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的針對(duì)細(xì)菌的探針，和 )能確定與選定性狀相關(guān)的染色體DNA、mRNA和/或質(zhì)粒核酸的針對(duì)染色體DNA的、 針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針，所述樣品中所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和/ 或其它細(xì)菌可以具有所述選定的性狀；b)確定所述樣品中的一種或多種革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌；以及c)確定所述樣品中具有所述選定性狀的細(xì)菌；其中，i)所述方法在全細(xì)胞上實(shí)施， )步驟(b)和(c)以任意順序進(jìn)行或同時(shí)進(jìn)行，并且 iii)所述針對(duì)染色體DNA的、針對(duì)mRNA的和/或針對(duì)天然質(zhì)粒的標(biāo)記探針中的每一種包含單一標(biāo)簽或兩種標(biāo)簽。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌全細(xì)胞分析的方法。所述方法能確定樣品(例如，臨床樣品)是否包含一種或多種選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，以及確定例如所述樣品中所述選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌是否都不具有所選的目的性狀、或部分細(xì)菌具有所選的目的性狀或所有細(xì)菌都具有所選的目的性狀，或者所述樣品中可能存在的其它細(xì)菌具有所選的目的性狀。在一些實(shí)施方案中，所述方法可用于確定所述樣品中的抗甲氧苯青霉素(選定的性狀)的金黃色葡萄球菌(選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)、凝固酶陰性葡萄球菌(另一種選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌)和/或甲氧苯青霉素敏感性金黃色葡萄球菌(MSSA)。例如，可以通過(guò)原位雜交(ISH)、熒光原位雜交(FISH)、免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)或以上兩種或更多種的任意組合進(jìn)行全細(xì)胞分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102439178SQ201080022002
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2010年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月20日
發(fā)明者何恩瑞克·斯戴恩德, 利薩·L·科利馬斯, 安妮·K·I·拉斯繆森, 詹·純諾夫斯凱 申請(qǐng)人:阿德萬(wàn)德克斯公司