專(zhuān)利名稱(chēng)：多潛能和多能細(xì)胞在微載體上的培養(yǎng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在存在ROCK抑制劑的情況下多潛能和多能細(xì)胞在微載體上的培養(yǎng)。
背景技術(shù)：
與分化的細(xì)胞不同，干細(xì)胞具有分裂和自我更新或分化成在表型和功能上不同的子細(xì)胞的能力(Keller, Genes Dev. 2005 ;19 :1129-1155 ;Wobus 和 Boheler，Physiol Rev. 2005 ；85 :635-678 ；Wiles, Methods in Enzymology· 1993 ；225 :900-918 ；Choi 等人， Methods Mol Med. 2005 ；105 :359-368)。人胚胎干細(xì)胞(hESC)是具有分化成多種干細(xì)胞類(lèi)型的多潛能細(xì)胞。干細(xì)胞(如胚胎干細(xì)胞(ESC))的多潛能性和它們從所有三種胚層分化成細(xì)胞的能力使它們成為多種疾病和組織創(chuàng)傷的再生療法的理想細(xì)胞來(lái)源(Keller, Genes Dev. 2005 ；19 :1129-1155 ； Wobus 和 Boheler, Physiol Rev. 2005 ；85 :635-678)。干細(xì)胞擴(kuò)增至較大量需要傳代一次或多次，這是細(xì)胞療法的必要條件。目前，通常將作為集落生長(zhǎng)的干細(xì)胞(包括人胚胎干細(xì)胞，hESC)以2維QD)生長(zhǎng)的方式維持在塑料培養(yǎng)表面上。在2D培養(yǎng)中擴(kuò)增至較大量將需要使用較大表面積。通過(guò)反復(fù)吸取使細(xì)胞傳代的人工操作本質(zhì)或酶促處理將這些2D集落破碎至較小尺寸將是不實(shí)際的。準(zhǔn)備用于接種大表面積的眾多平板可能經(jīng)歷操作錯(cuò)誤。此外，將需要如(例如) Nunc托盤(pán)的極大的表面積。因此，當(dāng)前以2D集落培養(yǎng)在涂覆的塑料表面上使干細(xì)胞生長(zhǎng)的方法不適合于放大并且進(jìn)行培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)條件一般不適合于進(jìn)行良好控制。現(xiàn)有技術(shù)包括在三維(“3D”)環(huán)境中培養(yǎng)干細(xì)胞的多種嘗試，如在懸浮培養(yǎng)中的微載體上。除了小鼠胚胎干細(xì)胞在微載體上(Fernandes 等人，2007 ；Abranches 等人，2007 ；King和 Miller，2007)以及在懸浮培養(yǎng)中使 hESC 作為擬胚體分化(Dang 等人，2004 ；Fok 和 Zandstra，2005 ；Cameron 等人，2006)的一些研究以外，在懸浮培養(yǎng)中尚沒(méi)有長(zhǎng)期、連續(xù)培養(yǎng)hESC的穩(wěn)健方法。在本領(lǐng)域中，已知胚胎干細(xì)胞能夠在懸浮培養(yǎng)中作為“擬胚體”分化。這些擬胚體包含大量已分化的細(xì)胞。例如，Gerecht Nir等人Q004)描述了使用旋轉(zhuǎn)壁生物反應(yīng)器來(lái)培養(yǎng)擬胚體。Zandstra等人000；3)、Dang等人Q004)和Wartenberg等人(1998)還顯示了使用攪拌系統(tǒng)的擬胚體培養(yǎng)。Dang和Zandstra(2005)以及King和MilleH2007)還報(bào)道了擬胚體懸浮培養(yǎng)。這些技術(shù)適合于培養(yǎng)包含分化干細(xì)胞的這些組織樣擬胚體聚集體， 但是不適合于未分化的干細(xì)胞。Fok和Zandstra(2005)描述了用于未分化小鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)增殖的攪拌懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)。該攪拌懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)包含微載體和聚集體培養(yǎng)物。在玻璃微載體上培養(yǎng)的小鼠胚胎干細(xì)胞具有與組織培養(yǎng)瓶對(duì)照可比較的群體倍增時(shí)間。一旦除去白血病抑制因子， mESC聚集體將發(fā)育為能夠多譜系分化的擬胚體(EB)。在King和MilleH20(^)中還描述了小鼠ESC的懸浮培養(yǎng)。然而，King和Miller (2005)說(shuō)明“未分化人ESC(hESC)的擴(kuò)增比 mESC更困難并且尚未在攪拌培養(yǎng)中有過(guò)報(bào)道”。
US2007/0264713 (Terstegge)公開(kāi)了在微載體上培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞的嘗試。將人胚胎干細(xì)胞與Cyt0dex3(Amersham)微載體一起引入到加入不同體積的條件培養(yǎng)基的旋轉(zhuǎn)器或生物反應(yīng)器中。在1小時(shí)中，以20-30rmp攪拌培養(yǎng)物30分鐘。將該培養(yǎng)物維持10天至6周的不同時(shí)間。然而，任何培養(yǎng)物均從未進(jìn)行傳代或繼代，而傳代或繼代是干細(xì)胞大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)的必要要求。在微載體上連續(xù)傳代的表現(xiàn)以及以“優(yōu)良”(指數(shù))生長(zhǎng)率進(jìn)行繼代的能力是干細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)的必要要求。這一點(diǎn)在Terstegge等人的工作中未得到體現(xiàn)。W02008/004990描述了在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)干細(xì)胞的嘗試以及對(duì)微載體使用的考慮。它與其中未使用Matrigel的培養(yǎng)有關(guān)。W02008/004990描述了帶正電荷的表面在抑制干細(xì)胞分化方面的作用。在Phillips 等人，2008 (Journal of Biotechnology 138(2008)24-32)的報(bào)道中報(bào)道了通過(guò)接種聚集體以及單細(xì)胞在微載體上培養(yǎng)hESC的嘗試。開(kāi)始，在5天內(nèi)實(shí)現(xiàn)了 3 倍擴(kuò)增，然而，隨著每次連續(xù)傳代，細(xì)胞擴(kuò)增下降直至6周后細(xì)胞不能傳代為止。使用可商購(gòu)微載體(如Cytodex 1和3)放大培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞(hESC)的先前嘗試是不成功的。hESC培養(yǎng)物在載體上死亡或分化并且不能增殖(Oh & Choo，2006)。Watanabe等人和Harb等人提議使用ROCK抑制劑Y-27632作為能夠允許解離的人胚胎干細(xì)胞在2D培養(yǎng)中存活的因子(Watanabe等人，A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology Vol. 25 No. 6 P681-686 June 2007 ；WO 2008/035110 ；Harb^A,The Rho-Rock-myosin Signaling Axis Determines Cell-Cell Integrity of Self-Renewing Pluripotent Stem Cells. PLoS ONE 3(8) :e3001. doi :10 :1371/journal, pone. 0003001)。還研究了使用ROCK抑制劑作為可以改善人胚胎干細(xì)胞冷凍保存的試劑 (Xiangyun Li 等人’ ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/ feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction, Vol. 24, No. 3pp. 580-589,2009 ；Martin-Ibanez 等人，Novel cryopreservation method for dissociated human embryonic stem cells in the presence of a ROCK inhibitor. Human Reproduction. Vol. 23. No. 12 pp.2744-2754，2008 ;Claassen 等 A, ROCK Inhibition Enhances the Recovery and Growth of Cryopreserved Human Embryonic Stem Cells and Human Induced Pluripotent Stem Cells. Molecular Reproduction & Development 2009)。然而，在所有情況下，它均用于在Matrigel上的人胚胎干細(xì)胞的2D 培養(yǎng)的背景下使用。使用Matrigel涂覆的微載體，我們先前已通過(guò)連續(xù)傳代在靈長(zhǎng)類(lèi)未分化的多潛能細(xì)胞(包括人胚胎干細(xì)胞和人誘導(dǎo)性多潛能細(xì)胞)的懸液中實(shí)現(xiàn)了穩(wěn)定和連續(xù)的生長(zhǎng)(在Oh等人，2009中有部分報(bào)道，并且在2009年3月17日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US 61/069694、2008 年 10 月 31 日提交的 US 61/110256、2009 年 1 月四日提交的 US 61/148064 和2009年2月27日提交的US 61/155940中進(jìn)一步加以說(shuō)明)。然而，迄今為止，使用不具有細(xì)胞外基質(zhì)衍生材料的表面涂層的微載體尚未獲得該結(jié)果。自此，Lock等人已說(shuō)明了 hESC在Matrigel涂敷的微載體上的生長(zhǎng)，但是沒(méi)有iitil專(zhuān)代(Lock 等人，expansion and Differentiation of Human Embyronic StemCells to Endoderm Progeny in a Microcarrier Stirred-Suspension Culture. Tissue Engineering =Part A Vol. 15, No. 002009)而Nie等人研究了 hESC在具有基質(zhì)涂層或飼養(yǎng)細(xì)胞層的微載體上的生長(zhǎng)(Nie 等人，Scalable Culture and Cryopreservation of Human Embyronic Stem Cells on microcarriers. Biotechnol. Prog. ,2009, Vol.25, No. 1)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在存在ROCK的情況下在不具有基質(zhì)涂層的微載體上可以成功培養(yǎng)和傳代多潛能干細(xì)胞，并同時(shí)維持所培養(yǎng)和傳代細(xì)胞的多潛能狀態(tài)。本發(fā)明提供了在存在ROCK抑制劑的情況下，在體外培養(yǎng)中穩(wěn)定并且長(zhǎng)期培養(yǎng)多潛能和多能細(xì)胞的方法。使用這種方法，已經(jīng)使人胚胎干細(xì)胞擴(kuò)增并傳代，并且所擴(kuò)增和傳代的人胚胎干細(xì)胞群體的多潛能性已維持超過(guò)了至少9次傳代。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及在懸浮培養(yǎng)中多潛能或多能細(xì)胞在微載體上的生長(zhǎng)和增殖。該方法可以包括通過(guò)一次或多次傳代的培養(yǎng)，并同時(shí)保持細(xì)胞在培養(yǎng)中各自的多潛能或多能狀態(tài)。在存在ROCK抑制劑的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，其中ROCK抑制劑可以作為培養(yǎng)補(bǔ)充劑或添加劑加入到培養(yǎng)基中。通過(guò)在培養(yǎng)中加入ROCK抑制劑，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)不是必須用基質(zhì)(例如，細(xì)胞外基質(zhì)材料)涂覆微載體表面。到目前為止，已經(jīng)認(rèn)為這是維持懸浮微載體培養(yǎng)的多潛能或多能細(xì)胞，特別是人或靈長(zhǎng)類(lèi)胚胎干細(xì)胞以及人或靈長(zhǎng)類(lèi)誘導(dǎo)性多潛能細(xì)胞的多潛能或多能狀態(tài)的必要要求。用多潛能或多能細(xì)胞接種微載體。然后，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)微載體-細(xì)胞復(fù)合物， 優(yōu)選地以擴(kuò)增在培養(yǎng)中的多潛能或多能細(xì)胞的數(shù)目。培養(yǎng)的細(xì)胞可以傳代，并且還可以將傳代的細(xì)胞接種在微載體上，例如，用于進(jìn)一步的培養(yǎng)或用于分化。以這種方式，可以通過(guò)多次傳代，例如，至少2次傳代來(lái)獲得多潛能或多能細(xì)胞， 其中所培養(yǎng)和傳代的細(xì)胞保持各自的多潛能或多能狀態(tài)。使用這種方法，在每次傳代之間的每個(gè)培養(yǎng)循環(huán)中，觀察到了多潛能或多能細(xì)胞的增殖并且它可以維持多次傳代(至少9 次)。這種培養(yǎng)法允許在體外培養(yǎng)中使多潛能或多能細(xì)胞連續(xù)生長(zhǎng)和傳代，借此提供了用于將多潛能或多能細(xì)胞擴(kuò)增至治療有用數(shù)目的方法。盡管多潛能或多能細(xì)胞在微載體上的連續(xù)傳代通常將是優(yōu)選的，但是作為本發(fā)明方法的一部分，可以將多潛能或多能細(xì)胞從微載體上的培養(yǎng)中轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)系統(tǒng)(例如，2D集落培養(yǎng))中，然后返回懸浮微載體培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，用基質(zhì)涂覆微載體，優(yōu)選地，用具有細(xì)胞外組分的基質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，所述微載體是帶正電荷的。所述方法優(yōu)選地包括在傳代之前，在每個(gè)培養(yǎng)循環(huán)期間將多潛能或多能細(xì)胞連接至微載體的步驟。允許在未涂敷的微載體上進(jìn)行一些培養(yǎng)循環(huán)，而在涂覆基質(zhì)的微載體上進(jìn)行其它循環(huán)。盡管多潛能或多能細(xì)胞在微載體上的連續(xù)傳代通常將是優(yōu)選的，但是作為本發(fā)明方法的一部分，可以將培養(yǎng)的細(xì)胞從微載體上的培養(yǎng)中轉(zhuǎn)移到其它培養(yǎng)系統(tǒng)(例如，2D集落培養(yǎng))中，然后返回懸浮微載體培養(yǎng)。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在存在ROCK抑制劑的情況下，懸浮培養(yǎng)中的連接到微載體上的多潛能或多能細(xì)胞的分化。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)使用如上所述的微載體培養(yǎng)法可以使多潛能或多能細(xì)胞生長(zhǎng)至分化所需的細(xì)胞密度。一旦獲得所需的細(xì)胞密度，可以改變培養(yǎng)條件以誘導(dǎo)連接至微載體的多潛能或多能細(xì)胞的分化。對(duì)于分化來(lái)說(shuō)，與用于多潛能或多能細(xì)胞生長(zhǎng)的那些相比，可以使用相同或不同的微載體。類(lèi)似地，在使用基質(zhì)涂層的情況下，可以使用相同或不同的基質(zhì)涂層。例如，具有第一涂層的第一微載體可以用于多潛能或多能細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖而具有第二涂層的第二微載體可以用于那些細(xì)胞的分化。第二微載體可以是未涂覆的或可以是涂覆基質(zhì)的表面。對(duì)于多潛能或多能細(xì)胞的增殖以及對(duì)于它們的分化來(lái)說(shuō)，微載體培養(yǎng)的使用具有以下優(yōu)勢(shì)不再需要重新接種分化培養(yǎng)，增殖培養(yǎng)提供了大量用于分化的多潛能或多能細(xì)胞以及通過(guò)改變培養(yǎng)條件便于從增殖向分化轉(zhuǎn)變。在其它實(shí)施方式中，通過(guò)其它培養(yǎng)法(例如，通過(guò)2D集落培養(yǎng))，可以使用于分化的多潛能或多能細(xì)胞生長(zhǎng)至所需的細(xì)胞密度。然后，將那些細(xì)胞連接到微載體上并在存在 ROCK抑制劑的情況下，在誘導(dǎo)多潛能或多能細(xì)胞分化的條件下，在懸浮培養(yǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，可以將已經(jīng)歷分化的多潛能或多能細(xì)胞(但優(yōu)選地，未終末分化)連接到微載體上并且在存在ROCK抑制劑的情況下，在誘導(dǎo)細(xì)胞分化的條件下，在懸浮培養(yǎng)中進(jìn)行培養(yǎng)。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選地允許ROCK抑制劑接觸正在培養(yǎng)或分化的細(xì)胞。還優(yōu)選地允許ROCK抑制劑接觸連接了或要連接細(xì)胞的微載體。為了允許這種接觸，優(yōu)選液體、流體、凝膠或其它可流動(dòng)的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了體外培養(yǎng)多潛能或多能細(xì)胞的方法，該方法包括(i)將多潛能或多能細(xì)胞連接到多個(gè)微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物，和(ii)在存在ROCK抑制劑的情況下，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)該微載體-細(xì)胞復(fù)合物。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括使來(lái)自(ii)的培養(yǎng)的細(xì)胞傳代，其中傳代后的細(xì)胞是多潛能或多能的。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括(iii)使來(lái)自(ii)的培養(yǎng)的細(xì)胞傳代；和(iv)經(jīng)過(guò)(through)至少2次傳代，重復(fù)步驟(i)-(iii)，其中在步驟(iv)之后培養(yǎng)的細(xì)胞是多潛能或多能的。在一些實(shí)施方式中，在每個(gè)重復(fù)周期中，從先前重復(fù)周期的步驟(iii)的傳代細(xì)胞中獲得了步驟(i)的干細(xì)胞。在步驟(iv)中，可以經(jīng)過(guò)下列之一重復(fù)步驟(i)-(iii)至少傳代3次、至少傳代 4次、至少傳代5次、至少傳代6次、至少傳代7次、至少傳代8次、至少傳代9次、至少傳代 10次、至少傳代11次、至少傳代12次、至少傳代13次、至少傳代14次、至少傳代15次、至少傳代16次、至少傳代17次、至少傳代18次、至少傳代19次、至少傳代20次、至少傳代21 次、至少傳代22次、至少傳代23次、至少傳代M次、至少傳代25次、至少傳代30次、至少傳代40次、至少傳代50次、至少傳代60次、至少傳代70次、至少傳代80次、至少傳代90 次、至少傳代100次。在一些實(shí)施方式中，在步驟(ii)中，將細(xì)胞培養(yǎng)足以使培養(yǎng)中的細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增的一段時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，在步驟(iv)后，至少60%的培養(yǎng)的細(xì)胞是多潛能或多能的。 在一些實(shí)施方式中，在步驟(iv)后，至少60%的培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)0ct4、SSEA4、TRA-l-60和 Mab84中的一種、兩種、三種或全部。在一些實(shí)施方式中，在規(guī)定的傳代次數(shù)后，增殖細(xì)胞優(yōu)選地保留了多潛能或多能細(xì)胞的至少一種生物活性。該生物活性可以選自(i)多潛能標(biāo)志物的表達(dá)、(ii)細(xì)胞存活率、(iii)正常染色體組型，(iv)分化為內(nèi)胚層、外胚層或中胚層的能力。該生物活性可以包括多潛能標(biāo)志物的表達(dá)，其選自0CT-4、SSEA-4、TRA-1-60和Mab84。在一些實(shí)施方式中，該方法包括在無(wú)血清培養(yǎng)基、或干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(stem cell conditioned media)或無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件可以包括在懸浮培養(yǎng)中的微載體上不存在涂覆的飼養(yǎng)細(xì)胞和/或懸浮培養(yǎng)中完全不存在飼養(yǎng)細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，還將飼養(yǎng)細(xì)胞連接到微載體上。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)還包括連接到與多潛能或多能細(xì)胞所連接的微載體不同的微載體上的飼養(yǎng)細(xì)胞(或，培養(yǎng)還包括將飼養(yǎng)細(xì)胞連接到與多潛能或多能細(xì)胞所連接的微載體不同的微載體上)。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括傳代至替代培養(yǎng)系統(tǒng)(例如，2D培養(yǎng))或從替代培養(yǎng)系統(tǒng)傳代。細(xì)胞可以(例如)凍融儲(chǔ)存以有利于在培養(yǎng)系統(tǒng)之間轉(zhuǎn)移。在一些實(shí)施方式中，可以在其它顆粒/表面上將多潛能或多能細(xì)胞培養(yǎng)有限的一段時(shí)間。例如，在回到存在ROCK抑制劑的微載體上的培養(yǎng)之前，可以在替代培養(yǎng)系統(tǒng)(例如，在2D培養(yǎng))中將來(lái)自步驟(ii)或(iii)的多潛能或多能細(xì)胞培養(yǎng)有限的傳代次數(shù)(例如，小于5次，更優(yōu)選地，小于3次，更優(yōu)選地，1次)。在其它實(shí)施方式中，在回到根據(jù)本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)之前，可以從該培養(yǎng)法中除去多潛能或多能細(xì)胞并(例如，作為冷凍細(xì)胞)保存?？梢栽诖嬖赗OCK抑制劑的情況下保存 (例如，冷凍)細(xì)胞。在這些實(shí)施方式中，回到根據(jù)本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)中不需要回到相同的培養(yǎng)中。根據(jù)本發(fā)明的懸浮培養(yǎng)甚至可以在不同的地理位置上繼續(xù)，例如，在細(xì)胞冷凍和運(yùn)輸后。根據(jù)本發(fā)明的方法還可以包括將人胚胎干細(xì)胞與微載體分離的步驟。在一些實(shí)施方式中，該方法包括誘導(dǎo)從培養(yǎng)中獲得的多潛能或多能細(xì)胞分化的步驟。因此，在一些實(shí)施方式中，該方法包括將微載體-細(xì)胞復(fù)合物置于誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化的條件下。在一些實(shí)施方式中，該方法包括將獲自該培養(yǎng)法的多潛能或多能細(xì)胞與微載體分離并且在誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化的條件下在非微載體培養(yǎng)中培養(yǎng)所述分離的細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括獲自該培養(yǎng)法的多潛能或多能細(xì)胞的體外分化，其包括(a)將獲自該培養(yǎng)法的多潛能或多能細(xì)胞連接到多個(gè)第二微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物，(b)在誘導(dǎo)細(xì)胞分化的條件下，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)來(lái)自(a)的微載體-細(xì)胞復(fù)合物。該方法還可以包括(c)將獲自步驟(b)的分化的細(xì)胞連接到多個(gè)第三微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物；和
(d)在誘導(dǎo)已分化細(xì)胞再分化的條件下，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)來(lái)自(C)的微載體-細(xì)胞復(fù)合物。在一些實(shí)施方式中，分化培養(yǎng)條件包括在存在ROCK抑制劑的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，分化培養(yǎng)條件包括在不存在ROCK抑制劑的情況下培養(yǎng)細(xì)胞。提供了通過(guò)本發(fā)明方法獲得的多潛能或多能細(xì)胞。還提供了通過(guò)本發(fā)明方法獲得的分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)通過(guò)本發(fā)明方法獲得的分化細(xì)胞以形成擬胚體。因此，還提供了由此所獲得的擬胚體(embryoid body)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了使多潛能或多能細(xì)胞體外分化的方法，該方法包括將多潛能或多能細(xì)胞連接到多個(gè)微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物，其中微載體的表面未涂覆或涂覆了基質(zhì)；和在存在ROCK抑制劑的情況下并且在誘導(dǎo)細(xì)胞分化的條件下，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)微載體-細(xì)胞復(fù)合物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了多潛能或多能細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，其中將所述細(xì)胞連接到多個(gè)微載體上，借此形成了微載體-細(xì)胞復(fù)合物，并且所述懸浮培養(yǎng)基包含ROCK抑制劑。在一些實(shí)施方式中，提供了用于使多潛能或多能細(xì)胞增殖(包括懸浮培養(yǎng))的容器(例如，生物反應(yīng)器)或裝置。所述懸浮培養(yǎng)可以是旋轉(zhuǎn)懸浮培養(yǎng)(spinner suspension culture)。在一些實(shí)施方式中，ROCK抑制劑以下列一種濃度存在于培養(yǎng)基中至少1 μ Μ、至少2 μ Μ、至少3 μ Μ、至少4 μ Μ、至少5 μ Μ、至少6 μ Μ、至少7 μ Μ、至少8 μ Μ、至少9 μ Μ、至少 10 μ Μ、至少15 μ Μ、至少20 μ Μ、至少30 μ Μ、至少40 μ M或至少50 μ Mo ROCK抑制劑可以任選地以小于下列一種濃度存在于培養(yǎng)基中100 μ Μ、90 μ Μ、80 μ Μ、70 μ M或60 μ Μ。在本發(fā)明的其它方面，提供了 ROCK抑制劑在多潛能或多能細(xì)胞的體外懸浮培養(yǎng)中的應(yīng)用，其中這些細(xì)胞處于微載體-細(xì)胞復(fù)合物的形式。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了 ROCK抑制劑在體外懸浮培養(yǎng)的多潛能或多能細(xì)胞的分化中的應(yīng)用，其中這些細(xì)胞處于微載體-細(xì)胞復(fù)合物的形式。在本發(fā)明的其它方面，提供了使多潛能或多能細(xì)胞增殖的方法，該方法包括以下步驟(a)提供微載體；(b)使多潛能或多能細(xì)胞連接至所述微載體；和(c)使在其上連接有多潛能或多能細(xì)胞的微載體聚集以由此使多潛能或多能細(xì)胞增殖，其中在步驟(a)、(b)或(C)的一個(gè)或多個(gè)步驟中或全部步驟中，將微載體和/或細(xì)胞與ROCK抑制劑接觸。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了使多潛能或多能細(xì)胞增殖的方法，該方法包括(a)提供連接至第一微載體的第一多潛能或多能細(xì)胞；(b)提供連接至第二微載體的第二多潛能或多能細(xì)胞；(c)使第一多潛能或多能細(xì)胞與第二多潛能或多能細(xì)胞接觸以形成細(xì)胞聚集體； 和(d)在存在ROCK抑制劑的情況下，培養(yǎng)該聚集體以使多潛能或多能細(xì)胞增殖至少1代。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了使多潛能或多能細(xì)胞增殖的方法，該方法包括以下步驟(a)提供其上連接了多潛能或多能細(xì)胞的第一微載體；(b)使第一微載體與包含與其連接的第二多潛能或多能細(xì)胞的第二微載體接觸以形成聚集體；和(c)在存在ROCK抑制劑的情況下，培養(yǎng)該聚集體。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了使多潛能或多能細(xì)胞增殖的方法，該方法包括以下步驟(a)提供具有與其連接的多潛能或多能細(xì)胞的多個(gè)微載體；(b)使所述多個(gè)微載體聚集以形成聚集體；和(c)在存在ROCK抑制劑的情況下，培養(yǎng)該聚集體。在本發(fā)明的方面和實(shí)施方式中，ROCK抑制劑優(yōu)選地選自Y-27632、ΗΑ_1077(法舒地爾)、HA-1100 (羥基法舒地爾)、H-1152、3- (4-吡啶基)-IH-吲哚、N- (4-吡啶基)-N' _(2，4，6_三氯苯基)脲、金硫葡糖(Aurothioglucose)、LY^4002或其鹽、堿、酯或前藥。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述微載體不具有基質(zhì)涂層。在其它實(shí)施方式中，微載體的表面可以涂覆基質(zhì)。所述基質(zhì)可以包括細(xì)胞外基質(zhì)組分并且可以是MatrigelTm(BD Biosciences)、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、膠原、彈性蛋白、硫酸乙酰肝素(硫酸肝素，h印aran sulphate)、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素中的一種或多種。所述基質(zhì)可以包括層粘連蛋白、I型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和內(nèi)功素Kentactin 1，內(nèi)動(dòng)蛋白1)的混合物。在一些實(shí)施方式中，多潛能或多能細(xì)胞是干細(xì)胞，并且可以是胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞或成體干細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是哺乳動(dòng)物(例如，兔、豚鼠、大鼠、小鼠或其它嚙齒動(dòng)物(包括來(lái)自嚙齒目中任何動(dòng)物的細(xì)胞)、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛、馬、非人哺乳動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類(lèi))、靈長(zhǎng)類(lèi)或人。在本發(fā)明的方面和實(shí)施方式中，所述微載體可以包括纖維素、葡聚糖、羥基化甲基丙烯酸酯、膠原、明膠、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一種或多種或者由其組成。可替換地，微載體可以是大孔或微孔Carboseed微載體。在一些實(shí)施方式中，微載體偶聯(lián)了魚(yú)精蛋白或聚賴氨酸。在一些實(shí)施方式中，微載體是帶正電荷的。在一些實(shí)施方式中，微載體帶有表面正電荷。在一些實(shí)施方式中，微載體是親水性的。在一些實(shí)施方式中，微載體是桿狀的。在其它實(shí)施方式中，微載體具有基本球形形狀。根據(jù)本發(fā)明的方法可以包括細(xì)胞培養(yǎng)的連續(xù)或間歇攪拌，例如，從約5至約 200rpm、從約5至約150rpm、從約5至約lOOrpm、約30rpm或以上，或約50rpm或以上，或約 IOOrpm或以上?？商鎿Q地，這些方法可以包括靜態(tài)培養(yǎng)。在一些實(shí)施方式中，攪拌速率或量的提高可以用于誘導(dǎo)細(xì)胞分化，然而較低的攪拌速率或量可以用于使多潛能或多能細(xì)胞群體擴(kuò)增而不誘導(dǎo)顯著分化。為了培養(yǎng)多潛能或多能細(xì)胞群體而不誘導(dǎo)顯著分化，可以采用從約5rpm至約lOOrpm、從約5rpm至約50rpm、從約5rpm至約40rpm、從約5rpm至約30rpm、從約5rpm至約 25rpm、從約5rpm至約20rpm、從約5rpm至約15rpm、從約5rpm至約IOrpm的轉(zhuǎn)速對(duì)培養(yǎng)物
進(jìn)行攪拌。對(duì)于顯著分化的誘導(dǎo)來(lái)說(shuō)，可以采用從約25rpm至約200rpm或以上的轉(zhuǎn)速對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行攪拌，例如，從約30rpm至約200rpm或以上、從約35rpm至約200rpm或以上、從約 40rpm至約200rpm或以上、從約45rpm至約200rpm或以上、從約50rpm至約200rpm或以上、從約75rpm至約200rpm或以上、從約IOOrpm至約200rpm或以上。細(xì)胞的顯著分化可以包括至少約10%的培養(yǎng)的細(xì)胞分化的情況?？商鎿Q地，這可以是其中約15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%中至少之一的培養(yǎng)(或在培養(yǎng)中)的細(xì)胞分化的情況。因此，本發(fā)明的方法可以包括以第一攪拌速率或量進(jìn)行方法的第一部分以培養(yǎng)細(xì)胞并同時(shí)保持它們的多潛能或多能狀態(tài)，然后進(jìn)行其中以第二攪拌速率或量來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞以使在培養(yǎng)中的細(xì)胞分化的第二部分。第一速率或量?jī)?yōu)選地小于第二速率或量。因此，該方法的第一部分可以使多潛能或多能細(xì)胞群體擴(kuò)增而該方法的第二部分可以開(kāi)始那些細(xì)胞的一些或全部向內(nèi)胚層、外胚層或中胚層系分化的過(guò)程。在本發(fā)明的其它方面，提供了對(duì)需要治療的個(gè)體中的疾病進(jìn)行治療的方法，該方法包括根據(jù)本文所述的方法使多潛能或多能細(xì)胞增殖，產(chǎn)生分化的細(xì)胞或擬胚體并且將該多潛能或多能干細(xì)胞、分化的細(xì)胞或擬胚體施用到所述個(gè)體中。
具體實(shí)施例方式在以下所附說(shuō)明中說(shuō)明了本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方式的詳細(xì)信息，舉例來(lái)說(shuō)， 包括本發(fā)明人對(duì)實(shí)施本發(fā)明所考慮的最佳方式的具體詳細(xì)信息。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是可以在不受這些具體詳細(xì)信息的限制的情況下實(shí)踐本發(fā)明。結(jié)果總結(jié)我們已開(kāi)發(fā)了在不存在基質(zhì)涂層(例如，Matrigel)的情況下，使用多種微載體 (DE53、QA52、Tosoh, Cytodex 1、Cytodex 3)在存在 ROCK 抑制劑補(bǔ)充劑(例如，Y27632、 HA1077 (法舒地爾)或金硫葡糖)的情況下在微載體上培養(yǎng)hESC連續(xù)傳代超過(guò)5次的方法。傳代5次或5次以上后，hESC保持了它們的生長(zhǎng)、最終細(xì)胞密度、多潛能標(biāo)志物0ct4、 Mab84和TRA-1-60的表達(dá)以及正常染色體組型。這改善了我們?cè)谑褂靡幌盗形⑤d體涂層的情況下使用微載體培養(yǎng)多潛能和多能細(xì)胞的早期工作(在Oh等人，2009中有部分報(bào)道并且在2009年3月17日提交的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US 61/069694,2008年10月31日提交的US 61/110256,2009年1月四日提交的US 61/148064和2009年2月27日提交的US 61/155940中進(jìn)一步說(shuō)明，所有文獻(xiàn)作為參考并入本文)。由于不再需要用Matrigel、動(dòng)物來(lái)源基質(zhì)或其它細(xì)胞外基質(zhì)組分涂覆微載體以實(shí)現(xiàn)多潛能hESC的擴(kuò)增和分化，因此本發(fā)明方法是特別有前途的。這將有助于開(kāi)發(fā)在研究、 治療和診斷應(yīng)用中使用的擴(kuò)增和分化hESC以及其它多潛能和多能細(xì)胞的符合GMP的方法。具體地，我們已表明1、使用ROCK抑制劑Y-27632，在纖維素DE53微載體上將hESC長(zhǎng)期培養(yǎng)9周(傳
12代9次)(

圖1)。2、使用ROCK抑制劑Y-27632，在球形Tosoh微載體上將hESC長(zhǎng)期培養(yǎng)6周(傳代 6次)(圖4)。3、使用 ROCK 抑制劑 Y-27632，將 hESC 在纖維素 DE53、Tosoh、Cytodex 1 和 Cytodex 3微載體上長(zhǎng)期培養(yǎng)5周(傳代5次)之間的比較。4、使用ROCK抑制劑Y-27632，在5至10周之間在纖維素DE53、QA52、Tosoh和 Cytodex 3微載體上的hESC的正常染色體組型(圖10和11)。5、使用替代ROCK抑制劑HA1077 (法舒地爾)和金硫葡糖，在纖維素DE53微載體上將hESC培養(yǎng)2周(圖12-14)。干細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)和傳代我們先前已證明在具有基質(zhì)涂層的顆粒上培養(yǎng)、增殖和傳代靈長(zhǎng)類(lèi)和人干細(xì)胞和 iPS細(xì)胞是可能的。具體地，我們已表明干細(xì)胞可以在懸浮培養(yǎng)中在基質(zhì)涂覆的微載體上連續(xù)生長(zhǎng)和傳代。我們現(xiàn)在描述了在存在ROCK抑制劑的情況下在懸液中使干細(xì)胞增殖的方法。所述增殖方法可以包括使干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、繁殖、培養(yǎng)、擴(kuò)增或增加。如下所述，增殖的干細(xì)胞能夠傳代1次或以上?？梢酝ㄟ^(guò)使用具有某些性質(zhì)的微載體或顆粒實(shí)現(xiàn)這種增殖。微載體或顆?？梢园姾?。微載體或顆粒可以任選地包含涂層。其它性質(zhì)可以包括尺寸。增殖干細(xì)胞的方法可以包括提供顆粒的步驟。所述顆?？梢允俏赐扛驳幕蚩梢园扛财渖系幕|(zhì)。它們可以具有正電荷。顆?？梢跃哂性试S與其連接的靈長(zhǎng)類(lèi)或人干細(xì)胞聚集的尺寸。允許干細(xì)胞連接到所述顆粒上。允許在不同顆粒上生長(zhǎng)的細(xì)胞彼此接觸并形成聚集體。培養(yǎng)物傳代至少1個(gè)傳代?？梢允褂门c載體連接的干細(xì)胞或與它們分離或分開(kāi)的干細(xì)胞。它們可以以未分化或多潛能狀態(tài)或以兩種狀態(tài)使用，或者可以分化成所需的細(xì)胞類(lèi)型。它們可以用于形成擬胚體。為了使顆粒支持連續(xù)生長(zhǎng)，它們應(yīng)具有與靈長(zhǎng)類(lèi)或人干細(xì)胞的尺寸相適應(yīng)的尺寸， 如 10 μ m、20 μ m、30 μ m、40 μ m、50 μ m、60 μ m、70 μ m、80 μ m、90 μ m、100 μ m、110 μ m、 120 μ m、130 μ m、140 μ m、150 μ m、160 μ m、170 μ m、180 μ m、190 μ m、200 μ m、210 μ m、220 μ m、 230 μ m、240 μ m、250 μ m等。靈長(zhǎng)類(lèi)或人干細(xì)胞在具有這種尺寸水平的顆粒上的培養(yǎng)將能夠使細(xì)胞在其上生長(zhǎng)以彼此聚集并支持連續(xù)生長(zhǎng)。以下進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明了顆粒的適合組合物、形狀和尺寸。實(shí)施例顯示可以將干細(xì)胞培養(yǎng)(如人胚胎干細(xì)胞2D集落培養(yǎng))接種到微載體顆粒上并在存在ROCK抑制劑的情況下通過(guò)一次或多次傳代來(lái)生長(zhǎng)數(shù)代。可以通過(guò)如機(jī)械或酶促解離或兩種方法組合的任何方式從表面移出而使干細(xì)胞傳代。在顆粒上，微載體顆粒培養(yǎng)物可以世代生長(zhǎng)?？商鎿Q地或另外，培養(yǎng)物可以在常規(guī) 2D培養(yǎng)上生長(zhǎng)一代或多代?？梢詫⒃谖⑤d體上生長(zhǎng)的人干細(xì)胞轉(zhuǎn)移回到2D集落培養(yǎng)中，反之亦然。本發(fā)明所述的方法是未分化形式的干細(xì)胞的有效增殖的可用方法?？梢酝ㄟ^(guò)機(jī)械或酶促解離以1 2至1 10的分種率(比常規(guī)2D培養(yǎng)可能的比值要高)將微載體培養(yǎng)傳代到微載體上。這使得能夠以更快速的擴(kuò)大培養(yǎng)來(lái)更有效地利用生物材料。微載體培養(yǎng)中的細(xì)胞體積得率通常是2D集落對(duì)照的2至4倍。通過(guò)本發(fā)明所述的方法增殖的人干細(xì)胞的體積得率可以高達(dá)200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/毫升或以上。本發(fā)明所述的方法能夠使人干細(xì)胞在顆粒之間傳代9次或以上，如下文中將進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明的。本發(fā)明所述的方法能夠使保持其多潛能特征的干細(xì)胞增殖。實(shí)施例顯示根據(jù)本發(fā)明所述的方法和組合物所增殖的人胚胎干細(xì)胞能夠維持干細(xì)胞的一種或多種生物學(xué)特征。 因此，增殖的干細(xì)胞顯示了對(duì)于5次或以上的傳代多潛能標(biāo)志物(Oct-4、Tra-1-60和mAb 84)的表達(dá)，這與作為2D集落培養(yǎng)所生長(zhǎng)的干細(xì)胞等同，并且增殖的干細(xì)胞保留了正常染色體組型。顯著地，通過(guò)將干細(xì)胞錨定在微載體上，有可能在較大規(guī)模的轉(zhuǎn)瓶中使細(xì)胞連續(xù)傳代?？梢允褂帽景l(fā)明所述的方法使任何干細(xì)胞增殖。這些可以包括靈長(zhǎng)類(lèi)干細(xì)胞，如猴、猿或人干細(xì)胞。所述干細(xì)胞可以包括胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞。所述干細(xì)胞可以包括誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞。例如，所述干細(xì)胞可以包括人胚胎干細(xì)胞(hESC)。在下文中將進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明適合在本發(fā)明所述方法和組合物中使用的這些和其它干細(xì)胞。與已知的“2D” 培養(yǎng)法相比，本發(fā)明所述的方法和組合物具有多種優(yōu)勢(shì)。所述顆粒在連接干細(xì)胞方面比2D 集落培養(yǎng)基底更有效。出于這種及其它原因，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞能夠更有效地傳代。本發(fā)明所述的方法能夠使干細(xì)胞凍融(冷凍和解凍)幾個(gè)循環(huán)。它們可以直接在微載體上冷凍并融化到生長(zhǎng)培養(yǎng)基(無(wú)論是常規(guī)平板培養(yǎng)或是在顆粒微載體上)中。在微載體上增殖的干細(xì)胞可以在符合GMP的無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。本發(fā)明所述的方法基本能夠培養(yǎng)和維持未分化狀態(tài)的干細(xì)胞，如胚胎干細(xì)胞。培養(yǎng)(例如，在微載體上)的或從其上分離的增殖的干細(xì)胞可以是部分或完全分化的。增殖的干細(xì)胞可以用于形成擬胚體以備今后使用。與需要在擬胚體形成之前從2D 生長(zhǎng)表面上除去細(xì)胞的額外步驟的在先方法不同，可以簡(jiǎn)單地將在微載體上生長(zhǎng)的干細(xì)胞轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基中以直接形成擬胚體。因此，本發(fā)明所述的方法和組合物能夠使生長(zhǎng)表面或基底上的干細(xì)胞定向分化而不需要將干細(xì)胞從生長(zhǎng)表面或基底中除去。本發(fā)明所述的方法和組合物能夠使培養(yǎng)的干細(xì)胞擴(kuò)增并放大至較大體積。放大至生物反應(yīng)器或工業(yè)規(guī)模使得能夠更高產(chǎn)地培養(yǎng)干細(xì)胞。在攪拌培養(yǎng)中，使干細(xì)胞能夠在微載體上生長(zhǎng)的能力意味著可以將培養(yǎng)放大至懸浮條件?？梢允褂萌鏦ave生物反應(yīng)器的可控生物反應(yīng)器或攪拌培養(yǎng)。與當(dāng)前錨定依賴性2維集落培養(yǎng)的限制相比，這使得細(xì)胞能夠在較大的體積中擴(kuò)增。在高達(dá)100升的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模懸浮培養(yǎng)是有可能的。ROCK 抑制劑根據(jù)本發(fā)明的方法涉及在存在ROCK抑制劑的情況下，多潛能或多能細(xì)胞的培養(yǎng)、 生長(zhǎng)、增殖、繁殖、群體擴(kuò)增和/或分化。ρ激酶(P -相關(guān)卷曲螺旋激酶或ROCK ；GenBank登錄號(hào)No. NM_005406)、絲氨酸 /蘇氨酸激酶，用作P的靶蛋白(其中存在三種同種型PA、PB和PC)并且已被鑒定為形成PA誘導(dǎo)性應(yīng)力纖維和局部粘附的介體。最初ROCK I (可替換地，稱(chēng)為ROK b)和ROCK II (還被稱(chēng)為P激酶或ROK a)被分離出來(lái)作為PA-GTP相互作用蛋白。這兩種激酶在人中具有64%的整體同一性，其中催
14化激酶域中的同一性為89%。兩種激酶均含有卷曲螺旋區(qū)(55%的同一性)和被Cl保守區(qū)分開(kāi)的血小板-白細(xì)胞C激酶底物同源性(PH)域(80%的同一性)。有關(guān)ROCK激酶抑制的綜述，參見(jiàn) Olson 等人(Current Opinion in Cell Biology 2008，20 :242_248，其作為參考并入本文)。通過(guò)下游靶蛋白的磷酸化作用，ROCK促進(jìn)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白-介導(dǎo)的收縮力的產(chǎn)生。ROCK使LIM激酶-1和激酶-2 (LIMK1和LIMK2)在它們的激活環(huán)中的保守蘇氨酸處發(fā)生磷酸化，從而提高了 LIMK活力，并且隨后使絲切蛋白磷酸化，從而阻斷了它們的纖維型肌動(dòng)蛋白切割活力。ROCK還直接使MLC磷酸酶的調(diào)控肌球蛋白輕鏈(MLC)和肌球蛋白結(jié)合亞基(MYPTl)磷酸化以抑制催化活力。ROCK的激活導(dǎo)致發(fā)生了促進(jìn)作用力產(chǎn)生和形態(tài)變化的一系列事件。這些事件直接促使多個(gè)肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白介導(dǎo)的過(guò)程，如細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、粘附、平滑肌收縮、軸突回縮和噬菌作用。另外，ROCK激酶在繁殖、分化、細(xì)胞凋亡和致癌性轉(zhuǎn)化中起作用，盡管這些應(yīng)答可以是細(xì)胞類(lèi)型依賴性的。在本說(shuō)明書(shū)中，“ROCK抑制劑”是能夠抑制ROCK I和/或ROCK II的分子、化合物、物質(zhì)或組合物，并且優(yōu)選地具有小于100 μ M的IC5tl，更優(yōu)選地，小于10 μ Μ,更優(yōu)選地，小于1 μ Μ，并且更優(yōu)選地，小于900ηΜ或者小于或等于約800ηΜ、700ηΜ、600ηΜ或500ηΜ之一。 在本發(fā)明中有用的ROCK激酶的IC5tl可以與Υ-27632的基本相同或更優(yōu)(S卩，更小)或者在 Υ-27632的IC5tl(500ηΜ)之內(nèi)，如在相同ROCK激酶測(cè)定中所測(cè)量的。在本說(shuō)明書(shū)中，“R0CK抑制劑”還指金硫葡糖和LY^4002，其主要已知是NFK B和 PI3激酶的抑制劑。照此，在本發(fā)明所述的方面和實(shí)施方式中的ROCK抑制劑的使用包括 NF κ B禾Π /或ΡΙ3激酶的抑制劑的使用。在本領(lǐng)域中，ROCK激酶抑制測(cè)定是熟知的。例如，HTScan R0CK2激酶測(cè)定試劑盒 #7508 (Cell Signalling Technology, Inc.)和 R0CK-II 測(cè)定試劑盒產(chǎn)物 No. R8163 和 R8164(Molecular Devices)。在本發(fā)明的方法中，加入到培養(yǎng)中的ROCK抑制劑的量通常將考慮生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)和培養(yǎng)規(guī)模。例如，ROCK抑制劑的典型濃度將在10-50 μ M的范圍內(nèi)?？梢詫OCK抑制劑定期加入到培養(yǎng)基中(例如，每日一次)以維持所需的濃度?？梢詫OCK抑制劑加入到培養(yǎng)基中從而使培養(yǎng)基中ROCK抑制劑的濃度為下列之一至少1 μ Μ、至少2 μ Μ、至少3 μ Μ、至少4 μ Μ、至少5 μ Μ、至少6 μ Μ、至少7 μ Μ、至少8 μ Μ、 至少9 μ Μ、至少10 μ Μ、至少15 μ Μ、至少20 μ Μ、至少30 μ Μ、至少40 μ M或至少50 μ Μ。ROCK 抑制劑可以任選地以小于下列之一的濃度存在于培養(yǎng)基中100 μ Μ、90 μ Μ、80 μ Μ、70 μ M 或 60 μ Μ。ROCK抑制劑可以作為活性劑的鹽、堿、酯或前體藥物提供。ROCK抑制劑的實(shí)例包括(A) Υ-27632Υ-27632是ROCK I和ROCK II的高效、細(xì)胞可滲透、選擇性和ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑， 其IC50為約SOOnM并且具有結(jié)構(gòu)(1)，如下
Y-27632通常作為二鹽酸化物[(R)_(+)_反式-N_(4-吡啶基)-4-(1-氨乙基)_環(huán)己烷羧酰胺.2HC1]生產(chǎn)和銷(xiāo)售。在下列發(fā)表的論文中對(duì)Y-27632進(jìn)行了綜述，所有文獻(xiàn)作為參考并入本文· Calcium sensitization of smooth muscle mediated by a Rho-associated protein kinase in hypertension :M. Uehata,et al. ；Nature 389,990(1997)· Molecular dissection of the Rho-associated protein kinase(pl60R0CK)-regulated neurite remodeling in neuroblastoma Nl E-115 cells M. Hirose, et al. J. Cell Biol.141，1625 (1998)· Signaling from Rho to the actin cytoskeleton through protein kinases ROCK and LIM-kinase :M. Maekawa,et al. ；Science 285,895(1999)· Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors :S. P. Davies, et al. ；Biochem. J. 351,95 (2000)· Use and properties of ROCK-specific inhibitor Y-27632 :S.Narumiya, et al. ；Meth. Enzymol. 325, 273 (2000)· Pharmacological properties of Y-27632, a specific inhibitor of rho-associated kinases :T.Ishizaki，et al. ；Mol· Pharmacol· 57,976(2000)·Α pl60R0CK_specific inhibitor,Y-27632,attenuates rat hepatic stellate cell growth :H. Iwamoto, et al. ； J. Hepatol. 32, 762 (2000)· Y-27632, an inhibitor of rho-associated protein kinase， suppresses tumor cell invasion via regulation of focal adhesion and focal adhesion kinase F. Imamura, et al. ；Jpn. J. Cancer Res. 91,811 (2000) · The effect of a Rho kinase inhibitor Y-27632 on superoxide production， aggregation and adhesion in human polymorphonuclear leukocytes :A. Kawaguchi，et al. ；Eur. J. Pharmacol. 403,203 (2000)· Antagonism of Rho-kinase stimulates rat penile erection via a nitric oxide-independent pathway :K.Chitaley,et al. ；Nat. Med. 7,119(2001)· Inhibition of intrahepatic metastasis of human hepatocellular carcinoma by Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632 :M. Takamura, et al. ；Hepatology 33,577(2001)· Inhibition of high K+_induced contraction by the ROCKs inhibitor Y-27632 in vascular smooth muscle :possible involvement of ROCKs in a signal transduction pathway :K.Sakamoto, et al. ； J. Pharmacol. Sci. 92,56(2003).Φ)ΗΑ_1077(法舒地爾)HA-1077是肌球蛋白輕鏈激酶和Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II的抑制劑。它抑制ΡΚ β Ι.ΡΚ β II和PKC(的易位并且是具有抗血管痙攣性質(zhì)的細(xì)胞可滲透Ca2+拮抗劑。 它的分子量為約四1. 36。它通過(guò)與ATP競(jìng)爭(zhēng)抑制R0CK。對(duì)于ROCK 1的IC5ci為1. 2_ol/ 1，而對(duì)于R0CK2的IC5ci為0. 82mmol/l0它還對(duì)其它絲氨酸/蘇氨酸激酶具有非特異性抑制作用，例如，對(duì)于PKA的IC5ci為5.3mmol/l，對(duì)于I5KCa的IC5C)> 100mmol/l。該二鹽酸化
物具有結(jié)構(gòu)(2)，如下:
權(quán)利要求
1.體外培養(yǎng)多潛能或多能細(xì)胞的方法，所述方法包括(i)將多潛能或多能細(xì)胞連接至多個(gè)微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物，以及( )在存在ROCK抑制劑的情況下，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)所述微載體-細(xì)胞復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述ROCK抑制劑選自Y-27632、HA-1077(法舒地爾)、HA-1100(羥基法舒地爾)、!1-1152、3-(4-吡啶基)-1!1-吲哚力44-吡啶基)4' -(2， 4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY^4002或其鹽、堿、酯或前藥。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述方法還包括使來(lái)自(ii)的所述培養(yǎng)的細(xì)胞傳代，其中傳代后的細(xì)胞為多潛能或多能的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述方法還包括(iii)使來(lái)自(ii)的所述培養(yǎng)的細(xì)胞傳代；和(iv)經(jīng)過(guò)至少2次傳代，重復(fù)步驟(i)-(iii)，其中，在步驟(iv)之后培養(yǎng)的細(xì)胞是多潛能或多能的。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體不具有基質(zhì)涂層。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體的表面涂覆有基質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述基質(zhì)包括細(xì)胞外基質(zhì)組分。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述基質(zhì)包括MatrigelTM(BDBiosciences)、透明質(zhì)酸、層粘連蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、膠原、彈性蛋白、硫酸乙酰肝素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述基質(zhì)包括層粘連蛋白、I型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和內(nèi)功素1的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為干細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為胚胎干細(xì)胞。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為成體干細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類(lèi)或人。
15.根據(jù)權(quán)利要求4至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(iv)中，經(jīng)過(guò)下列之一重復(fù)步驟(i)-(iii)至少傳代3次、至少傳代4次、至少傳代5次、至少傳代6次、至少傳代7 次、至少傳代8次、至少傳代9次、至少傳代10次、至少傳代11次、至少傳代12次、至少傳代13次、至少傳代14次、至少傳代15次、至少傳代16次、至少傳代17次、至少傳代18次、 至少傳代19次、至少傳代20次、至少傳代21次、至少傳代22次、至少傳代23次、至少傳代 24次、至少傳代25次、至少傳代30次、至少傳代40次、至少傳代50次、至少傳代60次、至少傳代70次、至少傳代80次、至少傳代90次、至少傳代100次。
16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體包含纖維素、葡聚糖、 羥基化甲基丙烯酸酯、膠原、明膠、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一種或多種，或者由纖維素、葡聚糖、羥基化甲基丙烯酸酯、膠原、明膠、聚苯乙烯、塑料、玻璃、陶瓷、硅酮中的一種或多種組成。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體為大孔或微孔 carboseed 微載體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體偶聯(lián)有魚(yú)精蛋白或聚賴氨酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體帶正電荷。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體帶正表面電荷。
21.根據(jù)權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體是親水性的。
22.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體是桿狀的。
23.根據(jù)權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述微載體具有基本球形形狀。
24.根據(jù)權(quán)利要求1至M中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(ii)中，將所述細(xì)胞培養(yǎng)足以使在培養(yǎng)中的細(xì)胞的數(shù)目擴(kuò)增的一段時(shí)間。
25.根據(jù)權(quán)利要求4至M中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(iv)之后，至少60%的在培養(yǎng)中的細(xì)胞是多潛能或多能的。
26.根據(jù)權(quán)利要求4至25中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟(iv)之后，至少60%的在培養(yǎng)中的細(xì)胞表達(dá)0ct4、SSEA4、TRA-1-60和Mab84中的一種、兩種、三種或全部。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括在無(wú)血清培養(yǎng)基、或干細(xì)胞條件培養(yǎng)基或無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞條件下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中還將飼養(yǎng)細(xì)胞連接到所述微載體上。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)還包括連接到與所述多潛能或多能細(xì)胞所連接的微載體不同的微載體上的飼養(yǎng)細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至四中任一項(xiàng)所述的方法，還包括誘導(dǎo)獲自所述培養(yǎng)的多潛能或多能細(xì)胞的分化。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述方法包括將所述微載體-細(xì)胞復(fù)合物置于誘導(dǎo)所述細(xì)胞分化的條件下。
32.根據(jù)權(quán)利要求1至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括將獲自所述培養(yǎng)法的多潛能或多能細(xì)胞與所述微載體分離，并且在誘導(dǎo)所述細(xì)胞分化的條件下在非微載體培養(yǎng)中培養(yǎng)所述分離的細(xì)胞的步驟。
33.根據(jù)權(quán)利要求1至四中任一項(xiàng)所述的方法，還包括獲自所述培養(yǎng)法的多潛能或多能細(xì)胞的體外分化，其包括(a)將獲自所述培養(yǎng)法的多潛能或多能細(xì)胞連接至多個(gè)第二微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物，(b)在誘導(dǎo)所述細(xì)胞分化的條件下，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)來(lái)自(a)的所述微載體-細(xì)胞復(fù)合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述方法還包括(c)將獲自步驟(b)的分化的細(xì)胞連接至多個(gè)第三微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物；和(d)在誘導(dǎo)已分化細(xì)胞進(jìn)一步分化的條件下，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)來(lái)自(c)的所述微載體-細(xì)胞復(fù)合物。
35.根據(jù)權(quán)利要求30至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分化培養(yǎng)條件包括在存在 ROCK抑制劑的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
36.根據(jù)權(quán)利要求30至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述分化培養(yǎng)條件包括在沒(méi)有 ROCK抑制劑的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞。
37.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至四中任一項(xiàng)所述的方法獲得的多潛能或多能細(xì)胞。
38.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求30至36中任一項(xiàng)所述的方法獲得的分化細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求30至36中任一項(xiàng)所述的方法，其中培養(yǎng)所述分化的細(xì)胞以形成擬胚體。
40.通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法獲得的擬胚體。
41.一種使多潛能或多能細(xì)胞體外分化的方法，所述方法包括將多潛能或多能細(xì)胞連接至多個(gè)微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物，其中所述微載體的表面未涂覆或涂覆有基質(zhì)，以及在存在ROCK抑制劑的情況下和在誘導(dǎo)所述細(xì)胞分化的條件下，在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)所述微載體-細(xì)胞復(fù)合物。
42.多潛能或多能細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)，其中將所述細(xì)胞連接到多個(gè)微載體上，由此形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物，并且所述懸浮培養(yǎng)基包含ROCK抑制劑。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的懸浮培養(yǎng)，其中所述ROCK抑制劑以至少ΙμΜ的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的懸浮培養(yǎng)，其中所述ROCK抑制劑以至少ΙΟμΜ的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
45.根據(jù)權(quán)利要求42至44中任一項(xiàng)所述的懸浮培養(yǎng)，其中所述ROCK抑制劑選自 Υ-27632、ΗΑ-1077(法舒地爾)、ΗΑ-1100 (羥基法舒地爾)、Η_1152、3_(4-吡啶基)-IH-吲哚、N-(4-吡啶基)-N' -(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY^4002或其鹽、堿、酯或前藥。
46.ROCK抑制劑在多潛能或多能細(xì)胞體外懸浮培養(yǎng)中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞處于微載體-細(xì)胞復(fù)合物的形式。
47.ROCK抑制劑在體外懸浮培養(yǎng)的多潛能或多能細(xì)胞的分化中的應(yīng)用，其中所述細(xì)胞處于微載體-細(xì)胞復(fù)合物的形式。
48.根據(jù)權(quán)利要求46或權(quán)利要求47所述的應(yīng)用，其中所述ROCK抑制劑選自Y_27632、 ΗΑ-1077 (法舒地爾)、ΗΑ-1100 (羥基法舒地爾)、Η_1152、3_ (4-吡啶基)-IH-吲哚、N- (4-吡啶基)-Ν' -(2，4，6-三氯苯基)脲、金硫葡糖、LY^4002或其鹽、堿、酯或前藥。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了體外培養(yǎng)多潛能或多能細(xì)胞的方法，所述方法包括將多潛能或多能細(xì)胞連接到多個(gè)微載體上以形成微載體-細(xì)胞復(fù)合物，以及在存在ROCK抑制劑的情況下在懸浮培養(yǎng)中培養(yǎng)所述微載體-細(xì)胞復(fù)合物。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102428172SQ201080021929
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2010年3月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月20日
發(fā)明者史蒂文·侯, 安德烈·朔, 肖爾·魯維尼, 陳冠良 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局