一種白血病治療用的細胞凍存液的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織細胞培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種細胞凍存液及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] 干細胞(stem cell)是一類具有自我復制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可 以分化成多種功能細胞。根據干細胞所處的發(fā)育階段分為胚胎干細胞和成體干細胞。根據 干細胞的發(fā)育潛能分為三類:全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞(專能干細胞）。干細胞 是一種未充分分化，尚不成熟的細胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學界稱 為"萬用細胞"。在腦、脊髓等所有神經組織中，不同的神經干細胞類型產生的子代細胞種類 不同，分布也不同。雖然該細胞利用廣泛，但要廣泛地應用于臨床治療領域，其來源和數量 仍遠遠不能滿足需求。因此神經干細胞的體外大規(guī)模擴增，以及將擴增后的細胞進行冷凍 保存，是本領域技術人員迫切的需求。
[0003] 白血病是危害人類的重要的腫瘤之一，在白血病治療和研究中，對于白血病干細 胞的瞬時需求量很大，而傳統(tǒng)的分離方法不可能馬上獲得，因此，批量貯存，一起取出應用 是必要的，但是常規(guī)的貯存方法效果不好，而冷凍的方法卻有很大的局限性。這是因為細胞 凍存的過程會顯著改變細胞的熱力學、化學和物理環(huán)境，同時伴隨生物性損傷的危險。影響 凍存效率的因素主要有:細胞濃度、冷凍速率以及凍存液。目前，干細胞凍存使用的凍存液 有含血清和無血清的兩類，由于血清具有成分復雜、質量不穩(wěn)定、價格昂貴等缺點，無血清 凍存和復蘇技術成為發(fā)展趨勢。低溫保存干細胞主要依靠抗凍液二甲基亞砜(DMSO)和血清 的保護。常用到的細胞保護劑還有羥乙基淀粉OES )、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO會對細胞 產生毒性作用，對凍存的干細胞造成不可逆的損傷。為獲得來源方便的干細胞，開展有效的 干細胞凍存方法是本領域迫切的需求，建立一種長期低溫保存干細胞的方法對于促進神經 干細胞的研宄和應用具有重大意義。
【發(fā)明內容】
[0004] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種細胞冷凍保存液以及相應的制備方法及使 用方法。
[0005] 本發(fā)明的技術方案如下： 一種細胞冷凍保存液，其特征在于由如下各組分組成:其特征是冷凍存液中含有：二 甲基亞砜5% w/v，0.5% w/v低密度脂蛋白，1% w/v的海藻糖，1% w/v卵磷脂，多肽1% w/v， bFGF 1% w/v，維生素 E 1% w/v，最后用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容至 100ml，所述多肽的序列如SEQ ID NO: 1-16任一所示。所述多肽有申請人通過前期的大量的 基因庫篩選得到，所述多肽具有保護細胞免受損傷的功能。其名稱分別為LD-I、LD-3、LD-4、 LD-5、LD-8、LD-9、LD-10、LD-13、LD-15、LD-16、LD-21、LD-23、LD-25、LD-27、LD-28、LD-30，其 依次對應于SEQ ID NO: 1-16。
[0006] 在本發(fā)明的細胞的凍存液中，海藻糖以及維生素 E和多肽具有明確的抵御外來傷 害對細胞的損傷，特別是多肽，還具有保護細胞免受凍存時冰結晶對細胞的損傷。
[0007] 本發(fā)明還提供了一種細胞的凍存液的制備方法，即將所述各組分混合搖勻即成。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種神經細胞凍存方法，包括以下步驟： A. 凍存液制備：制備所述的細胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法將各組分按照 相應的比例混合即可獲得； B. 細胞懸液制備:培養(yǎng)生長成單層的神經細胞一瓶，0.20%胰蛋白酶液消化4分鐘，棄胰 酶液，加入DMEM培養(yǎng)液15ml，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，離心4000轉/分，棄上清，加入步 驟A凍存液2ml，混均，置入無菌的凍存管內； C. 冷凍:先將凍存管在4°C下凍存30min，然后放入-30°C凍存Ih，再放入-80° C凍存3h， 最后移入液氮中保存； D. 細胞復蘇:取出凍存管快速置于37°C水浴，震蕩直至細胞懸液完全融化，然后用5倍 DMEM液稀釋，1000r/min離心5min，離心去除上清液，再重復3次。所述細胞懸浮濃度為IO8細 胞細胞/ml。
[0009] 本發(fā)明的有益效果： 本發(fā)明的細胞凍存液，復蘇細胞存活率可達99%以上，較使用常規(guī)細胞凍存液的復蘇存 活率有了顯著提高，基本上沒有細胞的損耗。
[0010] 本發(fā)明的干細胞凍存液可以長期保存干細胞，細胞活性不發(fā)生變化，保證了細胞 生物學活性。
[0011] 本發(fā)明神經細胞凍存方法，操作簡單可行，價格適宜，具有較好的實用價值。
【具體實施方式】
[0012] 實施例1細胞凍存液的制備 將二甲基亞砜5% w/v，0.5% w/v低密度脂蛋白，1% w/v的海藻糖，1% w/v卵磷脂，多肽 1% w/v，bFGF 1% w/v，維生素 E 1% w/v，最后用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容 至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0013]實施例2細胞凍存液的制備 將二甲基亞砜5% w/v，0.5% w/v低密度脂蛋白，1% w/v的海藻糖，1% w/v卵磷脂，多肽 1% w/v，bFGF 1% w/v，維生素 E 1% w/v，最后用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容 至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0014] 實施例3細胞凍存液的制備 將二甲基亞砜5% w/v，0.5% w/v低密度脂蛋白，1% w/v的海藻糖，1% w/v卵磷脂，多肽 1% w/v，bFGF 1% w/v，維生素 E 1% w/v，最后用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容 至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID N0:3所示。
[0015] 實施例4細胞凍存液的制備 將二甲基亞砜5% w/v，0.5% w/v低密度脂蛋白，1% w/v的海藻糖，1% w/v卵磷脂，多肽 1% w/v，bFGF 1% w/v，維生素 E 1% w/v，最后用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容 至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID N0:4所示。
[0016] 實施例5細胞凍存液的制備 將二甲基亞砜5% w/v，0.5% w/v低密度脂蛋白，1% w/v的海藻糖，1% w/v卵磷脂，多肽 1% w/v，bFGF 1% w/v，維生素 E 1% w/v，最后用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容 至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID N0:5所示。
[0017]實施例6細胞凍存液的制備 將二甲基亞砜5% w/v，0.5% w/v低密度脂蛋白，1% w/v的海藻糖，1% w/v卵磷脂，多肽 1% w/v，bFGF 1% w/v，維生素 E 1% w/v，最后用DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清按照1:1的比例定容 至100ml，其中所述多肽的序列如SEQ ID NO:6所示。
[0018]實施例7細胞凍存液的制備 將二甲基亞砜5% w/v，0.5% w/v低密度脂蛋白，1% w