專利名稱：用于分子生物學(xué)應(yīng)用的包含核酸聚合酶的干燥和穩(wěn)定的即用組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸聚合酶的穩(wěn)定化，且涉及還可用于診斷的目的的包含這樣的聚合酶穩(wěn)定劑的即用反應(yīng)組合物和試劑盒的制備。
現(xiàn)有技術(shù)核酸的體內(nèi)和體外合成通過鏈的準(zhǔn)確復(fù)制來控制，其中每一個(gè)單一核酸鏈確定完全互補(bǔ)的鏈中的核苷酸的順序。DNA復(fù)制的具體機(jī)制必須通過稱為聚合酶的酶家族使用，且通過聚合酶來進(jìn)行。從各種有機(jī)體純化的聚合酶通常用于研究和診斷，特別是隨著基因擴(kuò)增的各種系統(tǒng)例如聚合酶鏈反應(yīng)的出現(xiàn)(PCR-Mullis等人，美國專利第4，683，195號；第4，683，202 號；和第4，800，159號)。PCR的基本配置由兩種合成引物、核酸模板和聚合酶組成。每一種引物與靶核酸中的區(qū)互補(bǔ)，或更好是與兩個(gè)互補(bǔ)的鏈中的一個(gè)互補(bǔ)。聚合酶明顯地是擴(kuò)增系統(tǒng)的關(guān)鍵性部分，這是由于聚合酶以3’方向按順序地加入核苷酸，將它們鍵合至能夠通過氫鍵與模板鏈結(jié)合的靶特異性多核苷酸引物的羥基的能力。標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增混合物可以具有以下組成dNTP、緩沖液、MgCl2、正向引物、反向引物、 Taq聚合酶、DNA禾口 H2O。反應(yīng)混合物必須被加熱至90_95°C，以使模板DNA的雙螺旋變性。在變性步驟之后，將溫度降低至50-60°C，以使得引物與互補(bǔ)鏈退火；聚合酶通過在通常被稱為延伸 (extension)的步驟中延長所述引物來完成該過程。PCR反應(yīng)中使用的酶已經(jīng)從嗜熱生物分離，且因此在高溫下是穩(wěn)定的。然而，即使這些高熱穩(wěn)定的酶也可能由于化學(xué)劑、蛋白酶或環(huán)境變化而失活。使用熱穩(wěn)定的酶，如同其他酶一樣，常常需要伴隨使用變性條件例如高溫如對于 PCR的情況、具有次優(yōu)濃度的輔因子和底物的含水混合物和最大酶活性的非最佳的pH。該情況表明，酶的穩(wěn)定化是強(qiáng)烈所需的且對于酶的長期保存來說是必需的，尤其是如果連同其他試劑和用于擴(kuò)增核酸的即用反應(yīng)混合物一起被包括在含水混合物中。許多用于穩(wěn)定聚合酶的技術(shù)是已知的且已經(jīng)被描述在專利和申請中。所述技術(shù)包括酶的化學(xué)改性、在固相支持體上的固定、適體的使用、酶的基因工程和穩(wěn)定劑的加入。已經(jīng)證明穩(wěn)定活性的一組物質(zhì)是表面活性劑，表面活性劑在酶的活性形式和包含它們的水環(huán)境之間的界面處起作用。分子生物學(xué)技術(shù)中使用的穩(wěn)定酶的常用方法是通過將每一種酶的液體制劑儲存在-20°C下的包含50%甘油和還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)或β-巰基乙醇的溶液中。該程序足以保存酶的活性達(dá)幾個(gè)月，且活性損失最小。相比之下，當(dāng)儲存在室溫或在+4°C下時(shí)，酶活性迅速地?fù)p失。
非離子型洗滌劑例如Triton X_100和Tween 20已經(jīng)被表明穩(wěn)定DNA聚合酶活性。 專利申請EP 776，970A1描述了包括Tween 20 和NP-40 的非離子型洗滌劑穩(wěn)定熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶的活性的用途。已表明低濃度的十二烷基硫酸鈉(SDQ穩(wěn)定酶活性。使酶能夠容忍長時(shí)間暴露于室溫或簡短暴露于較高溫度的保存酶的方法，仍然是對于郵政托運(yùn)的更容易的和更成本有效的管理和新領(lǐng)域中的利用的唯一的現(xiàn)實(shí)限制。酶且尤其是聚合酶，包括衍生自嗜熱生物的聚合酶，即通常用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的聚合酶， 至今已經(jīng)在低于+2-8°C且通常在-20°C的溫度下被運(yùn)輸。在用于保存生物材料的方法中，冷凍干燥至今已經(jīng)用于保存食品、細(xì)胞、生物膜、 生物大分子，且甚至是酶。冷凍干燥方法包括從被凍結(jié)的樣品除去水，S卩，在低于室內(nèi)壓力條件下不經(jīng)過液態(tài)蒸發(fā)固體的含水組分。蛋白制劑在被干燥之前通常被凍結(jié)以減少由于干燥弓I起的結(jié)構(gòu)變形。不完全干燥的冷凍干燥，即還包含低百分比的水的冷凍干燥，比完全干燥的冷凍干燥似乎確保更好的保存，尤其是如果隨后在不高于+4-10°C的溫度下保存時(shí)。然而，甚至在這些條件下，存在少量的酶活性損失。然而，一些酶例如聚合酶在沒有冷凍保護(hù)劑下冷凍干燥之后完全失活，與冷凍干燥的類型(干燥或以其他方式)無關(guān)。許多具有冷凍防護(hù)活性的物質(zhì)或添加劑已經(jīng)用于或被建議用于穩(wěn)定聚合酶。例如，US 5，614，387和US 5，834，2M描述了用于制備用來擴(kuò)增核酸的穩(wěn)定的凍干酶組合物的方法和組合物，其中海藻糖和/或聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)用作防凍劑。已知技術(shù)的分析和目前出售的產(chǎn)品表明，保存聚合酶的問題和簡化聚合鏈反應(yīng)混合物的制備(和因此甚至在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中PCR反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化)的潛力是時(shí)下非常關(guān)注的和在連續(xù)的開發(fā)中。市售的被稱為puRe Taq Ready-To-Go PCR Beads (GE Healthcare)的系統(tǒng)由用于標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增的單一劑量的預(yù)混合凍干制劑組成。然而，該系統(tǒng)具有用被描述為先導(dǎo)酶(leading enzyme)的特異性Taq聚合酶(puRe Taq聚合酶)來制備的由于其穩(wěn)定性和純度的限制。相反，本發(fā)明的所建議的方法可以與所有的聚合酶一起使用，因?yàn)槔w維二糖能夠穩(wěn)定和保護(hù)所有的Taq聚合酶，不管是簡單的聚合酶還是熱啟動(dòng)聚合酶(Hot Start Polymerase)或甚至它們的活性片段例如Klenow。概述本發(fā)明涉及適合于用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩母稍锘騼龈傻慕M合物，該組合物包含被穩(wěn)定為經(jīng)得起冷凍干燥和在高達(dá)的溫度下儲存的核酸聚合酶，其特征在于，所述組合物具有在0. 01至250單位(0，4-10000U/ml)范圍內(nèi)的核酸聚合酶濃度、在50mM(17, 115g/L) 至500mM(171，15g/L)范圍內(nèi)的濃度的纖維二糖和緩沖液。所述核酸聚合酶是優(yōu)選地選自由以下組成的組的DNA聚合酶Taq聚合酶、熱啟動(dòng)聚合酶或它們的活性片段。所述組合物還被稱為“凍干和即用的擴(kuò)增混合物”或“Universal Master Mix”。本發(fā)明的另外的方面涉及適合于用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩慕M合物，該組合物包含被穩(wěn)定為經(jīng)得起冷凍干燥和在高達(dá)的溫度下儲存的核酸聚合酶，其特征在于，所述組合物具有在0. 01至250單位范圍內(nèi)的核酸聚合酶濃度、在50至500mM范圍內(nèi)的濃度的纖維二糖、緩沖液、dNTP、KCl 和 MgCl2。本發(fā)明還涉及組合物用于核酸的擴(kuò)增尤其是用于分子生物學(xué)應(yīng)用的用途，分子生物學(xué)應(yīng)用例如但不限于，PCR、實(shí)時(shí)PCR、熔解曲線分析、高分辨率熔解曲線分析、測序、定量熒光PCR、多重PCR、全基因組擴(kuò)增、等溫?cái)U(kuò)增。本發(fā)明還另外涉及用于核酸的擴(kuò)增的方法，該方法包括以下步驟i.在水中或在緩沖液中重構(gòu)本發(fā)明的組合物； 加入靶DNA特異性引物；iii.加入核酸模板；iv任選地加入選自由以下組成的組的試劑中的一種或多種KC1、MgCl2, dNTP、至少一種任選地被標(biāo)記的探針、還原劑和另外的穩(wěn)定劑。本發(fā)明還提供即用產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含根據(jù)本發(fā)明的干燥或凍干的組合物和用于重構(gòu)所述組合物的溶劑。此外，本發(fā)明包括用于DNA樣品的PCR擴(kuò)增的試劑盒，該試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的組合物和任選的關(guān)于聚合酶鏈反應(yīng)中的酶的重構(gòu)和使用的說明書。本發(fā)明的特別優(yōu)選的實(shí)施方式由纖維二糖用于在冷凍干燥和在高達(dá)55°C的溫度下長期儲存期間保存核酸聚合酶的用途組成。附圖描述

圖1.在完成冷凍干燥過程之后立即進(jìn)行的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1-6 用來自公司X的熱啟動(dòng)聚合酶制備的凍干和即用的組合物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物；在冷凍干燥之前的體積25 μ 1 (泳道1-3)或9. 1 μ 1 (泳道4-6)。泳道7_12 用公司 Y的熱啟動(dòng)DNA聚合酶制備的凍干和即用混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；在冷凍干燥之前的體積 25 μ 1 (泳道7-9)或7. 5 μ 1 (泳道10-12)。泳道13-15 用獲自公司X的聚合酶制備的凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的PCR產(chǎn)物；在冷凍干燥之前的體積25μ 1。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β -珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲(Plasmodium spp) 18s RNA基因的片段。圖2.在室溫下或在37°C下保存三個(gè)星期之后的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。泳道1-8 用包含公司X的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的擴(kuò)增混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；在冷凍干燥之前的體積25 μ 1 (泳道1-4)或9. 1 μ 1 (泳道5-8)。泳道9_12 用包含公司X的DNA聚合酶的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；在冷凍干燥之前的體積 25 μ 1。在室溫下(泳道1-3、5-7、9-11)或在37°C下(泳道4、8、12)保存三個(gè)星期。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖3.在完成冷凍干燥過程之后立即進(jìn)行的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含(i)公司W(wǎng)的反應(yīng)緩沖液(泳道1-4)、公司X的反應(yīng)緩沖液(泳道5-8)、公司R的反應(yīng)緩沖液(泳道9-12)或公司Y的反應(yīng)緩沖液(泳道 13-19) ； (ii)獲自公司W(wǎng)的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道1、5、9和13)、獲自公司Y的熱啟動(dòng) DNA聚合酶(泳道2、6、10、14、17、18和19)、獲自公司X的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道3、7、11和15)或獲自公司R的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道4、8、12和16)。泳道17、18和19的擴(kuò)增產(chǎn)物用還分別包含 0. 25% NP-40 和 0. 25% Tween-20、IOOmM 蔗糖和 0. 25% NP_40、0. 25% Tween-20和IOOmM蔗糖的凍干和即用的混合物獲得。M 分子量標(biāo)記物"BenchTop PCR 標(biāo)記物”,Promega0PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖4.在室溫下保存六個(gè)星期之后的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物分別包含(i)公司W(wǎng)的反應(yīng)緩沖液(泳道1-4)、公司X的反應(yīng)緩沖液(泳道5-8)、公司R的反應(yīng)緩沖液(泳道9-12)或公司Y的反應(yīng)緩沖液(泳道13-19)； (i i)獲自公司W(wǎng)的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道1、5、9和13)、獲自公司Y的熱啟動(dòng)DNA聚合酶 (泳道2、6、10、14、17、18和19)、獲自公司X的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道3、7、11和15)或獲自公司R的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道4、8、12和16)。泳道17、18和19的擴(kuò)增產(chǎn)物用還分別包含 0. 25% NP-40 和 0. 25% Tween-20UOOmM 蔗糖和 0. 25% NP_40、0. 25% Tween-20 和IOOmM蔗糖的凍干和即用的混合物獲得。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖5.在完成冷凍干燥過程之后立即進(jìn)行的包含250mM蔗糖的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含(i)公司X的反應(yīng)緩沖液(泳道 1、8和9)、公司W(wǎng)的反應(yīng)緩沖液(泳道2、3、14-17)、公司R的反應(yīng)緩沖液(泳道4、5、10-13) 或公司Y的反應(yīng)緩沖液(泳道6、7、18-21) ； (ii)獲自公司X的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道 1-7)或獲自公司R的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道8-21)。在泳道1、2、4、6、8、10、14和18中使用的凍干和即用的混合物中，沒有加入物質(zhì)；在泳道3、5、7、11、15和19的凍干和即用的混合物中，將250mM蔗糖加入反應(yīng)緩沖液；在泳道9、12、16和20的凍干和即用的混合物中， 將250mM蔗糖加入儲存緩沖液，而在泳道13、17和21的凍干和即用的混合物中，將250mM 蔗糖加入反應(yīng)緩沖液和儲存緩沖液兩者中。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖6.在室溫下保存八個(gè)星期之后的包含250mM蔗糖的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含⑴公司X的反應(yīng)緩沖液(泳道1、8和9)、公司W(wǎng)的反應(yīng)緩沖液(泳道2、3、14-17)、公司R的反應(yīng)緩沖液(泳道4、5、10-13)或公司Y的反應(yīng)緩沖液(泳道6、7、18-21) ； (ii)獲自公司X的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道1_7)或獲自公司R的熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道8-21)。在泳道1、2、4、6、8、10、14和18中使用的凍干和即用的混合物中，沒有加入物質(zhì)；在泳道3、5、7、11、15和19的凍干和即用的混合物中，將250mM蔗糖加入反應(yīng)緩沖液；在泳道9、12、16和20的凍干和即用的混合物中，將250mM蔗糖加入儲存緩沖液，而在泳道13、17和21的凍干和即用的混合物中，將250mM蔗糖加入反應(yīng)緩沖液和儲存緩沖液兩者。
M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖7.在完成冷凍干燥過程之后的包含下面所描述的穩(wěn)定劑的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司W(wǎng)(泳道1-5)或獲自公司 R(泳道6-10)的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶。作為穩(wěn)定劑被加入至凍干和即用的混合物中的是200mM海藻糖(泳道2和7)、250mM蔗糖(泳道3和8)、200mM麥芽糖(泳道4 和9)或0. 025%瓊脂糖(5和10)。沒有將物質(zhì)加入到泳道1和6中使用的凍干和即用的混合物。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖8.在室溫下或在37°C下保存一個(gè)星期之后的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司W(wǎng)(泳道1-5)或獲自公司R(泳道 6-10)的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶。作為穩(wěn)定劑被加入至凍干和即用的混合物中的是200mM海藻糖(泳道2和7)、250mM蔗糖(泳道3和8)、200mM麥芽糖(泳道4和9)或 0. 025%瓊脂糖(5和10)。沒有將物質(zhì)加入到泳道1和6中使用的凍干和即用的混合物。M 分子量標(biāo)記物"BenchTop PCR 標(biāo)記物”,Promega0PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖9.在完成冷凍干燥過程之后立即進(jìn)行的包含穩(wěn)定劑的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司W(wǎng) (泳道1-5)或獲自公司R (泳道6-10)的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶。被加入至凍干和即用的混合物中的是250mM 海藻糖(泳道2和7)、6. 6%右旋糖(泳道3和8)、200mM纖維二糖(泳道4和9)或6. 6% 支鏈淀粉(5和10)。沒有將物質(zhì)加入到泳道1和6中使用的凍干和即用的混合物。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖10.在37°C下保存一個(gè)星期之后的包含穩(wěn)定劑的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司W(wǎng)(泳道1-5)或獲自公司R(泳道 6-10)的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶。被加入至凍干和即用的混合物中的是250mM海藻糖(泳道2和7)、6. 6%右旋糖(泳道3和8)、200mM纖維二糖(泳道4和9)或6. 6%支鏈淀粉(5和10)。沒有將物質(zhì)加入到泳道1和6中使用的凍干和即用的混合物。M 分子量標(biāo)記物"BenchTop PCR 標(biāo)記物”,Promega0PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖11.在完成冷凍干燥過程之后立即進(jìn)行的包含纖維二糖的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司W(wǎng)(泳道1-5)或獲自公司 R(泳道6-10)的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶。被加入至凍干和即用的混合物中的是250mM海藻糖(泳道2和7)、6. 6%右旋糖(泳道3和8)、200mM纖維二糖(泳道4和9)或 6. 6%支鏈淀粉(5和10)。沒有將物質(zhì)加入到泳道1和6中使用的凍干和即用的混合物。M 分子量標(biāo)記物"BenchTop PCR 標(biāo)記物”,Promega0PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖12.在37°C下保存兩個(gè)星期之后的包含纖維二糖的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司R的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道1-13)。將不同濃度(mM)的纖維二糖加入凍干和即用的混合物0(泳道1)、 50 (泳道 2)、100 (泳道 3)、150 (泳道 4)、200 (泳道 5)、250 (泳道 6)、300 (泳道 7)、350 (泳道 8)、400(泳道 9)、450(泳道 10)、500(泳道 11)、600(泳道 12)、700(泳道 13)。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖13.在完成冷凍干燥過程之后立即進(jìn)行的包含纖維二糖或海藻糖的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司R的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道1-16)。被加入至凍干和即用的混合物中的是100mM纖維二糖 (泳道1-5)、200mM纖維二糖(泳道6_10)或200mM海藻糖(泳道12-16)。沒有將物質(zhì)加入到泳道11中使用的凍干和即用的混合物。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖14.在37°C下保存兩個(gè)星期之后的包含纖維二糖或海藻糖的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司R的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道1-15)。被加入至凍干和即用的混合物中的是100mM纖維二糖(泳道 1-5)、200mM纖維二糖(泳道6-10)或200mM海藻糖(泳道11-15)。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片段。圖15.在55°C下保存24小時(shí)(泳道1和6)、48小時(shí)(泳道2和7)、72小時(shí)(泳道3和8)、96小時(shí)或一個(gè)星期(泳道5和10)之后的包含纖維二糖或海藻糖的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司R的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道1-10)。M 分子量標(biāo)記物"BenchiTop PCR 標(biāo)記物”，Promega。PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp ；瘧原蟲18s RNA基因的片 段。在所有的圖中，“M”對應(yīng)于Promega公司的分子量標(biāo)記物“Bench TopPCR標(biāo)記物” 的泳道；所述標(biāo)記物的片段從50bp至IOOObp變化。圖16.用凍干和即用的擴(kuò)增混合物和用參考方法獲得的野生型(Wt)DNA對照樣品 (Cl)、未知的DNA樣品(C2)、突變體DNA對照樣品(C3)以及無模板對照(N)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。圖16a.在擴(kuò)增產(chǎn)物的純化程序之前的結(jié)果。圖16b.在擴(kuò)增產(chǎn)物的純化程序之后的結(jié)果。圖17.直接測序結(jié)果。圖17a.用凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的野生型和突變體序列擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測序結(jié)果。圖17b.用參考方法獲得的野生型和突變體序列擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測序結(jié)果。圖 18. PCR 和實(shí)時(shí) PCR圖18a(i).用凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的野生型(Wt)DNA對照樣品(Cl)、未知的DNA樣品(C2)、突變體DNA對照樣品(O)以及無模板對照(N)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖18a(ii).用凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的實(shí)時(shí)PCR起始曲線(take off curve)；圖18a(iii).用凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的實(shí)時(shí)PCR定量比較結(jié)果。圖18b(i).用參考方法獲得的野生型(Wt)DNA對照樣品(Cl)、未知的DNA樣品 (C2)、突變體DNA對照樣品(C3)和無模板對照(N)擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖18b(ii).用參考方法獲得的實(shí)時(shí)PCR起始曲線；圖18b (iii).用參考方法獲得的實(shí)時(shí)PCR定量比較結(jié)果。圖19a.用凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的熔解曲線分析結(jié)果；圖19b.用參考方法獲得的熔解曲線分析結(jié)果。圖20a.用凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的高分辨率熔解曲線分析(HRM)結(jié)果；圖20b.用參考方法獲得的高分辨率熔解曲線分析(HRM)結(jié)果。圖21a.用凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的定量熒光(QF)酶蛋白色層圖 (pherogram)結(jié)果；圖21b.用參考方法獲得的定量熒光(QF)酶蛋白色層圖結(jié)果。發(fā)明詳述定義為了利于理解本發(fā)明，在下面定義了一些術(shù)語。術(shù)語“穩(wěn)定劑”意指相比于在沒有穩(wěn)定劑下保存材料，當(dāng)被加入至生物學(xué)上活性材料時(shí)可以防止或延遲活性隨時(shí)間損失的劑。術(shù)語“聚合酶”是指能夠從DNA模板和可用的核糖核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸合成核酸鏈(RNA或DNA)的酶或其活性片段。術(shù)語“聚合酶活性”是指酶由核糖核苷三磷酸或脫氧核苷三磷酸開始合成核酸鏈 (RNA或DNA)的能力。術(shù)語“緩沖液”或“緩沖劑”是指當(dāng)被加入至溶液時(shí)給予該溶液對PH變化的抵抗性的物質(zhì)或制劑。術(shù)語“還原劑”是指電子供體，S卩，將電子貢獻(xiàn)給第二物質(zhì)以還原第二物質(zhì)的原子中的一個(gè)或多個(gè)的氧化態(tài)的物質(zhì)。術(shù)語“溶液”是指含水的或非含水的混合物。
術(shù)語“緩沖溶液”是指包含緩沖劑的溶液。術(shù)語“反應(yīng)緩沖液”是指在其中進(jìn)行酶反應(yīng)的緩沖溶液。術(shù)語“儲存緩沖液”是指在其中保存酶的緩沖溶液。術(shù)語“模板”是指分析“靶”的存在的起源于生物樣品的核酸。術(shù)語“靶”是指當(dāng)根據(jù)分子生物學(xué)技術(shù)使用時(shí)，被用于擴(kuò)增反應(yīng)的特異性引物識別的核酸的區(qū)。在用于診斷用途的PCR的情況下，靶DNA由病原體的核酸組成。術(shù)語“引物”或觸發(fā)劑是指當(dāng)在誘導(dǎo)核酸合成的條件(存在核苷酸和聚合酶)下使用時(shí)能夠作為合成的觸發(fā)劑的合成的寡核苷酸。術(shù)語dNTP (脫氧核苷三磷酸)是指脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷的混合物，其中指出了脫氧核苷三磷酸中的每一種的濃度。術(shù)語“PCR產(chǎn)物”或“擴(kuò)增片段”是指由以下步驟的兩個(gè)或更多個(gè)PCR循環(huán)，即鏈聚合，產(chǎn)生的通常雙螺旋的DNA片段模板DNA鏈的變性、其與特異性引物的退火和與模板 DNA互補(bǔ)的鏈由引物的OH末端開始的延伸或延長。詳細(xì)描述本發(fā)明涉及二糖纖維二糖用于在冷凍干燥(或干燥)期間穩(wěn)定核酸聚合酶尤其是 DNA聚合酶、熱啟動(dòng)DNA聚合酶、RNA聚合酶或它們的活性片段和長時(shí)間地以該形式保存它們的用途。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及適合于用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩母稍锘騼龈傻慕M合物，該組合物包含被穩(wěn)定為經(jīng)得起冷凍干燥和在高達(dá)的溫度下的儲存的核酸聚合酶，其特征在于，所述組合物具有在0. 01至250單位的范圍內(nèi)的核酸聚合酶濃度、在 50mM(17, 115g/L)至500mM(171，15g/L)范圍內(nèi)的濃度的纖維二糖和緩沖液，其中緩沖液優(yōu)選地是Tris HCl0所述核酸聚合酶是優(yōu)選地選自由以下組成的組的DNA聚合酶Taq聚合酶、熱啟動(dòng)聚合酶或它們的活性片段。所述組合物還被稱為“凍干和即用的擴(kuò)增混合物”或“Universal Master Mix”。干燥或凍干的組合物通過從液體或凍結(jié)混合物冷凍干燥(或干燥)來獲得，其中纖維二糖的濃度包括在50mM和500mM之間或包括在150mM(51, 345g/L)和250mM(85, 575g/ L)之間或優(yōu)選地為250mM，且其中核酸聚合酶濃度在0. 01至250單位的范圍內(nèi)或優(yōu)選地為至少2單位。用于冷凍干燥的纖維二糖優(yōu)選地具有分析等級。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及適合于用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩慕M合物，該組合物包含被穩(wěn)定為經(jīng)得起冷凍干燥和在高達(dá)的溫度下的儲存的核酸聚合酶，其特征在于，所述組合物具有在0. 01至250單位的范圍內(nèi)的核酸聚合酶濃度、在50至500mM范圍內(nèi)的濃度的纖維二糖、緩沖液、dNTP, KCl和MgCl2,其中緩沖液優(yōu)選地是Tris HCl0根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，組合物優(yōu)選地包含PCR中即用形式的酶，甚至更優(yōu)選地以下試劑中的至少一種i.穩(wěn)定劑，其選自由以下組成的組表面活性劑、離子型洗滌劑或非離子型洗滌劑例如NP40、Tween 20或Triton-XlOO和/或非還原糖例如右旋糖、蔗糖、海藻糖； 還原劑，其選自由以下組成的組β -巰基乙醇、DTT或硫酸銨；iii.至少一種探針，其任選地被標(biāo)記。任選地，當(dāng)凍干組合物用于實(shí)時(shí)PCR時(shí)，該凍干組合物可以包含可以用例如熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針，所述探針選自由以下組成的組TaqMan探針 、分子Beacons 、 Scorpions探針 、HiBeacon探針 或可用于實(shí)時(shí)PCR的其他探針。當(dāng)在水中或在包含DNA的緩沖系統(tǒng)中重構(gòu)本發(fā)明的組合物時(shí)，纖維二糖的濃度包括在50mM和500mM之間，或包括在150mM和250mM之間或優(yōu)選地為250mM，且在該濃度下其不會(huì)干擾基因擴(kuò)增反應(yīng)。甚至更優(yōu)選地，組合物由即用的凍干或干燥制劑組成，該凍干或干燥制劑包含在優(yōu)選的實(shí)施方式中描述的所有試劑且被預(yù)先制備，在單一容器例如管或微板(microplate) 中或大批地重構(gòu)之后立即用于基因擴(kuò)增。本發(fā)明還涉及組合物用于可以自動(dòng)化方式進(jìn)行的核酸的擴(kuò)增尤其是用于分子生物學(xué)應(yīng)用的用途，分子生物學(xué)應(yīng)用例如但不限于，PCR、實(shí)時(shí)PCR、熔解曲線分析、高分辨率熔解曲線分析、測序、定量熒光PCR、多重PCR、全基因組擴(kuò)增、等溫?cái)U(kuò)增。本發(fā)明還提供即用產(chǎn)品，該產(chǎn)品包含根據(jù)本發(fā)明的干燥或凍干的組合物和用于重構(gòu)所述組合物的溶劑。根據(jù)本發(fā)明制備的凍干組合物導(dǎo)致由該凍干組合物進(jìn)行的PCR過程的相當(dāng)大的簡化，因而使得污染問題能夠被預(yù)防，但主要提供關(guān)于反應(yīng)所需要的核酸體積的相當(dāng)大的靈活性，且因此測試穩(wěn)健性顯著增加。該最后方面在法學(xué)上(forensic science)是特別令人感興趣的，因?yàn)楦篌w積的核酸可以與凍干組合物一起使用。此外，包含聚合酶的組合物的室溫穩(wěn)定性的相當(dāng)大的增加意味著，對獸醫(yī)和人類診斷領(lǐng)域以及食品分析領(lǐng)域特別關(guān)注的應(yīng)用變成可能，尤其是如果在非裝備精良的設(shè)施中進(jìn)行時(shí)。這些用途因此是特別優(yōu)選的。組合物在高達(dá)55°C的溫度下儲存的穩(wěn)定性的增加還提供了裝運(yùn)和儲存的更大的靈活性。本發(fā)明還進(jìn)一步涉及用于核酸的擴(kuò)增的方法，該方法包括以下步驟v.在水中或在緩沖液中重構(gòu)本發(fā)明的組合物；vi.加入靶DNA特異性引物；Vii加入核酸模板；viii.任選地加入選自由以下組成的組的試劑中的一種或多種KCl、MgCl2、dNTP、 至少一種任選地被標(biāo)記的探針、還原劑和另外的穩(wěn)定劑。本發(fā)明的另外的方面涉及一種用于制備包含在室溫下穩(wěn)定的聚合酶，優(yōu)選地DNA 聚合酶，且甚至更優(yōu)選地Taq聚合酶或還更優(yōu)選地?zé)釂?dòng)聚合酶的干燥或凍干的組合物的方法，該方法基本上由以下來表征根據(jù)被定義為“最低限度(minimal) ”的方案將所述酶 (或所述多種酶)與在50mM和500mM之間，優(yōu)選地在150mM和250mM之間的濃度的纖維二糖混合在可以由例如Tris-HCl組成的冷凍干燥和儲存緩沖液中，且優(yōu)選地在迅速凍結(jié)之后使該溶液經(jīng)歷冷凍干燥或干燥。加入至少1-5IU的量的酶最低限度方法還提供在冷凍干燥之前優(yōu)選地選自由 KCUMgCl2組成的組的鹽的加入。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是，借助于纖維二糖穩(wěn)定的系統(tǒng)來適應(yīng)來自不同制造公司的所有DNA聚合酶。此外，纖維二糖通過由纖維素開始的酶促水解系統(tǒng)來生產(chǎn)，所述纖維二糖是由植物源的葡萄糖(糖)的長鏈組成的分子。植物源保證沒有源自于細(xì)菌污染的可能的核酸污染物，當(dāng)如在海藻糖的情況下，生產(chǎn)包括將細(xì)菌培養(yǎng)物用于其合成時(shí)，細(xì)菌污染是可能的。存在將一種或多種酶和單獨(dú)的或與其他組分一起的穩(wěn)定劑(纖維二糖)混合的許多系統(tǒng)，這些系統(tǒng)都可適用。例如，將包含溶解的酶的溶液與穩(wěn)定劑一起加入的方法，或?qū)傅娜芤号c包含穩(wěn)定劑的第二溶液混合的方法，或?qū)⒚溉芙庠诎€(wěn)定劑的溶液中的方法以及將包含酶和穩(wěn)定劑兩者的溶液作為液體或凍干形式保存的另一種方法。根據(jù)本領(lǐng)域?qū)＜乙阎臉?biāo)準(zhǔn)進(jìn)行冷凍干燥。用于冷凍干燥的可能的方案的實(shí)例如下長時(shí)間的冷凍干燥方案·從+20°C至_40°C的梯度，在5分鐘內(nèi)·_40 ，3 小時(shí)·從_40°C至-10°C的梯度，在30分鐘內(nèi)·_10 ，4 小時(shí)·從-10°C至+10°C的梯度，在15分鐘內(nèi).+101:,2 小時(shí)·從+10°C至+30°C的梯度，在15分鐘內(nèi)·+30°C，4_8 小時(shí)。冷凍干燥可以根據(jù)以下較短的方案來進(jìn)行，由于所涉及的體積小，這也可適用。用于冷凍干燥的可能的方案的實(shí)例如下短時(shí)間的冷凍干燥方案·從 +20°C至 _40°C 的梯度，在 5min 內(nèi)‘ -40°C,30min·從 _40°C至-10°C 的梯度，在 15min 內(nèi)‘ -IO0C, 30min·從-10°C至+10°C 的梯度，在 15min 內(nèi)‘ +10°C,60min·從+10°C至+30°C的梯度，在 15min 內(nèi)·+30°C,60min。當(dāng)酶未被儲存在甘油中時(shí)，特別指定短的凍結(jié)-干燥方案，而無論酶是否被儲存在甘油中，都可以使用長的凍結(jié)-干燥方案。在另外的和優(yōu)選的實(shí)施方式中，尤其是對于診斷用途，本發(fā)明涉及一種用于制備冷凍干燥聚合酶的即用形式的組合物的方法，該方法包括以下步驟-根據(jù)被定義為“最低限度的”方案，將酶與包括在50和500mM之間，優(yōu)選地在150 和250mM之間的濃度的纖維二糖(或反之亦然)混合在可以由例如Tris-HCl組成的冷凍干燥和儲存緩沖液中，-加入優(yōu)選地選自由以下組成的組的鹽KC1、Tris-HCl、MgCl2,-任選地加入以下物質(zhì)OdNTP,〇引物，優(yōu)選地對樣品中存在的靶DNA具有特異性的至少一種5’引物(正向)和一種3’引物(反向)，
〇任選地加入選自由以下組成的組的另外的穩(wěn)定劑離子型洗滌劑或非離子型洗滌劑例如NP40、Tween-20和/或非還原糖例如右旋糖、蔗糖、海藻糖、或諸如DTT或β -巰基乙醇的還原劑，-優(yōu)選地在迅速凍結(jié)之后如上所指出的冷凍干燥(或干燥)，和保存該形式的酶。該方法還可以包括在冷凍干燥之前加入聚合鏈反應(yīng)的對照DNA和特異性引物。術(shù)語穩(wěn)定劑意指洗滌劑(或表面活性劑)例如ΝΡ-40(烷基酚乙氧基化物)、 Tween-20(山梨聚糖-聚氧乙基化物單月桂酸酯)或Triton-XlOO或其類似物，以及非還原糖例如右旋糖、蔗糖、海藻糖。另外的試劑可以被單獨(dú)地加入或被預(yù)混合在反應(yīng)混合物中，例如來自制造商的與酶一起被供應(yīng)的另外的試劑，是比用于聚合反應(yīng)的最終濃度濃縮η倍(通常xlO)?？梢约从玫膬龈尚问降拿缚梢员痪S持在室溫下達(dá)若干月。這一形式的酶的冷凍干燥和穩(wěn)定性，可能地加上用于隨后的聚合酶鏈反應(yīng)的特異性試劑，使得能夠制備包括在用緩沖液或用水重構(gòu)之后被使用的干燥和即用的形式的混合物的容器(管、試管或微板)，該緩沖液或水可能地包含樣品中的將被擴(kuò)增的DNA/RNA模板 (如果存在的話)。該方面因此能夠使用于包括診斷用途的本發(fā)明的所有用途的隨后的擴(kuò)增反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)化。此外，冷凍干燥和保存方案適合于傳統(tǒng)PCR和實(shí)時(shí)PCR的鏈擴(kuò)增反應(yīng)兩者，并因此用于定量類型用途和定性類型用途兩者。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)之一是，所使用的穩(wěn)定劑(纖維二糖)對酶的冷凍干燥和保存兩者有效，而已知領(lǐng)域的穩(wěn)定劑通常用于一個(gè)目的或另一個(gè)目的。雖然可與用于該目的的其他分子相容，但是纖維二糖的使用使得其他“穩(wěn)定”分子對于多個(gè)階段不是必須的。此外，因?yàn)槔w維二糖比海藻糖更不可溶，所以還預(yù)期其吸濕性更差，且因此能夠給予凍干產(chǎn)物優(yōu)良的貯存期限。此外，本發(fā)明包括用于DNA樣品的PCR擴(kuò)增的試劑盒，該試劑盒包含根據(jù)本發(fā)明的組合物和任選的關(guān)于聚合酶鏈反應(yīng)中的酶的重構(gòu)和使用的說明書。本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式由纖維二糖在凍結(jié)-干燥和在高達(dá)55°C的溫度下長期儲存期間保存核酸聚合酶的用途組成。用于單一反應(yīng)的所述凍干組合物在最少體積的幾μ 1 Q-50，優(yōu)選地5-30)中重構(gòu)之后適用于擴(kuò)增至少Ing的DNA樣品。還可以直接地在包含樣品的DNA的緩沖液中重構(gòu)凍干物(lyophilisate)。即用形式的凍干組合物中或在酶重構(gòu)之后立即被加入的反應(yīng)混合物中的各種試劑的濃度，必須是使得對于通過PCR的DNA擴(kuò)增來說，在用合適體積的水或緩沖液重構(gòu)組合物之后是最佳的，即，優(yōu)選地，其中KCl的濃度在20和150mM之間，MgCl2的濃度在0. 5和5mM之間，用于聚合反應(yīng)和靶DNA的擴(kuò)增的特異性引物的濃度在0. 05和0. 2mM之間，且dNTP的濃度在50 和200mM之間。包含凍干形式的酶的這樣的試劑盒，可以維持在室溫下。本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及纖維二糖在凍結(jié)-干燥和在高達(dá)55°C的溫度下儲存期間保存DNA聚合酶，優(yōu)選地?zé)釂?dòng)DNA聚合酶的用途。如上所述，酶的冷凍干燥和酶的甚至以單一劑量或大批的即用反應(yīng)混合物的形式的穩(wěn)定性，允許鏈擴(kuò)增反應(yīng)條件更加標(biāo)準(zhǔn)化。因此，通過本發(fā)明變成可能的本發(fā)明組合物和冷凍干燥方法的優(yōu)選用途，涉及具體地用于確定生物流體或組織中寄生體的存在的診斷試劑盒的制備。因此，特別優(yōu)選用于DNA樣品中的所述病原體的診斷鑒定的即用形式的凍干或干燥組合物，該組合物除了酶和纖維二糖以及上文定義的試劑(例如，鹽和dNTP)之外， 還包含瘧原蟲的靶DNA的特異性引物(對于物種惡性瘧原蟲(falciparum)、三日瘧原蟲 (malariae)、間日瘧原蟲(vivax)和卵形瘧原蟲(ovale)中的每一種為一對)，該特異性引物優(yōu)選地被設(shè)計(jì)在ISsRNA的保守區(qū)，或利什曼原蟲(Leishmania)的靶DNA的特異性引物， 引物優(yōu)選地被設(shè)計(jì)在ISsRNA的保守區(qū)，或另外的弓形體(Toxoplasma)的靶DNA的特異性引物，引物優(yōu)選地被設(shè)計(jì)在高度重復(fù)區(qū)HRE。每一種即用形式的凍干組合物還包含優(yōu)選地對應(yīng)于通常在參考系統(tǒng)中表達(dá)的基因例如優(yōu)選地人類β -珠蛋白基因的引物對的內(nèi)部擴(kuò)增對照和任選的用于擴(kuò)增的對照DNA 模板。優(yōu)選地存在于以即用的形式生產(chǎn)的組合物中的另外的組分是在重構(gòu)之后包括在20和150mM之間的最終濃度的KCl和在0. 05-5mM之間的MgCl2、優(yōu)選地在5_20mM的 Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)、任選的0. 05-0. 2mM的濃度的用于在樣品中檢測需要存在的DNA 的擴(kuò)增的特異性引物，和包括在50和200mM之間的濃度的dNTP。本文在一些具體的非限制性實(shí)施例中描述本發(fā)明的實(shí)施。實(shí)驗(yàn)部分材料方法.在不另外和單獨(dú)指出的情況下，實(shí)驗(yàn)部分中描述的冷凍干燥組合物通常包含在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間加入的以下具體的試劑DNA聚合酶(在1至5單位的范圍內(nèi))、由制造商供應(yīng)的反應(yīng)緩沖液、MgCl2、dNTP和引物。特定地，在本發(fā)明給出的實(shí)施例中，反應(yīng)混合物包含用于擴(kuò)增DNA中的兩個(gè)區(qū)的引物1)被設(shè)計(jì)在瘧原蟲的18s核糖體RNA基因(靶DNA)中的MObp (堿基對)片段，2) 被設(shè)計(jì)在人類β-珠蛋白基因中、用作內(nèi)部擴(kuò)增對照(DNA對照)片段；鹽和dNTP。在冷凍干燥之后，通過硅膠方法從對惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)呈陽性的外周血提取的約IOng (納克)基因組DNA被加入至凍干混合物，并用無菌蒸餾水使最終的體積達(dá)到25μ1 (微升)。在94°C初始變性2分鐘之后，進(jìn)行由變性(94°C，2分鐘)、退火(55°C，30秒)和延伸(72°C，45秒)組成的擴(kuò)增循環(huán)。為了完成反應(yīng)，進(jìn)行40次如前所述的循環(huán)。所使用的冷凍干燥方案之一由以下組成·從+20°C至_40°C的梯度，在5分鐘內(nèi)·_40 ，3 小時(shí)·從-40°C至-10°C的梯度，在30分鐘內(nèi)·_10 ，4 小時(shí)·從-10°C至+10°C的梯度，在15分鐘內(nèi).+101，2 小時(shí)·從+10°C至+30°C的梯度，在15分鐘內(nèi)·+30°C，4_8 小時(shí)。
實(shí)施例1.在DNA聚合酶和熱啟動(dòng)聚合酶之間的比較為了鑒別在冷凍干燥過程之后維持良好的聚合酶活性的DNA聚合酶的類型，我們比較了商業(yè)DNA聚合酶和可從兩個(gè)不同的制造商得到的兩種熱啟動(dòng)DNA聚合酶。在圖1中，泳道1至6示出用獲自公司X的熱啟動(dòng)聚合酶制備的凍干和即用混合物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；特定地，在冷凍干燥之前的反應(yīng)體積，對于泳道1至3，對應(yīng)于25 μ 1，和對于泳道4至6，對應(yīng)于9. 1 μ 1。泳道7至12對應(yīng)于用獲自公司Y的熱啟動(dòng)DNA聚合酶制備的凍干和即用混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；特定地，在冷凍干燥之前的反應(yīng)體積，對于泳道7 至9，對應(yīng)于25 μ 1，和對于泳道10至12，對應(yīng)于7. 5 μ 1。泳道13至15對應(yīng)于用獲自公司 X的聚合酶制備的凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的PCR產(chǎn)物；反應(yīng)體積是25 μ 1。在冷凍干燥之前，沒有將穩(wěn)定劑加入至反應(yīng)混合物。如圖1所示的，在冷凍干燥過程之后立即分析擴(kuò)增產(chǎn)物，從泳道7至12可以看出， 包含獲自公司Y的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的混合物不能實(shí)現(xiàn)兩種預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物的擴(kuò)增，然而獲自公司X的熱啟動(dòng)聚合酶和非熱啟動(dòng)聚合酶兩者(分別地1至6和13至1 在冷凍干燥之后維持了它們的聚合酶活性。公司X在其自己的反應(yīng)緩沖液中包括物理地增加溶液密度的物質(zhì)，它們被單獨(dú)地和一般地被定義為穩(wěn)定劑。為了評估用于PCR的用獲自公司X的聚合酶制備的凍干和即用的混合物的熱穩(wěn)定性，將相同的混合物在室溫下和在37°C下保存3個(gè)星期。照片2示出用包含公司X的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的擴(kuò)增混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；特定地，在冷凍干燥用于PCR的混合物之前的最終體積，對于泳道1至4，對應(yīng)于25 μ 1，和對于泳道5至8，對應(yīng)于9. 1 μ 1。泳道9至12示出用包含來自公司X的DNA聚合酶的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；在冷凍干燥之前的反應(yīng)體積對應(yīng)于25 μ 1。在冷凍干燥之后將所述凍干反應(yīng)混合物在室溫下(泳道1至3、5至7、9至11)或在37°C下(泳道 4、8和12)保存3個(gè)星期。如照片中所示的，在室溫下3個(gè)星期之后，用包含熱啟動(dòng)DNA聚合酶的混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物(泳道1至3和5至7)證明比用簡單的DNA聚合酶獲得的那些(泳道9至11) 強(qiáng)度更大。此外，熱啟動(dòng)DNA聚合酶不會(huì)導(dǎo)致引物二聚體的形成，這與其他聚合酶相反。最后，在37 °C下3個(gè)星期的保存之后，熱啟動(dòng)DNA聚合酶維持其酶活性(泳道4和 8)，而簡單的DNA聚合酶不能維持其酶活性(泳道12)。因此，絕對肯定的是1)穩(wěn)定劑的使用對于在冷凍干燥過程期間保存DNA聚合酶的酶活性是關(guān)鍵的，2)對于擴(kuò)增效率，熱啟動(dòng)DNA聚合酶比正常DNA聚合酶更適合，但對于冷凍干燥過程不是這樣，因?yàn)閮煞N類別的DNA聚合酶展示相似的行為，即，它們需要冷凍干燥的穩(wěn)定劑。最后，在該實(shí)驗(yàn)中，在冷凍干燥步驟之前測試2種不同的體積(25 μ 1和9. 1 μ 1)， 而在結(jié)果上沒有注意到任何變化。實(shí)施例2.在不同的熱啟動(dòng)DNA DNA聚合酶之間的比較在以下實(shí)驗(yàn)中，制備包含獲自4個(gè)不同公司(W、X、R、Y)的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的凍干和即用的擴(kuò)增混合物，每一個(gè)與它們的4種反應(yīng)緩沖液或與加入的穩(wěn)定劑例如NP-40、 Tween-20和蔗糖組合，總計(jì)19種組合。
在圖3和圖4中，泳道1至4、5至8、9至12和13至19表示使用分別包含獲自公司W(wǎng)、X、R或Y的反應(yīng)緩沖液的凍干的即用混合物通過PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物。在相同的圖中，泳道1、5、9和13對應(yīng)于用包含獲自公司W(wǎng)的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道2、6、10、14、17、18和19對應(yīng)于用包含獲自公司Y的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3、7、11和15對應(yīng)于用包含獲自公司 X的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4、8、12和16對應(yīng)于用包含獲自公司R的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。 在圖3和圖4中，泳道17、18和19對應(yīng)于用還分別包含0. 25% NP-40和0. 25% Tween-20、 IOOmM蔗糖和0. 25% NP_40、0. 25% Tween-20和IOOmM蔗糖的凍干和即用的混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3中呈現(xiàn)的PCR產(chǎn)物在完成冷凍干燥方案之后立即使用凍干和即用的混合物來擴(kuò)增。相比之下，圖4示出在室溫下保存6個(gè)月的相同混合物的結(jié)果。如圖3中清楚地示出的，在冷凍干燥之后就被監(jiān)測的包含公司X的反應(yīng)緩沖液的混合物維持了 4種聚合酶中的3種的酶活性，然而，對于第四種聚合酶，活性僅部分地被維持。用公司W(wǎng)或R的反應(yīng)緩沖液制備的混合物保存4種聚合酶中的1種的活性。最后， 在獲自公司Y的反應(yīng)緩沖液的存在下，沒有看到對應(yīng)于兩種預(yù)期片段的擴(kuò)增；在IOOmM蔗糖的存在下僅可以看到殘余的酶活性。此外，在進(jìn)行通過PCR擴(kuò)增之前，將凍干和即用的擴(kuò)增混合物在室溫下保存6個(gè)星期。如圖4所示的，只有用公司X的反應(yīng)緩沖液制備的凍干混合物能夠保存所使用的四種熱啟動(dòng)DNA聚合酶中的三種的酶活性。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了在冷凍干燥過程期間將穩(wěn)定劑包括在PCR反應(yīng)混合物中以便保存聚合酶的酶活性的重要性。實(shí)施例3.用于PCR的包含250mM蔗糖的凍干和即用的組合物的穩(wěn)定性為了評估凍干PCR反應(yīng)混合物的穩(wěn)定性的改進(jìn)，初步評估250mM蔗糖在儲存緩沖液中、在反應(yīng)緩沖液中或在兩者中存在的影響。評估獲自兩個(gè)不同的公司的兩種不同的熱啟動(dòng)DNA聚合酶。在圖5和圖6中，泳道1至7和泳道8至21表示用分別包含獲自公司X或R的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。在圖5和圖6中，泳道1、8 和9對應(yīng)于用公司X的反應(yīng)緩沖液制備的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道 2和3和泳道14至17對應(yīng)于用公司W(wǎng)的反應(yīng)緩沖液制備的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4和5和泳道10至13對應(yīng)于用公司R的反應(yīng)緩沖液制備的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道6和7和泳道18至21對應(yīng)于用公司Y的反應(yīng)緩沖液制備的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。在圖5和圖6中，泳道3、5、7、11、15和 19表示用通過將250mM蔗糖加入至反應(yīng)緩沖液中制備的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道9、12、16和20表示用通過將250mM蔗糖加入至儲存緩沖液中制備的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道13、17和21表示用通過將250mM蔗糖加入至反應(yīng)緩沖液和儲存緩沖液中制備的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5中示出的擴(kuò)增產(chǎn)物用在完成冷凍干燥過程之后立即被利用的凍干和即用的反應(yīng)混合物來擴(kuò)增，而圖6的結(jié)果與圖5的結(jié)果相同，但是在將凍干和即用的混合物在室溫下保存8個(gè)星期之后。如圖5中顯著的，在反應(yīng)緩沖液中但不在儲存緩沖液中存在250mM蔗糖對于在冷凍干燥過程期間和在冷凍干燥過程之后維持酶活性是必不可少的。在室溫下保存8個(gè)星期之后，酶活性的保存僅在半數(shù)情況(10個(gè)中的5個(gè))下是可能的(圖6)。因此，可以推斷出，蔗糖對酶活性具有保護(hù)作用，雖然其對于長期保存來說并不有效。實(shí)施例4.用不同的穩(wěn)定物質(zhì)制備的凍干組合物的穩(wěn)定性為了比較包含不同的穩(wěn)定劑的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的熱穩(wěn)定性，利用諸如二糖、多糖或碳水化合物的成分，它們被加入至如在引言所描述地制備的擴(kuò)增混合物中。在圖7和圖8中，泳道1至5和泳道6至10表示用分別包含獲自公司W(wǎng)或R的熱啟動(dòng)DNA聚合酶的凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。在圖7和圖8中，泳道1和 6、2和7、3和8、4和9、以及5和10對應(yīng)于分別包含以下物質(zhì)的凍干和即用的擴(kuò)增混合物 無穩(wěn)定劑；200mM海藻糖、250mM蔗糖、200mM麥芽糖和0.025%瓊脂糖。圖7中示出的擴(kuò)增產(chǎn)物在完成冷凍干燥過程之后立即用凍干和即用的擴(kuò)增混合物來獲得，而圖8中示出的結(jié)果與圖7的結(jié)果相同，但在將凍干和即用的反應(yīng)混合物在37°C 下保存一個(gè)星期之后。250mM蔗糖、200mM海藻糖、200mM麥芽糖和0. 025%瓊脂糖在凍干和即用的反應(yīng)混合物中的存在最初通過使用獲自兩個(gè)不同公司的兩種不同的熱啟動(dòng)DNA聚合酶來評估。如圖7中顯著的，海藻糖、蔗糖和麥芽糖(分別地泳道2和7、3和8以及4和9)在凍干和即用的反應(yīng)混合物中的存在使得兩種酶的酶活性被保存，雖然該作用好像不如對獲自公司R 的酶(泳道7、8和9)有效；這對于蔗糖(泳道8)是特別明顯的。對于瓊脂糖，沒有記錄到擴(kuò)增帶(圖7，泳道5和10)。此外，在通過PCR處理之前，凍干和即用的混合物在37°C下被保存一個(gè)星期。包含200mM海藻糖的凍干混合物維持了兩種熱啟動(dòng)DNA聚合酶(圖8，泳道 2和7)的完整酶活性，而具有250mM蔗糖和0. 025%瓊脂糖的那些凍干混合物則沒有(圖 8，分別地泳道3和8、5和10)。200mM的麥芽糖維持一種聚合酶的活性(圖8，泳道9)，但僅部分地維持其他聚合酶的活性。然后在相同的兩種聚合酶上評估在被凍干之前被加入至反應(yīng)混合物中的250mM 海藻糖、6. 6%右旋糖、200mM纖維二糖(Fluka Analytical22150D-(+)-纖維二糖)和6. 6% 支鏈淀粉的作用。在圖9和圖10中，泳道1至5和泳道6至10表示用分別獲自公司W(wǎng)或R的熱啟動(dòng)DNA聚合酶制備的凍干和即用的反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物。在圖9和圖10中，泳道1 和6、2和7、3和8、4和9、5和10對應(yīng)于分別包含以下物質(zhì)的凍干和即用的反應(yīng)混合物無穩(wěn)定劑、250mM海藻糖、6. 6%右旋糖、200mM纖維二糖或6. 6%支鏈淀粉。圖9中的結(jié)果對應(yīng)于在已經(jīng)完成冷凍干燥過程之后立即被處理的凍干混合物，而圖10中示出的結(jié)果對應(yīng)于與先前的反應(yīng)混合物相同的時(shí)間被制備但在37°C下被保存一個(gè)星期的具有相同特征的反應(yīng)混合物。如圖9所示的，將海藻糖和纖維二糖引入凍干反應(yīng)混合物中保存了兩種熱啟動(dòng) DNA聚合酶的酶活性(分別地泳道2和7、4和9)，而右旋糖和支鏈淀粉僅保護(hù)兩種酶中的一種(分別地泳道3和8、5和10)。此外，具有相同的特征和在與先前的反應(yīng)混合物相同的時(shí)間被制備的反應(yīng)混合物在通過PCR處理之前，在37°C下被保存一個(gè)星期。包含作為穩(wěn)定劑的250mM海藻糖和200mM纖維二糖的凍干反應(yīng)混合物保護(hù)兩種聚合酶的酶活性(圖10， 分別地泳道2和7、4和9)，而6. 6%右旋糖和6. 6%支鏈淀粉不保存兩種聚合酶的酶活性 (圖10，分別地泳道3和8、5和10)。此外，還評估0.5%白蛋白、2%白蛋白和3%乳糖，但沒有獲得與用海藻糖和纖維二糖得到的那些結(jié)果相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。因此，清楚地證明，只有纖維二糖和海藻糖對DNA聚合酶提供保護(hù)。實(shí)施例5.評估用于穩(wěn)定凍干組合物的纖維二糖的最佳濃度為了鑒別保存DNA聚合酶的酶活性的最有效的纖維二糖濃度，如引言中所描述地制備包含增加濃度的纖維二糖的凍干和即用的反應(yīng)混合物。纖維二糖的分析的濃度范圍是0至700mM。在圖11和圖12中，泳道1至13表示用分別包含以以下濃度加入的纖維二糖的凍干反應(yīng)混合物獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物:0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600和 700mMo圖11的擴(kuò)增產(chǎn)物通過在完成冷凍干燥過程之后立即使用凍干反應(yīng)混合物來獲得，而圖12的結(jié)果對應(yīng)于具有相同的特征且在與先前的反應(yīng)混合物相同的時(shí)間被制備但在37°C下被保存兩個(gè)星期的反應(yīng)混合物。如圖11和圖12中所示的，最好地保存聚合酶的酶活性的纖維二糖濃度在150至 250mM的范圍內(nèi)，甚至在37°C下保存一個(gè)星期之后(圖12)。因此，證明了纖維二糖在150至250mM的濃度范圍內(nèi)向凍干和即用的反應(yīng)混合物提供最好的穩(wěn)定性。實(shí)施例6.評估包含作為穩(wěn)定劑的海藻糖或纖維二糖的凍干和即用的組合物的時(shí)間穩(wěn)定性為了鑒別包含海藻糖或纖維二糖的凍干和即用的混合物的時(shí)間穩(wěn)定性，如引言中所描述地制備凍干的即用的反應(yīng)混合物，但加入200mM纖維二糖或200mM海藻糖。混合物在經(jīng)歷通過PCR擴(kuò)增之前被凍干。在圖13中，泳道1至5、6至10、11以及12至16對應(yīng)于分別包含IOOmM纖維二糖、 200mM纖維二糖、無穩(wěn)定劑和200mM海藻糖的混合物。圖13中示出的擴(kuò)增產(chǎn)物在完成冷凍干燥過程之后立即用凍干反應(yīng)混合物獲得， 而圖14的結(jié)果對應(yīng)于具有相同的特征且在與先前的反應(yīng)混合物相同的時(shí)間被制備但在 37 0C下被保存兩個(gè)星期的反應(yīng)混合物。在圖14中，泳道1至5、6至10、11至15對應(yīng)于分別包含IOOmM纖維二糖、200mM 纖維二糖或200mM海藻糖的凍干混合物。圖15中示出的擴(kuò)增產(chǎn)物用在55°C下分別被保存以下時(shí)間的凍干反應(yīng)混合物獲得24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)和一個(gè)星期(分別地， 泳道 1、6 和 11 ；2、7 和 12 ；3、8 和 13 ；4、9 和 14 ；5,10 和 15)。在圖15中，泳道1至5表示在55°C下保存M小時(shí)(泳道1和6)、48小時(shí)(泳道 2和7)、72小時(shí)(泳道3和8)、96小時(shí)或一個(gè)星期(泳道5和10)之后的包含纖維二糖或海藻糖的凍干和即用的擴(kuò)增混合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。凍干和即用的混合物包含獲自公司R的反應(yīng)緩沖液和熱啟動(dòng)DNA聚合酶(泳道1-10)。M 分子量標(biāo)記物“Bench Top PCR標(biāo)記物”，Promega0PCR產(chǎn)物268bp 人類β-珠蛋白基因的片段；240bp 瘧原蟲18s RNA基因的片段。在所有圖中，“M”對應(yīng)于!Iomega公司的分子量標(biāo)記物“Bench Top PCR標(biāo)記物” 的泳道；所述標(biāo)記物的片段從50bp至IOOObp變化。如圖13中所示的，存在于該實(shí)施例的凍干和即用的反應(yīng)混合物中的穩(wěn)定劑非常好地保存聚合酶活性。在用PCR處理之前，凍干反應(yīng)混合物還在37°C下被保存一個(gè)星期。甚至在暴露于該應(yīng)激之后，存在于包含200mM纖維二糖(圖14，泳道6至10)的凍干和即用的反應(yīng)混合物中的聚合酶維持它們的完整酶活性，與加入200mM海藻糖(圖14，泳道11至15)的那些一樣。與200mM纖維二糖(圖14，泳道6至10)或200mM海藻糖(圖 14，泳道11至1 在37°C下保存兩個(gè)星期之后，酶維持它們的活性。最后，具有相同的特征和在與先前的反應(yīng)混合物相同的時(shí)間被制備反應(yīng)混合物在 55°C下被保存24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)、96小時(shí)和一個(gè)星期(圖15)，然后經(jīng)歷PCR擴(kuò)增。使用海藻糖作為穩(wěn)定劑(圖15，泳道6至10)能夠保護(hù)熱啟動(dòng)DNA聚合酶的酶活性，甚至在55°C的應(yīng)激之后。在55°C下延長處理(48小時(shí)、72小時(shí)和96小時(shí))部分地?fù)p害酶活性(圖15，分別地泳道2、3和4)。然而，包含200mM纖維二糖的凍干和即用的混合物具有與包含200mM海藻糖的混合物相同的穩(wěn)定性。我們因此可以斷言，作為穩(wěn)定劑，纖維二糖具有與海藻糖相同的性質(zhì)， 但是與海藻糖相比，纖維二糖具有前述優(yōu)點(diǎn)，包括從纖維素通過酶水解系統(tǒng)來生產(chǎn)，所述纖維素是由植物源的長葡萄糖(糖)鏈組成的分子。植物源確保沒有源自于細(xì)菌污染的可能的核酸污染物，當(dāng)如在海藻糖生產(chǎn)的情況下，細(xì)菌培養(yǎng)物用于合成它時(shí)，細(xì)菌污染是可能的。實(shí)施例7.纖維二糖穩(wěn)定劑形成用于寄生蟲學(xué)領(lǐng)域中的診斷試劑盒的即用組合物的用途在適合于形成寄生蟲學(xué)領(lǐng)域中的診斷試劑盒的即用和凍干混合物的制備中，纖維二糖用作熱啟動(dòng)DNA聚合酶的穩(wěn)定劑。特定地，對于所研究的寄生蟲的每一種，預(yù)先制備包含以下物質(zhì)的最終反應(yīng)混合物IOmM Tris-HCl(pH 8. 0)、50mM KC1、0. 25 μ M 正向引物、0. 25 μ M 反向引物、0. 2mM dNTP、1. 5mM MgCl2和2單位的Taq聚合酶。瘧原蟲的觸發(fā)劑或引物(對于物種惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、間日瘧原蟲和卵形瘧原蟲中的每一種為一對)被設(shè)計(jì)在ISsRNA的保守區(qū)。利什曼原蟲的引物被設(shè)計(jì)在ISsRNA 的保守區(qū)。弓形體的引物被設(shè)計(jì)在高度重復(fù)區(qū)HRE。所有制備的混合物包含對應(yīng)于被設(shè)計(jì)在人類珠蛋白基因序列中的引物對的內(nèi)部對照。在多種配置中的每一種引物以0. 25 μ M的濃度被供應(yīng)。
實(shí)施例8. DNA擴(kuò)增和直接測序性能的比較 擴(kuò)增的野生型(wt) DNA對照樣品(Cl)、未知的DNA樣品(C2)、突變體DNA對照樣品(C3)和無模板對照(N)的瓊脂糖凝膠電泳圖。進(jìn)行DNA擴(kuò)增以比較用凍干和即用的擴(kuò)增混合物獲得的PCR產(chǎn)物和用參考方法獲得的那些PCR產(chǎn)物。向凍干和即用的擴(kuò)增組合物加入以下組分
正向引物反向引物 DNA
H9O
參考方法具有以下組成
dNTP
緩沖液反應(yīng) MgCl2
正向引物反向引物 Taq聚合酶 DNA
0.4 μΜ 0.4 μΜ 3 Ong 至 25 μ 。
每種0.2 mM Ix
1.5 mM
0.4 μΜ 0.4 μΜ 0.003υ/μ1 3 Ong
H2O至 25 μ 。兩種系統(tǒng)的PCR收率相當(dāng)。通過在2%瓊脂糖凝膠上電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物(圖16a)。在測序分析之前，使用MultiScreen HTS真空歧管系統(tǒng)(Millipore)來純化每一種PCR產(chǎn)物。相比于用參考方法獲得的PCR產(chǎn)物，對于使用Universal Master Mix獲得的 PCR產(chǎn)物進(jìn)行更短的時(shí)間的純化程序。凍結(jié)-干燥形式保證高品質(zhì)的PCR產(chǎn)物，消除了可以擾亂和延遲純化步驟的常規(guī)添加劑的存在，生成足夠量的用于隨后測序分析的擴(kuò)增產(chǎn)物 (圖 16b)。結(jié)果表明，凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)對于擴(kuò)增反應(yīng)和隨后的測序分析是理想的(圖17)。實(shí)施例9.在熒光染料存在下的實(shí)時(shí)PCR、熔解曲線分析和高分辨率熔解曲線分析 (HRM)性能的比較凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)的性能通過使用Rotor Gene 6000(Corbett Life Science)來評估。該儀器允許在同一分析會(huì)話中3種不同的應(yīng)用在熒光雙鏈特異性染料(EvaGreen，Biotium)存在下的實(shí)時(shí)PCR、熔解曲線分析和高分辨率熔解曲線分析。對于每一種應(yīng)用，比較凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)與參考方法。對于3種應(yīng)用中的每一種，示出野生型DNA對照樣品(Cl)、未知的DNA樣品(C2)、 帶有A > G置換的突變體DNA樣品(C3)和無模板對照(N)的結(jié)果。顯示出相似的擴(kuò)增效率擴(kuò)增分析和實(shí)時(shí)PCR起始(take off)值的結(jié)果表明，凍干和即用的擴(kuò)增混合物 (Universal Master Mix)對于PCR和對于實(shí)時(shí)PCR是理想的。當(dāng)使用凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)和參考方法時(shí)，熔解分析提供明確定義的熔解溫度(T熔解)的鑒別。特定地，在89°C下鑒別用凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)獲得的樣品的T熔解，而在87°C下確定用參考方法獲得的樣品的T熔解。此外，用凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)獲得的熔解曲線允許在不同的樣品之間完全的重疊；對用參考方法獲得的熔解曲線，未觀察到該情況。熔解曲線分析的結(jié)果和高分辨率熔解曲線分析的結(jié)果表明，凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)對于在兩種應(yīng)用中使用是理想的。實(shí)施例10.定量熒光(QF)PCR中的性能的比較特別是對于最普通的常染色體和性染色體非整倍性的產(chǎn)前診斷，在QFPCR中評估用凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)獲得的性能和結(jié)果并將它們與用參考方法獲得的那些性能和結(jié)果進(jìn)行比較。QF PCR分析包括擴(kuò)增、檢測和分析染色體特異性 DNA微衛(wèi)星。熒光標(biāo)記的標(biāo)記物特異性引物用于單個(gè)標(biāo)記物的PCR擴(kuò)增，且每一種標(biāo)記物的復(fù)制數(shù)量表示染色體的復(fù)制數(shù)量?？梢允褂米詣?dòng)基因分析儀來分析和量化所得到的PCR產(chǎn)物。QF PCR 方案:
參考方法擴(kuò)增混合物 7,5 μ 引物組7,5 μ DNA 50ng H2O 至 25 μ 。組合物引物組7，5μ1DNA 50ngH2O 至 25 μ 1。使用軟件GeneMarker分析QF PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物中的每一種的峰高和峰面積比的分析表明，凍干和即用的擴(kuò)增混合物(Universal Master Mix)對于在定量熒光中使用是理想的。
權(quán)利要求
1.一種適合于用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩母稍锘騼龈傻慕M合物，包含被穩(wěn)定為經(jīng)得起冷凍干燥和在高達(dá)55°C的溫度下的儲存的核酸聚合酶，其特征在于，所述組合物具有在0. 01至 250單位的范圍內(nèi)的核酸聚合酶濃度、在50mM(17，115g/L)至500mM(171，15g/L)范圍內(nèi)的濃度的纖維二糖和緩沖液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述核酸聚合酶是選自由以下組成的組的DNA 聚合酶Taq聚合酶、熱啟動(dòng)聚合酶或其活性片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項(xiàng)所述的組合物，包含250mM纖維二糖和2單位的核酸聚合酶。
4.一種適合于用適當(dāng)?shù)娜軇┫♂尩慕M合物，包含被穩(wěn)定為經(jīng)得起冷凍干燥和在高達(dá) 55°C的溫度下的儲存的核酸聚合酶，其特征在于，所述組合物具有在0. 01至250單位的范圍內(nèi)的核酸聚合酶濃度、在50mM至500mM范圍內(nèi)的濃度的纖維二糖、緩沖液、dNTP、KCl和 MgCl20
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的組合物，其中所述緩沖液是TrisHCl0
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，還包含以下組分(i-iii)中的一種或多種 i.穩(wěn)定劑，其選自由以下組成的組表面活性劑和/或非還原糖；i i還原劑，其選自由以下組成的組β -巰基乙醇、DTT ； iii.至少一種探針，其任選地被標(biāo)記。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的組合物用于核酸的擴(kuò)增的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中所述擴(kuò)增方法以自動(dòng)化的方式進(jìn)行。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8中任一項(xiàng)所述的用途，用于進(jìn)行PCR、實(shí)時(shí)PCR、熔解曲線分析、 高分辨率熔解曲線分析、測序、定量熒光PCR、多重PCR、全基因組擴(kuò)增或等溫?cái)U(kuò)增。
10.一種用于核酸的擴(kuò)增的方法，包括以下步驟a.在水中或在緩沖液中重構(gòu)根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物；b.加入靶DNA特異性引物；c.加入核酸模板；d.加入選自由以下組成的組的試劑中的一種或多種KCl、MgCl2、dNTP、至少一種任選地被標(biāo)記的探針、還原劑和另外的穩(wěn)定劑。
11.一種用于核酸的擴(kuò)增的方法，包括以下步驟a.在水中或在緩沖液中重構(gòu)根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物；b.加入靶DNA特異性引物；c.加入核酸模板；d.任選地加入至少一種任選地被標(biāo)記的探針、還原劑和另外的穩(wěn)定劑。
12.—種即用產(chǎn)品，包含a.根據(jù)權(quán)利要求1或4中任一項(xiàng)所述的干燥或凍干的組合物；b.用于重構(gòu)所述組合物的溶劑。
13.一種用于DNA樣品的PCR擴(kuò)增的試劑盒，包含根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的組合物和任選的關(guān)于聚合酶鏈反應(yīng)中的酶的重構(gòu)和使用的說明書。
14.纖維二糖在冷凍干燥和在高達(dá)55°C的溫度下長期儲存期間保存核酸聚合酶的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述核酸聚合酶是DNA聚合酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含核酸聚合酶和纖維二糖的干燥或凍干的組合物，其中所述酶甚至在高達(dá)55℃的溫度下穩(wěn)定一段時(shí)間。本發(fā)明的組合物還可以包含另外的試劑例如鹽、對樣品中存在的模板DNA具有特異性的引物、探針等和可能的其他穩(wěn)定化合物。本發(fā)明涉及一種可以在容器中制備包含核酸聚合酶和纖維二糖的干燥或凍干的組合物的方法，其中酶被凍干并在加入樣品之后即用于分子生物學(xué)應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102414315SQ201080019549
公開日2012年4月11日 申請日期2010年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日
發(fā)明者烏戈·德盧卡, 毛里奇奧·格拉梅尼亞, 路易吉·羅維德 申請人:森迪奈爾Ch有限責(zé)任公司