專利名稱：博爾納病病毒p24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，為一種通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品獲得cDNA，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光 定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)定量樣品中的博爾納病病毒核酸，具體涉及一種博爾納病病毒實(shí)時(shí)熒 光定量PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
博爾納病病毒(Borna disease virus，BDV)是一種嗜神經(jīng)性的單股負(fù)鏈RNA病 毒，BDV作為致病因子造成的疾病稱為博爾納病(Borna disease, BD)，是一種人畜共患病。 近年來(lái)，采用間接免疫熒光(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫印記(IB)、RT-PCR等方 法在精神疾病患者外周血和腦組織中頻繁檢測(cè)出BDV的抗原、抗體和核酸，提示BDV的慢性 感染可能與人類精神疾病有關(guān)。然而，不同檢測(cè)方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果有著較大差異，研究表明使 用IFA檢測(cè)BDV方便迅速敏感，但特異性較差；IB特異性較IFA高但敏感性有所降低；檢測(cè) 特異性抗體ELISA敏感性不高，并且血清學(xué)試驗(yàn)陽(yáng)性并不一定代表受檢者正存在BDV感染， BDV抗體陽(yáng)性不能肯定是存在感染還是曾存在感染；免疫組化的敏感性取決于被檢組織和 細(xì)胞中BDV蛋白的數(shù)量以及所使用的BDV抗體與抗原的結(jié)合力，特異性則取決于抗體與非 BDV蛋白的交叉反應(yīng)情況；原位雜交的特異性和敏感性均較高，但當(dāng)BDV RNA濃度過(guò)低或細(xì) 胞中的BDV RNA已經(jīng)降解時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)假陰性；病毒分離是診斷BDV的金標(biāo)準(zhǔn)，但是普遍用 于檢驗(yàn)篩選比較困難。綜上所述，開發(fā)一種簡(jiǎn)便、靈敏、高效的診斷方法非常重要。實(shí)時(shí)焚光定量 PCR(Real-Time Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction)可用于檢測(cè)BDV病毒核酸，除了具有常規(guī)PCR的高靈敏性外，定量和擴(kuò)增同步進(jìn) 行，特異性和可靠性更強(qiáng)，并且封閉不易污染，而且方便快捷，普通實(shí)驗(yàn)室均可開展檢測(cè)。我 們之前曾開發(fā)出BDV套式熒光定量RT-PCR試劑盒(徐平，謝鵬，鄒德智，等.博爾納病病毒 熒光定量套式RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，28(6): 688-691)， 雖然套式熒光定量PCR特異性較高，但步驟多工作量大，且中間步驟需要處理PCR產(chǎn)物， 在檢測(cè)大量標(biāo)本時(shí)容易出現(xiàn)PCR產(chǎn)物污染造成假陽(yáng)性，我們?cè)陂_發(fā)新的BDV熒光定量PCR 試劑盒時(shí)重新設(shè)計(jì)了引物，并優(yōu)化了熒光定量PCR反應(yīng)緩沖液、退火溫度、引物探針濃度、 dNTPs濃度、鎂離子濃度，開發(fā)了逆轉(zhuǎn)錄后熒光定量一步法檢測(cè)試劑盒，無(wú)需處理第二步 PCR產(chǎn)物，減少PCR產(chǎn)物污染的可能性。在該試劑盒與套式熒光定量RTP-CR試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲 線比較中，前者相關(guān)系數(shù)(R2)為0. 99989，后者R2為0. 998，故在Ct值和起始模板濃度的 線性關(guān)系上，前者的定量要更可靠。而開發(fā)的新試劑盒擴(kuò)增效率達(dá)到了 92. 763%，后者擴(kuò)增 效率為88. 717%?？梢?jiàn)新開發(fā)的試劑盒能進(jìn)一步提高定量的準(zhǔn)確性和擴(kuò)增效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種簡(jiǎn)單方便，靈敏度和特異性高的熒光定量PCR試劑 盒，能夠優(yōu)化提高PCR的擴(kuò)增效率，降低PCR污染發(fā)生率，準(zhǔn)確、快速檢測(cè)標(biāo)本中的BDV核酸。
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的博爾納病病毒p24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢 測(cè)試劑盒包括10X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、2X熒光定量PCR反應(yīng)液、Taq聚合酶、 標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照。其中上述IOX逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液；Oligo(ClT)15引物；dNTPs ；氯化 鎂；DEPC-H2O。其中上述2 X熒光定量PCR反應(yīng)液配方為20mmol/L Tris-H2SO4 (PH值8. 3); 100 mmol/L KCL ；6 mmol/L MgCL2 ；12 mmol/L (NH4)2SO4 ；1. 6mol/L甜菜堿；0. 3%Triton X-100 ； 16 mmol/L TMAC ；0. 2 mmol/L dNTPs ；上下游引物和熒光探針各 1 μ mol/L。其中上述標(biāo)準(zhǔn)品為將p24片段插入pET41a載體所構(gòu)建的重組質(zhì)粒(1 X IO8拷貝/ μ 1)，標(biāo)準(zhǔn)品序列見(jiàn)SEQ ID NOl (不包括載體序列)。其中上述陰性對(duì)照由不加入任何模板的熒光定量PCR反應(yīng)液和Taq酶組成。其中上述上下游引物序列為 上游引物序列為SEQ ID Ν02 ；
下游引物序列為SEQ ID Ν03 ；
所擴(kuò)增的特異性序列(ρ24片段303bp 501bp,總長(zhǎng)199bp)為SEQ ID N04。其中上述熒光探針的序列為SEQ ID N05。本試劑盒的使用方法每次檢測(cè)均需加入標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)設(shè)置陰 性對(duì)照。標(biāo)準(zhǔn)品使用滅菌去離子水按10倍依次稀釋至IXlO3 IO8拷貝/μ 1。1、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
10Χ逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 2μ1 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1
RNA樣品5μ1
DEPC-H2O12 μ 1
總反應(yīng)體積20 μ 1
反應(yīng)條件為42°C 15min,95°C 5min。
2、熒光定量PCR反應(yīng)
2 X熒光定量PCR反應(yīng)液 10 μ 1 Taq 酶0. 5 μ 1
標(biāo)準(zhǔn)品/cDNA/陰性對(duì)照1 μ 1/5 μ 1/0 μ 1
去離子水8. 5μ 1/4. 5μ 1/9. 5μ 1
總反應(yīng)體積20 μ 1
反應(yīng)條件為93°C 3min，93°C 45min、55°C 60min，后兩步反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，設(shè)置在 55 0C退火和延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。 本發(fā)明建立了使用Taqman探針熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)BDV核酸的方法，Taqman探 針的使用可以明顯提高熒光定量PCR的特異性和準(zhǔn)確性，使得檢測(cè)的結(jié)果更為可靠。同時(shí) 在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，使用一步法熒光定量PCR來(lái)檢測(cè)cDNA，較之套式PCR縮短了反應(yīng)時(shí)間，無(wú) 需處理第二步的PCR產(chǎn)物，降低了 PCR產(chǎn)物污染導(dǎo)致假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。Taqman探針原理為該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，標(biāo)記在5’端者為熒光報(bào)告基團(tuán) (Report dyes，R)，標(biāo)記在3’端者為熒光淬滅基團(tuán)(Quencher dyes，Q)，當(dāng)探針保持完整時(shí)， 3’端熒光淬滅基團(tuán)抑制或吸收5’端熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出的熒光。探針自身的3’端羥基已經(jīng) 被去除或封閉，不具有延伸的能力，探針在無(wú)特異性PCR擴(kuò)增時(shí)，熒光信號(hào)無(wú)變化。當(dāng)發(fā)生 特異性擴(kuò)增，復(fù)性期探針與模板DNA雜交，延伸期Taq酶從5’ 一 3’方向延伸，當(dāng)移動(dòng)到探 針與模板結(jié)合位置時(shí)發(fā)揮5’ 一 3’外切酶活性，將探針切斷，5’端熒光報(bào)告基團(tuán)被切下釋 放于反應(yīng)體系中，從而熒光淬滅基團(tuán)對(duì)報(bào)告基團(tuán)的抑制作用被解除，通過(guò)熒光定量PCR儀 可以檢測(cè)到熒光。于是模板每復(fù)制一次，就會(huì)有相同數(shù)量的探針被切斷釋放出熒光，可見(jiàn)熒 光值和PCR產(chǎn)物的量是一對(duì)一關(guān)系，因此相對(duì)于常規(guī)PCR后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳更為精確， 特異性也更高。當(dāng)熒光信號(hào)增強(qiáng)到某一閾值，此時(shí)的循環(huán)數(shù)被稱為Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct 值和拷貝數(shù)的相關(guān)性可以建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此可以根據(jù)樣本已知的Ct值來(lái)計(jì)算未知的DNA 起始拷貝數(shù)。在開發(fā)試劑盒過(guò)程中，優(yōu)化了熒光定量PCR緩沖液(含有20mmol/L Tris-H2SO4, PH 值 8. 3; 100 mmol/L KCL ；6 mmol/L MgCL2 ； 12 mmol/L (NH4) 2S04 ； 1. 6mol/L 甜菜堿; 0. 3%Triton X-100 ；16 mmol/L TMAC)，構(gòu)成PCR緩沖液的這些成分價(jià)格不高，可以降低試 劑盒的成本。此外還優(yōu)化了退火溫度(最佳為55°C )、引物探針濃度(最佳為0. 5 μ mol/L)、 dNTPs濃度(最佳為0. lmmol/L)和鎂離子濃度(最佳為3mmol/L)，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化 減少PCR過(guò)程中的非特異性擴(kuò)增和提高擴(kuò)增效率，結(jié)果可見(jiàn)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增 曲線均良好，在該試劑盒與以前套式熒光定量RTP-CR試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較中，前者相關(guān) 系數(shù)(R2)為0. 99989，后者R2為0. 998，故在Ct值和起始模板濃度的線性關(guān)系上，前者由 于R2更接近1，所以定量要更可靠。而開發(fā)的新試劑盒擴(kuò)增效率達(dá)到了 92. 763%，后者擴(kuò)增 效率為88. 717%，可見(jiàn)新開發(fā)的試劑盒不僅縮短反應(yīng)時(shí)間和降低PCR污染可能性，而且還能 進(jìn)一步提高定量的準(zhǔn)確性和擴(kuò)增效率。使用該試劑盒可以對(duì)動(dòng)物樣本進(jìn)行大規(guī)模篩選，通 過(guò)流行病調(diào)查來(lái)了解該病毒在我國(guó)的分布及流行特征，為防治將來(lái)可能出現(xiàn)大規(guī)模的暴發(fā) 流行提供基礎(chǔ)，此外在臨床檢驗(yàn)中可以進(jìn)一步分析BDV和人類精神疾病的相關(guān)性。


圖1為退火溫度的優(yōu)化，Marker為DL2000，1 8分別代表退火溫度依次為 54. 80C >55. 50C >56. 6°C >57. 9°C >59. 4°C >60. 7°C、61. 7°C和 62. 3°C。圖2為引物和探針濃度的優(yōu)化，其中1 10分別代表引物和探針終濃度依次為 0. 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9、1. Oymol/L。圖3為dNTPs濃度的優(yōu)化，其中1 7分別代表dNTPs終濃度依次為0. 1,0. 15、 0.2、0·25、0· 3、0· 35、0. 4mmol/L。圖4為鎂離子濃度的優(yōu)化，其中1 4分別代表鎂離子終濃度依次為2、3、4、 5mmol/L0圖5為使用Takara公司商品化熱啟動(dòng)PCR緩沖液對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，該圖的橫 坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值，其中1 6分別代表標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)依次為IX IO3 1 X IO8拷貝/μ 1，7為陰性對(duì)照。圖6為使用Takara公司商品化熱啟動(dòng)PCR緩沖液擴(kuò)增建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該圖的橫
5坐標(biāo)為模板的起始拷貝數(shù)，縱坐標(biāo)為Ct值。圖7為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線，該圖的橫坐標(biāo)為循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光值，其中 1 6分別代表標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒拷貝數(shù)依次為1 X IO3 1 X IO8拷貝/ μ 1，7為陰性對(duì)照。圖8為本發(fā)明擴(kuò)增建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，該圖的橫坐標(biāo)為模板的起始拷貝數(shù)，縱坐標(biāo) 為Ct值。圖9為本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增后PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，Marker為DL2000，1 6分別代表標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)?？截悢?shù)依次為1 X IO3 1 X IO8拷貝/ μ 1，7為陰性對(duì)照。圖10為使用本發(fā)明建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)定量BDV所感染的OL細(xì)胞中核酸的起始拷貝 數(shù)，其中1 4分別代表樣本1、樣本2、樣本3和樣本4。
具體實(shí)施例方式一、試劑盒的制備
1、熒光定量PCR引物和探針的設(shè)計(jì)，擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為199bp，均由上海英 (Invitrogen)生物技術(shù)有限公司合成和標(biāo)記。上游引物序列為SEQ ID N02 ； 下游引物序列為SEQ ID N03 ； 熒光探針序列為為SEQ ID N05。2、標(biāo)準(zhǔn)品的制備
標(biāo)準(zhǔn)品為插入P24片段的重組質(zhì)粒，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。根據(jù)質(zhì)粒濃度可以換算成拷貝 數(shù)，將質(zhì)粒稀釋至IX IO8拷貝/y 1，-20°C保存，使用前按10倍梯度稀釋。3、退火溫度的優(yōu)化
上下游引物的Tm值分別為57. 8°C和57. 3°C，根據(jù)Tm值將退火溫度分貝分別設(shè)置為 54. 80C >55. 50C >56. 6°C >57. 9°C >59. 4°C >60. 7°C、61. 7°C和 62. 3°C，使用普通 PCR 擴(kuò)增，選 出效果最好的退火溫度，結(jié)果見(jiàn)圖1，可見(jiàn)55°C左右為最佳退火溫度。
4、引物和探針濃度的優(yōu)化
在其他條件不變的情況下，將引物和探針的終濃度分別設(shè)置為0. 1,0. 2,0. 3,0. Ιο. 9、 1. 0 μ mol/L這10個(gè)梯度，使用熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，從擴(kuò)增曲線質(zhì)量上選取最佳的 引物和探針濃度。結(jié)果見(jiàn)圖2，可見(jiàn)引物探針在終濃度為0. 5 μ mol/L時(shí)較佳。5、dNTPs濃度的優(yōu)化
在其他條件不變的情況下，將dNTPs終濃度分別設(shè)置為0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3、 0. 35,0. 4mmol/L這7個(gè)梯度，使用熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，從擴(kuò)增曲線質(zhì)量、熒光強(qiáng)度和Ct 值上選取最佳的dNTPs終濃度，結(jié)果見(jiàn)圖3，可見(jiàn)最佳的dNTPs終濃度為0. lmmol/L。6、鎂離子濃度的優(yōu)化
在其他條件不變的情況下，將鎂離子終濃度分別設(shè)置為2、3、4、5mmol/L這4個(gè)濃度梯 度，使用熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，從擴(kuò)增曲線質(zhì)量、熒光強(qiáng)度和Ct值上選取最佳的鎂離子終 濃度，結(jié)果見(jiàn)圖4，可見(jiàn)各個(gè)鎂離子終濃度差別不大，以終濃度為3mmol/L時(shí)較佳。7、熒光定量PCR緩沖液的優(yōu)化
首先確定緩沖液適合擴(kuò)增目的片段的滴定酸，分別使用鹽酸、磷酸和硫酸在室溫下滴 定緩沖液，使用這3種緩沖液分別進(jìn)行常規(guī)PCR，結(jié)果可見(jiàn)硫酸滴定的緩沖液擴(kuò)增效果最佳，產(chǎn)量最多。在PCR添加劑的選擇上首先選取(NH4)2SO4的最佳濃度，然后依次選擇甜菜 堿、Triton X-100,TMAC (四甲基氯化銨)、DMS0 (二甲基亞砜)的最佳工作濃度，并將后4種 添加劑分別進(jìn)行組合，最終選擇甜菜堿、Triton X-100和TMAC進(jìn)行組合的擴(kuò)增效果最好。 最終優(yōu)化出的熒光定量PCR緩沖液主要包含以下成分20mmol/L Tris-H2SO4,PH值8. 3 ；100 mmol/L KCL ；6 mmol/L MgCL2 ；12 mmol/L (NH4)2SO4 ；1. 6 mol/L甜菜堿；0. 3%Triton X-100 ； 16 mmol/L TMAC0將優(yōu)化后的熒光定量PCR緩沖液同Takara公司商品化的熱啟動(dòng)PCR緩 沖液進(jìn)行比較，可見(jiàn)不論從擴(kuò)增曲線上還是標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量上均要優(yōu)于后者(圖5-6)。8、熒光定量PCR緩沖液(2X )的配制方法
①稱取0.242g Tris (三羥甲基氨基甲烷)溶于90ml雙蒸水中，使用硫酸在室溫下滴 定直至PH達(dá)8. 3 ；
②稱取0.745g KCL溶于上述液體中；
③稱取0.057g MgCL2溶于上述液體中；
④稱取0.159g (NH4) 2S04溶于上述液體中；
⑤稱取18.744g甜菜堿溶于上述液體中；
⑥加入0.3ml Triton X-100分析純(濃度> 99%)；
⑦稱取0.175g TMAC溶于上述液體中，均勻攪拌直至全部溶解，最后使用雙蒸水定容 至 100ml ；
⑧使用孔徑為0.22 μ m的濾膜對(duì)緩沖液進(jìn)行過(guò)濾除菌。9、使用博爾納病病毒p24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒建立標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)品使用滅菌去離子水按10倍依次稀釋至IX IO3 IO8拷貝/ μ 1，在優(yōu)化后的反
應(yīng)體系及反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR反應(yīng)體系
2 X熒光定量PCR反應(yīng)液 10 μ 1 Taq 酶0. 5 μ 1
標(biāo)準(zhǔn)品1 μ 1
去離子水8. 5 μ 1
總反應(yīng)體積20 μ 1
反應(yīng)條件為93°C 3min，93°C 45min、55°C 60min，后兩步反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，設(shè)置在55°C 退火和延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖7 ；標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖8 ；將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠 電泳鑒定，見(jiàn)圖9。從圖5 7可見(jiàn)擴(kuò)增曲線質(zhì)量良好，PCR產(chǎn)物電泳呈現(xiàn)明顯的梯度。陰 性對(duì)照曲線呈水平狀態(tài)，電泳無(wú)明顯條帶出現(xiàn)，無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增，特異性較理想。標(biāo)準(zhǔn) 曲線根據(jù)軟件計(jì)算出斜率為-3. 508，R2=O. 99989，擴(kuò)增效率為92. 763%，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線的線 性關(guān)系良好，定量可信度高，擴(kuò)增效率也很理想。二、實(shí)施例
使用博爾納病病毒P24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣本中的BDV核
酸
1、儀器和試劑
7熒光定量PCR儀為澳大利亞Corbett Research公司生產(chǎn)的Rotor-Gene 6000,常規(guī) PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司，Trizol試劑盒購(gòu)自Takara公司，BDV感染的OL細(xì)胞由德國(guó) 柏林自由大學(xué)Harms Ludwig教授惠贈(zèng)。2、樣本總RNA的提取
取4份BDV感染的OL細(xì)胞，分別標(biāo)記為樣本1 4，使用Trizol試劑盒提取總RNA，步 驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，提取完畢后可進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證RNA提取質(zhì)量。3、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系如下 IOX逆轉(zhuǎn)錄緩沖液 2μ1 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1
RNA樣品5μ1(1μβ左右)
DEPC-H2O12 μ 1
總反應(yīng)體積20 μ 1
反應(yīng)條件為42°C 15min,95°C 5min。
4、熒光定量PCR擴(kuò)增建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品為IXlO2 IO8拷貝/ μ 1，反應(yīng)
體系如下
2 X熒光定量PCR反應(yīng)液 10 μ 1 Taq 酶0. 5 μ 1
標(biāo)準(zhǔn)品/cDNA1μ 1/5μ 1
去離子水8. 5μ1/4. 5μ1
總反應(yīng)體積20 μ 1
反應(yīng)條件為93°C 3min，93°C 45min、55°C 60min，后兩步反應(yīng)40個(gè)循環(huán)，設(shè)置在 55 0C退火和延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖10，根據(jù)Ct值使用軟件計(jì)算出這4個(gè)樣本BDV mRNA的起始拷貝數(shù)， 結(jié)果見(jiàn)下表
權(quán)利要求
博爾納病病毒p24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征是該試劑盒包括 (1)10×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液； (2)AMV逆轉(zhuǎn)錄酶； (3)2×熒光定量PCR反應(yīng)液； (4)Taq聚合酶； (5)標(biāo)準(zhǔn)品； (6)陰性對(duì)照；其中，2×熒光定量PCR反應(yīng)液包括熒光定量PCR緩沖液，0.2 mmol/L dNTPs；上、下游引物和熒光探針各1 μmol/L；所述熒光定量PCR緩沖液的組成為20mmol/L Tris H2SO4(PH值8.3)；100 mmol/L KCL；6 mmol/L MgCL2；12 mmol/L (NH4)2SO4；1.6mol/L甜菜堿；0.3%Triton X 100；16 mmol/L TMAC。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的博爾納病病毒p24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒， 其特征是10X逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液；Oligo(ClT)15引物；dNTPs ；氯化鎂； DEPC-H2O。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的博爾納病病毒P24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特 征是標(biāo)準(zhǔn)品為將P24片段插入pET41a載體所構(gòu)建的重組質(zhì)粒(1 X IO7拷貝/ μ 1 )，其中， 不包括載體序列的標(biāo)準(zhǔn)品的序列為SEQ ID NOl。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的博爾納病病毒Ρ24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特 征是陰性對(duì)照由不加入任何模板的熒光定量PCR反應(yīng)液和Taq酶組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的博爾納病病毒Ρ24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特 征是上游引物的DNA序列為SEQ ID Ν02 ；下游引物的DNA序列為SEQ ID Ν03 ；所擴(kuò)增的特異性Ρ24片段的DNA序列為SEQ ID Ν04。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的博爾納病病毒ρ24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其 特征是熒光探針的序列為SEQ ID Ν05。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種使用簡(jiǎn)單方便，靈敏度和特異性高的熒光定量PCR試劑盒，能夠優(yōu)化提高PCR的擴(kuò)增效率，降低PCR污染發(fā)生率，準(zhǔn)確、快速檢測(cè)標(biāo)本中的BDV核酸。本發(fā)明提供的博爾納病病毒p24片段實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒包括10×逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、2×熒光定量PCR反應(yīng)液、Taq聚合酶、標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對(duì)照。其中熒光定量PCR反應(yīng)液為經(jīng)過(guò)優(yōu)化的反應(yīng)液。能夠縮短反應(yīng)時(shí)間和降低PCR污染可能性，還能顯著提高定量的準(zhǔn)確性和擴(kuò)增效率。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101967525SQ20101054924
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者張亮, 徐曉艷, 謝鵬, 金戈 申請(qǐng)人:重慶醫(yī)科大學(xué)