專利名稱：一種抗肝癌藥物及其制備、應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗癌蛋白的制備及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種新的抗肝癌蛋白 ERp48的制備及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝癌發(fā)病及預(yù)后現(xiàn)狀肝癌為全球常見癌癥之一，是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一。 國(guó)際抗癌研究中心(IARC)估計(jì)，目前全球肝癌新發(fā)病例約56. 4萬，其中中國(guó)新發(fā)肝癌每年 約30. 6萬，肝癌死亡約每年30. 0萬。顯然，中國(guó)肝癌年發(fā)病和年死亡數(shù)均占全球肝癌的半 數(shù)以上。我國(guó)是全球肝癌發(fā)病數(shù)最多的國(guó)家。我國(guó)肝癌患者40-50歲青壯年男性居多，而且 預(yù)后極差。1970s年代，我國(guó)未經(jīng)治療肝癌確診后平均生存時(shí)間1-2個(gè)月。在確診后95% 的患者于6個(gè)月內(nèi)死亡。1991-1998年澳大利亞對(duì)245例肝癌的中位生存期分析表明，其中 位生存期僅為8個(gè)月。其發(fā)病率，死亡率之高，預(yù)后之差，因而被稱之為“癌中之王”。我國(guó) 是肝炎病毒感染大國(guó)，乙型及丙型肝炎病毒攜帶率超過1. 5億人，而長(zhǎng)期攜帶病毒患者其 肝癌發(fā)生率是正常人群肝癌發(fā)生率的200-300倍之多。顯然，肝癌防治是我國(guó)醫(yī)務(wù)人員及 科研人員任重道遠(yuǎn)的任務(wù)。肝癌治療現(xiàn)狀及趨勢(shì)一個(gè)多世紀(jì)以來，肝癌的治療基本上是建立在系統(tǒng)病理學(xué) 的基礎(chǔ)上，及采用外科，放療，化療，介入和局部方法消滅病理證實(shí)的腫瘤細(xì)胞。在傳統(tǒng)的 治療模式下，小肝癌用射頻，切除，以及肝移植的5年生存率分別為40%、50%、以及60 70%。在這種綜合系統(tǒng)干預(yù)支持下的傳統(tǒng)肝癌治療措施下，小肝癌術(shù)后生存率已經(jīng)基本穩(wěn) 定于上述現(xiàn)狀，近年來基于上述傳統(tǒng)治療方案，即便是早期肝癌的預(yù)后也無顯著改善(湯 釗猷.從生物學(xué)角度看肝癌治療趨勢(shì).中華肝膽外科雜志.2009; 19:401-402)。導(dǎo)致患者 手術(shù)后難以長(zhǎng)期生存的根本原因在于轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)。化療的療效及局限性目前經(jīng)典的觀念認(rèn)為，減少患者手術(shù)，放療，射頻，以及肝 移植后復(fù)發(fā)的根本措施是全身化療。但近期美國(guó)圣地亞哥的科研人員甚至發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典化 療藥物之一的環(huán)磷酰胺甚至能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(Yamauchi K，Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice :an opposite effect of chemotherapy. Cancer Res. 2008 ；68 (2) =516-520) 這無疑為肝癌等腫瘤患者化療或術(shù)后 化療的應(yīng)用敲響了一個(gè)警鐘。而基于栓塞療法的化療可能會(huì)促進(jìn)肺癌轉(zhuǎn)移早已是近幾年腫 瘤專家們已經(jīng)注意的問題。顯然，腫瘤的化學(xué)治療很難成為肝癌治療的主要治療措施。無 論是局部治療還是全身化療，治療失敗的主要原因主要有兩個(gè)耐藥性及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但無論 是耐藥還是轉(zhuǎn)移，其根本原因在于缺乏徹底抑制腫瘤細(xì)胞復(fù)制的藥物。生物治療現(xiàn)狀及趨勢(shì)近半個(gè)多世紀(jì)以來，對(duì)不能手術(shù)切除的肝癌療效并無根本 進(jìn)展。其中最主要的原因是缺乏有效的特異性藥物治療靶點(diǎn)。近幾年來，以免疫療法為主 導(dǎo)的生物治療已經(jīng)成為腫瘤生物治療的主導(dǎo)方向之一。但基于免疫調(diào)節(jié)的生物治療對(duì)實(shí)體 瘤顯然難以實(shí)現(xiàn)完全消除實(shí)體病灶，但對(duì)癌細(xì)胞在血道、淋巴道的播散顯然具有一定療效。 就目前所提供的靶點(diǎn)而言，即便是針對(duì)部分、幾個(gè)所謂免疫靶點(diǎn)的藥物(如Sorafenib)，對(duì)不能手術(shù)切除肝癌的生存期也僅能延長(zhǎng)40%左右。顯然，肝癌有效靶點(diǎn)的探索仍然是制約 其療效和預(yù)后的瓶頸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種新的肝癌生物治療藥物，即一種新的 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)居民蛋白ERp48(發(fā)明人命名PubMed編號(hào)NM_032042)，該蛋白與現(xiàn)有生物免疫治療 制劑相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是直接抑制癌細(xì)胞DNA合成，而不是通過間接免疫調(diào)控達(dá)到抗癌治 療的作用。由于所述蛋白是人類正?；虻木幋a產(chǎn)物，無免疫原性及過敏反應(yīng)等潛在的副 作用。理論上同樣也不具有傳統(tǒng)腫瘤化療藥物的嚴(yán)重副作用，諸如造血抑制，脫發(fā)等。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種抗肝癌藥物，包括抗癌蛋白ERp48的， 原核或真核表達(dá)蛋白、重組蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多肽片段，中的一種或多種；所 述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編號(hào)為NM_032042。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表達(dá) 蛋白、重組蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多肽片段，中的一種或多種，在制備抗肝癌藥物 中的應(yīng)用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編號(hào)為NM_032042。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明又提供了一種抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表達(dá) 蛋白、重組蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多肽片段，中的一種或多種，在抗肝癌藥物篩選 中的應(yīng)用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編號(hào)為NM_032042。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明另提供了一種一種抗癌蛋白ERp48的制備方法，包 括以下步驟首先根據(jù)ERp48基因編碼序列，設(shè)計(jì)體外擴(kuò)增引物克隆該基因編碼序列，體外 克隆純化后的cDNA片段連接到pET-32a(+)表達(dá)質(zhì)粒上，連接目的片段的pET-32a-ERp48 表達(dá)質(zhì)粒體外擴(kuò)增，純化，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli,然后IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)ERp48蛋白； 表達(dá)后的蛋白采用反相色譜柱層析純化；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編號(hào)為 NM_032042o所述體外擴(kuò)增引物優(yōu)選為上游引物Pl 5' -ggtaccatgtctatttccttgagctc-3‘ ，下游弓 I物 P2 5' -aagcttcagctcttcgtgcttgatg-3 ‘。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明再提供了一種抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方 法，包括以下步驟a.應(yīng)用Trizol提取人肝癌細(xì)胞IfepG2總RNA ；b.逆轉(zhuǎn)錄制備H印G2細(xì)胞cDNA模板；c. PCR 法擴(kuò)增 ERp48 基因；d. pET32a-ERp48 目的載體構(gòu)建；e.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；f.重組蛋白的純化。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明也提供了一種抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表達(dá) 蛋白、重組蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多肽片段，中的一種或多種，在肝癌診斷和/或 治療中的應(yīng)用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編號(hào)為NM_032042。本發(fā)明有益的技術(shù)效果在于，本發(fā)明抗肝癌蛋白及其異構(gòu)體，活性多肽片段及相 應(yīng)的翻譯后修飾產(chǎn)物(1)是目前唯一直接作用于肝癌細(xì)胞，抑制癌細(xì)胞增殖的生物制劑。(2)由于其相應(yīng)的蛋白序列為人類自身基因編碼，無免疫原性.(3)與傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物相 比，理論上無導(dǎo)致DNA損傷等相應(yīng)的副作用，諸如嚴(yán)重的骨髓造血抑制，脫發(fā)等。(4)制備簡(jiǎn) 單，通過基因工程即可獲得相應(yīng)的純品。無需經(jīng)過單克隆抗體等制備過程復(fù)雜的細(xì)胞系篩 選。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例所述，培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞系H印G2，48小時(shí)后細(xì)胞(1X400 倍)照片，H印G2細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞庫；圖2為本發(fā)明實(shí)施例所述，培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞系H印G2，轉(zhuǎn)染ERp48真核表達(dá) 質(zhì)粒[pCDNA3. l(-)-ERp48]48小時(shí)后，肝腫瘤細(xì)胞系增生(IX400倍)照片，pcDNA3. 1 myc-his(-)A(簡(jiǎn)稱pcDNA3. 1(-))購自 Invitrogen 公司，產(chǎn)品編號(hào) V80020 ；圖3為本發(fā)明實(shí)施例所述，培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞系H印G2轉(zhuǎn)染ERp48表達(dá)質(zhì)粒 [PCDNA3. l(-)-ERp48]48小時(shí)后，細(xì)胞增生(1X200倍)照片；圖4為本發(fā)明實(shí)施例所述，培養(yǎng)人肝腫瘤細(xì)胞系H印G2轉(zhuǎn)染ERp48 RNA干預(yù)質(zhì)粒 (pcDNA6. 2-Gff/EmGFPmiR-ERp48shRNA)(簡(jiǎn)稱 pcDNA6· 2-ERp48shRNA) 48 小時(shí)后，細(xì)胞增生 (1X200倍)照片；圖5為本發(fā)明實(shí)施例所述，培養(yǎng)H印G2細(xì)胞48小時(shí)，流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié) 果圖；圖6為本發(fā)明實(shí)施例所述，ERp48重組蛋白(0. 0001 μ g/ml)處理培養(yǎng)的H印G2細(xì) 胞48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；圖7為本發(fā)明實(shí)施例所述，ERp48重組蛋白(0. 001 μ g/ml)處理培養(yǎng)的H印G2細(xì) 胞48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；圖8為本發(fā)明實(shí)施例所述，ERp48重組蛋白(0. 01 μ g/ml)處理培養(yǎng)的!fepG2細(xì)胞 48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖；圖9為本發(fā)明實(shí)施例所述，ERp48重組蛋白(0. 1 μ g/ml)處理培養(yǎng)的H印G2細(xì)胞 48小時(shí)后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于，提供一種新的肝癌生物治療藥物，即一種新的 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)居民蛋白ERp48(發(fā)明人命名，PubMed編號(hào)為NM_032042)，該蛋白與現(xiàn)有生物免疫 治療制劑相比，最大的優(yōu)點(diǎn)是直接抑制癌細(xì)胞DNA合成，而不是通過間接免疫調(diào)控達(dá)到抗 癌治療的作用。由于所述蛋白是人類正?；虻木幋a產(chǎn)物，無免疫原性及過敏反應(yīng)等潛在 的副作用。理論上同樣也不具有傳統(tǒng)腫瘤化療藥物的嚴(yán)重副作用，諸如造血抑制，脫發(fā)等。本發(fā)明具體實(shí)施包括以下主要步驟1.應(yīng)用Trizol提取人肝癌細(xì)胞0fepG2)總RNA(1)在大約為IO7個(gè)人肝癌細(xì)胞0fepG2)中，加入Iml Trizol試劑，充分混勻，室 溫靜置5min ；(2)加入0. 2ml氯仿，震蕩15s，靜置2min ；(3) 40C，12000rpm 離心 15min，留取上清；
(4)加入0. 5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置IOmin ；(5) 40C，12000rpm 離心 IOmin,棄上清；(6)加入Iml 75%乙醇(DEPC水配置)，洗滌沉淀，(7) 4"C，75OOrpm 離心 5min，吸棄上清；(8)超凈臺(tái)內(nèi)晾干，加入50 μ 1的DEPC水溶解(65°C促溶IOmin)。DEPC水是用DEPC (diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理過并經(jīng)高溫高壓消 毒的純水。經(jīng)檢測(cè)不含RNase> DNase禾口 proteinase。DEPC水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各種反應(yīng)體系如反轉(zhuǎn)錄、siRNA的退 火等，以及其它各種要求無RNase、DNase和proteinase的反應(yīng)體系。DEPC水一般是指千分之一濃度的DEPC，在攪拌器上攪拌至完全溶解，即看不到 “油珠”為止，用來處理Tip頭、離心管的DEPC水不需高壓滅活，而用于配制DEPC酒精等試 劑和用來這種RNA相關(guān)試驗(yàn)的DEPC水需滅火后使用。DEPC水的制備方法是取市售DEPC Iml，加入IL待處理水(蒸餾水等)中，經(jīng)猛 烈振搖后，于室溫靜止數(shù)小時(shí)，然后高壓滅菌，以除去降解DEPC (DEPC分解為CO2和乙醇)。2.逆轉(zhuǎn)錄制備H印G2細(xì)胞cDNA模板逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用寶生物(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)D6210A(1)配置 Reverse Transcription 反應(yīng)液_試劑使用量(μ )
Oligo dT Primer1
dNTP Mixture1
Total RNA2
DEPC水補(bǔ)充至10
(2) 65°C保溫5min后，冰上迅速冷卻；
(3)在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，總量為
試劑使用量(μ )
上述變性后反應(yīng)液10
5X PrimeScript II Buffer4
RNase Inhibitor0. 5
PrimeScript II RTase1
DEPC水補(bǔ)充至20_(4) 42 0C 50min，95°C 5min，冰上冷卻。3. PCR 法擴(kuò)增 ERp48 基因根據(jù)ERp48 序列(PubMed :NM-032042)，設(shè)計(jì)合成引物，上游引物 Pl 5' -ggtaccatgtctatttccttgagctc-3‘,下游弓丨物P2 5' -aagcttcagctcttcgtgcttgatg-3‘,分另Ij弓丨入 BamH I和Hind酶切位點(diǎn)。擴(kuò)增條件94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，58°C退火40s，72°C 延伸lmin20s，循環(huán)35次后，72°C保溫lOmin。1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果。反應(yīng)體
系如下
權(quán)利要求
1.一種抗肝癌藥物，其特征在于，包括抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表達(dá)蛋白、重組 蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多肽片段，中的一種或多種；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed 中的編號(hào)為NM_032042。
2.抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表達(dá)蛋白、重組蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多肽 片段，中的一種或多種，在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編 號(hào)為 NM_032042。
3.抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表達(dá)蛋白、重組蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多肽 片段，中的一種或多種，在抗肝癌藥物篩選中的應(yīng)用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編 號(hào)為 NM_032042。
4.一種抗癌蛋白ERp48的制備方法，其特征在于，包括以下步驟首先根據(jù)ERp48基 因編碼序列，設(shè)計(jì)體外擴(kuò)增引物克隆該基因編碼序列，體外克隆純化后的cDNA片段連接到 pET-32a (+)表達(dá)質(zhì)粒上，連接目的片段的pET-32a-ERp48表達(dá)質(zhì)粒體外擴(kuò)增，純化，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌E. coli，然后IPTG誘導(dǎo)大量表達(dá)ERp48蛋白；表達(dá)后的蛋白采用反相色譜柱層析純 化；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編號(hào)為NM_032042。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述抗癌蛋白ERp48的制備方法，其特征在于，所述體外擴(kuò)增引物 為上游弓丨物Pl 5' -ggtaccatgtctatttccttgagctc-3‘,下游弓丨物P2 5' -aagcttcagctc ttcgtgcttgatg-3‘ 。
6.一種抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟a.應(yīng)用Trizol提取人肝癌細(xì)胞IfepG2總RNA；b.逆轉(zhuǎn)錄制備IfepG2細(xì)胞cDNA模板；c.PCR法擴(kuò)增ERp48基因；d.pET32a-ERp48目的載體構(gòu)建；e.重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；f.重組蛋白的純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟 a，應(yīng)用Trizol提取人肝癌細(xì)胞IfepG2總RNA進(jìn)一步包括(1)在106-108個(gè)人肝癌細(xì)胞H印G2中，加入ImlTrizol試劑，充分混勻，室溫靜置 5min ；(2)加入0.2ml氯仿，震蕩15s，靜置2min ；(3)40C，12000rpm 離心 15min，留取上清；(4)加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置IOmin ；(5)40C，12000rpm 離心 IOmin,棄上清；(6)加入Iml75% DEPC水配置的乙醇，洗滌沉淀；(7)40C，7500rpm 離心 5min，吸棄上清；(8)超凈臺(tái)內(nèi)晾干，加入50μ 1的DEPC水溶解，65°C促溶lOmin。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟 b，逆轉(zhuǎn)錄制備H印G2細(xì)胞cDNA模板進(jìn)一步包括逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用寶生物(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)D6210A;(1)配置 Reverse Transcription 反應(yīng)液
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟c，PCR法擴(kuò)增ERp48基因進(jìn)一步包括上游引物 Pl 5 ‘ -ggtaccatgtctatttccttgagctc-3 ‘，下游引物 P2 5' -aagcttcagctcttcgtgcttgatg-3‘，分別引入 BamH I 和 Hind III酶切位點(diǎn)；擴(kuò)增條件 94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，58°C退火40s，72°C延伸lmin20s，循環(huán)35次后，72°C保溫 IOmin0 瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增結(jié)果；反應(yīng)體系如下
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟d，pET32a-ERp48目的載體構(gòu)建進(jìn)一步包括(1)PCR產(chǎn)物回收；(2)T-A 克?。?3)轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞；(4)提取質(zhì)粒；(5)酶切鑒定；(6)DNA序列測(cè)定；(7)表達(dá)載體的構(gòu)建。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟(1)，PCR產(chǎn)物回收，進(jìn)一步包括PCR產(chǎn)物回收試劑盒使用威格拉斯(北京)生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)N004;DDNA電泳結(jié)束后，用潔凈刀片在紫外線燈下切出相應(yīng)片段；2)含DNA的瓊脂糖膠塊裝入1.5ml離心管，估算其重量，且保證每管不超過0. 2g ；當(dāng)膠 土夬彡 0. Ig 時(shí)加入 Buffer I 300 μ 1 ；當(dāng)膠塊 >0. Ig 時(shí)，加入 Buffer I 600 μ 1 ； DNA Binding Matrix震蕩混勻后取5 μ 1加入以上液體；3)離心管置于60°C水浴lOmin，每隔2 3min取出混懸震蕩lOsec，至瓊脂糖凝膠完 全溶解；4)室溫放置5min，于臺(tái)式離心機(jī)上高速離心lmin，小心吸去液體；5)加入BufferII 300 μ 1，吹打混勻，高速離心lmin，小心吸去液體;6)加入BufferIII 600 μ 1，吹打混勻，高速離心lmin,小心吸凈液體，室溫晾干5min ；7)加入20μ 1 Elution Buffer,混懸震蕩，置于50 60°C水浴5min ；高速離心lmin， 吸出上清液體，轉(zhuǎn)入新的離心管中，即為純化的DNA溶液。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟(2)，T-A克隆，進(jìn)一步包括T4 DNA連接酶將目的基因片段插入載體pGEM-T:取3. 5μ1 PCR的回收產(chǎn)物，0. 5 μ 1 pGEM-T，加入 5μ1 2ΧΤ4 buffer 及 1 μ 1 Τ4 連接酶，16°C孵育過夜。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟(3)，轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)一步包括感受態(tài)制備來自單菌落或凍存菌液的細(xì)菌E. coli DH5a接種于5ml的LB培養(yǎng)基中 370C，小于200rpm振搖過夜活化，Iml接種于IOOml的LB培養(yǎng)基中，小于200rpm，37°C振搖 培養(yǎng)至A600 = 0. 6 0. 8 ；兩個(gè)離心管各裝入50ml培養(yǎng)液，冰浴lOmin，于4°C，4000rpm離 心lOmin，棄上清，各用IOml冰冷的0. IM CaCl2重懸菌體，4°C，4000rpm離心lOmin，棄上 清；各用2ml 0. IM CaCl2及0. 5ml的80%的甘油以250 μ 1分裝到Ep管中，凍存于_70°C ；轉(zhuǎn)化冰浴中融化一管凍存的感受態(tài)細(xì)菌加入10 μ 1的連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴 30min,轉(zhuǎn)入42°C水浴中熱休克90sec，再立即冰浴2min ；加入800 μ 1的不含抗生素的LB培 養(yǎng)基，于37°C 120 150rpm振搖45min ；IOOOg離心4min，棄掉800 μ 1上清，用剩余的培 養(yǎng)基重懸，鋪入氨芐西林平板上進(jìn)行菌落篩選，于37°C溫箱中倒置培養(yǎng)12 20h。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟(4)，提取質(zhì)粒，進(jìn)一步包括使用威格拉斯生物技術(shù)有限公司質(zhì)粒提取試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)NOll ；收菌取過夜培養(yǎng)菌l_3ml菌液，裝入1. 5ml的離心管中，12000xg室溫離心2min沉淀菌體，完全棄除上清；重懸加入200ul Buffer Pl，首次使用時(shí)加入RNase A，混勻，充分混懸震蕩菌體沉淀 10-15seC，使其完全分散開，至無絮塊存在；裂解加入200ul Buffer P2，輕輕顛倒離心管3_5次，室溫放置2-3min，使細(xì)菌完全裂 解，溶液透明；中和加入300ul Buffer P3，輕輕顛倒離心管4_6次，充分混勻，室溫放置l-5min，可 見白色絮狀物產(chǎn)生；于室溫12000Xg離心8min ；柱平衡向插入套管的離心柱內(nèi)加入300 Buffer PE，于臺(tái)式離心機(jī)上高速離心30sec， 棄去套管內(nèi)廢液，將離心柱插入套管；DNA結(jié)合將中和后離心的質(zhì)粒粗提物上清小心吸出，轉(zhuǎn)移至平衡液處理過的離心柱 內(nèi)，于臺(tái)式離心機(jī)上高速離心30sec ；棄去套管內(nèi)廢液，再將離心柱插回套管；清洗向離心柱內(nèi)加入Buffer PffT 500ul，高速離心30sec，棄去套管內(nèi)廢液，將離心 柱插回套管；再清洗向離心柱內(nèi)加入Buffer Pff 700ul，高速離心30sec，棄去套管內(nèi)廢液，再將離 心柱插回套管；再次高速離心l-2min甩干； 收離心柱取出離心柱，棄去套管；洗脫DNA 將離心柱插入一個(gè)新的1. 5ml離心管，在離心管內(nèi)硅膠膜中心位置加入30ul Elution Buffer ；高速離心lmin，離心管中即得純化的質(zhì)粒DNA溶液，保存于_20°C。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟(5)，酶切鑒定，進(jìn)一步包括反應(yīng)體系為提取的質(zhì)粒 pGEM-T-ERp48 的 DNA5 μ 1、EcoRI 和 Hind III各 1 μ 1、10ΧΜ buffer 1 μ 1，雙蒸水2 μ 1，總體積10 μ 1?；靹蚝?7°C過夜；2%瓊脂糖凝膠電泳，確認(rèn)質(zhì) 粒均已酶切；回收含ERP48基因片段的凝膠。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟(6)，DNA序列測(cè)定，進(jìn)一步包括挑取白色菌落，于含氨芐西林50 100yg/ml的液體LB 5ml中37 °C振蕩200 250rpm培養(yǎng)過夜，分裝到Ep管中，然后，進(jìn)行DNA序列測(cè)定。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟(7)，表達(dá)載體的構(gòu)建，進(jìn)一步包括pGEM-T-ERp48和pET_32a分別用EcoRI和Hind III雙酶切，反應(yīng)體系為質(zhì)粒DNA為 8 μ UEcoRI 和 Hind III各 1μ 1、10XM buffer 2 μ 1，雙蒸水 8 μ 1，總體積為 20 μ 1 ；混勻后 37°C過夜；2%瓊脂糖凝膠電泳樣品，確認(rèn)質(zhì)粒均已酶切； 酶切產(chǎn)物于2%瓊脂糖電泳分離，回收產(chǎn)物DNA ；T4 DNA連接酶將ERP48基因片段插入酶切后的載體pET-32a 取6 μ IPCR的回收產(chǎn)物， 1μ 1 pET-32a酶切回收產(chǎn)物，2μ 1 5ΧΤ4 buffer及1 μ 1 Τ4連接酶，16°C孵育過夜；pET-32a-ERP48連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒并用EcoRI和 Hind III雙酶切鑒定；最后將酶切鑒定陽性的轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行DNA序列測(cè)定。
18.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步驟e，重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)一步包括將轉(zhuǎn)化有pET-32a(+)-ERP48的大腸埃希氏菌50 μ 1接種于3ml含100 μ g/ml氨芐青 霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中，37°C 230 250rpm過夜培養(yǎng)，次日，取20ml轉(zhuǎn)種于2000ml含 100 μ g/ml氨芐青霉素的新鮮LB培養(yǎng)基中37°C 230 250rpm培養(yǎng)，至菌液密度為A600 = 0. 6 0. 8，加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為lmmol/L,以37°C繼續(xù)搖菌4h ；離心集菌，將沉淀 凍存于-80°C冰箱中。
19.根據(jù)權(quán)利要求6所述抗癌蛋白ERp48的重組蛋白的制備方法，其特征在于，所述步 驟f，重組蛋白的純化，進(jìn)一步包括(1)將細(xì)菌沉淀反復(fù)凍融三次后從-80度冰箱取出，收集菌斑于IOOml燒杯中；(2)稱量細(xì)菌沉淀重量3g；(3)加入濕菌液30ml，反復(fù)吹勻；(4)用濕菌液將細(xì)菌懸液稀釋200倍，紫外分光光度儀測(cè)OD值，濕菌液配方20mM Tris-HCl(PH8. 0)，5mM EDTA ；(5)超聲碎菌超聲5秒暫停5秒，5min/循環(huán)，每10個(gè)循環(huán)測(cè)OD值，30個(gè)循環(huán)后改為 超聲20秒暫停20秒，共50個(gè)循環(huán)；(6)40C 15000rpm 離心 20min ；(7)洗滌液30ml洗滌包涵體3次，離心3次，離心條件15000rpm，4°C，15min，洗滌液 配方0. 5M 尿素，20mM Tris-HCl (PH8. 0), 5mM EDTA, IOOmM NaCl, 1% Triton X-100 ；(8)ddH20 30ml洗滌包涵體2次，離心2次，條件同上；(9)A液，8M脲，30ml溶解包涵體，室溫低速搖過夜；(10)15000rpm，4°C離心 25min ；(11)A液充分溶解包涵體后，離心收集上清，0.22 μ m濾膜過濾后經(jīng)AKTA purifier蛋 白純化儀進(jìn)行復(fù)性和純化；(12)蛋白分析試劑盒BCA法測(cè)定得到的重組蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分析蛋白純度， 蛋白分析試劑盒購自Thermo公司，產(chǎn)品編號(hào)23227。
20.抗癌蛋白ERp48的，原核或真核表達(dá)蛋白、重組蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多 肽片段，中的一種或多種，在肝癌診斷和/或治療中的應(yīng)用，所述抗癌蛋白ERp48在PubMed 中的編號(hào)為NM_032042。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗肝癌藥物及其制備方法，應(yīng)用?？垢伟┧幬锇拱┑鞍譋Rp48的，原核或真核表達(dá)蛋白、重組蛋白、異構(gòu)體、剪切體、以及活性多肽片段，中的一種或多種；所述抗癌蛋白ERp48在PubMed中的編號(hào)為NM_032042。本發(fā)明抗肝癌蛋白及其異構(gòu)體，活性多肽片段及相應(yīng)的翻譯后修飾產(chǎn)物(1)是目前唯一直接作用于肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期，抑制癌細(xì)胞增殖的多肽類藥物。(2)由于其相應(yīng)的蛋白序列為人類自身基因編碼，無免疫原性.(3)與傳統(tǒng)化學(xué)治療藥物相比，理論上無導(dǎo)致DNA損傷等相應(yīng)的副作用，諸如脫發(fā)等。(4)制備簡(jiǎn)單，通過基因工程即可獲得相應(yīng)的純品。無需經(jīng)過單克隆抗體等制備過程復(fù)雜的細(xì)胞系篩選。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102000322SQ20101054905
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月18日
發(fā)明者張錦前, 肖凡, 魏紅山 申請(qǐng)人:北京地壇醫(yī)院