專利名稱：納米金顆粒在dna折紙芯片上的可控分布方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種納米技術(shù)領(lǐng)域的分布方法，特別是基于非對稱二維DNA折紙 術(shù)芯片為模板，構(gòu)建5nm納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法。
背景技術(shù)：
納米金(nanogold)是指金的微小顆粒，其直徑為1 lOOnm，一般為分散在水中形 成的膠體溶液，故又稱膠體金。在納米金顆粒表面吸附著某種化學(xué)物質(zhì)，單體納米金顆粒是 非常穩(wěn)定的。金納米粒子電子密度高，具有量子尺寸效應(yīng)，小體積效應(yīng)和表面效應(yīng)，可以通 過靜電引力、疏水效應(yīng)等多種作用形式與大分子結(jié)合形成穩(wěn)定的膠體金探針。在過去40多 年來，納米金顆粒已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于免疫細(xì)胞化學(xué)以及生物標(biāo)記等生物技術(shù)中。2006年，加州理工大學(xué)的Rothemund提出、設(shè)計、并實現(xiàn)了 DNA折紙術(shù)。[Rothemund Pff. Nature 2006，440，297]。Rothemund在最初的文章中折出了六種圖形，雖然各具特色， 但不難發(fā)現(xiàn)它們?nèi)渴菍ΨQ圖形。DNA折紙術(shù)排布納米金按照方式方法的不同大體可分為 三類第一類是寡核苷酸雜交法。在納米金顆粒上修飾某寡核苷酸鏈(實際一個金球表面 會連很多鏈)，然后把它加入折紙術(shù)圖形中，由于訂書釘鏈上會伸出與該寡核苷酸鏈互補的 探針，所以金球?qū)⑼ㄟ^核酸鏈的雜交而結(jié)合到圖形的特定位置上[Le JD, Pinto Y，Seeman NC，et al.Nano Letters 2004，4，2343]。第二類是直接組裝法。既然納米金可以與DNA結(jié) 合，那么就有可能讓其直接參與折紙術(shù)圖形自組裝過程，自組裝完成的同時，也就形成了這 些小分子的排布[Sharma J, Chhabra R, Andersen CS, et al. J Am Chem Soc 2008，130， 7820]。第三類是其他方法。其他連接納米金的方法還有很多，比如Chengde Mao組開發(fā)的 分子光亥Ij法(molecular lithography) [Deng Ζ,Mao C. Angew Chem Int Ed Engl 2004,43, 4068]，等等。公開文獻記載了張釗等在先進材料上發(fā)表名為空間可尋址免索引的液相非對稱 DNA折紙芯片文章中公開了 DNA折紙芯片訂書釘鏈序列表[Zhao Ζ, Ying W，et al. Adv Mater 2010，22，1]，該文利用仿中國地圖形狀的非對稱二維DNA折紙術(shù)為模板，在模板上 設(shè)計和引出特定的寡核苷酸序列作為連接位點，通過和修飾了互補序列DNA短鏈的生物 素_親和素系統(tǒng)雜交結(jié)合，把納米粒子結(jié)合到折紙芯片上，同時，還對納米粒子的結(jié)合位置 進行了比較。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種納米顆粒在DNA折紙芯片上 的可控分布方法。本發(fā)明采用現(xiàn)有技術(shù)相同的DNA折紙芯片訂書釘鏈序列表，方向是從左 到右為5’ -3，。但是，本發(fā)明中模板上設(shè)計結(jié)合位點的位置和伸出特定的寡核苷酸序列在 制備DNA折紙芯片時，需將帶伸出寡核苷酸捕獲探針的訂書釘鏈替換列表中相同序列號的 訂書釘鏈即可。本發(fā)明通過利用寡核苷酸序列修飾和雜交的方法，在仿中國地圖形狀的納 米折紙術(shù)結(jié)構(gòu)上連接5nm粒徑膠體金顆粒，從而實現(xiàn)納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布。本發(fā)明是通過以下三種技術(shù)方案實現(xiàn)的技術(shù)方案一技術(shù)方案一包括步驟如下第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片；所述的非對稱二維圖形，在特定位置的訂書釘鏈末端伸出寡核苷酸捕獲探針，讓 它與末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的目標(biāo)鏈一對一雜交。所述的非對稱二維圖形是依靠M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長達(dá)7249個堿基腳手 架長鏈光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而圖形則來自用于綁定的229條短訂書釘鏈。所述的DNA折紙芯片的制備方法(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ訂書釘鏈，包括形成非對稱二維圖形的、伸出探針的等 體積混合，再稀釋20倍備用；訂書釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號為9。(2)在96孔板上混合總量為30 μ 1的溶液0. 025 μ M訂書釘鏈22 μ 1 ；1/2濃度 的 M13mpl8 1 μ 1 ； 1 X TAE-Mg2+buffer :7μ 1。第二步，制備膠體金探針；第二步中所述的膠體金探針制備方法①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫 300rpm搖24小時。②加入終濃度0. IM NaCl，室溫300rpm搖48小時。③4°C，15000rpm離心10分鐘，棄上清。④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0. IM NaCl清洗兩次。⑤加入IxTE ；IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存。⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長紫外吸收峰測定。第三步，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接；第三步中所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片 摩爾濃度比2比1混合，37°C水浴雜交1小時。第四步，原子力顯微鏡成像；第四步中所述的原子力顯微鏡成像的步驟吸取2. 5 μ 1樣品(實際2-5 μ 1均可) 滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)一使用輕敲模式，液相 成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，采用技術(shù)方案一所述方法，納米金顆粒在DNA折紙 術(shù)圖形上連接效率能達(dá)到10%左右。技術(shù)方案二考慮到連接在金膠顆粒上的寡核苷酸探針存在著大約50°C的活性溫度閾值 (meltingtemperature)，低于該溫度寡核苷酸探針吸附在金膠顆粒表面而喪失了大部分和 捕獲探針鏈鏈接的能力，結(jié)果導(dǎo)致連接效率很低。當(dāng)雜交溫度高于50°C時，仿中國地圖折紙 圖形會出現(xiàn)局部熱降解和不規(guī)則連接，失去原有形貌。所以雜交固定在靠近金顆粒底部寡 核苷酸探針上，以避免寡核苷酸探針吸附在金膠顆粒表面影響連接效率。
技術(shù)方案二包括步驟如下第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片；所述的非對稱二維圖形是依靠M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長達(dá)7249個堿基腳手 架長鏈光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而圖形則來自用于綁定的229條短訂書釘鏈。所述的DNA折紙芯片的制備方法(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ訂書釘鏈，包括形成非對稱二維圖形的、伸出探針的等 體積混合，再稀釋20倍備用；訂書釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號為9。(2)在96孔板上混合總量為30 μ 1的溶液0. 025 μ M訂書釘鏈22 μ 1 ；1/2濃度 的 M13mpl8 1 μ 1 ； 1 X TAE-Mg2+buffer :7μ 1。第二步，制備膠體金探針；所述的膠體金探針，在膠體金探針連入地圖之前，先將一個IOnt短鏈，在50°C時， 雜交固定在靠近金顆粒底部寡核苷酸探針上。所述的膠體金探針制備方法包括以下步驟 ①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫 300rpm搖24小時。②加入終濃度0. IM NaCl，室溫300rpm搖48小時。③4°C，15000rpm離心10分鐘，棄上清。④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0. IM NaCl清洗兩次。⑤加入IxTE ；IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存。⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長紫外吸收峰測定。第三步，DNA短鏈與膠體金探針雜交；第三步中所述的雜交是指5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比1比 1混合，50°C水浴雜交1小時。第四步，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接；第四步中所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片 摩爾濃度比2比1混合，37°C水浴雜交1小時。第五步，原子力顯微鏡成像；第五步中所述的原子力顯微鏡成像的步驟吸取2. 5 μ 1樣品(實際2-5 μ 1均可) 滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)一使用輕敲模式，液相 成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，采用技術(shù)方案二所述方法，納米金顆粒在DNA折紙 術(shù)圖形上連接效率略有提高，能達(dá)到15%左右。技術(shù)方案三技術(shù)方案三包括步驟如下第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片；所述的非對稱二維圖形，在特定位置附近伸出三條訂書釘鏈末端修飾寡核苷酸捕 獲探針，讓它們與同一個末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的報告探針鏈三對一雜交。所述的非對稱二維圖形是依靠M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長達(dá)7249個堿基腳手
6架長鏈光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而圖形則來自用于綁定的229條短訂書釘鏈。所述的DNA折紙芯片的制備方法(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ訂書釘鏈，包括形成非對稱二維圖形的、伸出探針的等 體積混合，再稀釋20倍備用；訂書釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號為9，10，22。(2)在96孔板上混合總量為30 μ 1的溶液0. 025 μ M訂書釘鏈22 μ 1 ；1/2濃度 的 M13mpl8 1 μ 1 ； 1 X TAE-Mg2+buffer :7μ 1。第二步，制備膠體金探針；第二步中所述的膠體金探針制備方法①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫 300rpm搖24小時。②加入終濃度0. IM NaCl，室溫300rpm搖48小時。③4°C，15000rpm離心10分鐘，棄上清。④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0. IM NaCl清洗兩次。⑤加入IxTE ；IOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存。⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長紫外吸收峰測定。第三步，DNA短鏈與膠體金探針雜交；第三步中所述的雜交是指5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比1比 1混合，50°C水浴雜交1小時。第四步，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接；第四步中所述的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片 摩爾濃度比2比1混合，37°C水浴雜交1小時。第五步，原子力顯微鏡成像；第五步中所述的原子力顯微鏡成像的步驟吸取2. 5 μ 1樣品(實際2-5 μ 1均可) 滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)一使用輕敲模式，液相 成像。在折紙圖形特定位置附近伸出三條訂書釘鏈末端修飾寡核苷酸捕獲探針，讓它們 與同一個末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的報告探針鏈三對一雜交，再結(jié)合方案二，使得金 顆粒空間位置得到有效控制同時增強了連接的穩(wěn)定性。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，采用 技術(shù)方案三所述方法，納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率明顯提高，能達(dá)到95%以 上。
具體實施例方式本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過 程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法， 通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1檢測條件本實施例采用DNA折紙術(shù)構(gòu)造了中國地圖的形狀，原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示所得到的中國地圖最長處約150納米，最寬處約120納米，高度為2納米。此圖形是依靠腳手 架長鏈(M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長達(dá)7249個堿基)光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而 地案則來自用于綁定的229條短訂書釘鏈。此圖形的特點是229條訂書釘鏈就是兩百 多個可尋址的潛在反應(yīng)位點，模版上的任何一點都可以利用圖形自身作為參照精確定位， 無需索引標(biāo)記。另外，229條短DNA單鏈中的任意一條都可以伸出核苷酸序列作為捕獲探針 與帶納米顆粒標(biāo)記的互補核苷酸序列進行雜交，作為折紙圖形上納米顆粒的連接點。在利 用此非對稱圖形為模板形成納米點分布時，利用模板復(fù)雜性來降低對納米點分布的復(fù)雜性 要求。本實施例中所述的非對稱二維圖形，在特定位置的訂書釘鏈末端伸出寡核苷酸捕獲 探針，讓它與末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的目標(biāo)鏈一對一雜交。本實施例以中國地圖為芯片基底，所有訂書釘鏈，包括形成地圖的、伸出探針的， 全部從上海捷瑞公司訂購(PAGE純化)，且統(tǒng)一用二次水稀釋到100 μ M備用。腳手架鏈?zhǔn)?用NEB公司的M13mpl8病毒單鏈，貨號N4040S。共7249base，濃度為0. 25 μ g/μ 1，總5 μ g。 由于Iyg 0.42pmol，故濃度約0. ΙρΜ/μΙ = 0. ΙμΜ。實際稀釋到1/2濃度使用。不用 酶切處理，保持環(huán)鏈狀態(tài)。5nm粒徑膠體金顆粒使用Sigma公司，貨號G1402。使用相同的 反應(yīng)buffer和成像buffer 在1 X TAE (Tris，40mM ；乙酸，20mM ；EDTA, 2mM)中加入乙酸鎂粉 末，Mg2+終濃度為12. 5mM,pH8. 0。使用美國Veeco/Digital Instruments公司的多模式原 子力顯微鏡(Multimode AFM)觀測。J-scanner，NP-S針尖，共振頻率在7_10kHz之間。本實施例的納米顆粒的可控分布實施步驟如下第一制備仿中國地圖形狀DNA折紙芯片1.把所有要用的訂書釘鏈(ΙΟΟμΜ)包括形成地圖的、伸出探針的等體積混合，再 稀釋20倍備用。訂書釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號為9。2.在96孔板上按照以下體系混合溶液(以下是最“節(jié)省”的體系，實際做時可以 整體翻倍，或單獨把腳手架鏈翻倍)訂書釘鏈(0.025 μ Μ) 22 μ 1M13mpl8 (1/2 濃度) 1 μ 11X TAE-Mg2+buffer 7 μ 1Total30 μ 13.放在 PCR 儀(ABI 9700)上退火，95°C 降溫至 20°C，0. 1°C /IOs = 0. 6°C /min = rc /ioos。第二 制備5nm粒徑膠體金探針1.寡核苷酸與5nm粒徑膠體金顆粒摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中， 室溫300rpm搖24小時。2.加入終濃度0. IM NaCl，室溫300rpm搖48小時。3. 4°C，15000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。4.加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0. IM NaCl清洗兩次。5.加入 lxTE(10mM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4°C保存。6. 5nm粒徑膠體金顆粒探針濃度利用0D260測定。第三5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國地圖形狀DNA折紙芯片連接5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國地圖形狀DNA折紙芯片摩爾濃度比2比1混合，37 °C水浴雜交1小時。第四原子力顯微鏡成像吸取2. 5 μ 1樣品(實際2-5 μ 1均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿 到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)一使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，本實施例納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率 能達(dá)到10%左右。實施例2檢測條件本實施例采用DNA折紙術(shù)構(gòu)造了中國地圖的形狀，原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示所 得到的中國地圖最長處約150納米，最寬處約120納米，高度為2納米。此圖形是依靠腳手 架長鏈(M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長達(dá)7249個堿基)光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而 地案則來自用于綁定的229條短訂書釘鏈。此圖形的特點是229條訂書釘鏈就是兩百 多個可尋址的潛在反應(yīng)位點，模版上的任何一點都可以利用圖形自身作為參照精確定位， 無需索引標(biāo)記。另外，229條短DNA單鏈中的任意一條都可以伸出核苷酸序列作為捕獲探針 與帶納米顆粒標(biāo)記的互補核苷酸序列進行雜交，作為折紙圖形上納米顆粒的連接點。在利 用此非對稱圖形為模板形成納米點分布時，利用模板復(fù)雜性來降低對納米點分布的復(fù)雜性 要求。本實施例中考慮到連接在金膠顆粒上的寡核苷酸探針存在著大約50°C的活性溫度閾 值(melting temperature)，低于該溫度寡核苷酸探針吸附在金膠顆粒表面而喪失了大部 分和捕獲探針鏈鏈接的能力，結(jié)果導(dǎo)致連接效率很低。當(dāng)雜交溫度高于50°C時，仿中國地圖 折紙圖形會出現(xiàn)局部熱降解和不規(guī)則連接，失去原有形貌。所以雜交固定在靠近金顆粒底 部寡核苷酸探針上，以避免寡核苷酸探針吸附在金膠顆粒表面影響連接效率。本實施例以中國地圖為芯片基底，所有訂書釘鏈，包括形成地圖的、伸出探針的， 全部從上海捷瑞公司訂購(PAGE純化)，且統(tǒng)一用二次水稀釋到100 μ M備用。腳手架鏈?zhǔn)?用NEB公司的M13mpl8病毒單鏈，貨號N4040S。共7249base，濃度為0. 25 μ g/μ 1，總5 μ g。 由于Iyg 0.42pmol，故濃度約0. ΙρΜ/μΙ = 0. ΙμΜ。實際稀釋到1/2濃度使用。不用 酶切處理，保持環(huán)鏈狀態(tài)。5nm粒徑膠體金顆粒使用Sigma公司，貨號G1402。使用相同的 反應(yīng)buffer和成像buffer 在1 X TAE (Tris，40mM ；乙酸，20mM ；EDTA, 2mM)中加入乙酸鎂粉 末，Mg2+終濃度為12. 5mM,pH8. 0。使用美國Veeco/Digital Instruments公司的多模式原 子力顯微鏡(Multimode AFM)觀測。J-scanner，NP-S針尖，共振頻率在7_10kHz之間。本實施例的納米顆粒的可控分布實施步驟如下第一制備仿中國地圖形狀DNA折紙芯片1.把所有要用的訂書釘鏈(ΙΟΟμΜ)包括形成地圖的、伸出探針的等體積混合，再 稀釋20倍備用。訂書釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號為9。2.在96孔板上按照以下體系混合溶液(以下是最“節(jié)省”的體系，實際做時可以 整體翻倍，或單獨把腳手架鏈翻倍)訂書釘鏈(0.025 μ Μ) 22 μ 1M13mpl8(l/2 濃度)Ιμ IXTAE-Mg2+buffer 7 μ 1Total30 μ 1
3.放在 PCR 儀(ABI 9700)上退火，95°C 降溫至 20°C，0. 1°C/IOs = 0. 6°C/min = rc /ioos。第二 制備5nm粒徑膠體金探針1.寡核苷酸與5nm粒徑膠體金顆粒摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中， 室溫300rpm搖24小時。2.加入終濃度0. IM NaCl，室溫300rpm搖48小時。3. 4°C，15000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。4.加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0. IM NaCl清洗兩次。5.加入 IxTEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4°C保存。6. 5nm粒徑膠體金顆粒探針濃度利用0D260測定。第三IOnt DNA短鏈與5nm粒徑膠體金顆粒探針雜交5nm粒徑膠體金顆粒探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比1比1混合，50°C水浴雜交 1小時。第四5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國地圖形狀DNA折紙芯片連接5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國地圖形狀DNA折紙芯片摩爾濃度比2比1混合， 37 °C水浴雜交1小時。第五原子力顯微鏡成像吸取2.5μ1樣品(實際2-5 μ 1均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿 到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)一使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，本實施例納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率 略有提高，能達(dá)到15%左右。實施例3檢測條件本實施例采用DNA折紙術(shù)構(gòu)造了中國地圖的形狀，原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示所 得到的中國地圖最長處約150納米，最寬處約120納米，高度為2納米。此圖形是依靠腳手 架長鏈(M13mpl8噬菌體的單鏈DNA，長達(dá)7249個堿基)光柵填充式的反復(fù)折疊形成的，而 地案則來自用于綁定的229條短訂書釘鏈。此圖形的特點是229條訂書釘鏈就是兩百 多個可尋址的潛在反應(yīng)位點，模版上的任何一點都可以利用圖形自身作為參照精確定位， 無需索引標(biāo)記。另外，229條短DNA單鏈中的任意一條都可以伸出核苷酸序列作為捕獲探 針與帶納米顆粒標(biāo)記的互補核苷酸序列進行雜交，作為折紙圖形上納米顆粒的連接點。在 利用此非對稱圖形為模板形成納米點分布時，利用模板復(fù)雜性來降低對納米點分布的復(fù)雜 性要求。本實施例中在折紙圖形特定位置附近伸出三條訂書釘鏈末端修飾寡核苷酸捕獲探 針，讓它們與同一個末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的報告探針鏈三對一雜交，再結(jié)合方案 二，使得金顆?？臻g位置得到有效控制同時增強了連接的穩(wěn)定性。本實施例以中國地圖為芯片基底，所有訂書釘鏈，包括形成地圖的、伸出探針的， 全部從上海捷瑞公司訂購(PAGE純化)，且統(tǒng)一用二次水稀釋到100 μ M備用。腳手架鏈?zhǔn)?用NEB公司的M13mpl8病毒單鏈，貨號N4040S。共7249base，濃度為0. 25 μ g/μ 1，總5 μ g。 由于Iyg 0.42pmol，故濃度約0. ΙρΜ/μΙ = 0. ΙμΜ。實際稀釋到1/2濃度使用。不用 酶切處理，保持環(huán)鏈狀態(tài)。5nm粒徑膠體金顆粒使用Sigma公司，貨號G1402。使用相同的反應(yīng)buffer和成像buffer 在1 X TAE (Tris，40mM ；乙酸，20mM ；EDTA, 2mM)中加入乙酸鎂粉 末，Mg2+終濃度為12. 5mM,pH8. 0。使用美國Veeco/Digital Instruments公司的多模式原 子力顯微鏡(Multimode AFM)觀測。J-scanner，NP-S針尖，共振頻率在7_10kHz之間。本實施例的納米顆粒的可控分布實施步驟如下第一制備仿中國地圖形狀DNA折紙芯片1.把所有要用的訂書釘鏈(ΙΟΟμΜ)包括形成地圖的、伸出探針的等體積混合，再 稀釋20倍備用。訂書釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列號為9，10，22。2.在96孔板上按照以下體系混合溶液(以下是最“節(jié)省”的體系，實際做時可以 整體翻倍，或單獨把腳手架鏈翻倍)訂書釘鏈(0.025 μ Μ) 22 μ 1M13mpl8(l/2 濃度)Ιμ 1 X TAE-Mg2+buf f er 7μ 1Total30 μ 13.放在 PCR 儀(ABI 9700)上退火，95°C 降溫至 20°C，0. 1°C /IOs = 0. 6°C /min = rc /ioos。第二 制備5nm粒徑膠體金探針1.寡核苷酸與5nm粒徑膠體金顆粒摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中， 室溫300rpm搖24小時。2.加入終濃度0. IM NaCl，室溫300rpm搖48小時。3. 4°C，15000rpm 離心 10 分鐘，棄上清。4.加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0. IM NaCl清洗兩次。5.加入 IxTEdOmM Tris-HCl, ImM EDTA, pH = 8. 0)，4°C保存。6. 5nm粒徑膠體金顆粒探針濃度利用0D260測定。 第三IOnt DNA短鏈與5nm粒徑膠體金顆粒探針雜交5nm粒徑膠體金顆粒探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比1比1混合，50°C水浴雜交 1小時。第四5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國地圖形狀DNA折紙芯片連接5nm粒徑膠體金顆粒探針與仿中國地圖形狀DNA折紙芯片摩爾濃度比2比1混合， 37 °C水浴雜交1小時。第五原子力顯微鏡成像吸取2.5μ1樣品(實際2-5 μ 1均可)滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿 到原子力顯微鏡下成像。統(tǒng)一使用輕敲模式，液相成像。原子力顯微鏡成像結(jié)果顯示，本實施例納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上連接效率 明顯提高，能達(dá)到95%以上。DNA折紙芯片訂書釘鏈伸出寡核苷酸捕獲探針序列如下(直體部分是訂書釘鏈， 斜體部分是伸出寡核苷酸捕獲探針，從左到右為5’ _3’，制備DNA折紙芯片時，替換相同序 列號訂書釘鏈)9CGCCTAGTTGGACGGCGACACAGGAGGTAGTGCCGTCGAGAGGG (用于技術(shù)方案一，二，三)10CGCCTAGTTGGACGGCGACACAGTACCAGGCGGATATTAGCGGG (用于技術(shù)方案三)
22CGCCTAGTTGGACGGCGACAGTTTTGCTAAGAGAAGGATTAGGAGAGGCTGA (用于技術(shù)方案 三)IOnt DNA短鏈序列(從左到右為5，-3，)CGCCTAGTTG巰基基團修飾報告探針序列(從左到右為5’ -3’ )TGTCGCCGTCCAACTAGGCG-SH以上實施例的原子力顯微鏡成像結(jié)果分別顯示納米金顆粒在DNA折紙術(shù)圖形上 連接效率能達(dá)到10% -15%，最高能達(dá)到95%以上。
權(quán)利要求
一種納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征在于，所述的方法為以下三種技術(shù)方案的任一種技術(shù)方案一包括如下步驟第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片，第二步，制備膠體金探針，第三步，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接，第四步，原子力顯微鏡成像，所述的非對稱二維圖形，在特定位置的訂書釘鏈末端伸出寡核苷酸捕獲探針，讓它與末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的目標(biāo)鏈一對一雜交；技術(shù)方案二包括如下步驟第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片，第二步，制備膠體金探針，第三步，DNA短鏈與膠體金探針雜交，第四步，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接，第五步，原子力顯微鏡成像，所述的膠體金探針，在膠體金探針連入地圖之前，先將一個10nt短鏈，在50℃時，雜交固定在靠近金顆粒底部寡核苷酸探針上；技術(shù)方案三包括如下步驟第一步，利用DNA折紙術(shù)構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片，第二步，制備膠體金探針，第三步，DNA短鏈與膠體金探針雜交，第四步，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接，第五步，原子力顯微鏡成像，所述的非對稱二維圖形，在特定位置附近伸出三條訂書釘鏈末端修飾寡核苷酸捕獲探針，讓它們與同一個末端修飾5nm粒徑膠體金顆粒的報告探針鏈三對一雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述 的DNA折紙芯片，其制備方法如下(1)把所有要用的ΙΟΟμΜ訂書釘鏈，包括形成非對稱二維圖形的、伸出探針的等體積 混合，再稀釋20倍備用；(2)在96孔板上混合總量為30μ 1的溶液0. 02511|1訂書釘鏈22111 ；1/2濃度的 M13mpl8 1 μ 1 ； 1 XTAE-Mg2+buffer :7μ 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述 的膠體金探針，其制備方法①寡核苷酸與5nm粒徑膠體金摩爾濃度比200比1加入IOmM磷酸緩沖液中，室溫 300rpm搖24小時；②加入終濃度0.IM NaCl，室溫300rpm搖48小時；③40C，15000rpm離心10分鐘，棄上清；④加入IOmM磷酸緩沖液，終濃度0.IM NaCl清洗兩次；⑤加入IxTE ；IOmM Tris-HCl，ImM EDTA, pH = 8. 0，4°C保存；⑥5nm粒徑膠體金探針濃度利用520nm波長紫外吸收峰測定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述 的雜交是指5nm粒徑膠體金探針與IOnt DNA短鏈摩爾濃度比1比1混合，50°C水浴雜交1 小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述 的連接是指5nm粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片摩爾濃度比2比1混合， 37 °C水浴雜交1小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法，其特征是，所述 的原子力顯微鏡成像是指吸取2-5 μ 1樣品滴到新切云母表面，吸附2分鐘后即可拿到原 子力顯微鏡下成像。
全文摘要
一種納米技術(shù)領(lǐng)域的納米顆粒在DNA折紙芯片上的可控分布方法。該方法為三種方案的任一種一、構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片，制備膠體金探針，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接，原子力顯微鏡成像；二、構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片，制備膠體金探針，DNA短鏈與膠體金探針雜交，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接，原子力顯微鏡成像；三、構(gòu)造一個非對稱二維圖形，制備DNA折紙芯片，制備膠體金探針，DNA短鏈與膠體金探針雜交，粒徑膠體金探針與非對稱二維圖形DNA折紙芯片連接，原子力顯微鏡成像，本發(fā)明在極微量生化檢測芯片研制，納米器件開發(fā)，納米粒子基本性質(zhì)研究等學(xué)科領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用空間。
文檔編號C12Q1/68GK101948927SQ201010503080
公開日2011年1月19日 申請日期2010年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月12日
發(fā)明者馮曉錄, 李璨, 賀林, 陳培華 申請人:上海交通大學(xué);上海佰真生物科技有限公司