專利名稱：檢測和定型食管hpv病毒的引物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測和定型感染食管細(xì)胞(例如食管粘膜細(xì)胞)的人乳頭瘤病毒 的引物和方法。
背景技術(shù)：
人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，簡稱HPV)是一種小型、無包膜的DNA病 毒，其具有雙鏈閉環(huán)的DNA基因組，大小約為7. 2-8kb，相對分子量約為5X106。HPV基因組 可分為3個區(qū)域非編碼的上游調(diào)節(jié)區(qū)；早期開放讀碼區(qū)，包括E6、E7、E1、E2、E4、E5 ；晚期 開放讀碼區(qū)，編碼主要衣殼蛋白Ll和小衣殼蛋白L2。根據(jù)編碼主要衣殼蛋白Ll的開放讀 碼框(ORF)基因序列的不同，可以對HPV進行分型將Ll區(qū)ORF的相似性小于60%的HPV 分為不同的屬，相似性在60-70%之間的HPV分為不同的種，相似性在71-89%之間的HPV 則分為不同的型別。目前已鑒定的HPV約有130多型，根據(jù)其病毒致病力大小，可分為高危 型 HPV，如 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、 HPV59、HPV66、HPV68、HPV73 等，以及低危型 HPV，如 HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44 等。HPV病毒是與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)的感染因素。據(jù)報道，全世界約有15%的人類腫 瘤與HPV病毒相關(guān)。1982年，Syrjanen等首先發(fā)現(xiàn)高危型HPV感染可能和食管癌有關(guān)。目前HPV檢測技術(shù)主要包括第二代雜交捕獲技術(shù)(HC2)，熒光定量PCR、采用基質(zhì) 輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-T0F-MS)的質(zhì)譜檢測。其中HC2已成為 臨床HPV檢測領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)。第二代雜交捕獲技術(shù)(HC2)是美國Digene公司發(fā)展的、唯一獲得FDA批準(zhǔn)的可 在臨床使用的一種檢測HPV DNA的技術(shù)。該技術(shù)的原理是對抗體捕獲信號進行放大和對 化學(xué)發(fā)光信號進行檢測。該方法使用高危型和低危型核糖核酸探針，能檢測13種高危型 HPV(HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59 和 68)，是一種易于操作的液基雜交檢 測方法。然而，該方法并不能對HPV進行精確分型，也不能檢測多重感染，并且當(dāng)任何一種 型別的HPV DNA超過閾值時，其檢測結(jié)果均為陽性。此外，高危型探針還可與其他型別的 HPV(例如HPV 53、66、67和73)發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，降低實驗特異性。熒光定量PCR(FQ-PCR)在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上把基因擴增、分子雜交和光化學(xué)融為 一體，使PCR擴增和產(chǎn)物分析的全過程在單管封閉條件下進行，實現(xiàn)了實時動態(tài)檢測和結(jié) 果自動化分析，從根本上解決了擴增產(chǎn)物污染和不能定量的問題。該方法通過探針雜交進 一步提高了 HPV DNA檢測的特異性，具有快速、簡便、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，適用于臨 床工作和大規(guī)模篩查。然而，目前該方法主要針對HPV6、11、16和18感染，易漏診其他HPV 亞型。同時，與HC2 —樣，熒光定量PCR也不能實現(xiàn)對HPV進行精確分型，即不能明確HPV 感染型別。采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-T0F-MS)的質(zhì)譜檢測 可以同時檢測HPV型別的一種或幾種，具有高靈敏度，高特異性和高適量的特點，且相對于 其它的檢測方法成本低。然而，該方法目前主要用于檢測和定型感染宮頸上皮細(xì)胞的HPV， 應(yīng)用受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-T0F-MS) 的質(zhì)譜檢測技術(shù)，開發(fā)了新的用于檢測和/或分型樣品中的HPV病毒，特別地感染食管細(xì)胞 的HPV病毒的引物和方法。目前已知的感染食管細(xì)胞的HPV病毒主要有以下15種型別HPV3、HPV6、HPVlU HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59 和 HPV94。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了對樣品中的HPV病毒進行檢測和/或分型的方 法，其包括以下步驟(1)根據(jù)所選擇的待檢測的HPV型別(S卩，上述15種HPV型別)的基因序列， 在GP5+/GP6+通用引物的基礎(chǔ)上，設(shè)計出特異于各個型別的擴增引物，優(yōu)選所述擴增引物 在5'端具有10個堿基acgttggatg的標(biāo)簽序列；設(shè)計延伸引物，所述延伸引物的長度為 17-28個堿基，并且在其3'端包含一個型別特異性多態(tài)性位點標(biāo)記，延伸引物選擇的位置 是GP5+/GP6+序列中相對保守的區(qū)域，并且延伸產(chǎn)物和延伸引物之間分子量差異不小于 9D，且各個型別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于30D ；(2)通過用擴增引物進行PCR擴增，獲得靶序列擴增產(chǎn)物；(3)除去所述擴增產(chǎn)物中的dNTP，優(yōu)選通過使用SAP酶處理所述擴增產(chǎn)物來除去 dNTP ；(4)使用延伸引物進行單堿基延伸反應(yīng)，以獲得延伸產(chǎn)物；(5)純化延伸產(chǎn)物，優(yōu)選通過樹脂來進行純化；(6)采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)對純化后的產(chǎn)物進行質(zhì)譜 檢測，從而檢測和/或分型HPV型別。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法所使用的擴增引物包含23種引物，各引物 的核苷酸序列分別如缺失5'端前10個堿基的SEQ ID NO: 1-23所示，優(yōu)選所述引物在5' 端還包含標(biāo)簽序列，更優(yōu)選各引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 1-23所示。在一個優(yōu)選 實施方案中，本發(fā)明的方法所使用的延伸引物包含15種引物，各引物的核苷酸序列分別如 SEQ ID NO 26-40 所示。在一個優(yōu)選實施方案中，樣品優(yōu)選是食管細(xì)胞，例如食管粘膜細(xì)胞。在一個優(yōu)選實 施方案中，待檢測和/或分型的HPV病毒選自HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、 58、59和94中的一種或多種。因此，在另一個方面，本發(fā)明提供了擴增引物組，其包含23種引物，各引物的核苷 酸序列分別如缺失5'端前10個堿基的SEQ ID N0:l-23所示，優(yōu)選所述引物在5'端還包 含標(biāo)簽序列，更優(yōu)選各引物的核苷酸序列分別如SEQ ID N0:l-23所示。特別地，本發(fā)明的 擴增引物組可用于本發(fā)明的方法中和/或用于擴增感染食管細(xì)胞的HPV病毒，例如HPV3、 HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59 和 HPV94。在另一個方面，本發(fā)明提供了延伸引物組，其包含15種引物，各引物的核苷酸序 列分別如SEQ ID NO :26-40所示。特別地，本發(fā)明的延伸引物組可用于本發(fā)明的方法中，以 檢測和/或分型樣品中的HPV病毒，例如感染食管細(xì)胞的HPV病毒，例如HPV3、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、HPV58、HPV59 和 HPV94。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含本發(fā)明的擴增引物組和延伸引 物組。在一個實施方案中，本發(fā)明的試劑盒還可以包含其他試劑，例如用于PCR擴增反應(yīng)的 酶和試劑，用于單堿基延伸反應(yīng)的酶和試劑，用于純化延伸產(chǎn)物的樹脂等。特別地，本發(fā)明的試劑盒可用于檢測和/或分型樣品中的HPV病毒，例如感染食管 細(xì)胞的 HPV 病毒，例如 HPV3、HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、 HPV56、HPV57、HPV58、HPV59 和 HPV94。在另一個方面，還提供了本發(fā)明的擴增引物組和/或延伸引物組用于制備試劑盒 的用途，所述試劑盒用于檢測和/或分型樣品中的HPV病毒，例如感染食管細(xì)胞的HPV病在另一個方面，還提供了本發(fā)明的試劑盒的用途，其用于對樣品中的HPV病毒進 行檢測和/或分型，其中待檢測和/或分型的HPV病毒優(yōu)選選自HPV 3、6、11、16、18、26、31、 33、45、52、56、57、58、59和94中的一種或多種，所述樣品優(yōu)選是食管細(xì)胞，例如食管粘膜細(xì) 胞。在又一個方面，本發(fā)明提供了對樣品中的HPV病毒進行檢測和/或分型的方法，其 包括以下步驟1)用本發(fā)明的擴增引物組或本發(fā)明的試劑盒中的擴增引物組PCR擴增樣品中的 DNA，從而獲得擴增產(chǎn)物；2)除去所述擴增產(chǎn)物中的dNTP，優(yōu)選通過使用SAP酶處理所述擴增產(chǎn)物來除去 dNTP ；3)以步驟2)中獲得的產(chǎn)物為模板，使用本發(fā)明的延伸引物組或本發(fā)明的試劑盒 中的延伸引物組，通過單堿基延伸反應(yīng)獲得延伸產(chǎn)物；4)純化所述延伸產(chǎn)物，優(yōu)選通過樹脂來進行純化，從而獲得純化產(chǎn)物；和5)用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)對所述純化產(chǎn)物進行質(zhì)譜檢 測，從而對樣品中的HPV病毒進行檢測和/或分型；在一個優(yōu)選實施方案中，待檢測和/或分型的HPV病毒選自HPV 3、6、11、16、18、 26、31、33、45、52、56、57、58、59和94中的一種或多種。在一個優(yōu)選實施方案中，所述樣品是 食管細(xì)胞，例如食管粘膜細(xì)胞。發(fā)明的有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)方案具有以下顯著優(yōu)點1)使用的試劑耗材相對簡單且穩(wěn)定，不需要熒光染料、特殊的酶等價格昂貴的試 劑；2)反應(yīng)可以在微量體系中進行，減少了樣品和各種消耗品的使用；3)由于質(zhì)譜技術(shù)直接檢測DNA的分子量(質(zhì)荷比)且直接確定堿基的類型(即， 不需要經(jīng)過任何形式的信號轉(zhuǎn)換)，因此，理論上只要有一個拷貝的SNP片段被擴增即可識 別，從而杜絕了假陽性發(fā)生的可能；4)質(zhì)譜技術(shù)還有自動化、高通量檢測等特點，因此，質(zhì)譜技術(shù)與多引物延伸技術(shù)相 結(jié)合，可以在一個反應(yīng)體系中同時檢測多種HPV型別，從而大大減少了工作量，提高了檢測通量。
另外，質(zhì)譜分型系統(tǒng)從引物設(shè)計的角度而言，特別適合于進行HPV檢測。一方面， 質(zhì)譜分型系統(tǒng)要求前PCR產(chǎn)物在IOO-ISObp的范圍內(nèi)為最佳，而HPV的Ll區(qū)通用引物GP5+/ GP6+擴增大約140bp的片段，且擴增的有效性已經(jīng)得到證實。即，在本發(fā)明的方法中，修改 后的引物GP5+/GP6+擴增的產(chǎn)物長度滿足質(zhì)譜分型系統(tǒng)對前PCR產(chǎn)物片段的長度的要求。 另一方面，質(zhì)譜分型系統(tǒng)要求延伸產(chǎn)物和延伸引物之間的分子量差異不小于9D，且各個型 別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于30D，而本發(fā)明的方法中設(shè)計的特異于上述15型HPV 的延伸引物在質(zhì)譜系統(tǒng)中能彼此區(qū)分，滿足了質(zhì)譜分型系統(tǒng)的要求。因此，本發(fā)明的引物和 方法可以同時檢測和分型上述15種HPV型別。特別地，本發(fā)明的技術(shù)方案采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng) (MALDI-T0F-MS)，通過設(shè)計一套全新的質(zhì)譜延伸引物，實現(xiàn)了對上述15種HPV型別的檢測 和分型。其與第二代雜交捕獲技術(shù)和熒光定量PCR方法相比，能夠準(zhǔn)確檢測出15種HPV型 另Ij (HPV3、HPV6、HPVl 1、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV56、HPV57、 HPV58、HPV59和HPV94)并對其進行精確分型，與現(xiàn)有的飛行時間質(zhì)譜技術(shù)相比，能夠另外 準(zhǔn)確檢測出HPV3、HPV26、HPV57和HPV94這四種HPV型別，具有顯著的優(yōu)點。本發(fā)明的引物和方法實現(xiàn)了對感染食管細(xì)胞的15種HPV型別的檢測和分型，有利 于研究HPV感染型別與食管癌之間的關(guān)系，對于研究食管癌的發(fā)病機制有重要意義。下面將結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人 員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖 和優(yōu)選實施方案的下列詳細(xì)描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說 將變得顯然。附圖概述

圖1和2為HPV3質(zhì)粒樣品的檢測結(jié)果。具體而言，圖1為質(zhì)譜檢測峰圖，其顯示， 在質(zhì)量5407. 58處的峰(對應(yīng)于產(chǎn)物峰)很高，而在質(zhì)量5120. 39處的峰(對應(yīng)于引物峰) 不存在。這表明樣品中含有病毒HPV 3。圖2顯示質(zhì)譜峰圖分析軟件的分析結(jié)果，其表明樣 品中含有HPV 3型病毒，而不含其他14種型別的HPV病毒。圖3和4為HPV 33質(zhì)粒樣品的檢測結(jié)果。具體而言，圖3為質(zhì)譜檢測峰圖，其顯 示，在質(zhì)量5446. 6處的峰(對應(yīng)于產(chǎn)物峰)很高，而在質(zhì)量5175. 37處的峰(對應(yīng)于引物 峰)不存在。這表明樣品中含有病毒HPV 33。圖4顯示質(zhì)譜峰圖分析軟件的分析結(jié)果，其 表明樣品中含有HPV 3型病毒，而不含其他14種型別的HPV病毒。
具體實施例方式本發(fā)明的實施例提供了對感染食管細(xì)胞的上述15種HPV型別進行檢測和分型的 方法，其包括如下的步驟。(1)根據(jù)所選擇的待檢測的HPV型別(S卩，上述15種HPV型別)的基因序列， 在GP5+/GP6+通用引物的基礎(chǔ)上，設(shè)計出特異于各個型別的擴增引物，所述擴增引物在 3'端具有與其所針對的型別的基因序列完全匹配的12個堿基，在5'端具有10個堿基 (acgttggatg)的標(biāo)簽序列；設(shè)計延伸引物，所述延伸引物的長度為17-28個堿基，并且在其 3'端的包括延伸堿基在內(nèi)的4個堿基中，包含一個型別特異性多態(tài)性位點標(biāo)記，延伸引物 選擇的位置是GP5+/GP6+序列中相對保守的區(qū)域；其中，延伸產(chǎn)物和延伸引物之間的分子量差異不小于9D，且各個型別的延伸產(chǎn)物間的分子量差異不小于30D;按照引物間，引物與 擴增產(chǎn)物/延伸產(chǎn)物間不形成二聚體，引物自身不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，以及引物與模板間不發(fā) 生錯配的原則設(shè)計引物。特別地，用于質(zhì)譜檢測的延伸引物按照下列原則設(shè)計各延伸產(chǎn)物的分子量相互 間的差別不小于30Da，各延伸引物與各延伸產(chǎn)物之間的分子量差異不小于9Da，延伸引物 與延伸產(chǎn)物的分子量在4500-8500Da之間。本發(fā)明設(shè)計的針對所述15種HPV型別的擴增 引物參見表1，延伸引物參見表2。表1 針對所述15種HPV型別的Ll區(qū)PCR擴增引物。
權(quán)利要求
擴增引物組，其包含23種引物，各引物的核苷酸序列分別如缺失5′端前10個堿基的SEQ ID NO1 23所示，優(yōu)選所述引物在5′端還包含標(biāo)簽序列，更優(yōu)選各引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO1 23所示。
2.延伸引物組，其包含15種引物，各引物的核苷酸序列分別如SEQID N0:26-40所示。
3.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求1的擴增引物組和權(quán)利要求2的延伸引物組，優(yōu)選其還 包含其他試劑，例如用于PCR擴增反應(yīng)的酶和試劑，用于單堿基延伸反應(yīng)的酶和試劑，或用 于純化延伸產(chǎn)物的樹脂。
4.權(quán)利要求1的擴增引物組和/或權(quán)利要求2的延伸引物組用于制備試劑盒的用途， 所述試劑盒用于對樣品中的HPV病毒，例如感染食管細(xì)胞的HPV病毒，進行檢測和/或分 型。
5.權(quán)利要求1的擴增引物組和/或權(quán)利要求2的延伸引物組的用途，其用于對樣品中 的HPV病毒進行檢測和/或分型，其中待檢測和/或分型的HPV病毒優(yōu)選選自HPV 3、6、11、 16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59和94中的一種或多種，所述樣品優(yōu)選是食管細(xì)胞，例如食管粘膜細(xì)胞。
6.權(quán)利要求3的試劑盒的用途，其用于對樣品中的HPV病毒進行檢測和/或分型，其中 待檢測和 / 或分型的 HPV 病毒優(yōu)選選自 HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、57、58、59 和94中的一種或多種，所述樣品優(yōu)選是食管細(xì)胞，例如食管粘膜細(xì)胞。
7.對樣品中的HPV病毒進行檢測和/或分型的方法，其包括以下步驟1)用權(quán)利要求1的擴增引物組或權(quán)利要求3的試劑盒中的擴增引物組PCR擴增樣品中 的DNA，從而獲得擴增產(chǎn)物；2)除去所述擴增產(chǎn)物中的dNTP，優(yōu)選通過使用SAP酶處理所述擴增產(chǎn)物來除去dNTP；3)以步驟2)中獲得的產(chǎn)物為模板，使用權(quán)利要求2的延伸引物組或權(quán)利要求3的試劑 盒中的延伸引物組，通過單堿基延伸反應(yīng)獲得延伸產(chǎn)物；4)純化所述延伸產(chǎn)物，優(yōu)選通過樹脂來進行純化，從而獲得純化產(chǎn)物；和5)用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)對所述純化產(chǎn)物進行質(zhì)譜檢測，從 而對樣品中的HPV病毒進行檢測和/或分型；其中，待檢測和/或分型的HPV病毒優(yōu)選選自HPV 3、6、11、16、18、26、31、33、45、52、56、 57、58、59和94中的一種或多種，所述樣品優(yōu)選是食管細(xì)胞，例如食管粘膜細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測和定型感染食管細(xì)胞(例如食管粘膜細(xì)胞)的人乳頭瘤病毒的引物和方法。特別地，本發(fā)明基于采用基質(zhì)輔助激光解吸附/電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-TOF-MS)的質(zhì)譜檢測技術(shù)，設(shè)計了一套全新的引物(包括擴增引物和延伸引物)，從而實現(xiàn)對感染食管細(xì)胞的15種型別進行檢測和定型。
文檔編號C12Q1/68GK101942440SQ201010298199
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者倪培相, 李曉艷, 瞿寧 申請人:深圳華大基因科技有限公司