專利名稱：用于檢測(cè)基孔肯雅病毒的探針和引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過使用“寡核苷酸”探針利用分離自血液樣品的核酸來檢測(cè)基孔肯雅病毒感染的方法。本發(fā)明所采用的檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)PCR。
背景技術(shù)：
基孔肯雅病毒產(chǎn)于熱帶非洲和亞洲，通過感染的蚊子叮咬傳播給人類，通常是伊蚊屬?；卓涎挪《緦儆诙嗉硬《究频摩敛《尽Ｋ且环N“蟲媒病毒”(Ar-節(jié)肢動(dòng)物， bo_傳播)。CHIK熱(基孔肯雅熱)流行病經(jīng)由人類-蚊子-人類蔓延傳播。單詞“基孔肯雅”被認(rèn)為來自當(dāng)?shù)胤窖运枋龅呐c該病相關(guān)的嚴(yán)重的關(guān)節(jié)疼痛引起的患者的扭曲姿勢(shì)。 主要的病毒儲(chǔ)存宿主是猴子，但其他物種也會(huì)受到感染，包括人類?；卓涎?馬孔德語(yǔ)指“彎曲的”)病毒(CHIKV)是一種昆蟲傳播的病毒，α病毒屬，由病毒攜帶體伊蚊傳播給人類。最近有CHIKV的爆發(fā)，具有較高的發(fā)病率。CHIKV引起疾病的癥狀類似于登革熱。CHIKV顯現(xiàn)疾病的急性發(fā)熱階段，僅持續(xù)兩到五天，接著是長(zhǎng)期的影響到四肢關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)痛病。CHIKV感染相關(guān)的關(guān)節(jié)疼痛持續(xù)數(shù)周或數(shù)月?；卓涎挪〉臐摲谑莾傻剿奶臁Ｔ摬〉陌Y狀包括高熱到40C(104F)，軀干及偶爾四肢的瘀斑或斑丘疹，及影響到多個(gè)關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)痛或關(guān)節(jié)炎。其他非特異癥狀包括頭痛、結(jié)膜感染及輕微畏光。典型地，發(fā)燒持續(xù)兩天，然后突然結(jié)束。然而，其他癥狀，即關(guān)節(jié)痛、劇烈頭痛、失眠與極度衰竭，持續(xù)時(shí)間不同，通常約5到7天。主訴關(guān)節(jié)痛持續(xù)時(shí)間很長(zhǎng)的患者取決于他們的年齡。常見的實(shí)驗(yàn)室檢查基孔肯雅包括RT-PCR、病毒分離和血清學(xué)試驗(yàn)。病毒分離提供了最明確的診斷，但需要1-2周完成，且必須在生物研究安全性3級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 該技術(shù)包含使具體的細(xì)胞系接觸到全血樣品，并識(shí)別基孔肯雅病毒特異性反應(yīng)。RT-PCR應(yīng)用套式引物對(duì)(nested primer pairs)，放大全血的數(shù)個(gè)基孔肯雅特異性基因。結(jié)果在1_2 天確定。血清學(xué)診斷比其他方法需要更多量的血，應(yīng)用ELISA試驗(yàn)測(cè)量基孔肯雅特異性IgM 水平。結(jié)果需要2-3天，且其他相關(guān)病毒感染，如奧尼昂尼昂病毒(0’ nyong' nyong)和塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)時(shí)常產(chǎn)生假陽(yáng)性。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及有SEQ ID No. 1和2的探針；有SEQ ID No. 1和2在5'末端或 3'末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合的探針；SEQ ID No. 3、4、5和6的引物；用于檢測(cè)基孔肯雅病毒的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含待檢測(cè)的樣品、核酸擴(kuò)增試劑、選自包含SEQ ID No. 1和2的組中的探針、及選自包含SEQ ID No. 3、4、5和6的組中的相應(yīng)引物；一種檢測(cè)及可選地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步驟a)形成反應(yīng)混合物，包含待檢測(cè)的樣品、核酸擴(kuò)增試劑、選自包含SEQ ID No. 1和2的組中的探針、及選自包含SEQ ID No.3、4、5和6的組中的相應(yīng)引物，b)使反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR以獲得目標(biāo)序列的拷貝，然后通過測(cè)量熒光信號(hào)的增加以檢測(cè)基孔肯雅感染，以及c)可選地從檢測(cè)信號(hào)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以獲得用于量化基孔肯雅感染的拷貝數(shù)；一種檢測(cè)基孔肯雅感染的試劑盒，所述試劑盒包含單獨(dú)地或組合地SEQ ID No. 1和2的探針；單獨(dú)地或組合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相應(yīng)引物對(duì)，以及擴(kuò)增試劑。


圖1顯示基孔肯雅病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及有SEQ ID No. 1和2的探針。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述探針用于檢測(cè)基孔肯雅病毒。本發(fā)明涉及有SEQ ID No. 1和2在5'末端或3'末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合的探針。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述探針在5'末端與熒光團(tuán)結(jié)合，而在3'末端與猝滅劑結(jié)合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光團(tuán)選自包含熒光素及熒光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及黑洞猝滅劑染料的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，優(yōu)選的熒光團(tuán)是5'末端的6-羧基熒光素[FAM]，優(yōu)選的猝滅劑是3'末端的四甲基羅丹明[TAMRA]。本發(fā)明涉及引物SEQ ID No. 3、4、5和6。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 3和4的引物是正義引物，有SEQ ID No. 5 和6的引物是反義引物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 2。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 1和2的探針可選地在5'末端或3' 末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。本發(fā)明涉及一種檢測(cè)基孔肯雅病毒的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含待檢測(cè)的樣品，核酸擴(kuò)增試劑，選自包含SEQ ID No. 1和2的組中的探針，及選自包含SEQ ID No. 3、 4、5和6的組中的相應(yīng)引物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 2。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 1和2的探針可選地在5'末端或3' 末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述樣品選自包含血液、血清和血漿的組。本發(fā)明涉及一種檢測(cè)及可選地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步驟a)形成反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含待檢測(cè)的樣品、核酸擴(kuò)增試劑、選自包含SEQ ID No. 1和2的組中的探針、以及選自包含SEQ ID No. 3、4、5和6的組中的相應(yīng)引物；b)使反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR以獲得目標(biāo)序列的拷貝，然后通過測(cè)量熒光信號(hào)的增加以檢測(cè)基孔肯雅感染；以及c)可選地從檢測(cè)信號(hào)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以獲得用于量化基孔肯雅感染的拷貝數(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 3和4的引物是正義引物，有SEQ ID No. 5 和6的引物是反義引物，其中樣品選自包含血液、血清和血漿的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 3和5的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 1， 有SEQ ID No. 4和6的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 2。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 1和2的探針在5'末端或3'末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合，其中熒光信號(hào)由在5'末端的熒光團(tuán)和在3'末端有猝滅劑的探針產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光團(tuán)選自包含熒光素及熒光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組，其中，所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及黑洞猝滅劑染料的組。本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)基孔肯雅感染的試劑盒，所述試劑盒包含單獨(dú)地或組合地探針SEQ ID No. 1和2，單獨(dú)地或組合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相應(yīng)引物對(duì)，以及擴(kuò)增試齊LU在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，有SEQ ID No. 1和2的探針可選地在5 ‘末端或3 ‘末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述擴(kuò)增試劑是包含氯化鎂、Taq聚合酶和擴(kuò)增緩沖液的組合。本發(fā)明的主要目的是利用分離自感染的血液樣本的核酸來檢測(cè)基孔肯雅病毒感染。檢測(cè)的方式是通過使用標(biāo)記熒光團(tuán)與猝滅劑的“寡核苷酸”探針，應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)熒光的增加。探針和引物設(shè)計(jì)有SEQ ID No. 1的探針與有SEQ ID No. 3和5的引物一起被設(shè)計(jì)針對(duì)基孔肯雅的非結(jié)構(gòu)性蛋白nsP4基因。類似地，SEQ ID No. 2探針與SEQ ID No. 4和6引物被設(shè)計(jì)成針對(duì)基孔肯雅的結(jié)構(gòu)蛋白基因。本發(fā)明涉及稱為SEQ ID No. 1探針的“寡核苷酸”探針與稱為SEQ ID No. 3和5的引物一起用于檢測(cè)基孔肯雅病毒感染，其中所述引物分別是正義和反義引物；SEQ ID No. 2 探針與稱為SEQ ID No. 4和6的引物一起用于檢測(cè)基孔肯雅病毒感染，其中所述引物分別是正義和反義引物。根據(jù)本發(fā)明，SEQ ID No. 1探針分別與其正義和反義引物一起被設(shè)計(jì)用作基孔肯雅的非結(jié)構(gòu)性蛋白nsP4基因。類似地，SEQ ID No. 2探針分別與其相應(yīng)的正義和反義引物一起被設(shè)計(jì)用作基孔肯雅的結(jié)構(gòu)蛋白基因。根據(jù)本發(fā)明，所述“寡核苷酸”探針與在5'末端有熒光團(tuán)在3'末端有猝滅劑的可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。所述熒光團(tuán)選自包含熒光素及熒光素衍生物FAM、VIC、J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、 德克薩斯紅、四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4 ‘ - (4- 二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及BHQ染料的組。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述熒光團(tuán)是6-羧基熒光素[FAM]，所述猝滅劑是四甲基羅丹明[TAMRA]。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述檢測(cè)本質(zhì)上是定性或定量的。本發(fā)明涉及一個(gè)檢測(cè)基孔肯雅病毒感染的PCR反應(yīng)混合物，其中所述混合物包含核酸擴(kuò)增試劑，稱為SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 2的“寡核苷酸”探針結(jié)合稱為SEQ ID No. 3 和5或SEQ ID No.4和6的引物，和分離自血液/血清/血漿樣品的基孔肯雅核酸。本發(fā)明涉及一種檢測(cè)基孔肯雅病毒感染的方法，其中所述PCR混合物包含核酸擴(kuò)增試劑，稱為SEQ ID No.l或SEQ ID No. 2的“寡核苷酸”探針及其相應(yīng)引物，和應(yīng)用實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增獲得目標(biāo)序列拷貝的待檢測(cè)的樣品。擴(kuò)增的測(cè)量依據(jù)熒光信號(hào)的增加。所述“寡核苷酸”探針的大小范圍是2046個(gè)核苷酸。所設(shè)計(jì)的探針5'末端有熒光團(tuán)，3'末端有猝滅劑。5'末端的熒光團(tuán)是6-羧基熒光素[FAM]，當(dāng)猝滅劑存在于3'末端時(shí)是四甲基羅丹明[TAMRA]。本發(fā)明用于檢測(cè)血液/血清/血漿樣品中的基孔肯雅病毒感染。用于檢測(cè)的方法是通過監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)熒光的增加。根據(jù)本發(fā)明，所述“寡核苷酸探針”指的是一種脫氧核糖核酸(DNA)的短序列。該寡核苷酸探針能與目標(biāo)DNA特異雜交，而與未感染的DNA沒有表現(xiàn)出非特異雜交。本文所用探針遵循Taqman化學(xué)原則。TaqMan探針也稱為雙染寡核苷酸或雙標(biāo)探針，是最廣泛應(yīng)用的探針類型。因此，根據(jù)本發(fā)明，所述“寡核苷酸”探針被進(jìn)一步與其相應(yīng)的正義和反義引物結(jié)合提供，通過實(shí)時(shí)PCR能夠用于特異擴(kuò)增和檢測(cè)檢驗(yàn)樣品中的基孔肯雅病毒序列。也可以基于從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的Ct量化病毒負(fù)載量。有SEQ ID No. 1和2的探針與其相應(yīng)的引物具有如表1和表2中所描述的序列。表.1
序列名核苷酸序列SEQ ID No. 15 ‘ -TTCGATGCCATCATAGCCGCACACTT-3‘SEQ ID No. 35 ‘ -CCTCCTACCCAATGTACATACACTATTT-3‘SEQ ID No. 55' -AGGAGGCTATGTCCGTTTCTAAAA-3‘表.2
權(quán)利要求
1.有SEQID No. 1和2的探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其中所述探針用于檢測(cè)基孔肯雅病毒。
3.有SEQID No. 1和2在5'末端或3'末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的探針，其中所述探針在5'末端與熒光團(tuán)結(jié)合、而在3'末端與猝滅劑結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的探針，其中所述熒光團(tuán)選自包含熒光素及熒光素衍生物VIC、 J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的探針，其中所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4'-(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及黑洞猝滅劑染料的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求5和6所述的探針，其中優(yōu)選的熒光團(tuán)是5'末端的6-羧基熒光素 [FAM]，而優(yōu)選的猝滅劑是3'末端的四甲基羅丹明[TAMRA]。
8.引物SEQ ID No. 3、4、5 和 6。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的引物，其中有SEQID No. 3和4的引物是正義引物，有SEQ ID No. 5和6的引物是反義引物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的引物，其中所述有SEQID No. 3和5的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 2。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的引物，其中所述有SEQID No. 1和2的探針可選地在5'末端或3'末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。
12.—種檢測(cè)基孔肯雅的PCR反應(yīng)混合物，所述混合物包含待檢測(cè)的樣品、核酸擴(kuò)增試劑、選自包括SEQ ID No. 1和2的組中的探針、以及選自包括SEQ ID No. 3、4、5和6的組中的相應(yīng)引物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的反應(yīng)混合物，其中所述有SEQID No. 3和5的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 2。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的反應(yīng)混合物，其中所述有SEQID No. 1和2的探針在5' 末端或3'末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記可選地結(jié)合。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的反應(yīng)混合物，其中所述樣品選自包括血液、血清和血漿的組。
16.一種檢測(cè)與可選地量化基孔肯雅感染的方法，所述方法包含以下步驟(a)形成反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含待檢測(cè)的樣品、核酸擴(kuò)增試劑、選自包括SEQ ID No. 1和2的組中的探針、以及選自包括SEQ ID No. 3、4、5和6的組中的相應(yīng)引物；(b)使反應(yīng)混合物進(jìn)行PCR以獲得目標(biāo)序列的拷貝，然后通過測(cè)量熒光信號(hào)的增加來檢測(cè)基孔肯雅感染；以及(c)可選地，由檢測(cè)信號(hào)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線以獲得用于量化所述基孔肯雅感染的拷貝數(shù)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中有SEQID No. 3和4的引物是正義引物，有SEQ ID No. 5和6的引物是反義引物，并且其中所述樣品選自包含血液、血清和血漿的組。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述有SEQID No. 3和5的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 1，所述有SEQ ID No. 4和6的引物對(duì)應(yīng)于探針SEQ ID No. 2。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述有SEQID No. 1和2探針在5'末端或3' 末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合，其中所述熒光信號(hào)由在5'末端具有熒光團(tuán)和在3'末端具有猝滅劑的探針產(chǎn)生。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述熒光團(tuán)選自包含熒光素及熒光素衍生物 VIC、J0E、5-(2'-氨乙基)氨基萘-1-磺酸、香豆素及香豆素衍生物、熒光黃、德克薩斯紅、 四甲基羅丹明、6-羧基熒光素(FAM)、四氯-6-羧基熒光素、5-羧基羅丹明和花青染料的組， 并且其中所述猝滅劑選自包含四甲基羅丹明、4' -(4-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸、4-二甲基氨基苯偶氮苯基-4'-馬來酰亞胺、四甲基羅丹明、羧基四甲基羅丹明及黑洞猝滅劑染料的組。
21.一種檢測(cè)基孔肯雅感染的試劑盒，所述試劑盒包含單獨(dú)地或組合地探針SEQ ID No. 1和2 ；單獨(dú)地或組合地SEQ ID No. 3、4、5和6的相應(yīng)引物對(duì)，及擴(kuò)增試劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其中所述有SEQID No. 1和2的探針可選地在5 ‘ 末端或3'末端或兩處與可檢測(cè)標(biāo)記結(jié)合。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述擴(kuò)增試劑是包含氯化鎂、Taq聚合酶和擴(kuò)增緩沖液的組合。
全文摘要
本發(fā)明詳細(xì)描述了通過使用“寡核苷酸”探針，確定血液/血清/血漿樣品中基孔肯雅病毒核酸存在的方法。通過使用實(shí)時(shí)PCR，所設(shè)計(jì)的“寡核苷酸”探針能用于定性或定量檢測(cè)感染樣品中的基孔肯雅病毒。
文檔編號(hào)C07H21/04GK102414217SQ201080018304
公開日2012年4月11日 申請(qǐng)日期2010年2月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月25日
發(fā)明者曼尤拉·賈甘納特, 皮拉里塞蒂·文卡塔·蘇巴拉奧, 錢德拉塞克哈爾·布哈斯卡拉恩·奈爾 申請(qǐng)人:彼格泰格私人有限公司