專利名稱：高產(chǎn)γ-氨基丁酸的大腸桿菌菌株及其γ-氨基丁酸生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸大腸桿菌ZS-07菌株及其γ-氨基丁酸的微生 物、酶法制備方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，簡稱GABA)是廣泛存在于自然界的非蛋 白質(zhì)氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。大腦長期缺乏GABA將會導(dǎo)致癲癇、 帕金森等疾病。同時，GABA還與腦衰老有關(guān)，其缺乏將導(dǎo)致老年人“耳不聰，目不明”。因 此，GABA不僅具有安神和抗抑郁作用，而且還能增強(qiáng)腦功能和長期記憶。近年，隨著人們對 GABA生理活性研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其生理功能極其廣泛。例如可增加生長激素分泌，防止 肥胖，健肝利腎，改善更年期綜合征，抑制大腸癌變，改善脂質(zhì)代謝，促進(jìn)精子的穿卵能力， 提高受精率，以及提高飼料利用率和日增重等。雖然GABA可由腦部的谷氨酸在專一性較 強(qiáng)的谷氨酸脫羧酶作用下轉(zhuǎn)化而成，但是年齡的增長和精神壓力的加大等諸多因素使GABA 的積累異常困難，而通過日常飲食補(bǔ)充可有效改善這種狀況，從而促進(jìn)人體健康。GABA在臨 床上常用于降低人體的血氨，治療各種類型的肝昏迷，同時又被廣泛地用于治療各種腦疾 病，還可以作為兒童智力的營養(yǎng)補(bǔ)充劑和促進(jìn)劑，老年人的營養(yǎng)劑。GABA正被廣泛應(yīng)用于醫(yī) 藥、食品保健、化工及農(nóng)業(yè)等行業(yè)。GABA天然存在量很低，因此很難從天然組織中大量提取分離。目前，Y-氨基丁 酸的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、植物富集法和生物合成法?；瘜W(xué)合成法受到苛刻的反應(yīng)條件 及昂貴的天然原料的限制，成本高、安全性差。植物富集法含量低，尚無法用作醫(yī)藥、醫(yī)藥中 間體和食品添加劑。與化學(xué)合成法相比，生物法合成GABA的主要優(yōu)點是條件溫和、不需要 昂貴的原料，能耗低。其原理是利用生物體的谷氨酸脫羧酶作為催化劑，以L-谷氨酸為底 物，將L-谷氨酸α-脫羧，產(chǎn)生Y-氨基丁酸和C02。由于微生物具有生長速度快、條件簡 單、代謝過程特殊等特點，因此利用微生物生產(chǎn)GABA不受資源、環(huán)境和空間的限制，具有顯 著的優(yōu)勢。篩選出具有高谷氨酸脫羧酶活力的優(yōu)良菌株是利用微生物合成GABA的關(guān)鍵之
ο目前，在已有的利用不同種屬微生物生產(chǎn)GABA的報道中，利用大腸桿菌的效率相 對較高。吳曉燕等(化工進(jìn)展，2005,8 889-892)利用大腸桿菌Asl. 505，以DL-谷氨酸為 底物，15h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化50g/LDL-谷氨酸形成D-谷氨酸和GABA。李永豐等(華東化工學(xué)院 學(xué)報，1981，2:7-11)用海藻酸鈉-戊二醛法固定產(chǎn)谷氨酸脫羧酶的大腸桿菌Asl. 505，在 pH4. 0的0. 2M醋酸緩沖液中，5h轉(zhuǎn)化5%的谷氨酸合成GABA。趙景聯(lián)等(生物工程學(xué)報， 1989,2:124-128)用海藻酸鈣包埋法制成固定化大腸桿菌細(xì)胞，與1 %谷氨酸溶液進(jìn)行間 歇反應(yīng)，5h轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。張汝平等(長沙電力學(xué)院學(xué)報自然科學(xué)版，1998,4:433-435) 用海藻酸鈣包埋法制備的大腸桿菌固定化細(xì)胞，對后道味精母液提取谷氨酸后的廢液進(jìn)行 轉(zhuǎn)化生產(chǎn)GABA，獲得的GABA純度達(dá)98. 94%，收率為49. 65%。Wang和Su利用Monascuspurpureus進(jìn)行固體發(fā)酵，GABA含量分別達(dá)5004mg/kg和1200mg/kg。利用乳酸菌富集或 發(fā)酵生產(chǎn)GABA的報道也有很多，徐冬云等(現(xiàn)代食品科技，2006，3 :59-61，64)篩選出產(chǎn) Y-氨基丁酸的乳酸菌，發(fā)酵樣品中GABA的含量達(dá)0.463g/L。Nomura等(J Dairy Sci., 1998,81:1486-1491)從生產(chǎn)奶酪的菌株中分離到一株Lactococcus Iactis 01-7，生產(chǎn)的 奶酷中 GABA 含量達(dá)至Ij了 383mg/kg。Yokoyama 等(J of Bioscience and Bioengineering, 2002,1:95-97)利用 Lactobacillus brevis IF0-12005 對酒糟進(jìn)行發(fā)酵，GABA 含量達(dá)到 了 10. 18mM。許建軍等(博士學(xué)位論文，江南大學(xué)，2004年2月)篩選到了高產(chǎn)GABA的 Lactococcus Iactis菌株，25L罐發(fā)酵72h，GABA達(dá)到了 2. 5g/L。劉清等(氨基酸和生 物資源，2004，1 :40-43)也進(jìn)行了高產(chǎn)GABA乳酸菌篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化，發(fā)酵液中GABA 達(dá) 3. lg/L。愛宕世高等(食品科學(xué)，2001，8，81-85)采用 Lactobacillus ρIantarum 利 用含有米糠抽提液的培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)GABA，干粉中含量達(dá)到了 5%。Takahashi等(J of Bioscience andBioengineering, 2004,6 :412_418)蹄選至Ij Sacharomyces cerevisiae UT-I的GABA轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酸半醛脫氫酶缺陷突變型菌株GAB7-1和GAB7-2，其發(fā)酵液中 GABA濃度分別達(dá)到了 0.4mM和0.42mM，較野生株分別提高了 2.0和2.1倍。崔曉俊等(食 品工藝，2005，6 64-69)利用乳酸菌SK005在含9. 5g/L谷氨酸單鈉的培養(yǎng)基中于30°C發(fā)酵 2天，GABA產(chǎn)量達(dá)5.4g/L。陸兆新等(CN 1710088A)公開了利用唾液鏈球菌嗜熱亞種生產(chǎn) GABA。梅樂和等(CN 1683545A，CN 1683544A, CN1673351A)公開了控制 pH 發(fā)酵生產(chǎn) γ-氨 基丁酸的方法，其利用短乳桿菌(Lactobacillus brevis)控制pH發(fā)酵40_60h，GABA的產(chǎn)量 為30g/L。江波等(CN 1392262)公開了一種食品功能因子Y _氨基丁酸的制備方法，GABA 在發(fā)酵液中的濃度達(dá)3-5g/L。焦慶才等(CN200410064813. 3)公開了一種Y-氨基丁酸的 酶法轉(zhuǎn)化制備方法，將Escherichia coli ASl. 505的菌體細(xì)胞與含有L-谷氨酸和L-天冬 氨酸混合物的轉(zhuǎn)化液混合，28-45°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，然后用等電點結(jié)晶或等電點結(jié)晶與離 子交換樹脂相結(jié)合的方法分離轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，得到高純度的Y-氨基丁酸和L-天冬氨酸。蔣冬 花等(微生物學(xué)雜志，2007，1 :35-39)從酸菜中篩選到2株高產(chǎn)Y -氨基丁酸的乳酸菌，經(jīng) 條件優(yōu)化后發(fā)酵液中GABA含量可達(dá)4g/L。已有的關(guān)于大腸桿菌谷氨酸脫羧酶的研究主要是針對酶的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)調(diào)控 等方面。已公開的利用大腸桿菌的谷氨酸脫羧酶制備GABA的專利和非專利文獻(xiàn)結(jié)果，存在 酶活力不高，反應(yīng)周期長，反應(yīng)液中產(chǎn)物濃度低等問題。因此，篩選高酶活菌株實現(xiàn)Y-氨 基丁酸的工業(yè)化生產(chǎn)是目前市場所急需。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種高產(chǎn)Y-氨基丁酸的大腸桿菌ZS-07菌株及其生產(chǎn) Y-氨基丁酸的方法。本發(fā)明通過篩選得到一菌株，該菌株經(jīng)形態(tài)特征、生理生化特征、生態(tài)特征比對及 16SrDNA序列測序，鑒定為大腸桿菌(拉丁文名稱Escherichia coli)菌株。序列表中序列 1為大腸桿菌(拉丁文名稱E. coli)ZS-07菌株16SrDNA序列；序列2為大腸桿菌菌株(拉 丁文名稱E. coli)ZS-07gadA ；序列3為大腸桿菌菌株(拉丁文名稱E. coli) ZS-07gadB序 列。本發(fā)明通過如下原理實現(xiàn)發(fā)明目的將本發(fā)明篩選得到的大腸桿菌ZS-07菌株或其谷氨酸脫羧酶作用于L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽以及含L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽的物質(zhì)， 使L-谷氨酸或L-谷氨酸鹽發(fā)生脫羧反應(yīng)生成Y-氨基丁酸。利用該菌株采用微生物法或 酶法生產(chǎn)Y-氨基丁酸，通過如下多種形式進(jìn)行1、接種CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株的斜面培養(yǎng)物于種子培養(yǎng)基中， 35-39°C震蕩培養(yǎng)6-9h制備種子液；在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 種相當(dāng)于發(fā)酵培養(yǎng)基重量3-12%的種子液；35-41°C通氣培養(yǎng)8-14h，于結(jié)束前0. 5_lh降 低pH至3. 5-3. 8，加入L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽；加酸控制pH 3.2-5.0，35-431繼續(xù)震蕩培養(yǎng)0. l_120h，即得含Y-氨基丁酸的發(fā)酵液。2、接種CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株的斜面培養(yǎng)物于種子培養(yǎng)基中， 35-39°C震蕩培養(yǎng)6-9h制備種子液；在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接種 相當(dāng)于發(fā)酵培養(yǎng)基重量3-12%的種子液；35-41°C通氣培養(yǎng)8-14h，于結(jié)束前0. 5_lh降低 PH至3. 5-3. 8，收集菌體，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽的轉(zhuǎn) 化液，加入0-2. Ommol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C震蕩轉(zhuǎn)化0. l_96h，得 到含Y-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化液。3、利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株培養(yǎng)制得的菌體或由其提取的谷氨 酸脫羧酶通過固定化后，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽的轉(zhuǎn) 化液，加入O-lOmmol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C反應(yīng)0. l_120h，得到含 Y-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化液。反應(yīng)的底物可以是純品DL-谷氨酸、純品L-谷氨酸、純品L-谷氨酸鹽或純品DL 谷氨酸鹽，也可以是谷氨酸生產(chǎn)過程中各環(huán)節(jié)產(chǎn)生的含有DL谷氨酸或L-谷氨酸的粗品或 結(jié)晶母液；加入量為0. 5-450g/L ；加入方法可為一次性添加或分批次添加。上述方法還可以采用減壓操作，加速反應(yīng)進(jìn)行，得到含Y-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化液。培養(yǎng)CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株所用的斜面培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和發(fā)酵 培養(yǎng)基碳源可以采用葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、木糖、乳糖、海藻糖、甘油、各類淀粉水解糖或其 混和物，其濃度為l_30g/L。氮源可以采用酵母膏、酵母粉、酵母提取物、玉米漿、蛋白胨、牛 肉膏、豆餅粉、尿素或其混合物，濃度為l_30g/L。本發(fā)明的優(yōu)勢在于利用高滲條件篩選獲得了一株谷氨酸脫羧酶活力高的大腸桿 菌E. coli ZS-07菌株CGMCC No. 3562，酶合成無需誘導(dǎo)，酶活力高(見附圖1、表1)，菌株 耐酸能力強(qiáng)(見附圖2、表2)，耐高濃度的底物和產(chǎn)物。利用其可生產(chǎn)高含量的Y-氨基丁 酸，反應(yīng)體系簡單，提取工藝可大為簡化，生產(chǎn)成本大幅降低。經(jīng)上述方法得到的轉(zhuǎn)化液中 谷氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，GABA濃度最高可達(dá)到315g/L。本發(fā)明研究人員給昆明小鼠灌喂 CGMCC No. 3562菌株的培養(yǎng)物(0. 2 X IO11Cfu/只)，未發(fā)現(xiàn)小鼠有任何不良反應(yīng)。因此，利 用該菌株生產(chǎn)Y-氨基丁酸無安全隱患。另外，利用CGMCC No. 3562培養(yǎng)制得的菌體或谷 氨酸脫羧酶催化DL-谷氨酸中的L-氨基酸形成Y-氨基丁酸，經(jīng)進(jìn)一步分離Y-氨基丁酸 和D-谷氨酸，可同時獲得了光學(xué)純度大于98%的D-谷氨酸。本發(fā)明篩選得到的大腸桿菌(拉丁文名稱E. coli) ZS-07菌株，已于2009年12月 31號保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路1號 院3號)，保藏編號為CGMCC No. 3562。


圖1不同E. coli菌株合成GABA能力比較；實驗條件LB培養(yǎng)基，L-谷氨酸添加 量為 30g/L ；菌濃 4. 6X10lclcfu/mL，41°C ；圖中一為 ZS-07 菌株 CGMCC No. 3562，一為 DH5 α 菌株，一為BL-21菌株。圖2不同Ε. coli菌株最適ρΗ比較；實驗條件2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液反應(yīng) 體系，菌濃 1. SxiO11CfuAiLdlt:振蕩反應(yīng) 30min ；其中圖 a 為 ZS-07 菌株 CGMCC No. 3562 轉(zhuǎn)化率隨PH變化曲線(L-Glu添加量為30g/L)；圖b為DH5 α菌株轉(zhuǎn)化率隨ρΗ變化曲線 (L-谷氨酸添加量為12g/L)；圖c為BL-21菌株轉(zhuǎn)化率隨ρΗ變化曲線(L-谷氨酸添加量為 12g/L)。
具體實施例方式為對本發(fā)明進(jìn)行更好地說明，舉實施例如下實施例1CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基， PH7.0-7.8，于37°C震蕩培養(yǎng)6-9h后，以3-12%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，ρΗ 7.0-7.8， 370C，220r/min,震蕩培養(yǎng)8_14h后，于結(jié)束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，獲得含菌體的發(fā) 酵液，4000r/min離心分離收集菌體。以相當(dāng)于原發(fā)酵液體積的1/2倍的水重懸菌體，每 IOOmL菌懸液先加入L-谷氨酸15g，加入磷酸吡哆醛0. lmmol/L，用鹽酸或硫酸控制ρΗ為 3. 5-3. 8，41°C震蕩反應(yīng)，當(dāng)無不溶底物存在時，補(bǔ)加底物L(fēng)-谷氨酸15g/100mL。約反應(yīng)20h 時，加入磷酸吡哆醛0. lmmol/L，再補(bǔ)加底物L(fēng)-谷氨酸15g/100mL，補(bǔ)加菌體(由相當(dāng)于轉(zhuǎn) 化液體積1/2倍量的發(fā)酵液制備)，繼續(xù)反應(yīng)，至底物轉(zhuǎn)化完全。離心即得到含Y-氨基丁 酸的反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。斜面培養(yǎng)基酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂粉 15g，水IL ；種子培養(yǎng)基酵母提取物5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，葡萄糖lg，水IL ；發(fā)酵培養(yǎng) 基酵母提取物 3g，蛋白胨 10g, NaCl 5g，葡萄糖 5g，Na2CO3O. 742g，NaHC037. 812g，水 IL0實施例2CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基，于 37°C震蕩培養(yǎng)6-9h后，以3-12%的接種量接種至含有磷酸吡哆醛(0. 02mmol/L)的發(fā)酵 培養(yǎng)基中，PH7. 0-7. 8，37 °C震蕩培養(yǎng)8_14h，于培養(yǎng)結(jié)束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，每 IOOmL發(fā)酵液加入28g L-谷氨酸，用鹽酸或硫酸控制ρΗ為3. 5-3. 8，繼續(xù)震蕩或攪拌至底 物完全轉(zhuǎn)化，離心即得到含Y-氨基丁酸的反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%。實施例3CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基， PH7. 0-7. 8，于37°C震蕩培養(yǎng)6_9h后，以3_12%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，pH7. 0-7. 8， 37°C，220r/min,震蕩培養(yǎng)8_14h后，于培養(yǎng)結(jié)束前0. 5_lh降低ρΗ至3. 5-3. 8，獲得含菌體 的發(fā)酵液，4000r/min離心分離收集菌體。以相當(dāng)于原發(fā)酵液體積的1/2倍的ρΗ為3. 5的 醋酸_醋酸鈉緩沖液重懸菌體，每IOOmL菌懸液加入L-谷氨酸鈉5g，用鹽酸或硫酸控制ρΗ 為3. 5-3. 8，41°C震蕩反應(yīng)至底物完全轉(zhuǎn)化，離心即得到含Y-氨基丁酸的反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率 達(dá)100%。GABA純度達(dá)到國家規(guī)定醫(yī)藥級標(biāo)準(zhǔn)。實施例4
CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基， PH7.0-7.8，于37°C震蕩培養(yǎng)6-9h后，以3-12%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震蕩培養(yǎng)8_14h，于結(jié)束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，獲得含菌體的發(fā)酵 液，4000r/min離心分離收集菌體。加磷酸吡哆醛(0. 05mmol/L)，每IOOmL菌懸液中加入 DL-谷氨酸30g (分2次加入，每次150g/L)，用鹽酸或硫酸控制pH為3. 5-3. 8，41°C震蕩至 反應(yīng)完全，離心即得到含Y -氨基丁酸和D-谷氨酸的反應(yīng)液，調(diào)整pH為3. 2，溫度4-6°C， 攪拌，使D-谷氨酸結(jié)晶析出，用pH 3. 2的水洗滌結(jié)晶。含有少量D-谷氨酸和Y-氨基丁 酸的結(jié)晶母液進(jìn)一步通過離子交換樹脂分離。獲得Y-氨基丁酸的同時獲得了 D-谷氨酸。實施例5CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基， PH7.07.8，于37°C震蕩培養(yǎng)6-9h后，以3-12%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震蕩培養(yǎng)8_14h后，于結(jié)束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，獲得含菌體的發(fā) 酵液，4000r/min離心分離收集菌體。以相當(dāng)于原發(fā)酵液體積的1/2倍的水重懸菌體，加磷 酸吡哆醛(0. 05mmol/L)，每IOOmL菌懸液加入L-谷氨酸粗品25g，用鹽酸/硫酸控制pH為 3. 5-3. 8，40°C震蕩，抽真空減壓反應(yīng)至底物完全轉(zhuǎn)化，離心即得到含、-氨基丁酸的反應(yīng) 液，轉(zhuǎn)化率達(dá)100%。實施例6CGMCC No. 3562E. coli ZS-07菌株經(jīng)斜面培養(yǎng)基活化后，轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基， PH7.0-7.8，于37°C震蕩培養(yǎng)6-9h后，以3-12%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，pH 7.0-7.8， 370C，220r/min,震蕩培養(yǎng)8_14h后，于結(jié)束前0. 5_lh降低pH至3. 5-3. 8，獲得含菌體的發(fā) 酵液，4000r/min離心分離收集菌體。用pH 4. 0的醋酸緩沖液重懸，加入2%的海藻酸鈉， 混勻，4°C靜止Ih后用注射器針頭滴加0. IM的CaCl2于溶液中，制備固定化細(xì)胞，每升反應(yīng) 液添加磷酸吡哆醛0. 05mmol, L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉100g，控制pH 3. 8和溫度39°C，反 應(yīng)至底物完全轉(zhuǎn)化，可得含Y-氨基丁酸的反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)100%。E. coli ZS-07菌株利用細(xì)胞轉(zhuǎn)化法合成GABA與有關(guān)文獻(xiàn)結(jié)果比較見表1表 權(quán)利要求
一種高產(chǎn)γ 氨基丁酸的大腸桿菌ZS 07菌株，其特征為該菌株(拉丁文名稱Escherichia coli)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.3562。
2.如權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)Y-氨基丁酸的大腸桿菌ZS-07菌株，其特征為該菌株 具有如序列1所示的16SrDNA序列。
3.如權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)Y-氨基丁酸的大腸桿菌ZS-07菌株，其特征為該菌株 具有如序列2、3所示的gadA、gadB序列。
4.一種利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株生產(chǎn)Y -氨基丁酸的方法，其特征為 通過如下步驟實現(xiàn)接種CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株的斜面培養(yǎng)物于種子培養(yǎng)基 中，35-39°C震蕩培養(yǎng)6-9h制備種子液；在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 種相當(dāng)于發(fā)酵培養(yǎng)基重量3-12%的種子液；35-41°C通氣培養(yǎng)8-14h，于結(jié)束前0. 5_lh降 低pH至3. 5-3. 8，加入L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽；加酸控制pH 3.2-5.0，35-431繼續(xù)震蕩培養(yǎng)0. l_120h，即得含Y-氨基丁酸的發(fā)酵液。
5.一種利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株生產(chǎn)Y -氨基丁酸的方法，其特征為 通過如下步驟實現(xiàn)接種CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株的斜面培養(yǎng)物于種子培養(yǎng)基 中，35-39°C震蕩培養(yǎng)6-9h制備種子液；在發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入0-0. lmmol/L磷酸吡哆醛，接 種相當(dāng)于發(fā)酵培養(yǎng)基重量3-12%的種子液；35-41°C通氣培養(yǎng)8-14h，于結(jié)束前0. 5_lh降低 PH至3. 5-3. 8，收集菌體，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽的轉(zhuǎn) 化液，加入0-2. Ommol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35-43°C震蕩轉(zhuǎn)化0. l_96h，得 到含Y-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化液。
6.一種利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株生產(chǎn)Y -氨基丁酸的方法，其特征為 通過如下步驟實現(xiàn)利用CGMCC No. 3562大腸桿菌ZS-07菌株培養(yǎng)制得的菌體或由其提取 的谷氨酸脫羧酶通過固定化后，加入含L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或DL-谷氨酸、DL-谷氨酸鹽 的轉(zhuǎn)化液，加入O-lOmmol/L磷酸吡哆醛，加酸控制pH 3. 2-5. 0，35_43°C反應(yīng)0. l_120h，得 到含Y-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化液。
7.如權(quán)利要求4-6任何一種利用CGMCCNo. 562大腸桿菌ZS-07菌株生產(chǎn)Y -氨基丁 酸的方法，其特征為采用減壓操作，得到含Y-氨基丁酸的轉(zhuǎn)化液。
8.如權(quán)利要求4-6任何一種利用CGMCCNo. 3562大腸桿菌ZS-07菌株生產(chǎn)Y -氨基丁 酸的方法，其特征為反應(yīng)的底物是純品L-谷氨酸、純品L-谷氨酸鹽或純品DL-谷氨酸、純 品DL谷氨酸鹽，或是谷氨酸生產(chǎn)過程中各環(huán)節(jié)產(chǎn)生的含有L-谷氨酸或DL谷氨酸的粗品或 結(jié)晶母液；加入量為0. 5-450g/L ；加入方法可一次性加入或分批次添加。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株安全、高產(chǎn)γ-氨基丁酸的大腸桿菌(Escherichia coli) ZS-07菌株以及利用其合成γ-氨基丁酸的方法，屬生物化學(xué)領(lǐng)域。該大腸桿菌菌株保藏編號為CGMCC No.3562，利用其含有的谷氨酸脫羧酶，作用于L-谷氨酸、L-谷氨酸鹽或含L-谷氨酸或L谷氨酸鹽的物質(zhì)，合成γ-氨基丁酸。本發(fā)明菌株谷氨酸脫羧酶活力高、耐酸性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少，方法簡單，易于操作，成本低，生產(chǎn)效率高。產(chǎn)品純度高，可用于化工、食品、飼料及醫(yī)藥等行業(yè)。
文檔編號C12P13/00GK101974455SQ20101029471
公開日2011年2月16日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者吳健, 周新欽, 戴桂馥, 李季倫, 王衛(wèi)富, 王廷, 王春陽, 蔣盛耀, 譚印成, 馬文艷 申請人:鄭州大學(xué)