重組大腸桿菌菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍生物的核酸轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌(E.coli)Nissle1917(EcN)細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含所述細(xì)胞以及可藥用的載體，本發(fā)明還涉及制備重組大腸桿菌(E.coli)Nissle1917細(xì)胞的方法、及其在治療克羅恩氏病中的應(yīng)用。
【專利說明】重組大腸桿菌菌株

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍生物的核酸轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌 (E. coli)菌株NiSSlel917(ECN)細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含所述細(xì)胞以 及可藥用的載體，本發(fā)明還涉及制備重組大腸桿菌（E. c〇li)NiSSlel917細(xì)胞的方法、及其 在治療克羅恩氏病中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 大腸桿菌（Escherichia coli)菌株Nisslel917(EcN)是研究得最為徹底的益生 菌菌株之一，并且其為微生物藥物MutaflorK (Ardeypharm GmbH公司，赫爾德克，德國） 的活性成分。所述益生菌藥物在許多歐洲國家被成功用于治療各種消化道疾病，包括急性 和長期腹瀉、無并發(fā)癥憩室病（uncomplicated diverticular disease)以及炎癥性腸病 (IBD)。其特別地用于緩解患有潰瘍性結(jié)腸炎（UC)的患者的癥狀的維持治療。對于潰瘍性 結(jié)腸炎，認(rèn)為EcN的主要作用機(jī)制之一在于誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中的防衛(wèi)素合成。EcN在UC治 療中的臨床療效背后的分子機(jī)制可能在于，由于NF-kB-依賴性信號通路和AP-1-依賴性信 號通路的誘導(dǎo)，鞭毛蛋白介導(dǎo)增強(qiáng)了人β-防衛(wèi)素2(HBD2)的產(chǎn)生。
[0003] 另一方面，除了小規(guī)模臨床試驗，EcN尚未顯示出在克羅恩氏?。á牵┗颊咧械钠?遍有效性。其原因在于抗菌肽（特別是防衛(wèi)素）在CD患者的消化道中的量低，這似乎是 由于防衛(wèi)素合成的原始缺陷。據(jù)報道，N0D2(核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域2)基因（細(xì)菌胞壁 酰二肽的胞內(nèi)受體）中的突變與回腸克羅恩氏病明顯相關(guān)。Wehkamp及其同事也發(fā)現(xiàn)，與 攜帶野生型的N0D2相比，攜帶N0D2突變的患有克羅恩氏病的患者中的α -防衛(wèi)素轉(zhuǎn)錄本 顯著降低（Wehkamp等，2004b，Wehkamp等，2005)。此外，Wehkamp的研究組表明，與結(jié)腸克 羅恩氏病患者和潰瘍性結(jié)腸炎患者相比，TCF4( -種已知的對帕內(nèi)特（Paneth)細(xì)胞分化和 α -防衛(wèi)素表達(dá)的調(diào)節(jié)子）在回腸克羅恩氏病患者中的表達(dá)降低（van Es等，2005 ;Wehkamp 等，2007)。此外，與對照相比，在結(jié)腸⑶中，HBD2基因拷貝數(shù)變?yōu)檩^低的數(shù)目（3vs. 4) (FeHermann 等，2006)。
[0004] 防衛(wèi)素是富含陽離子、精氨酸的大小在3. 5至4kDa的小肽，其由6個半胱氨酸構(gòu) 成三個二硫橋。它們表現(xiàn)出針對細(xì)菌、真菌和一些包膜病毒的廣譜抗菌活性，并且還可以作 為趨化因子。它們的抗菌作用的機(jī)制在于，陽離子防衛(wèi)素附著在帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞表面，導(dǎo) 致對質(zhì)膜的溶膜破壞。根據(jù)分子內(nèi)的3個二硫橋的位置，防衛(wèi)素分為α-或β-防衛(wèi)素。在 人體內(nèi)已經(jīng)鑒定了 6種α -防衛(wèi)素（ΗΝΡ1-4、HD5和HD6)以及6種β -防衛(wèi)素（HBD1-6)。 人α-防衛(wèi)素通過在嗜中性粒細(xì)胞（granulocytic neutrophil)和帕內(nèi)特細(xì)胞群體中的表 達(dá)和釋放從而在整個小腸及其周邊提供抗菌宿主防御。人α-防衛(wèi)素被合成為較大的無活 性的前肽（pro-p印tide)分子，并經(jīng)翻譯后加工得到成熟的活性肽。人α-防衛(wèi)素5 (HD5) 首先在腸帕內(nèi)特細(xì)胞中表達(dá)為無活性的前肽。然后被儲存在帕內(nèi)特細(xì)胞顆粒中的胰蛋白酶 切割成有活性的成熟HD5。人β-防衛(wèi)素由作為先天性免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的一部 分的上皮細(xì)胞產(chǎn)生。與人α-防衛(wèi)素相反，人β-防衛(wèi)素不以前體形式表達(dá)。HBD2的合成 是在皮膚以及泌尿、胃腸和呼吸道上皮細(xì)胞中，通過接觸微生物或細(xì)胞因子（諸如TNF-α 和IL-1 β )而刺激上皮細(xì)胞來誘導(dǎo)的。
[0005] 通過重組DNA方法，已經(jīng)在大腸桿菌（E.coli)中成功地合成了小的陽離子抗菌 肽。然而，使用大腸桿菌（E.coli)作為表達(dá)陽離子抗菌肽的宿主細(xì)胞存在一些缺陷，例如 產(chǎn)物的宿主殺傷活性、以及其對蛋白水解降解的敏感性。靶蛋白與伴侶的融合表達(dá)能減輕 這些問題。然而，這引起另一個問題：大多數(shù)融合產(chǎn)物是無活性的、或者以不可溶的形式產(chǎn) 生。據(jù)報道，硫氧還蛋白（TrxA)的融合表達(dá)系統(tǒng)導(dǎo)致可溶性產(chǎn)物的產(chǎn)量增加。這也見于 HBD2和HBD3。如上所述，由于防衛(wèi)素合成的原始缺陷，⑶患者的消化道具有少量的抗菌肽， 特別是防衛(wèi)素。
[0006] 因此，本發(fā)明的一個目的在于提供一種新的治療體系，其使得可方便地在體內(nèi)應(yīng) 用表達(dá)防衛(wèi)素的生理可接受的細(xì)胞。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種治療方法，其能夠 克服患者的內(nèi)源防衛(wèi)素合成的生理缺陷，從而為患有克羅恩氏病的患者提供有效的治療。 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種重組大腸桿菌（E.coli)細(xì)胞，其包含編碼防衛(wèi)素蛋白 的核酸，并且能夠?qū)⒎佬l(wèi)素蛋白運送至人身體中的目的位點。本發(fā)明的另一個目的在于提 供一種能夠抵抗防衛(wèi)素蛋白的宿主殺傷活性的宿主細(xì)胞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 這些目的是通過根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化有編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍生物的核酸的重組 大腸桿菌（E. c〇li)NiSSlel917(ECN)細(xì)胞來實現(xiàn)的。發(fā)明人成功的構(gòu)建了產(chǎn)生和分泌防衛(wèi) 素的益生EcN細(xì)菌，以用于補(bǔ)充人類患者中內(nèi)源防衛(wèi)素合成的缺乏。
[0008] 發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌（E. coli)菌株Nisslel917可表達(dá)治療合適量 的重組防衛(wèi)素，而不會受到防衛(wèi)素蛋白的宿主殺傷活性的影響。
[0009] 因此，提供了一種新的藥物組合物，其包含編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍生物的重組大 腸桿菌（E. C〇li)NiSSlel917細(xì)胞，并且提供了該藥物組合物在治療克羅恩氏病中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還涉及制備所述重組大腸桿菌（E.C〇li)NiSSlel917細(xì)胞的方法，所 述方法包括以下步驟：提供編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍生物的核酸以及大腸桿菌（E. coli) Nisslel917細(xì)胞；以及用所述核酸轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Nisslel917 細(xì)胞能夠表達(dá)防衛(wèi)素蛋白或其衍生物。
[0011] 發(fā)明詳述
[0012] 根據(jù)第一個方面，本發(fā)明涉及用編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍生物的核酸轉(zhuǎn)化的重組大 腸桿菌（E.coli)Nisslel917 細(xì)胞。
[0013] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"核酸序列"是指核苷酸的雜聚物或這些核苷酸的序列 的雜聚物。術(shù)語"核酸"包括RNA以及DNA，包括CDNA、基因組DNA和合成（如化學(xué)合成）的 核酸等。
[0014] 如本文所用，術(shù)語"衍生物"是指編碼防衛(wèi)素蛋白的核酸衍生物，其與原始防衛(wèi)素 核酸序列相比，包含一個或多個替換、插入和/或缺失。優(yōu)選地，這些衍生物在所述核酸序 列的5' -端或3' -端或內(nèi)部缺失1個、2個、3個、4個或多個核苷酸，或者這些核苷酸被其它 核苷酸替換。
[0015] 術(shù)語衍生物特別地包含這樣的核酸，其大體上與編碼防衛(wèi)素的原始核酸相同，但 顯示出與編碼防衛(wèi)素的原始序列有至少約80%、更通常為至少約90%或95%的序列同一 性。
[0016] 特別地，認(rèn)為蛋白質(zhì)的變體（例如在序列中缺失、插入和/或替換，其導(dǎo)致所謂的 "沉默"改變）屬于本發(fā)明的一部分。例如，認(rèn)為核酸序列中的這些改變被會引起相應(yīng)氨基 酸的替換。優(yōu)選地，所述氨基酸的替換是這樣的替換的結(jié)果：用具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性 質(zhì)的相似氨基酸來替換氨基酸，即保守性氨基酸替換。
[0017] 可以基于有關(guān)殘基在極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性和/或兩性性質(zhì)方面的 相似性來進(jìn)行氨基酸的替換。疏水性氨基酸的例子為丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯 氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。極性、中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨 酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷（堿性）的氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨 酸。帶負(fù)電的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
[0018] "插入"或"缺失"通常在1至5個氨基酸范圍內(nèi)。改變的允許的程度可以通過利 用重組DNA方法系統(tǒng)地在蛋白質(zhì)分子中進(jìn)行氨基酸的插入、缺失或替換來實驗地確定?？?以檢測所得變體的生物學(xué)活性。
[0019] 影響蛋白質(zhì)的N端和C端部分的核苷酸的改變通常不會改變蛋白質(zhì)的活性，這是 由于這些部分通常不涉及生物學(xué)活性。在重組制備蛋白質(zhì)時，由于半胱氨酸會導(dǎo)致形成不 期望的多聚體，因此希望去除序列中的一個或多個半胱氨酸。多聚體會使純化步驟變得復(fù) 雜。所建議的改變均在本領(lǐng)域現(xiàn)狀的范圍內(nèi)，并且可保留所編碼的產(chǎn)物的生物學(xué)活性。
[0020] 在本文中，防衛(wèi)素蛋白質(zhì)的"生物學(xué)活性"特別是指它們針對細(xì)菌、真菌和一些包 膜病毒的抗菌活性。還應(yīng)注意的是，無論本發(fā)明何時提到防衛(wèi)素蛋白的"衍生物"，該蛋白是 指具有與原始防衛(wèi)素蛋白相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)功能的蛋白質(zhì)，所述生物學(xué)功能即抗菌作用、以及 在治療克羅恩氏病中的有用性，即補(bǔ)充所缺乏的內(nèi)源防衛(wèi)素合成。
[0021] 在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的重組大腸桿菌（E.coli)細(xì)胞轉(zhuǎn)化有編碼選 自人α-或β-防衛(wèi)素中的防衛(wèi)素蛋白的核酸。這些防衛(wèi)素蛋白更優(yōu)選選自人α-防衛(wèi)素 ΗΝΡ1-4、人α -防衛(wèi)素5 (HD5)、人α -防衛(wèi)素6 (HD6)、以及人β -防衛(wèi)素1-6 (HBD1-6)，或選 自所述蛋白的各自的成熟型。
[0022] 術(shù)語"所述蛋白的成熟型"是指人α -防衛(wèi)素以前體形式表達(dá)然后經(jīng)切割而得到 的有活性的成熟型防衛(wèi)素。人防衛(wèi)素不以前體形式表達(dá)。
[0023] 上文所描述的人α -和β -防衛(wèi)素的序列之前已經(jīng)被公布，并且在（例如）以下 數(shù)據(jù)庫中公開：
[0024] 人防下.素序列
[0025] 人α -防衛(wèi)素
[0026] 人α -防衛(wèi)素1
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍生物的核酸轉(zhuǎn)化的重組大腸桿菌（E.coli) Nisslel917(EcN)細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組細(xì)胞，其中所述防衛(wèi)素蛋白選自人α-或防衛(wèi)素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組細(xì)胞，其中所述防衛(wèi)素蛋白選自人α-防衛(wèi)素 ΗΝΡ1-4、 人α-防衛(wèi)素5(HD5)、人α-防衛(wèi)素6(HD6)以及人β-防衛(wèi)素1-6(HBD1_6)，或選自所述 蛋白的各自的成熟型。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中一項或多項所述的重組細(xì)胞，其中所述防衛(wèi)素蛋白或其衍生物 被表達(dá)為融合蛋白，優(yōu)選為與組氨酸標(biāo)簽融合的融合蛋白或與大腸桿菌（E. coli)YebF蛋 白融合的融合蛋白。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中一項或多項所述的重組細(xì)胞，其中所述編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍 生物的核酸通過密碼子優(yōu)化而適合在大腸桿菌（E.coli)細(xì)胞中表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中一項或多項所述的重組細(xì)胞，其中所述編碼所述防衛(wèi)素蛋白或 其衍生物的核酸選自SEQ ID N0:l、2或3。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中一項或多項所述的重組細(xì)胞，其中所述編碼所述防衛(wèi)素蛋白或 其衍生物的核酸是表達(dá)載體的一部分，所述表達(dá)載體還包含一條或多條調(diào)控序列。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組細(xì)胞，其中所述表達(dá)載體為質(zhì)粒，并且所述調(diào)控序列包 含T7啟動子。
9. 一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-8中一項或多項所述的重組大腸桿菌（E. coli) Nisslel917(EcN)細(xì)胞和可藥用的載體。
10. 權(quán)利要求1-8中一項或多項所述的重組大腸桿菌（E. coli)Nisslel917(EcN)細(xì)胞 在治療克羅恩氏病中的應(yīng)用。
11. 一種制備權(quán)利要求1-8中一項或多項所述的重組大腸桿菌（E. coli) NiSSlel917(ECN)細(xì)胞的方法，包括以下步驟：提供編碼防衛(wèi)素蛋白或其衍生物的核酸以 及大腸桿菌（E. c〇li)NiSSlel917(ECN)細(xì)胞，以及用所述核酸轉(zhuǎn)化所述細(xì)胞，其中經(jīng)轉(zhuǎn)化 的大腸桿菌（E. c〇li)NiSSlel917(ECN)細(xì)胞能夠表達(dá)防衛(wèi)素蛋白或其衍生物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中將所述核酸克隆到表達(dá)載體中，并通過電穿孔 引入所述細(xì)胞中。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的方法，其中所述防衛(wèi)素蛋白或其衍生物被表達(dá)為具有 N端組氣酸標(biāo)簽的融合蛋白。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11至13中一項或多項所述的方法，其中所述防衛(wèi)素蛋白或其衍生物 被表達(dá)為與大腸桿菌（E. coli) YebF蛋白融合的融合蛋白。
【文檔編號】C12R1/19GK104126003SQ201380009844
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月17日
【發(fā)明者】托比亞斯·奧爾施拉格爾, E·J·徐, 簡·韋坎普, 愛德華·F·施坦格, 烏爾里?！に髂喜? 于爾根·馬林卡, 漢斯·普羅珀特 申請人:醫(yī)藥中心有限公司