專利名稱：含有2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd的工程菌及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種利用糖類碳源生產(chǎn) 3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯的含有2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd的工程菌及其用途。
背景技術(shù)：
聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，簡稱PHA)是一類廣泛存在于微生 物體內(nèi)的高分子生物聚酯，在細(xì)胞內(nèi)主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì)(Anderson AJ, Dawes EA. Occurrence,metabolism, metabolic role, and industrial use of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol Rev, 1990,54 :450_472)。 3-輕基丁酸禾口 4-輕基丁 酸共聚酯[poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)，簡稱 P3HB4HB]是 PHA 家族 中的一員(分子式I)，它最先由Doi Y等于1988年在羅氏真養(yǎng)桿菌Ralstonia eutropha 中發(fā)現(xiàn)(Doi Y, Kunioka M, Nakamura Y, et al. Nuclear magnetic-resonance studies on unusual bacterial copolyesters of3-hydroxybutyrate and 4-hydroxybutyrate. Macromolecules，1988，21 =2722-2727) 當(dāng)向培養(yǎng)基中添加4-羥基丁酸或者4-氯丁酸時， R. eutropha可以合成P3HB4HB，4HB單體的含量可以在O到49mol%之間調(diào)節(jié)。 I其中χ和y表示聚合度根據(jù)P3HB4HB聚合物中組成單體3_羥基丁酸(3-hydroxybutyrate，簡稱3HB)與 4-羥基丁酸(4-hydroxybutyrate，簡稱4HB)比例的不同，P3HB4HB具有從非常堅硬的高度 結(jié)晶體到柔軟的彈性體等一系列不同的材料學(xué)性質(zhì)。4HB含量較高時(64 100mol%)， P3HB4HB的拉伸強(qiáng)度可以由17Mpa提高到104Mpa，表現(xiàn)出熱塑性彈性體的性質(zhì)。當(dāng)4HB比 例由Omol%增加到82mol%時，P3HB4HB的斷裂伸長率可以由5%增加至Ij 1320% (Saito Y， Nakamura S, Hiramitsu M, et al. Microbial synthesis and properties of poly (3-hyd roxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate). Polym Int, 1996,39 :169_174)。P3HB4HB 的熔融 溫度隨著4HB單體比例的增加先降低，然后逐漸升高，而玻璃化轉(zhuǎn)變溫度則隨著4HB單體 比例的增加呈線性降低趨勢(Ishida K, Wang Y, Inoue Y. Comonomer unit composition and thermal properties of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)s biosynthesized by Ralstonia eutropha. Biomacromolecules,2001, 2 :1285-1293)。4HB單體被聚合到共聚酯后不含支鏈，使得P3HB4HB既可以被PHA降解酶降解，又 可以被脂肪酶水解。4HB單體的摻入加速了酶解和水解的速度，水解速度取決于其單體組 成，4HB含量越高時，P3HB4HB被脂肪酶水解的速度越快(Saito Y，Nakamura S，Hiramitsu M, et al. Microbial synthesis and properties of poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate). Polym Int,1996, 39 169-174 ;Doi Y, Kanesawa Y, Kunioka Μ, et al. Biodegradation of microbial copolyesters :poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydr oxyvalerate)and poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate). Macromolecules, 1990,23 26-31)，因此，P3HB4HB有著比其它PHA材料更為優(yōu)異的降解性能，被認(rèn)為是最有 應(yīng)用前景的PHA材料之一。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的可以合成P3HB4HB的野生型細(xì)菌包括羅氏真養(yǎng) 桿菌Ralstonia eutropha,廣泛產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes latus,食酸叢毛單胞菌 Comamonas acidovorans,Comamonas testosteroni 禾口gHfeUMfilii Hydrogenophaga pseudofIava0 一般來說，P3HB4HB共聚酯中的3HB和4HB單體分別由不 同類型的碳源來合成，用來產(chǎn)生3HB單體的碳源包括常規(guī)的蔗糖、葡萄糖、果糖和丁酸等， 而4HB單體的摻入需要向培養(yǎng)基中加入與4HB結(jié)構(gòu)類似的碳源，例如4-羥基丁酸、Y - 丁 內(nèi)酯和L4-丁二醇等。碳源的選用與生產(chǎn)菌的種類相關(guān)，不同的微生物喜好利用不同的碳 源。4HB結(jié)構(gòu)類似碳源的價格非常昂貴，對細(xì)胞毒性也較大，在發(fā)酵過程中常常需要以分批 補(bǔ)料的方式添加，并且混合碳源的發(fā)酵策略也較為繁瑣復(fù)雜。例如，4-羥基丁酸被認(rèn)為是最 有效地向共聚酯中摻入4HB單體的碳源，但它在我國是一種管制藥品，很難以化學(xué)品的形 式在市場上購買到。4HB結(jié)構(gòu)類似碳源的添加已經(jīng)成為制約P3HB4HB大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和 應(yīng)用的最大難題。如果能夠利用價格相對便宜的單一糖類碳源來生產(chǎn)P3HB4HB，將會有效地 降低其生產(chǎn)成本，推動其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用開發(fā)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用糖類碳源生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯的 含有2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd的工程菌，其中糖類碳源可以為葡萄糖，葡萄糖酸鈉，果 糖，甘露醇等可以被工程菌利用的單糖，或者經(jīng)過水解后含有上述產(chǎn)物的多糖。本發(fā)明提供的上述工程菌為R. eutropha H16 (pMCS4HBRE)或E. coli JM109SG (pBHR68orfZ+pMCS4HB)之-；其中 R. eutropha H16 (pMCS4HBRE)所含的表達(dá)載體的 物理圖譜如圖1所示，E. coli JM109SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)所含的表達(dá)載體的物理圖譜 如圖2所示；本發(fā)明還提供了得到上述工程菌，即將3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯生物合 成所需基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到宿主菌后得到重組菌；所述3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯生物合成所需基因包括來源于羅氏真 養(yǎng)桿菌Ralstonia eutropha的聚_3_羥基丁酸酯合成基因phaCAB (自GENBANK號為 AM260479 的5'端第 1557353-1561203位核苷酸)，來源于克氏梭菌Clostridium kluyveri 的4-羥基丁酰輔酶Α:輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因orfZ(自GENBANK號為CP000673的5'端第 3066385-3067674位核苷酸)，來源于克氏梭菌Clostridium kluyveri的4-羥基丁酸脫氫 酶基因4hbD (自GENBANK號為CP000673的5 ‘端第3061070-3062185位核苷酸)，和來源 于結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis的2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd (自GENBANK 號為CP000611的5'端第1390667-1394311位核苷酸)。P3HB4HB的生物合成途徑如圖3所示。所述宿主菌可為大腸桿菌或羅氏真養(yǎng)桿菌的野生型，也可為大腸桿菌或羅氏真養(yǎng)桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因突變株，優(yōu)選琥珀酸半縮醛脫氫酶基因突變株。所述在大腸桿菌中重組表達(dá)的載體的出發(fā)載體為pBluescript II SK(-) (NCBI GenBank 檢索號為 X52330)和 pBBRlMCS-2 (NCBI GenBank 號為 U23751)。所述在羅氏真養(yǎng) 桿菌中重組表達(dá)的載體的出發(fā)載體為pBBRlMCS-2 (NCBIGenBank號為U23751)。本發(fā)明所提供的生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯的方法，是將上述工程菌， 在添加糖類碳源的情況下，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)得到3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯。所述大腸桿菌工程菌的發(fā)酵溫度為28_38°C，優(yōu)選為37°C。所述羅氏真養(yǎng)桿菌工程菌的發(fā)酵溫度為30_33°C。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為以下三種的任意一種，以下培養(yǎng)基均用去離子水配制1)每升培養(yǎng)基含酵母提取物4_6g/L，蛋白胨8_12g/L，NaCl 8_12g/L，糖類碳源 18-22g/L，其余為水。2)每升培養(yǎng)基含酵母提取物4_6g/L，蛋白胨8_12g/L，糖類碳源20_60g/ L, (NH4)2SO4 1. 8-2. 2g/L ；MgSO4 0. 38-0. 45g/L ；Na2HPO4 ‘ 12H20 9. 6-9. 7g/L ；KH2PO4 1. 2-1. 8g/L，微量元素溶液I 8-12mL/L，微量元素溶液II 0. 8-1. 2mL/L，其余為水；每升微 量元素溶液 I 含:Fe (III)-NH4-Citrate 4_6g/L，CaCl2 · 2Η201· 8-2. 2g/L，其余為 0. 4-0. 6M HCl ；每升微量元素溶液 II 含ZnS04 · 7H20 80_120mg/L，MnCl2 · 4H20 25_35mg/L，H3BO3 280-320mg/L, CoCl2 · 6H20 180_220mg/L，CuSO4· 5H20 8_12mg/L，NiCl2 · 6H20 18_22mg/L， NaMoO4 · 2H20 28_32mg/L，其余為 0. 4-0. 6M HCl。3)每升培養(yǎng)基含糖類碳源 20-60g/L, (NH4)2SO4 1. 8-2. 2g/L ；MgSO4O. 38-0. 45g/ L ；Na2HPO4 · 12H20 9. 6-9. 7g/L ；KH2P04 1. 2-1. 8g/L，微量元素溶液 I 8_12mL/L，微量元素 溶液II 0.8-1. 2mL/L，其余為水；每升微量元素溶液I含F(xiàn)e(III)-MM-Citrate 4_6g/ L，CaCl2 · 2H20 1. 8-2. 2g/L，其余為 0. 4-0. 6M HCl ；每升微量元素溶液 II 含=ZnSO4 · 7H20 80-120mg/L, MnCl2 · 4H2025_35mg/L， H3BO3 280_320mg/L， CoCl2 · 6H20 180_220mg/L， CuSO4 ·5Η20 8-12mg/L，NiCl2 · 6H20 18_22mg/L，NaMoO4 · 2H20 28_32mg/L，其余為 0. 4-0. 6M HCl。在實際培養(yǎng)過程中，可向上述培養(yǎng)基中再添加一定濃度的抗生素以維持質(zhì)粒的穩(wěn) 定性，如30-50 μ g/mL硫酸卡那霉素和/或60-100 μ g/mL氨芐青霉素。本發(fā)明通過分子生物學(xué)和代謝工程的手段，構(gòu)建能夠利用糖類碳源發(fā)酵生產(chǎn)
3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯的工程菌，無需4HB結(jié)構(gòu)類似的碳源(例如4-羥基丁酸、 Y-丁內(nèi)酯和1，4_ 丁二醇等)的添加，即利用相對廉價的碳源發(fā)酵，降低了 3-羥基丁酸和
4-羥基丁酸共聚酯的生產(chǎn)成本。


圖1 :pMCS4HBRE的物理圖譜(Kan-R，卡那霉素抗性基因；orfZ，4_羥基丁酰輔酶 A 輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因；4hbD，4-羥基丁酸脫氫酶基因；kgd，2-酮戊二酸脫羧酶基因)；圖2 :pBHR68orfZ和pMCS4HB的物理圖譜，其中，左圖為pBHR68orfZ的物理圖 譜，右圖為PMCS4HB的物理圖譜(Amp-R，氨芐青霉素抗性基因；Kan-R，卡那霉素抗性基因； orfZ, 4-羥基丁酰輔酶A 輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因；phaC，PHA聚合酶基因；phaA，3-酮硫解酶基 因；phaB，NADPH-依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶基因；4hbD，4-羥基丁酸脫氫酶基因；kgd，2_酮戊二酸脫羧酶基因)；圖3 :P3HB4HB的生物合成途徑。
具體實施例方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中涉及分子生物學(xué)操作所用的酶，均購自MBI Fermentas公司，相應(yīng)的 操作步驟完全按照相關(guān)的產(chǎn)品說明書進(jìn)行；質(zhì)粒提取、DNA片段回收所用的試劑盒購自美 國OMEGA Bio-Tek公司，相應(yīng)的操作完全按照其產(chǎn)品說明書進(jìn)行；實驗中涉及的引物合成 和DNA測序工作由北京奧科生物技術(shù)公司完成。下述實施例中涉及的細(xì)菌培養(yǎng)基如下，如無特殊指明，培養(yǎng)基均用去離子水配制； 如無特殊指明，培養(yǎng)基的滅菌條件均為115°C，20分鐘LB液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、lOg/LNaCl，pH 7.0，其余為水。LB-Amp液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L NaCl 和100yg/mL氨芐青霉素，其余為水。LB-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有15g/L瓊脂、5g/L酵母提取物、10g/L蛋白 胨、10g/L NaCl和100 μ g/mL氨芐青霉素，其余為水。LB-Km液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/LNaCl和 50 μ g/mL硫酸卡那霉素，其余為水。LB-Km固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨， 10g/L NaCl和50 μ g/mL硫酸卡那霉素，其余為水。LB-Km-Amp液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，50 μ g/mL硫酸卡那霉素和100 μ g/mL氨芐青霉素，其余為水。LB-Km-Amp固體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，10g/L蛋白 胨，10g/L NaCl，50 μ g/mL硫酸卡那霉素和100 μ g/mL氨芐青霉素，其余為水。LBG-Km-Amp液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L葡萄糖，50 μ g/mL硫酸卡那霉素和100 μ g/mL氨芐青霉素，其余為水。LBM-Km-Amp液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含有5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，20g/L甘露醇，50 μ g/mL硫酸卡那霉素和100 μ g/mL氨芐青霉素，其余為水。LBGN-Km液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl, 20g/L葡萄糖酸鈉和50 μ g/mL硫酸卡那霉素，其余為水。LBF-Km液體培養(yǎng)基每升培養(yǎng)基含5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl, 20g/L果糖和50 μ g/mL硫酸卡那霉素，其余為水。 實施例1、構(gòu)建質(zhì)粒pBHR68orfZ1.用 ClaI 和 EcoRI 雙切質(zhì)粒 pCK3 ( Sohling B, Gott schalk G. Mol ecular analysis of the anaerobic succinate degradation pathway in Clostridium kluyveri. J Bacteriol，1996，178 :871_880)，膠回收得到 1. 8kb 的片段，含有 orfZ 基因及 其啟動子序列。2.用 ClaI 和 EcoRI 雙切質(zhì)粒 pBHR68 (Spiekermann P, Rehm BHA, KalscheuerR, et al. A sensitive, viable-colony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds. Arch Microbiol, 1999,171 :73_80)，膠回收得到 8. Ikb 的片段，含有 phaCAB基因及其啟動子序列、pBluescript II SK(-)來源的Amp抗性基因及復(fù)制子。3.使用T4DNA連接酶連接步驟1和步驟2中回收的片段；連接反應(yīng)完成后，得到 質(zhì)粒pBHR68orfZ。通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到Ε. coli JM109 (從中國普通微生物菌種保藏管 理中心購得)中，并涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h ；4.從LB-Amp固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h (37°C搖 床，200rpm)，提取質(zhì)粒，并通過ClaI和EcoRI雙酶切確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。陽性的單克 隆E. coli JM109 (pBHR68orfZ)經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為兩段DNA片段，大小為8. Ikb 及 1. 8kb。實施例2、構(gòu)建質(zhì)粒pMCS4HB1.含有丙酮酸脫羧酶啟動子(簡稱Ppd。)表達(dá)載體pPpdc的構(gòu)建人工合成一段雙鏈 DNA，其序列如下所示5' -tgataagaattccctaggactagtttacg ctcatgatcgcggcatgtcctgatatttttcctctaaaaaagataaaaagtcttttcgcttcggcagaagaggttca tcatgaacaaaaattcggcatttttaaaaatgcctatagctaaatccggaacgacactttagaggtttctgggtcat cctgattcagacatagtgttttgaatataggatccgagctcaagcttagatctggtacctctagacgcccgccataa actgccaggcatcaaattaagcagaaggccatcctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactcttcctgt其中含有來源于移動單胞菌的丙酮酸脫羧酶啟動子序列，多克隆位點，以及轉(zhuǎn)錄 終止序列。將其通過TA克隆的方法連接到T載體pMD19-T Simple (購自日本Takara公 司)中，得到表達(dá)載體pPpdc。2. 4hbD基因的克隆及表達(dá)載體pPpdc4hbD構(gòu)建1)在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以質(zhì)粒pCK3( Sdhling B，Gottschalk G. Molecular analysis of the anaerobic succinate degradation pathway in Clostridium kluyveri. J Bacteriol，1996，178 :871_880)為模板，以 Pl :GCTGGATCCAAGGA GATATACCATGAAGTTATTAAAATTGGCACCTG(BamH I_)和 P2 GCTGGTACCCTCTTAAGATGGGATATTTA ATG(KpnI)為上下游引物擴(kuò)增得到1185bp的DNA片段，經(jīng)測序表明，該片段含有克氏梭菌 Clostridium kluyveri 的 4-羥基丁酸脫氫酶基因 4hbD(自 GENBANK 號為 CP000673 的 5' 端第3061070-3062185位核苷酸序列)，用限制性內(nèi)切酶BamHI/Kpnl酶切處理后，回收含有 4-羥基丁酸脫氫酶基因4hbD的DNA片段。2)用限制性內(nèi)切酶BamHI/Kpnl酶切處理步驟1中得到的質(zhì)粒pPpdc，得到3. Okb 的載體片段。3)使用T4 DNA連接酶連接步驟1)和步驟2)中回收的片段；連接反應(yīng)完成后，得 到質(zhì)粒pPpdc4hbD。通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到Ε. coli JM109(從中國普通微生物菌種保藏 管理中心購得)中，并涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h ；4)從LB-Amp固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h (37°C搖 床，200rpm)，提取質(zhì)粒，并通過BamHI和KpnI雙酶切確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。陽性的單克 隆E. coli JM109 (pPpdc4hbD)經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為兩段DNA片段，大小為3. Okb 及 1. 2kb。
3. kgd基因的克隆及表達(dá)載體pPpdckgd構(gòu)建1)在標(biāo)準(zhǔn)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)條件下，以結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis H37Ra 的基因組為模板，以 P3 :GCTAAGCTTAAGGAGATATACCATGTACCGCAAG TTCCGCGACGAC(HindIII)和 P4 :GCTTCTAGACGTTCGGCTGAGCGAACTCAG(XbaI)為上下游引 物擴(kuò)增得到3693bp的DNA片段，經(jīng)測序表明，該片段含有結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosisH37Ra的2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd(自GENBANK號為CP000611的5'端第 1390667-1394311位核苷酸)，用限制性內(nèi)切酶HindiΙΙ/XbaI酶切處理后，回收含有2-酮 戊二酸脫羧酶基因kgd的DNA片段。2)用限制性內(nèi)切酶Hindi ΙΙ/XbaI酶切處理步驟1中得到的質(zhì)粒pPpdc，得到
3.Okb的載體片段。3)使用T4 DNA連接酶連接步驟1)和步驟2)中回收的片段；連接反應(yīng)完成后，得 到質(zhì)粒pPpdckgd。通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到Ε. coli JM109(從中國普通微生物菌種保藏管 理中心購得)中，并涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h ；4)從LB-Amp固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h (37°C搖 床，200rpm)，提取質(zhì)粒，并通過HindIII和XbaI雙酶切確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。陽性的單 克隆E. coli JM109 (pPpdckgd)經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為兩段DNA片段，大小為3. Okb 及 3. 7kb。4.質(zhì)粒pMCS4HB的構(gòu)建1)用限制性內(nèi)切酶Avrll/Xhol處理步驟3中得到的質(zhì)粒pPpdckgd，膠回收得到
4.Okb的DNA片段，含有Ppde轉(zhuǎn)錄的kgd基因。2)用限制性內(nèi)切酶Nhel/Xhol處理步驟2中得到的質(zhì)粒pPpdc4hbD，膠回收得到
4.2kb的DNA片段，作為載體，其中含有Ppde轉(zhuǎn)錄的4hbD基因。3)使用T4DNA連接酶連接步驟1)和步驟2)中回收的片段；連接反應(yīng)完成后，得 到質(zhì)粒pPpdc4hbD-kgd。通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E. coli JM109(從中國普通微生物菌種 保藏管理中心購得)中，并涂布于LB-Amp固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h ；4)從LB-Amp固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Amp液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h (37°C搖 床，200rpm)，提取質(zhì)粒，并通過EcoRI和XhoI雙酶切確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。陽性的單克 隆E. coli JM109 (pPpdc4hbD-kgd)經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為兩段DNA片段，大小為
5.5kb 及 2. 7kb。5)用限制性內(nèi)切酶EcoRI/XhoI處理步驟4)中得到的質(zhì)粒pPpdc4hbD_kgd，膠回 收得到5. 5kb的DNA片段，其中含有Ppde轉(zhuǎn)錄的4hbD基因和Ppde轉(zhuǎn)錄的kgd基因。6)用限制性內(nèi)切酶 EcoRI/XhoI 處理載體 pBBRlMCS-2 (NCBI GenBank 號為 U23751)，膠回收得到5. Ikb的DNA片段，作為載體。7)使用T4DNA連接酶連接步驟5)和步驟6)中回收的片段；連接反應(yīng)完成后，得 到質(zhì)粒PMCS4HB。通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E. coli JM109 (從中國普通微生物菌種保藏管 理中心購得)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h ；8)從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖 床，200rpm)，提取質(zhì)粒，并通過EcoRI和XhoI雙酶切確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。陽性的單克 隆E. coli JM109 (pMCS4HB)經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為兩段DNA片段，大小為5. 5kb及5. Ikb。實施例3構(gòu)建質(zhì)粒pMCS4HBRE1.用 ClaI 禾口 EcoRI 雙切質(zhì)粒 pCK3 ( Sohling B, Gottschalk G. Molecular analysis of the anaerobic succinate degradation pathway in Clostridium kluyveri. J Bacteriol，1996，178 :871_880)，膠回收得到 1. 8kb 的片段，含有 orfZ 基因及 其啟動子序列。2.用 ClaI 和 EcoRI 雙切質(zhì)粒載體 pBBRlMCS-2 (NCBI GenBank 號為 U23751)，得到 5. Ikb的DNA片段，作為載體。3.使用T4DNA連接酶連接步驟1和步驟2中回收的片段；連接反應(yīng)完成后，得到 質(zhì)粒pMCSorfZ。通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到Ε. coli JM109 (從中國普通微生物菌種保藏管理 中心購得)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h ；4.從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖 床，200rpm)，提取質(zhì)粒，并通過ClaI和EcoRI雙酶切確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。陽性的單克 隆E. coli JM109 (pMCSorfZ)經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為兩段DNA片段，大小為5. Ikb 及 1. 8kb。5.用限制性內(nèi)切酶EcoRI/XhoI處理實施例2中得到的質(zhì)粒pPpdC4hbD_kgd，膠回 收得到5. 5kb的DNA片段，其中含有Ppde轉(zhuǎn)錄的4hbD基因和Ppde轉(zhuǎn)錄的kgd基因；接下來 用T4DNA聚合酶處理，使其DNA末端平端化。6.用限制性內(nèi)切酶EcoRI處理步驟4中得到的質(zhì)粒pMCSorfZ，膠回收得到6. 9kb 的載體片段，其中含有Km抗性基因、復(fù)制子和orfZ基因，接下來用T4DNA聚合酶處理，使其 DNA末端平端化。7.使用T4DNA連接酶連接步驟5和步驟6中回收的片段；連接反應(yīng)完成后，得到 質(zhì)粒pMCS4HBRE。通過電轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入到E. coli JM109 (從中國普通微生物菌種保藏管 理中心購得)中，并涂布于LB-Km固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)16h ；8.從LB-Km固體培養(yǎng)基上挑取單克隆到LB-Km液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16h(37°C搖 床，200rpm)，提取質(zhì)粒，并通過ClaI酶切確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建是否成功。陽性的單克隆E. coli JM109 (pMCS4HBRE)經(jīng)上述步驟處理后，酶切產(chǎn)物為大小為12. 4kb的單一 DNA片段。實施例4工程菌E. coli JM109SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)的構(gòu)建及利用葡萄糖和 甘露醇發(fā)酵生產(chǎn)P3HB4HB的搖瓶實驗1.將實施例1中構(gòu)建的質(zhì)粒pBHR68orfZ和實施例2中構(gòu)建的質(zhì)粒pMCS4HB通過 電轉(zhuǎn)化的方法共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌琥珀酸半縮醛脫氫酶突變體E. coli JM109SG(Li ZJ, Shi ZY, Jian J,et al. Production of poly (3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)from unrelated carbon sources by metabolically engineered Escherichia coli. Metab Eng，2010，12 :352_359)中，構(gòu)建工程菌 E. coli JM109SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)。2.將 Ε. coli JM109SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)在 LB-Km-Amp 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12h (37°C搖床，200rpm)作為種子液；按體積比4%的接種量將種子液接種到LBG-Km-Amp或 LBM-Km-Amp液體培養(yǎng)基中，37°C搖床，200rpm,培養(yǎng)48h。3.氣相色譜法(Gas chromatography,GC)對發(fā)酵產(chǎn)物定性檢測，結(jié)果表明采用這 種方法生產(chǎn)得到的PHA組分為3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯(P3HB4HB)。
按照下述方法進(jìn)行菌體中PHA含量的氣相色譜法檢測氣相色譜分析使用HP 6890型氣相色譜儀，色譜柱為HP_5毛細(xì)管柱，柱長30m， 內(nèi)徑320陽，固定相為25nm厚的苯基甲基聚硅氧烷；檢測器為火焰離子化檢測器(Flame ionization detector, FID)；用高純氮氣作為載氣，氫氣作為燃?xì)猓諝鉃橹細(xì)?。氣相色譜分析的條件如下柱溫80°C開始，停留 1. 5min ；300C /min 的速率升溫到 140°C，停留 Omin ；400C /min 的速率升溫到 220°C，停留 0. 5min?？傆嫊r間為6min。柱壓IOpsi 開始，停留 1. 5min ；2. 5psi/min 的速率升壓到 20psi，停留 0. 5min。(psi為壓力單位，即磅/平方英寸，Ipsi = 6. 89476kPa)進(jìn)樣口 溫度為200°C，使用分流模式，分流比為30 100。檢測器溫度為220°C，氫氣流量30mL/min，空氣流量400mL/min。檢測步驟如下1)將上述發(fā)酵培養(yǎng)的 E. coli JM109SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)菌液，離心 (lOOOOrpm, IOmin)收集細(xì)菌，然后用蒸餾水洗滌后再次離心；將細(xì)胞冰凍干燥，測定細(xì)胞 干重(Cell dry weight, CDff)；2)取30_50mg左右干細(xì)胞于酯化管中，加入2mL酯化液(3%體積的濃硫酸溶于甲 醇中，含2g/L苯甲酸作為內(nèi)標(biāo))、2mL氯仿，加蓋密閉，100°C烘箱中酯化4h ；冷卻至室溫后， 加入ImL蒸餾水，充分振蕩，靜置分層；待氯仿相與水相完全分離后，取氯仿相進(jìn)行氣相色 譜分析；3)根據(jù)樣品濃度的不同，進(jìn)樣量為0.4-1 μ L，使用安捷倫公司的微量進(jìn)樣器。采 用內(nèi)標(biāo)法對PHA進(jìn)行定量分析，根據(jù)峰面積定量。PHA含量定義為PHA對細(xì)胞干重的比值， PHA產(chǎn)量=PHA含量X細(xì)胞干重。菌體內(nèi)積累Ρ3ΗΒ4ΗΒ的含量及細(xì)胞干重結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明，E. coliJM109 SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)在上述培養(yǎng)條件下能夠合成P3HB4HB，且P3HB4HB的含量可達(dá)細(xì) 胞干重的50左右％。表1 菌株 E. coli JM109 SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)培養(yǎng)積累 P3HB4HB 搖瓶結(jié)果 實施例5工程菌R. eutropha H16 (pMCS4HBRE)的構(gòu)建及利用葡萄糖酸鈉和果糖發(fā) 酵生產(chǎn)P3HB4HB的搖瓶實驗
1.將實施例3中構(gòu)建的質(zhì)粒pMCS4HBRE通過電轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到R. eutropha H16 (ATCC 17699)中(已含 phaCAB)，構(gòu)建工程菌 R. eutropha H16 (pMCS4HBRE)。2.將 R. eutropha H16 (pMCS4HBRE)在 LB-Km 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng) 12h(30°C搖床， 200rpm)作為種子液；按體積比4%的接種量將種子液接種到LBGN-Km或者LBF-Km液體培 養(yǎng)基中，30°C搖床，200rpm,培養(yǎng)48h。3.按照實施例4中的方法檢測工程菌中的P3HB4HB積累，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，R. eutropha H16 (pMCS4HBRE)可以在上述培養(yǎng)條件下生產(chǎn)P3HB4HB，在LBGN-Km培養(yǎng)基中，細(xì)胞干重達(dá) 到6. 02g/L, P3HB4HB含量達(dá)細(xì)胞干重的51%，其中4HB單體含量為1. 5mol% ；在LBF-Km 培養(yǎng)基中，細(xì)胞干重達(dá)到6. 71g/L，P3HB4HB含量達(dá)細(xì)胞干重的59%，其中4HB單體含量為 2. Imol %。
權(quán)利要求
一種利用糖類碳源生產(chǎn)3 羥基丁酸和4 羥基丁酸共聚酯的工程菌，其特征在于含有2 酮戊二酸脫羧酶基因kgd。
2.權(quán)利要求1所述的工程菌，其中糖類碳源可以為葡萄糖、葡萄糖酸鈉、果糖、甘露醇 之一或其組合或者經(jīng)過水解后含有葡萄糖、葡萄糖酸鈉、果糖、甘露醇之一的多糖。
3.權(quán)利要求1所述的工程菌為R.eutrophaH16 (pMCS4HBRE)或Ε· coli JM109SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)之一；其中 R. eutropha H16 (pMCS4HBRE)所含的表達(dá)載體 的物理圖譜如圖1所示，E. coli JM109SG(pBHR68orfZ+pMCS4HB)所含的表達(dá)載體的物理圖 譜如圖2所示。
4.權(quán)利要求1 3任一所述的工程菌，為將3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯生物合 成所需基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到宿主菌后得到重組菌。
5.權(quán)利要求4所述的工程菌，其中所述3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯生物合成 所需基因包括來源于羅氏真養(yǎng)桿菌Ralstonia eutropha的聚-3-羥基丁酸酯合成基因 phaCAB，來源于克氏梭菌Clostridium kluyveri的4-羥基丁酰輔酶A 輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因 orfZ，來源于克氏梭菌Clostridium kluyveri的4-羥基丁酸脫氫酶基因4hbD和來源于結(jié) 核分枝桿菌Mycobacteriumtuberculosis的2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd。
6.權(quán)利要求4所述的工程菌，其中宿主菌可為大腸桿菌或羅氏真養(yǎng)桿菌的野生型，也 可為大腸桿菌或羅氏真養(yǎng)桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因突變株。
7.權(quán)利要求6所述的工程菌為大腸桿菌或羅氏真養(yǎng)桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因 突變株。
8.權(quán)利要求6所述的工程菌在大腸桿菌中重組表達(dá)的載體的出發(fā)載體為pBluescript II SK (-)和pBBRlMCS-2 (NCBI GenBank號為U23751)；在羅氏真養(yǎng)桿菌中重組表達(dá)的載體 的出發(fā)載體為pBBRlMCS-2。
9.一種生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯的方法將權(quán)利要求1 8任一所述的 工程菌，在添加糖類碳源的情況下，經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)得到3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯。
10.權(quán)利要求9所述的生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯的方法，其中大腸桿菌工 程菌的發(fā)酵溫度為28-38°C ；所述羅氏真養(yǎng)桿菌工程菌的發(fā)酵溫度為30-33°C。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，更具體地本發(fā)明公開了一種利用糖類碳源生產(chǎn)3-羥基丁酸和4-羥基丁酸共聚酯的含有2-酮戊二酸脫羧酶基因kgd的工程菌。利用此工程菌可以使用價格相對便宜的單一糖類碳源來生產(chǎn)P3HB4HB，有效地降低其生產(chǎn)成本，推動其大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用開發(fā)。
文檔編號C12N1/21GK101906394SQ201010228730
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者呂渭川, 周子振, 陳國強(qiáng) 申請人:天津國韻生物材料有限公司