專利名稱：一種乳腺上皮細(xì)胞的組織塊種植方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乳腺上皮細(xì)胞的組織塊種植方法。
背景技術(shù)：
乳腺是哺乳動(dòng)物少數(shù)可以重復(fù)經(jīng)歷生長(zhǎng)，功能分化和退化過程的器官之一。由于外源基因可以在乳腺中表達(dá)后隨乳汁流出，乳腺上皮細(xì)胞成為轉(zhuǎn)基因研究中重要的靶細(xì) 胞。乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)對(duì)于研究乳腺生長(zhǎng)發(fā)育及闡明泌乳分子調(diào)控機(jī)制有重要意 義，同時(shí)也為轉(zhuǎn)基因研究提供有效模型。進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)首先要獲得一定數(shù)量的原代乳腺上皮細(xì)胞。目前應(yīng)用 最多的是組織塊種植法。組織塊種植法需要將組織塊種植到培養(yǎng)皿中，待貼壁后4-8天會(huì) 陸續(xù)有細(xì)胞遷出。如果直接種植，加入培養(yǎng)液后大部分組織塊會(huì)漂起，不利于細(xì)胞遷出。傳 統(tǒng)方法是預(yù)先在皿底鋪一層膠原，使組織塊黏附在皿底，并促進(jìn)組織塊貼壁。現(xiàn)在國(guó)內(nèi)一般采用自制鼠尾膠原，制備過程十分繁瑣，需經(jīng)過浸乙醇、浸酸、4度過 夜及高壓滅菌諸多步驟。對(duì)于長(zhǎng)期從事泌乳機(jī)理及轉(zhuǎn)基因研究的實(shí)驗(yàn)室，如果能找到一種 簡(jiǎn)單高效又易得的物質(zhì)來代替膠原將是十分有利的。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種乳腺上皮細(xì)胞的組織塊種植方法。本發(fā)明提供一種乳腺上皮細(xì)胞的組織塊種植方法，包括如下步驟1)預(yù)處理以血清鋪滿培養(yǎng)皿，靜置。上述血清優(yōu)選胎牛血清(FBS)，靜置條件為 室溫，30min。2)種植在所述培養(yǎng)皿中種植乳腺組織塊，優(yōu)選西農(nóng)薩能羊乳腺腺泡組織塊，收 集乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。種植的具體步驟為a.清洗乳腺組織，將其切割成塊；b.在所述培養(yǎng)皿中接種組織塊，并置于培養(yǎng)箱中，20 30分鐘；c.向培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液，1 2小時(shí)后再補(bǔ)加培養(yǎng)液，在37°C、5% CO2、飽和濕 度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)兩天，第三天更換培養(yǎng)液，以后每?jī)傻饺旄鼡Q一次培養(yǎng)液，即得乳腺 上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。上述培養(yǎng)液為含如下濃度成分的D-MEM/F-12培養(yǎng)基體積百分比 10%的FBS、5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、5mg/L表皮生長(zhǎng)因子和10萬IU/L的青鏈 霉素雙抗。3)純化除去成纖維細(xì)胞，得到乳腺上皮細(xì)胞。純化的具體步驟為a.在上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物中，加入消化液，37°C消化，待成纖維細(xì)胞脫離 瓶壁時(shí)，終止消化，將消化液吸出，再加入適量消化液，37°C繼續(xù)消化5 6min，加入所述培 養(yǎng)液后吸管吹打懸浮細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞；b.在步驟a收集的細(xì)胞中加入所述培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，成纖維細(xì)胞貼壁后， 將所述培養(yǎng)液吸出，將培養(yǎng)皿中細(xì)胞更換至一個(gè)新的培養(yǎng)皿中，再加入所述培養(yǎng)液，如此經(jīng)過3 4次，即可得到乳腺上皮細(xì)胞。作為優(yōu)選，上述消化液為含以下濃度成分的水溶液胰蛋白酶0.5g/L，NaCl Sg/ L，KC1 0. 4g/L，葡萄糖 lg/L，NaHC030. 58g/L，EDTA 0. 2g/L，酚紅 0. 002g/L 和青鏈霉素雙抗 10 萬 IU/Lo本發(fā)明的有益效果是提供了一種乳腺組織塊種植的最佳方案，省去傳統(tǒng)方法中制備膠原的繁瑣步驟，利用血清種植，獲得較高組織塊貼壁率，最終得到形態(tài)良好、數(shù)量較 多的乳腺上皮細(xì)胞。


圖1是消化中的原代細(xì)胞。圖2是純化后的乳腺上皮細(xì)胞。圖3是乳腺上皮細(xì)胞角蛋白免疫熒光鑒定。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以使本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以 更好的理解本發(fā)明并能予以實(shí)施，但所舉實(shí)施例不作為對(duì)本發(fā)明的限定。(1)乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)手術(shù)法西北農(nóng)林科技大學(xué)薩能羊原種場(chǎng)健康的純種西農(nóng)薩能羊乳腺腺泡組織。用 3倍雙抗的D-Hank’ s液反復(fù)沖洗乳腺組織，直到組織發(fā)白、沖洗液清亮為止。在超凈臺(tái)分 離修剪，剝離脂肪組織和結(jié)締組織，將呈白色顆粒狀的腺泡組織剪成約lmm3大小。用胎牛 血清(FBS)預(yù)處理培養(yǎng)皿，然后按照0. 5cm左右間隔在皿中接種組織塊，置37°C、5% CO2, 飽和濕度的培養(yǎng)箱中20 30分鐘左右，使組織塊微干涸，然后向培養(yǎng)皿中輕輕加入約ImL 培養(yǎng)液，置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 2小時(shí)后再補(bǔ)ImL培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)兩天，第 三天更換培養(yǎng)液，以后每?jī)傻饺旄鼡Q一次培養(yǎng)液。3-4天可以看到組織塊周圍有成纖維細(xì) 胞遷出，第8天左右可以看到混合生長(zhǎng)的乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。上述培養(yǎng)液的配制方法為⑴將牛胰島素(Sigma，干粉)溶于0. OlM HCl溶液 中，得溶液a;(2)將氫化可的松(Wolsen，干粉)溶于無水乙醇中，得溶液b ； (3)將表皮生 長(zhǎng)因子溶于三蒸水，得溶液c ； (4)將青鏈霉素雙抗溶于三蒸水，得溶液d ； (5)取一定量的 FBS、溶液a、b、c、d溶于D-MEM/F-12培養(yǎng)基，使上述D-MEM/F-12培養(yǎng)基中FBS體積百分比 為10%、牛胰島素為5mg/L、氫化可的松為5mg/L、表皮生長(zhǎng)因子為5mg/L和青鏈霉素雙抗為 10 萬 IU/Lo最佳預(yù)處理?xiàng)l件的篩選針對(duì)培養(yǎng)皿的預(yù)處理?xiàng)l件，分別設(shè)置不同的血清添加量及放置時(shí)間，然后按常規(guī) 方法種植組織塊，3天后比較各方案中組織塊貼壁率，10天后觀察各處理所獲得的乳腺上 皮細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。最后確定的預(yù)處理方案為向60mm皿(美國(guó)Corning)中加入ImL血清(天津?yàn)?洋)，輕輕晃動(dòng)使其均勻鋪展，覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿底部，然后將其吸出，室溫放置30分鐘。(2)乳腺上皮細(xì)胞的純化根據(jù)上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞對(duì)胰酶消化敏感性不同，在混合生長(zhǎng)的原代或傳代細(xì)胞培養(yǎng)物中，先加消化液(1XATV消化液胰蛋白酶0. 5g/L，NaCl 8g/L，KCl 0. 4g/L，葡萄糖lg/L，NaHCO3 0. 58g/L，EDTA 0. 2g/L，酚紅0. 002g/L和青鏈霉素雙抗，其中青、鏈霉素各 10萬IU/L。)，37°C消化，在倒置顯微鏡下觀察，待成纖維細(xì)胞脫離瓶壁時(shí)，終止消化，將消 化液吸出，此時(shí)棄去的大部分是成纖維細(xì)胞。然后再加入適量消化液，37°C繼續(xù)消化5 6min，加入上述培養(yǎng)液后吸管吹打懸浮細(xì)胞，離心后收集的細(xì)胞絕大多數(shù)為上皮細(xì)胞。在上 述收集的上皮細(xì)胞中加入適量培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞后，轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿中。成纖維細(xì)胞 貼壁速度快，消化后30 40分鐘即可貼壁，因此40分鐘后將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出更換至一個(gè) 新的培養(yǎng)皿中，如此經(jīng)過3 4代即可得到純化的乳腺上皮細(xì)胞，見附圖2。(3)對(duì)純化的乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行角蛋白免疫熒光鑒定對(duì)純化的乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行角蛋白免疫熒光鑒定，見附圖3，具體方法參照武漢博 士德生物工程有限公司免疫熒光試劑盒說明書，操作完成后用H0echst33342染核。以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范 圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
一種乳腺上皮細(xì)胞的組織塊種植方法，其特征在于，包括如下步驟1)預(yù)處理以血清鋪滿培養(yǎng)皿，靜置；2)種植在所述培養(yǎng)皿中種植乳腺組織塊，收集乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；3)純化除去成纖維細(xì)胞，得到乳腺上皮細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織塊種植方法，其特征在于，步驟1)所述血清為胎牛血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織塊種植方法，其特征在于，步驟1)所述靜置條件為室 溫，30mino
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織塊種植方法，其特征在于，步驟2)所述乳腺組織塊為西 農(nóng)薩能羊乳腺腺泡組織塊。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織塊種植方法，其特征在于，步驟2)所述種植的步驟為a.清洗乳腺組織，將其切割成塊；b.在所述培養(yǎng)皿中接種組織塊，并置于培養(yǎng)箱中，20 30分鐘；c.向培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液，1 2小時(shí)后再補(bǔ)加培養(yǎng)液，在37°C、5%CO2、飽和濕度培 養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)兩天，第三天更換培養(yǎng)液，以后每?jī)傻饺旄鼡Q一次培養(yǎng)液，即得乳腺上皮 細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的組織塊種植方法，其特征在于，所述培養(yǎng)液為含如下濃度成 分的D-MEM/F-12培養(yǎng)基體積百分比10 %的FBS、5mg/L牛胰島素、5mg/L氫化可的松、5mg/ L表皮生長(zhǎng)因子和10萬IU/L的青鏈霉素雙抗。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織塊種植方法，其特征在于，步驟3)所述純化的步驟為a.在上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞混合物中，加入消化液，37°C消化，待成纖維細(xì)胞脫離瓶壁 時(shí)，終止消化，將消化液吸出，再加入適量消化液，37°C繼續(xù)消化5 6min，加入所述培養(yǎng)液 后吸管吹打懸浮細(xì)胞，離心后收集細(xì)胞；b.在步驟a收集的細(xì)胞中加入所述培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，成纖維細(xì)胞貼壁后，將 所述培養(yǎng)液吸出，將培養(yǎng)皿中細(xì)胞更換至一個(gè)新的培養(yǎng)皿中，再加入所述培養(yǎng)液，如此經(jīng)過 3 4次，即可得到乳腺上皮細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組織塊種植方法，其特征在于，所述消化液為含以下濃度的 成分的水溶液胰蛋白酶 0. 5g/L，NaCl 8g/L，KCl 0. 4g/L，葡萄糖 lg/L，NaHC03 0. 58g/L， EDTA 0. 2g/L，酚紅0. 002g/L和青鏈霉素雙抗10萬IU/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種乳腺上皮細(xì)胞的組織塊種植方法，其特征在于，包括如下步驟1)預(yù)處理以血清鋪滿培養(yǎng)皿，靜置；2)種植在所述培養(yǎng)皿中種植乳腺組織塊，收集乳腺上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞；3)純化除去成纖維細(xì)胞，得到乳腺上皮細(xì)胞。上述方法省去傳統(tǒng)方法中制備膠原的繁瑣步驟，獲得較高組織塊貼壁率，最終得到形態(tài)良好、數(shù)量較多的乳腺上皮細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101812428SQ201010155429
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月26日
發(fā)明者林先滋, 滕炎玲, 王偉, 王楨, 羅軍, 趙旺生 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)