專利名稱：從哺乳動(dòng)物乳腺組織中獲得乳腺上皮細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)研究領(lǐng)域，特別是對(duì)乳腺細(xì)胞的采集、培養(yǎng)技術(shù)。
隨著細(xì)胞工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)研究的不斷深入發(fā)展，一種純凈的專一細(xì)胞的體外培養(yǎng)有著越來越廣泛的用途。但是，在某些特種細(xì)胞培養(yǎng)的樣品采集時(shí)，常常會(huì)出現(xiàn)獲得的細(xì)胞系不純的問題。由于這一問題的存在，英國科學(xué)家雖然是從綿羊的乳腺組織培養(yǎng)細(xì)胞克隆得到體細(xì)胞克隆綿羊—多莉，但由于其中摻雜有多種其它細(xì)胞(如成纖維細(xì)胞、白細(xì)胞、單核細(xì)胞、表皮細(xì)胞等)，至今尚不能知道究竟來自于何種類型的細(xì)胞，而只能統(tǒng)稱來自于乳腺細(xì)胞。
傳統(tǒng)的乳腺細(xì)胞采集有以下缺點(diǎn)1、必須從動(dòng)物體上切下乳腺組織塊，因此對(duì)動(dòng)物的損傷大，出血多，需要進(jìn)行全身或局部麻醉。
2、傳統(tǒng)的方法從組織塊中分離乳腺上皮細(xì)胞比較困難，因組織塊中夾雜有許多其它細(xì)胞，其中有些細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞的生長能力較強(qiáng)，必須有比較昂貴的選擇培養(yǎng)基來進(jìn)行培養(yǎng)。
3、獲得的乳腺上皮細(xì)胞純度差。
4、獲得的細(xì)胞數(shù)量極少。
本發(fā)明的目的是發(fā)明一種從哺乳動(dòng)物乳腺組織中獲得乳腺上皮細(xì)胞的方法，對(duì)動(dòng)物損傷小，收集細(xì)胞數(shù)量多，純度高。
本發(fā)明由以下步驟完成a、以注射器注入清洗液，至乳房脹滿為止；b、按摩1-2分鐘；c、拔出注射器，從乳房中擠出液體；d、以注射器注入灌注液，至乳房脹滿為止；e、按摩1-2分鐘；f、拔出注射器，從乳房中擠出液體；g、以注射器注入消化液，至乳房脹滿為止；h、按摩1-2分鐘；I、拔出注射器，從乳房中擠出液體；J、將步驟I中擠出的液體通過離心分離器分離出細(xì)胞后，再在細(xì)胞中加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。
本發(fā)明是應(yīng)用加壓沖洗的方法將清洗液、灌注液和消化液通過乳導(dǎo)管注入乳腺組織，經(jīng)反復(fù)沖洗后獲得脫落的乳腺上皮細(xì)胞，加培養(yǎng)液培養(yǎng)，回收得到的乳腺上皮細(xì)胞純凈度高、對(duì)動(dòng)物損傷小，并能作若干代(8-15代)培養(yǎng)。特別是本發(fā)明中因活體經(jīng)乳導(dǎo)管注入硝化液后獲得細(xì)胞數(shù)量多，本發(fā)明可應(yīng)用于科學(xué)研究、工廠化大量哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)學(xué)細(xì)胞和基因治療。
現(xiàn)舉一實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。
先將哺乳動(dòng)物仰臥保定，洗凈乳房組織及乳頭，再以70％酒精消毒，將帶有硅膠管的16-18號(hào)鈍針頭連接50ml注射液，緩慢向乳房中注入0.9％的氯化納溶液，直至乳房脹滿為止，然后輕輕按摩1-2分鐘，拔出針頭，用擠奶的方法擠出乳房內(nèi)液體，擠出的液體量約等于注入的溶液量。
再用同樣的方法注入磷酸緩沖液，經(jīng)按摩，擠出液體，擠出的液體量約等于注入的溶液量。
再注入含有0.3％胰蛋白酶的DMEM溶液或含有0.4％膠原酶的DMEM溶液，經(jīng)按摩，擠出液體，將本次擠出的液體置于離心器中分離出細(xì)胞，再在盛細(xì)胞的容器中加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。
權(quán)利要求
1.從哺乳動(dòng)物乳腺組織中獲得乳腺上皮細(xì)胞的方法，其特征在于由以下步驟完成a、以注射器注入清洗液，至乳房脹滿為止；b、按摩1-2分鐘；c、拔出注射器，從乳房中擠出液體；d、以注射器注入灌注液，至乳房脹滿為止；e、按摩1-2分鐘；f、拔出注射器，從乳房中擠出液體；g、以注射器注入消化液，至乳房脹滿為止；h、按摩1-2分鐘；I、拔出注射器，從乳房中擠出液體；J、將步驟I中擠出的液體通過離心分離器分離出細(xì)胞后，再在細(xì)胞中加入培養(yǎng)液培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟a中的清洗液為0.9％的氯化納溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟d中的灌注液為磷酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于步驟g中的消化液為含有0.1-0.4％胰蛋白酶或膠原酶的DMEM溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)研究領(lǐng)域,特別是對(duì)乳腺細(xì)胞的采集、培養(yǎng)技術(shù)。應(yīng)用加壓沖洗的方法將清洗液、灌注液和消化液通過乳導(dǎo)管注入乳腺組織,經(jīng)反復(fù)沖洗后獲得脫落的乳腺上皮細(xì)胞,加培養(yǎng)液培養(yǎng),回收得到的乳腺上皮細(xì)胞純凈度高、對(duì)動(dòng)物損傷小,并能作若干代(8－15代)培養(yǎng)。特別是本發(fā)明中因活體經(jīng)乳導(dǎo)管注入硝化液后獲得細(xì)胞數(shù)量多,本發(fā)明可應(yīng)用于科學(xué)研究、工廠化大量哺乳動(dòng)物乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)、生物制藥、醫(yī)學(xué)細(xì)胞和基因治療。
文檔編號(hào)C12N5/06GK1375554SQ0211284
公開日2002年10月23日 申請日期2002年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月3日
發(fā)明者成勇 申請人:揚(yáng)州揚(yáng)大港藥基因工程有限公司