黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種黃芪多糖的應(yīng)用方法；尤其涉及一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上 皮細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 奶牛乳腺炎嚴(yán)重影響奶牛的產(chǎn)奶量，降低牛奶品質(zhì)，危害消費(fèi)者健康，且延長(zhǎng)奶牛 產(chǎn)后發(fā)情期，增加奶牛淘汰率，從而降低奶牛養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟(jì)效益。目前，關(guān)于奶牛乳腺炎的治 療手段很多，如化學(xué)藥物療法、基因工程疫苗治療、細(xì)胞因子治療、細(xì)菌素治療、激素治療及 抗奶牛乳腺炎病原菌復(fù)合卵黃抗體治療等。這些方法各有所長(zhǎng)，雖不能徹底治愈，但都能起 到一定療效。然而這些方法的副作用卻不容忽視，特別是藥物殘留，間接危及人類(lèi)健康。因 此，如何利用生物活性物質(zhì)調(diào)動(dòng)乳腺組織自身的防御機(jī)制，從而調(diào)節(jié)乳腺的健康水平成為 奶牛乳腺炎防治研宄的熱點(diǎn)。
[0003] 乳腺上皮細(xì)胞是構(gòu)成乳腺的主要功能細(xì)胞，也是宿主機(jī)體抵御病原微生物入侵乳 腺時(shí)的第一道防御屏障。脂多糖（Lip 〇p〇lysaCCharide，LPS)，是革蘭氏陰性菌（G-)細(xì)胞外 膜上一種大分子結(jié)構(gòu)成分。牛的乳腺對(duì)LPS的刺激非常敏感，乳腺內(nèi)灌注LPS，能夠誘導(dǎo)明 顯的乳房炎癥狀，同時(shí)可增加血液和乳汁中脂多糖結(jié)合蛋白和可溶性CD14的水平及炎性 因子的釋放，其誘發(fā)的炎癥反應(yīng)和G-菌感染乳腺引起的炎癥反應(yīng)有著極其相似的地方，因 此在臨床上有著極為廣泛的應(yīng)用。且已有研宄報(bào)道表明，在體外經(jīng)LPS刺激，奶牛乳腺上皮 細(xì)胞亦能分泌炎癥相關(guān)的介質(zhì)來(lái)介導(dǎo)細(xì)胞損傷。
[0004] 中草藥及其活性有效成分在治療奶牛乳房炎的臨床實(shí)踐中早有報(bào)道。相關(guān)報(bào)道表 明，黃芪多糖對(duì)奶牛乳腺炎的防治具有潛在的研宄和開(kāi)發(fā)價(jià)值。鐘凱等研宄黃芪多糖對(duì)大 腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖誘發(fā)實(shí)驗(yàn)性山羊、奶牛和大鼠乳腺炎的影響，結(jié)果表明，乳房局部灌注 黃芪多糖或灌喂動(dòng)物黃芪多糖，均能減輕大腸桿菌內(nèi)毒素脂多糖對(duì)乳腺組織的破壞，對(duì)脂 多糖誘發(fā)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)性乳腺炎有一定的保護(hù)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用方法，本發(fā)明 方法具有高效、簡(jiǎn)便、可行且結(jié)果精確的優(yōu)點(diǎn)。
[0006] 一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用方法，包括如下步驟：
[0007] (1)培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，獲取2-3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)；
[0008] (2)細(xì)胞的分組及處理：
[0009] ①取所述2-3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期奶牛乳腺上皮細(xì)胞制備成1 X 104個(gè)/mL的細(xì)胞 懸液，按每孔150 yL接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C條件下，C02體積分?jǐn)?shù)為5%的 培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后，隨機(jī)分為如下5個(gè)試驗(yàn)組：（i )空白對(duì)照組；（ii )脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)模型組；（iii )第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模 型組；（v )第三黃芪多糖模型組；每組3板重復(fù)；吸棄上清后，所述空白對(duì)照組加入基礎(chǔ) 培養(yǎng)液200 111，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含10%體積分?jǐn)?shù)小牛血清的01^11/^12培養(yǎng)液；所述1^3 模型組加入含100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液200 y L ;所述第一黃芪多糖模型組加入含 100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS、lmg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液200 y L ;所述第二黃芪多糖 模型組加入含100 U g/mL質(zhì)量濃度LPS、3mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液200 y L ;所述 第三黃芪多糖模型組加入含100 U g/mL質(zhì)量濃度LPS、5mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液 200 y L ；
[0010] ②取所述2-3代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制備成5X 105-1 X 106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液， 按每孔1. 5mL接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37 °C條件下，C02體積分?jǐn)?shù)為5 %的培養(yǎng) 箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后，隨機(jī)分為如下5個(gè)試驗(yàn)驗(yàn)組：（i )空白對(duì)照組；（ii )脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)模型組；（iii)第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模型 組；（v )第三黃芪多糖模型組；每組3板重復(fù)；吸棄上清后，所述空白對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng) 液21^，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含10%體積分?jǐn)?shù)小牛血清的01^11/^12培養(yǎng)液；所述1^3模型組 加入含100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS的培養(yǎng)液2mL ;所述第一黃芪多糖模型組加入含100 y g/ mL質(zhì)量濃度LPS、lmg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL ;所述第二黃芪多糖模型組加入含 100 y g/mL質(zhì)量濃度LPS、3mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL ;所述第三黃芪多糖模型 組加入含100 U g/mL質(zhì)量濃度LPS、5mg/mL質(zhì)量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液2mL。
[0011] (3)CCK-8法檢測(cè)所述步驟（2)中的①中所述5個(gè)試驗(yàn)組中細(xì)胞存活率；
[0012] (4)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)所述步驟（2)中的②中所述5個(gè)試驗(yàn)組中乳腺上皮細(xì)胞周 期；
[0013] (5)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所述步驟⑵中的②中所述5個(gè)試驗(yàn)組中乳腺上皮細(xì)胞 DNA ladder 條帶；
[0014] (6)透射電鏡觀察所述步驟⑵中的②中所述5個(gè)試驗(yàn)組中乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)部超 微結(jié)構(gòu)的變化；
[0015] (7)放射免疫法檢測(cè)所述步驟（2)中的②中所述5個(gè)試驗(yàn)組中細(xì)胞上清液中炎癥 相關(guān)細(xì)胞因子含量；
[0016] (8)生化試劑盒法檢測(cè)所述步驟（2)中的②中所述5個(gè)試驗(yàn)組中細(xì)胞上清液中炎 癥相關(guān)酶酶活。
[0017] 本發(fā)明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用方法，其中，所述步 驟（1)具體包括如下步驟：
[0018] 采用組織塊培養(yǎng)法獲得奶牛乳腺上皮細(xì)胞，用含10%體積分?jǐn)?shù)小牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，于37°C、C0 2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)純化后取2-3 代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。
[0019] 本發(fā)明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用方法，其中，所述步 驟（3)具體包括如下步驟：
[0020] 所述步驟⑵中的①中得到的5個(gè)試驗(yàn)組分別繼續(xù)培養(yǎng)8h后，每孔加入10yL的 CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1~4h，觀察培養(yǎng)基顏色變化，在全自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在490nm處 的吸光度值，分別計(jì)算得到所述5個(gè)試驗(yàn)組細(xì)胞抑制率、細(xì)胞存活率，所述細(xì)胞抑制率的計(jì) 算方法為：細(xì)胞抑制率=1-(試驗(yàn)組0D值/對(duì)照組0D值）X 100 %，細(xì)胞存活率=1-細(xì)胞 抑制率；對(duì)照組的細(xì)胞存活率定義為100%。
[0021] 本發(fā)明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細(xì)胞凋亡中的應(yīng)用方法，其中，所述步 驟（4)具體包括如下步驟：
[0022] 所述步驟（2)中的②中得到所述5個(gè)試驗(yàn)組分別繼續(xù)培養(yǎng)8h后，分別進(jìn)行胰酶消 化得到單細(xì)胞懸液并分別移至離心管中進(jìn)行第一次離心，所述第一次離心為在室溫條件下 1500rpm離心5min，小心吸除上清液后，再分別加入lmL PBS吹打細(xì)胞沉淀后轉(zhuǎn)移至流式上 樣管中，再次離心并吸除上清，所述再次離心與所述第一次離心條件相同，所述吸除上清液 時(shí)留50 y L上清液以免吸走細(xì)胞，得到細(xì)胞周期待測(cè)樣品；將所述細(xì)胞周期待測(cè)樣品分別 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。
[0023] 本發(fā)明所述黃芪多糖在拮抗奶牛