乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其中，所述步 驟（5)具體包括如下步驟：
[0024] 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續(xù)培養(yǎng)8h后，分別胰酶消化收 集細胞，分別用酚-氯仿-異戊醇法抽提細胞DNA，于1 %瓊脂糖凝膠中電泳，檢測細胞DNA 完整性。
[0025] 本發(fā)明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其中，所述步 驟（6)具體包括如下步驟：
[0026] 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續(xù)培養(yǎng)8h后，分別胰酶消 化收集細胞，用質量分數為2. 5%的戊二醛固定，清洗數次后再用1 %鋨酸固定；然后分 別進行脫水，所述脫水為先用質量分數為50% -70%的酒精逐級脫水，再用質量分數為 80% -100 %的丙酮逐級脫水；脫水后分別用Epon812樹脂包埋，制成1 ym半薄切片，再用 甲苯胺蘭染色，組織定位后制成70-80nm超薄切片，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛將所述超薄切片雙 重染色，分別在JSM-6700F透射電鏡下觀察所述5個試驗組乳腺上皮細胞內部超微結構形 態(tài)及其凋亡情況。
[0027] 本發(fā)明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其中，所述步 驟（7)具體包括如下步驟：
[0028] 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續(xù)培養(yǎng)8h后，分別收集各組 細胞上清液，放射免疫法檢測所述各組細胞上清液中炎癥相關細胞因子TNF-a、IL-10、 IL-6、IL-2的質量分數，單位分別依次為pg/mL、ng/mL、pg/mL、ng/mL。
[0029] 本發(fā)明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其中，所述步 驟（8)具體包括如下步驟：
[0030] 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續(xù)培養(yǎng)8h后，分別收集各組 細胞上清液，生化試劑盒法檢測各組細胞上清液中炎癥相關酶NAGase、AKP、MPO、iNOS的酶 活，單位為U/L。
[0031] 本發(fā)明黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法的有益效果為：
[0032] 目前乳腺炎防治研宄的熱點是如何利用生物活性物質調動乳腺自身的防御機制、 調節(jié)乳腺的健康水平，利用中草藥有效成分（植物源生物活性成分）防治奶牛乳房炎的顯 著效果已日益為國內外專家關注。本發(fā)明所述方法致于闡明黃芪多糖對脂多糖誘導奶牛乳 腺上皮細胞凋亡的拮抗作用及其機制，有助于深入了解脂多糖對正常奶牛乳腺上皮細胞凋 亡損傷和黃芪多糖拮抗細胞凋亡的作用機理以及內在聯(lián)系。可為深入研宄奶牛乳腺炎的致 病機理、試驗性治療和藥效學研宄提供試驗模型基礎和數據參考。
[0033] 且以奶牛乳腺上皮細胞為試驗材料比通過活組織取樣或屠殺大型動物（如奶牛） 獲得試驗材料安全、經濟和簡便的多。在體外培養(yǎng)條件下研宄藥物或內毒素等對乳腺上皮 細胞的影響，從而能夠直接觀察正常和病變情況下細胞的一系列生理活動，并進一步對各 種藥物或內毒素的作用做出客觀評價，解決在活體情況下難以研宄的許多問題。
[0034] 下面結合附圖對本發(fā)明黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法作 進一步說明。
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發(fā)明黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法中CCK-8法 檢測各試驗組乳腺上皮細胞存活率的數據統(tǒng)計分析圖；其中，對照組為空白對照組，模型 組為LPS模型組，lmg/mL為第一黃芪多糖模型組，3mg/mL為第二黃芪多糖模型組，5mg/ mL為第三黃芪多糖模型組；**表示：與空白對照組相比，LPS模型組細胞存活率極顯著 降低（P〈0. 01) ;##表示：與LPS模型組相比，各黃芪多糖模型組細胞活率均極顯著提高 (P〈0. 01) 〇
[0036] 圖2為本發(fā)明黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法中各試驗組 DNA瓊脂糖凝膠電泳圖；A泳道為marker ;B泳道為空白對照組；C泳道為LPS模型組；D泳 道為第一黃芪多糖模型組；E泳道為第二黃芪多糖模型組；F泳道為第三黃芪多糖模型組。
[0037] 圖3為本發(fā)明黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法中各試驗組 細胞內部超微結構圖；其中，A圖為空白對照組；B圖為LPS模型組；C圖為第一黃芪多糖模 型組；D圖為第二黃芪多糖模型組；E圖為第三黃芪多糖模型組。
[0038] 圖4為本發(fā)明黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法中各試驗組 細胞上清液炎癥細胞因子含量的數據統(tǒng)計分析圖；其中，A圖為TNF-a含量比較；B圖為 IL-10含量比較；C圖為IL-6含量比較。其中，對照組為空白對照組，模型組為LPS模型組， lmg/mL為第一黃芪多糖模型組，3mg/mL為第二黃芪多糖模型組，5mg/mL為第三黃芪多糖模 型組；
[0039] 圖5為本發(fā)明黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法中各試驗組 細胞上清液炎癥相關酶酶活的數據統(tǒng)計分析圖；其中，A圖為NAGase酶活比較；B圖為AKP 酶活比較；C圖為MPO酶活比較；D圖為iNOS酶活比較。其中，對照組為空白對照組，模型組 為LPS模型組，lmg/mL為第一黃芪多糖模型組，3mg/mL為第二黃芪多糖模型組，5mg/mL為第 三黃芪多糖模型組。
【具體實施方式】
[0040] 實施例1
[0041] 一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，包括如下步驟：
[0042] (1)培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞，獲取2-3代對數生長期細胞用于后續(xù)試驗；
[0043] (2)細胞的分組及處理：
[0044] ①取所述2-3代對數生長期奶牛乳腺上皮細胞制備成1 X 104個/mL的細胞 懸液，按每孔150 yL接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C條件下，C02體積分數為5%的 培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后，隨機分為如下5個試驗組：（i)空白對照組；（ii)脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)模型組；（iii )第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模 型組；（v )第三黃芪多糖模型組；每組3板重復；吸棄上清后，所述空白對照組加入基礎 培養(yǎng)液200 111，所述基礎培養(yǎng)液為含10%體積分數小牛血清的01^11/^12培養(yǎng)液；所述1^3 模型組加入含100 y g/mL質量濃度LPS的培養(yǎng)液200 y L ;所述第一黃芪多糖模型組加入含 100 y g/mL質量濃度LPS、lmg/mL質量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液200 y L;所述第二黃芪多糖 模型組加入含100 U g/mL質量濃度LPS、3mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液200 y L;所述 第三黃芪多糖模型組加入含100 U g/mL質量濃度LPS、5mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養(yǎng)液 200 y L ；
[0045] ②取所述2-3代對數生長期奶牛乳腺上皮細胞制備成5X 105-1 X 106個/mL的 細胞懸液，按每孔1. 5mL接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C條件下，C02體積分數為5%的 培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24h后，隨機分為如下5個試驗驗組：（i )空白對照組；（ii )脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)模型組；（iii)第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模型 組；（v )第三黃芪多糖模型組；每組3板重復；吸棄上清后，所述空白對照組加入基礎培養(yǎng) 液21^，所述基礎培養(yǎng)液為含10