專利名稱：一種氟喹諾酮類藥物的單克隆抗體、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體、其制備方法及應(yīng)用，尤其是氟喹諾酮類藥物的單克 隆抗體、其制備方法及應(yīng)用，屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)為一族人工合成的新型殺菌性抗菌 藥物，因其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性、毒副作用小等特點(diǎn)而廣 泛用于動物和人類的多種感染性疾病的治療。隨著該類藥物在食源性動物中的廣泛應(yīng)用， 其殘留問題已引起廣泛的關(guān)注。FQs殘留除了其毒副作用，同時(shí)由于該類藥物在動物性食 品中的殘留容易誘導(dǎo)人類致病菌產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)一步加深了人們對該藥的認(rèn)識。為了監(jiān)控 FQs在動物性食品中的殘留，F(xiàn)A0/WH0食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JCEFA)制定的單諾沙 星在牛、豬、禽的最高殘留限量(MRLs)，牛、家禽肝、腎400μ g/kg，肌肉200μ g/kg，脂肪及 雞的皮膚100 μ g/kg ；豬腎臟200 μ g/kg，肌肉、脂肪100 μ g/kg，肝臟50 μ g/kg [2]。歐盟 (EC)在1999年3月4日公布了 508/1999號法規(guī)，對4種FQs藥物(單諾沙星、二氟沙星、 諾氟沙星、沙拉沙星)MRLs作了規(guī)定。諾氟沙星在家禽及豬所有可食用組織中的允許殘留 量(tolerance limit) 50 μ g/kg0其他FQs的安全濃度或MRL尚未制定。因此加強(qiáng)對該 類藥物在動物性食品中的殘留檢測和監(jiān)督顯得尤為突出。現(xiàn)行的檢測食品中氟喹諾酮類藥物殘留的方法以儀器分析法為主，但是由于儀器 分析法價(jià)格昂貴，對操作人員要求較高，不適合普及應(yīng)用。而常用的免疫學(xué)檢測方法由于獲 得的抗體常常只針對氟喹諾酮類藥物的1種或2種，因此，不能達(dá)到通過一次反應(yīng)檢測多種 藥物殘留的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決技術(shù)問題是針對以上現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點(diǎn)，提出一種氟喹諾酮類 藥物的單克隆抗體，并將該單克隆抗體應(yīng)用于檢測氟喹諾酮類藥物，其特異性強(qiáng)，使用方 便。本發(fā)明所涉及的雜交瘤細(xì)胞株4G11已于2009年12月31日保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號是CGMCC No. 3572。由以上雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體命名為4G11’，其制備步驟如下a.制備免疫原和包被原采用碳二亞胺法將封閉后的載體蛋白與諾氟沙星偶聯(lián)， 合成免疫原和包被原；b.動物免疫注射以Balb/c鼠作為免疫動物，腹腔注射免疫原免疫，首次免疫后 進(jìn)行2-3次加強(qiáng)免疫；c.篩選動物免疫血清用間接酶聯(lián)免疫吸附法和競爭間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選 免疫鼠血清；d.制備雜交瘤細(xì)胞取小 脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過亞克隆獲得可以穩(wěn)定分泌抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4G11 ；e.制備并純化單克隆抗體對小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞4G11，采集腹水，以及腹 水的液相層析純化，獲得氟喹諾酮類藥物單克隆抗體4G11’。其中，步驟a所述載體蛋白為牛血清白蛋白，人血清白蛋白或卵清白蛋白的至少 一種，對應(yīng)的免疫原為N0R-BSA，包被原為NOR-OVA ；所述碳二亞胺法中，載體蛋白封閉2_4 小時(shí)，交聯(lián)劑活化載體蛋白的時(shí)間為1-2小時(shí)，用諾氟沙星與載體蛋白偶聯(lián)反應(yīng)8-10小時(shí)。 所述步驟b中的各次免疫注射劑量為50-100 μ g/只。所述步驟e中對免疫小鼠腹腔進(jìn)行 單克隆抗體細(xì)胞株的注射量為(1-5) X IO6個(gè)/只。通過亞型鑒定得出本發(fā)明單克隆抗體的亞型為IgGl型。常規(guī)制備氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的方法主要是通過藥物的羧基與載體蛋白 的氨基偶聯(lián)，本發(fā)明采用小分子的亞胺基與載體蛋白的羧基偶聯(lián)，這樣，暴露氟喹諾酮類藥 物的共有結(jié)構(gòu)，在后期篩選過程中可以獲得針對多種氟喹諾酮類藥物的抗體。本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供該單克隆抗體在制備檢測氟喹諾酮類藥物中的應(yīng)用。 其主要是將其應(yīng)用于制備氟喹諾酮類藥物多殘留檢測試劑盒和膠體金試條紙。本發(fā)明的有益效果是通過小鼠雜交瘤細(xì)胞株4G11產(chǎn)生的單克隆抗體4G11’與多 種氟喹諾酮類藥物交叉反應(yīng)率高，能夠大量生產(chǎn)，可用于制備檢測氟喹諾酮類藥物的酶聯(lián) 免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達(dá)到快速且靈敏地檢測牛奶，肌肉及水產(chǎn)品中的氟喹 諾酮類藥物殘留的目的，為檢測多種氟喹諾酮類藥物殘留的試劑盒研制打下基礎(chǔ)。


圖1 封閉氨基后的BSA蛋白質(zhì)譜檢測圖。圖2 =NOR-BSA免疫原質(zhì)譜檢測圖。圖3 封閉氨基后的OVA蛋白質(zhì)譜檢測圖。圖4 =NOR-OVA免疫原質(zhì)譜檢測圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一試劑與材料準(zhǔn)備諾氟沙星(中國藥品生物制品檢定所，130450-200705)，DMF (sigma，D4551)，醋酸 鈉(sigma，S2889)，乙酸酐(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，牛血清白蛋白(BSA) (Jackson, 001-000-173)，卵清白蛋白(OVA) (Sigma, A5503)，弗氏完全佐劑(Sigma，F(xiàn)5881)，弗氏不 完全佐劑(Sigma，F(xiàn)5506),四甲基聯(lián)苯胺(TMB) (Amresco，0759)，HAT (Sigma, H0262)和 HT (Sigma, H0137)，氯化鈉(Amresco，0241)，氯化鉀(Amresco，0395)，磷酸二氫鉀(Sigma， P9791)，磷酸氫二鈉(Sigma, 71639)，羊抗鼠 IgG-HRP (Jackson, 115-035-044)，二 甲基亞 砜(DMSO) (Applichem，0231)，聚乙二醇 4000 (PEG4000) (Sigma, P7306)，DMEM 高糖培養(yǎng)基 (Gibco, 11995)，胎牛血清(Gibco, C2027050)。實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞Balb/c小鼠(6_8周齡，雌性)，購自揚(yáng)州大學(xué)動物中心， SP2/0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)由中科院生物物理研究所感染與免疫研究中心唐捷教授惠贈。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)步驟如下
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a.制備免疫原NOR-BSA和包被原N0R-0VA 本發(fā)明所述的人工抗原采用封閉載體蛋白上的氨基，利用諾氟沙星哌嗪基團(tuán)上的 亞氨基和載體蛋白上的羧基進(jìn)行偶聯(lián)，從而合成氟喹諾酮類抗原。1、載體蛋白氨基的封閉(1)準(zhǔn)確稱取20mg BSA或OVA溶解于2ml PBS溶液中；(2)向其中加入2ml醋酸鈉溶液；(3)再加入20ul醋酸酐，反應(yīng)3h ； (4)將上述反應(yīng)產(chǎn)物透析。2、人工抗原合成(1)取1ml DMF溶解7mg的諾氟沙星，得A液；(2)準(zhǔn)確稱取5mg NHS, IOmg EDC溶于200ul去離子水，得B液；(3)將B液加到BSA和OVA溶液中，得C液；(4)將A液加入C液中，反應(yīng)12h ；(5)將步驟(4)的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行透析，離心，收集上清，保存于-20°C，備用；(6)對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜檢測，結(jié)果見圖1 圖4。從圖示結(jié)果可以判定偶聯(lián)成功。b.動物免疫采用Balb/c小鼠作為免疫動物，免疫原是CAP-HSA或CAP-BSA，每次免疫劑量 ^ 50 μ g/只小鼠，免疫四次。c.篩選動物免疫血清以上免疫小鼠在第三次免疫后7-10天用ELISA法和間接競爭ELISA方法檢測血 清效價(jià)[2]。選取血清效價(jià)高的小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。d.制備雜交瘤細(xì)胞取上述免疫Balb/c小鼠的脾細(xì)胞，以50%的PEG4000作融合劑，將免疫脾細(xì)胞與 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按一定比例進(jìn)行細(xì)胞融合。采用間接ELISA法檢測融合后存活的細(xì)胞培 養(yǎng)上清，對陽性克隆進(jìn)行亞克隆，檢測有單克隆生長孔的細(xì)胞培養(yǎng)上清，陽性率達(dá)到100%， 得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4G11 ；該步驟中建立間接ELISA法的步驟如下最佳抗原包被稀釋度的選擇，采用方陣滴定法確定包被原濃度(1)包被用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液將包被原稀釋成一系列濃度加入酶標(biāo)板中， 100 μ L/孔，4°C包被過夜；(2)洗滌甩凈包被液，洗滌液是含1%。吐溫的pH7. 4的PBS，用洗板機(jī)洗板3次， 并在吸水紙上拍干；(3)封閉每孔加入200 μ L的BSA封閉液，37°C孵育Ih ；(4)洗滌同上；(5) 一抗加入系列濃度的抗體，100 μ L/孔，37°C孵育Ih ；(6)洗滌同上；(7)酶標(biāo)二抗加入羊抗鼠-HRP，100 μ L/孔，37°C孵育lh，洗滌同上；(8)顯色每孔加入100 μ L的TMB顯色液，20_25°C顯色I(xiàn)Omin ；(9)終止反應(yīng)加入2M的H2SO4終止液終止反應(yīng)，50 μ L/孔，并于酶標(biāo)儀上讀取 OD450 值。
判定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)陽性血清OD值及P/N ^ 2. 1，確定包被原最佳包被稀釋度為 1 28000 (濃度為0. 1 μ g/ml)?？乖?、抗體的最佳工作濃度見表1。
抗原稀釋 度抗體稀釋度1: 8001: 16001: 32001: 64001: 128001: 256001: 20001. 65851. 66751. 5891. 5551. 45351. 2971: 40001. 6241. 48351. 431. 36151. 30951. 05351: 80001. 491. 40051. 3561. 1331. 05950. 8211: 160001. 32451. 1991. 0660. 92450. 7210. 50051: 320000. 93350. 8730. 7520. 54950. 4140. 29751: 64000. 5770. 50. 4650. 3120. 2270. 1711: 128000. 3190. 2740. 24750. 1890. 13850. 111陰性0. 1850. 1420. 1270. 1210. 1460. 191空白0. 1640. 1690. 1160. 1170. 1280. 143表 1該步驟中建立間接競爭ELISA法的步驟如下(1)包被用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液將包被原稀釋到合適濃度，加入酶標(biāo)板中， 100 μ L/孔，包被過夜；(2)洗滌甩凈包被液，洗滌液是含1%。吐溫的pH7. 4的PBS，用洗板機(jī)洗板3次， 并在吸水紙上拍干；(3)封閉每孔加入200 μ L的BSA封閉液，37°C孵育Ih ；(4)洗滌同上；(5)加樣先將相鄰兩孔酶標(biāo)板孔內(nèi)加入稀釋液，50 μ L/孔，與此兩孔相鄰的孔內(nèi) 加入適當(dāng)濃度的氟喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，50 μ L/孔，最后加入稀釋好的抗體，50 μ L/孔，酶 標(biāo)板稍作震蕩混勻，37°c孵育Ih ；(6)洗滌同上；(7)酶標(biāo)二抗加入羊抗鼠-HRP，100 μ L/孔，37°C孵育lh，洗滌同上；(8)顯色每孔加入100 μ L的TMB顯色液，20_25°C顯色I(xiàn)Omin ；(9)終止反應(yīng)加入2mol/L的H2SO4終止液終止反應(yīng)，50 μ L/孔，并于酶標(biāo)儀上讀 取 OD45tl 值。判定標(biāo)準(zhǔn)首先，從肉眼可以看出，抑制孔與未抑制孔顏色的變化，若抑制孔顏色 較淺或者無色，說明有特異性抗體產(chǎn)生，反之則無特異性抗體產(chǎn)生。其次，根據(jù)OD值可以判
6定，抑制孔OD值小于未抑制孔OD值，說明有特異性抗體產(chǎn)生。采用有抑制效果血清的免疫 小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，并篩選出能分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株。抗體特異性的強(qiáng)弱可根據(jù)競爭抑制率的大小來判定。競爭抑制率=1-B/B0 (B為加競爭物的抑制孔OD值，BO為不加競爭物的陽性對照 孔OD值)。e.制備并純化單克隆抗體，效價(jià)測定首先制備和鑒定單克隆抗體細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即于37°C水浴中融化， 之后移入培養(yǎng)皿內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。其中，凍存管內(nèi)凍存的 是對數(shù)生長期的能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4G11。用滅菌石蠟免疫Balb/c小鼠，7天后小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞4G11，注射劑量為 5 X IO6個(gè)/只，7-10天采集腹水，得到單克隆抗體，命名為4G11’。然后純化單克隆抗體(以下簡稱單抗)用辛酸_硫酸銨鹽析法對上述腹水進(jìn)行 處理，具體步驟如下(1)取1倍體積的腹水，加入4倍體積的NaAC-HAc緩沖液；(2)按每ml腹水加入10-50%的辛酸的量，加好后，室溫于搖床上搖30min，之后 4°C靜置3h ；(3)以 12000rpm 轉(zhuǎn)速離心 30min,取上清，用 NaOH 調(diào) pH 至 7. 4 ；(4)向上清中加等體積的飽和硫酸銨溶液，靜置，之后12000rpm離心IOmin ；(5)棄上清，用適量的PBS懸浮沉淀；(6)將單抗懸液透析12h ；(7)透析后的單抗做進(jìn)一步純化，液相柱層析洗脫緩沖液為20mM Tris-HCL, IM NaCL, ρΗ8. 6，lml/ 管收集單抗。(8)純化后的單抗進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測其純度。利用紫外分光光度計(jì)測定其濃 度，效價(jià)，分裝，低溫保存；(9)單抗效價(jià)的測定以0. 1 μ g/ml的包被原NOR-OVA包被ELISA板，將純化的 4G11，單抗進(jìn)行 1 2000，1 4000，1 8000，1 16000，1 32000，1 64000，1 128000 稀釋，加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，反應(yīng)后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，最后用TMB顯色，4G11’的效價(jià) 測定結(jié)果見表3。
表 3陽性判定標(biāo)準(zhǔn)P/N彡2. 14G11，抗體檢測結(jié)果當(dāng)純化抗體濃度為lmg/ml時(shí)，效價(jià)可達(dá)1. 28 X IO5以上；(10)單克隆抗體親和力的測定根據(jù)Gosling介紹的ELISA方法進(jìn)行抗體親和力的測定，其親和力的大小用親和
常數(shù)Ka的大小來表示，公式為 γ— = K4 {1 V)
Ct親和常數(shù)的單位為濃度的倒數(shù)，即克分子濃度(L/moL)，其值越高表示抗原抗體 結(jié)合的緊密程度越高。其檢測過程如下第一步、確定抗原，抗體最佳作用濃度1、將人工抗原分別進(jìn)行 13000，26000, 52000,104000, 208000，416000 倍稀釋后各 包被4條，1OOL/孔，37 °C，溫育2h，洗滌、封閉；2、將抗體進(jìn)行 7500，15000，30000，60000，120000，240000，480000 倍稀釋，分別加 于2條中，100L/孔，室溫溫育Ih ；3、將這兩條中的抗體分別移入第二條中，室溫溫育Ih ；4、將這兩條洗滌加酶標(biāo)二抗，繼續(xù)做ELISA，最后測定OD值A(chǔ)l ；5、后兩條按上述步驟，最后測定OD值A(chǔ)2。
A1(C) — A2 (C)6、根據(jù)公式f 二
A1(C)
計(jì)算f值，選取所有f值都小于10 %的抗原，抗體稀釋度，根據(jù)OD值大小確定最佳 抗原濃度為208000倍稀釋，最佳抗體濃度為120000倍稀釋。第二步、測定親和力1、配制一系列濃度抗原6個(gè)；2、在加有最佳濃度抗體的EP管內(nèi)加入等量系列濃度抗原，共7管，最后一管加入 抗原稀釋液，室溫下過夜；3、同時(shí)將抗原進(jìn)行208000倍稀釋后進(jìn)行包被，室溫下過夜，洗板，封閉；4、將第二步的反應(yīng)產(chǎn)物取IOOyL加入以上封閉的板孔內(nèi)，室溫下進(jìn)行ELISA，最 后測定OD值A(chǔ) ；5、根據(jù)Scatchard公式^ =尺,(1 - F)計(jì)算其斜率值，
α其中，α為游離抗原的濃度，V為結(jié)合抗體位點(diǎn)與總抗體位點(diǎn)的比，所得親和力 的大小即親和常數(shù)Ka，為斜率值的負(fù)數(shù)。得到的結(jié)果是單克隆抗體4G11’的親和力為
1. 2*1010o實(shí)施例二藥物交叉反應(yīng)試驗(yàn)按實(shí)施例一中建立的單抗篩選間接競爭ELISA方法進(jìn)行，諾氟沙星的單克隆抗體 與諾氟沙星半抗原結(jié)構(gòu)類似物如鹽酸環(huán)丙沙星，氧氟沙星，甲磺酸達(dá)氟沙星，甲磺酸培氟沙 星，鹽酸二氟沙星，恩諾沙星，洛美沙星進(jìn)行競爭試驗(yàn)，將這些標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成不同濃度進(jìn)行 間接競爭ELISA，繪制抑制曲線，計(jì)算競爭物的IC5tl值和交叉反應(yīng)率，結(jié)果顯示本抗體除了 與甲氧磺酸達(dá)氟沙星和洛美沙星交叉反應(yīng)率較低以外，與其他所測的5種氟喹諾酮類藥物 均有較高的交叉反應(yīng)率，具體結(jié)果見表4。
種類% CR種類% CR諾氟沙星100%鹽酸環(huán)丙沙星23. 4%甲氧磺酸培氟 沙星120%鹽酸二氟沙星0. 03%氧氟沙星79. 7%沙拉沙星1. 66%恩諾沙星25. 0%甲氧磺酸達(dá)氟沙星82. 1%表4實(shí)施例三本實(shí)施例是本發(fā)明中單克隆抗體4G11’在建立檢測諾氟沙星殘留ELISA方法的應(yīng) 用舉例，可以用于雞肉，水產(chǎn)品，牛奶及蜂蜜中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測。以雞肉(市場 購買)為例，說明檢測雞肉中氟喹諾酮類藥物殘留的主要步驟如下
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1、樣品前處理稱取15g雞肉樣品進(jìn)行勻漿，稱取0. 5g勻漿液，加入1. 5ml樣品提 取液，震蕩混勻，離心，取100 μ L上清與900 μ L樣品稀釋液混勻，取50 μ L進(jìn)行檢測。2、本發(fā)明中試劑盒的檢測原理是間接競爭ELISA方法，將包被原NOR-OVA包被于 微孔板上，分別加入50 μ L的10，5，2. 5，1. 25，0. 625和0. 313ng/ml的諾氟沙星或者樣品， 再加入50 μ L抗氟喹諾酮類藥物的單克隆抗體4G11’，樣品中殘留的氟喹諾酮類藥物與包 被的抗原同時(shí)與抗氟喹諾酮類藥物的抗體競爭性結(jié)合，然后加入IOOyL酶標(biāo)二抗，TMB顯 色，顯色后在酶標(biāo)儀上讀取OD45tl，樣品中氟喹諾酮類藥物的含量與樣本吸光度值呈負(fù)相關(guān)， 與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，當(dāng)OD值低于提供的參考值時(shí)可判定樣品中含有的氟喹諾酮類藥物超過 檢測限。實(shí)施例四本實(shí)施例是本發(fā)明中的單克隆抗體4G11’在制備諾氟沙星殘留的膠體金試紙條中 的應(yīng)用舉例，主要是應(yīng)用于檢測肌肉(雞肉，魚肉，豬肉)、牛奶、蜂蜜中的氟喹諾酮類藥物 殘留。反應(yīng)原理采用競爭法對氟喹諾酮類藥物進(jìn)行半定量檢測，樣品中存在的氟喹諾酮 類藥物分子在沿試紙條上移過程中先與金顆粒標(biāo)記的抗體4G11’結(jié)合，固定在NC膜上的包 被原與氟喹諾酮類藥物同時(shí)競爭結(jié)合金標(biāo)抗體，T線的顯色強(qiáng)弱與樣品中殘留氟喹諾酮類 藥物的含量成反比，若樣品中無氟喹諾酮類藥物殘留，則金標(biāo)抗體全部與包被原反應(yīng)，試紙 條的T線顯色。當(dāng)C、T線均顯色時(shí)表示陰性，當(dāng)C線顯色T線不顯色時(shí)則表示為陽性，當(dāng)C 線不顯色，T線顯色或不顯色都表示試紙條失效。(1)具體操作步驟如下1、樣品前處理本方法中各種樣品的處理方法同ELISA方法中的樣品前處理方 法；2、將試紙條放于干凈平整的臺面上，用滴管吸取待測樣品溶液，滴加1 2滴于樣 品墊上；3、等待紫紅色條帶的出現(xiàn)，靜置反應(yīng)5-10分鐘時(shí)讀取測試結(jié)果，10分鐘以后判定無效。除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形 成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。參考文獻(xiàn)1 > Greg T. Hermanson. Bioconjugate techniques. AcademicPress, 2008 216-219.2、楊利國，《酶免疫測定技術(shù)》，南京大學(xué)出版社，1998.3.Gary C. Howard. Making and Using Antibodies :A PracticalHandbook. CRC Press,2006. 127—130.
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權(quán)利要求
一種產(chǎn)生氟喹諾酮類藥物的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4G11，是小鼠雜交瘤細(xì)胞系CGMCC No.3572。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株4G11產(chǎn)生的單克隆抗體4G11’。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述單克隆抗體4G11’，其特征在于所述單克隆抗體亞型為IgGl型。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述單克隆抗體4G11’的制備方法，包括以下步驟a.制備免疫原和包被原采用碳二亞胺法將封閉后的載體蛋白與諾氟沙星偶聯(lián)，合成 免疫原和包被原；b.動物免疫注射以Balb/c鼠作為免疫動物，腹腔注射免疫原免疫，首次免疫后進(jìn)行 2-3次加強(qiáng)免疫；c.篩選動物免疫血清用間接酶聯(lián)免疫吸附法和競爭間接酶聯(lián)免疫吸附法篩選免疫 鼠血清；d.制備雜交瘤細(xì)胞取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，經(jīng)過亞克隆獲 得可以穩(wěn)定分泌抗氟喹諾酮類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株4G11 ；e.制備并純化單克隆抗體對小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞4G11，采集腹水，以及腹水的 液相層析純化，獲得氟喹諾酮類藥物單克隆抗體4G11’。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述單克隆抗體4G11’的制備方法，其特征在于所述步驟a中 所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白或卵清白蛋白的至少一種，對應(yīng)的免疫原為 N0R-BSA，包被原為NOR-OVA ；所述碳二亞胺法中，載體蛋白封閉2_4小時(shí)，交聯(lián)劑活化載體 蛋白的時(shí)間為1-2小時(shí)，用諾氟沙星與載體蛋白偶聯(lián)反應(yīng)8-10小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述單克隆抗體4G11’的制備方法，其特征在于所述步驟b中的 各次免疫注射劑量為50-100 μ g/只。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述單克隆抗體4G11’的制備方法，其特征在于所述步驟e中對 免疫小鼠腹腔進(jìn)行單克隆抗體細(xì)胞株的注射量為(1-5) X IO6個(gè)/只。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述單克隆抗體4G11’在檢測氟喹諾酮類藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種單克隆抗體、其制備方法及應(yīng)用，尤其是氟喹諾酮類藥物的單克隆抗體及其應(yīng)用，屬于免疫化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的氟喹諾酮類藥物單克隆抗體4G11’是由小鼠雜交瘤細(xì)胞株4G11產(chǎn)生，其亞型是IgG1型。本發(fā)明的有益效果是通過小鼠雜交瘤細(xì)胞株4G11產(chǎn)生的單克隆抗體4G11’與多種氟喹諾酮類藥物交叉反應(yīng)率高，能夠大量生產(chǎn)，可用于制備檢測氟喹諾酮類藥物的酶聯(lián)免疫分析法試劑盒和膠體金試紙條，達(dá)到快速且靈敏地檢測牛奶，肌肉及水產(chǎn)品中的氟喹諾酮類藥物殘留的目的，為檢測多種氟喹諾酮類藥物殘留的試劑盒研制打下基礎(chǔ)。
文檔編號C12N5/20GK101921731SQ201010017960
公開日2010年12月22日 申請日期2010年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月19日
發(fā)明者倪同浩, 唐宏, 夏文靜, 尹麗梅, 崔迎利, 戴威, 楊利, 林紀(jì)昀, 汪紀(jì)宗, 王文, 王曉艷, 郁靚, 韓曉娟 申請人:泰州康正生物技術(shù)有限公司