專(zhuān)利名稱(chēng)：鏈親和素/白細(xì)胞介素7融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及來(lái)源于動(dòng)物的多肽，特別是白 細(xì)胞介素-7。
背景技術(shù)：
白細(xì)胞介素-7(Interleukin-7，IL-7)是基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的、調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和巨噬 細(xì)胞分化、增殖和活化的細(xì)胞因子。主要作用是促進(jìn)前B細(xì)胞的生長(zhǎng)，其不僅是T、B淋巴 細(xì)胞分化成熟過(guò)程中的重要生長(zhǎng)因子，還是多能干細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞的移動(dòng)因子，同時(shí)， IL-7還能促進(jìn)T細(xì)胞功能，誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子。因此，IL-7具有抗腫瘤 和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用。IL-7基因用來(lái)修飾腫瘤細(xì)胞，制備腫瘤細(xì)胞疫苗，以增強(qiáng)腫 瘤抗原的免疫原性。通過(guò)原位基因轉(zhuǎn)染(或轉(zhuǎn)導(dǎo))在腫瘤病灶局部實(shí)現(xiàn)IL-7持續(xù)有效表 達(dá)的治療策略，已在表淺膀胱癌的臨床前研究中顯示出誘人的前景。但是，用基因修飾法制 備腫瘤細(xì)胞疫苗存在如下固有缺陷修飾效率一般都較低(尤其是原位基因轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo))， 并取決于腫瘤細(xì)胞類(lèi)型；因影響因素較多，致使治療基因的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物的有效濃度在 局部難于達(dá)到并較長(zhǎng)時(shí)間地維持，從而實(shí)際抗腫瘤的臨床效果非常有限；因個(gè)體差異和獲 得腫瘤標(biāo)本時(shí)腫瘤細(xì)胞的成活狀態(tài)不一致，往往有些病人因無(wú)法提供成活狀態(tài)較好的腫瘤 細(xì)胞，最終不能制成自體腫瘤細(xì)胞疫苗；往往有潛在的病毒載體安全性問(wèn)題(所謂“遺傳毒 性”)和免疫原性問(wèn)題(反復(fù)使用同一病毒載體會(huì)影響導(dǎo)入基因的表達(dá)效率)；很難同時(shí)高 效表達(dá)多個(gè)具有協(xié)同作用的免疫刺激因子，并對(duì)它們的表達(dá)量進(jìn)行精確控制。此外，基因修 飾的自體腫瘤細(xì)胞疫苗制備比較費(fèi)時(shí)，不易大規(guī)模開(kāi)展和廣泛使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可以對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行快速表面修飾并能夠 永久地錨定在腫瘤細(xì)胞表面的新型白細(xì)胞介素_7。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細(xì)胞介素_7構(gòu)成，其中所 述的接頭肽的氨基酸序列為 Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser0本發(fā)明融合蛋白中的鏈親和素位于接頭肽的N端或C端；其中鏈親和素位于接頭 肽的N端的融合蛋白(如SEQ NO. 2)的活性和鏈親和素位于接頭肽的C端的融合蛋白(如 SEQ NO. 1)相當(dāng)。本發(fā)明融合蛋白可通過(guò)將鏈親和素基因、白細(xì)胞介素-7基因以及連接所述的鏈 親和素和白細(xì)胞介素_7的接頭多核苷酸通過(guò)基因重組、轉(zhuǎn)化構(gòu)建工程菌表達(dá)獲得，其中基 因重組和轉(zhuǎn)化的方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟識(shí)的技術(shù)。為了便于融合蛋白的分離純化，本發(fā)明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還 可以連接有純化標(biāo)簽，如本發(fā)明融合蛋白SEQ NO. 3的鏈親和素的C端連有組氨酸標(biāo)簽、本發(fā)明融合蛋白SEQ NO. 4的鏈親和素的N端連有組氨酸標(biāo)簽。本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸，該多核苷酸由成熟鏈親和素 cDNA、成熟白細(xì)胞介素-7cDNA 通過(guò) TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGCGGG GGC GGA TCC連接而成；該多核苷酸中成熟鏈親和素cDNA的末端還可以連接有CATCAT CAC CAT CAC CAT。將所述的編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸通過(guò)基因重組插入到原核表達(dá)載體中， 然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌可獲得高效表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的工程菌；所述的原核表達(dá)載體可以是 pET24a 或 pET21a，大腸桿菌為 BL21 (DE3)。本發(fā)明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵體的形式存在，從包涵體中分離純化 蛋白并復(fù)性處理后，即可獲得本發(fā)明融合蛋白。本發(fā)明融合蛋白采用富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽連接白細(xì)胞介素_7和鏈親和 素，此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的 生物活性，使融合蛋白具有鏈親和素和白細(xì)胞介素-7的雙重活性，可通過(guò)鏈親和素與生物 素的強(qiáng)力結(jié)合將白細(xì)胞介素-7錨定在生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，且能在Y射線(xiàn)滅活腫瘤 細(xì)胞表面穩(wěn)定存在，并仍保持白細(xì)胞介素_7的活性。經(jīng)本發(fā)明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預(yù)防和治療腫瘤的作用，本發(fā)明所述 的腫瘤疫苗是將本發(fā)明融合蛋白錨定在生物素化的腫瘤細(xì)胞表面獲得的。另外，融合蛋白 可以直接錨定于生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，直接發(fā)揮抗腫瘤作用。本發(fā)明所述的腫瘤疫苗的制備充分利用了蛋白質(zhì)的氨基(即-NH2)易生物素化以 及生物素與鏈親和素高效而強(qiáng)有力幾乎不可逆的結(jié)合這兩個(gè)特性，先用生物素化試劑將生 物素化學(xué)交聯(lián)到欲修飾的腫瘤細(xì)胞表面，然后本發(fā)明融合蛋白借助鏈親和素與生物素的特 異結(jié)合將白細(xì)胞介素_7迅速永久地錨定在腫瘤細(xì)胞表面，從而使白細(xì)胞介素_7在局部達(dá) 到持續(xù)有效的治療濃度；再者，由于一個(gè)鏈親和素蛋白可結(jié)合四個(gè)生物素，因此本發(fā)明融合 蛋白錨定到腫瘤細(xì)胞的量是可以精確控制的。


圖1是IL 7-L-SA-6His-pET24重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖2是6His-SA-L-IL7_pET24重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖3是融合蛋白IL7-L-SA-6His的SDS-PAGE電泳圖，其中1是分子量標(biāo)準(zhǔn)，2是工 程菌誘導(dǎo)前，3是工程菌誘導(dǎo)后；4是包涵體，5是Ni-NTA柱層析后；6是2-Iminobiotin親 和柱層析后。圖4是用抗IL-7單克隆抗體及熒光標(biāo)記的二抗經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)錨定在生物素化 的B16. FlO表面上本發(fā)明融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，左峰為未修飾的細(xì)胞(陰性對(duì)照)，而 右峰為本發(fā)明融合蛋白錨定修飾的細(xì)胞。圖5是用ConA刺激小鼠胸腺細(xì)胞MTT法對(duì)錨定在生物素化的B16. FlO表面上本發(fā) 明融合蛋白的IL-7進(jìn)行生物活性測(cè)定的結(jié)果，以錨定在生物素化的B16. FlO表面上SA-GFP 為陰性對(duì)照。圖6是接種本發(fā)明腫瘤疫苗后的預(yù)防腫瘤小鼠模型的小鼠存活情況曲線(xiàn)圖，以 SA-GFP修飾的B6. FlO腫瘤細(xì)胞疫苗加單獨(dú)IL7為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，PBS為空白對(duì)照。
圖7是接種本發(fā)明融合蛋白治療小鼠表淺膀胱癌模型的小鼠存活情況曲線(xiàn)圖，以 SA-GFP融合蛋白及單獨(dú)IL7為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，PBS為空白對(duì)照。下面將通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明以及本發(fā)明具有的技術(shù)效果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)所用的材料及設(shè)備如下細(xì)胞株、菌株與質(zhì)粒B16. FlO (鼠黑色素瘤細(xì)胞株)；菌株Str印tomyces avidinii (親和素鏈霉菌，ATCC)，DH5a 和 BL21 (DE3)；原核表達(dá)質(zhì)粒 pET24a(Kanar, Novagen)。主要生化試劑及材料=DNeasy組織試劑盒和質(zhì)粒DNA的制備試劑盒(Qiagen)，寡 核苷酸的合成(Sigma)，Trizol, SuperScript II 逆轉(zhuǎn)錄酶，Platinum Pfx DNA 聚合酶和 T4DNA 連接酶(Invitrogen) ；IL-7 標(biāo)準(zhǔn)品(R&D Systems)，瓊脂糖和 SDS-PAGE (Biorad)； 2-Iminobiotin(Sigma)和 Ni-NTA(Qiagen) ±真 14 ；Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce)和抗 IL-7 單克隆抗體(BD Biosciences Pharmingen)。DNA片段的連接、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選，限制性?xún)?nèi)切酶分析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn) ^^^M^&^^MJCW. (Sambrook J,et al. Molecular Cloning-Α Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 2nd edition, 1989)或廠(chǎng)家提供的產(chǎn)品 說(shuō)明書(shū)；DNA序列分析在大連寶生物工程公司的DNA測(cè)序服務(wù)中心完成。例1融合蛋白IL7-L-SA_6His的制備1、用DNeasy組織試劑盒從親和素鏈霉菌抽提出細(xì)菌的基因組DNA，然后用其作為 模板，通過(guò)Platinum pfx DNA聚合酶進(jìn)行PCR制備成熟鏈親和素cDNA。引物5，GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCGGATCCGCCGACCCCT CCAAGGACTCGAAGGCC 3’ (78nt)禾Π5’ GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3’ (39nt)。反應(yīng)條件變性94°C，2min, 25 個(gè)循環(huán)(94°C，15s — 60°C，15s — 68°C，30s)，最后 68 °C, 5min。2、用Trizol抽提起PHA-活化的外周血淋巴細(xì)胞的總RNA，并以其作為模板，進(jìn)行 RT-PCR 制備成熟 IL-7cDNA。引物5，CGGGATCCCATATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAG 3，(36nt)禾口5， CGGAATTCGTGTTCTTTAGTGCCCATC3， (27nt)反應(yīng)條件變性94°C，2min, 25 個(gè)循環(huán)(94°C，15s — 60°C，15s — 68°C，30s)，最后 68 °C, 5min。3、構(gòu)建 IL7-L-SA-6His_pET21 重組質(zhì)粒制備的IL_7cDNA(不含終止碼，兩端分別含NdeI和EcoRI限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn))和 SA cDNA(不含終止碼，兩端分別含EcoRI和XhoI限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn))，將上述IL-7和SA 基因片段克隆于pET-21a載體中，獲得IL7-L-SA-6His-pET21重組表達(dá)質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖 1所示)。其中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽(15肽)。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析 鑒定，驗(yàn)證其正確無(wú)誤。
5
4、構(gòu)建 IL7-L-SA-6His-pET21/BL21 (DE3)工程菌IL7-L-SA-6His-pET21重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，用含氨芐 霉素的LB平皿篩選。挑取轉(zhuǎn)化平皿上的單菌落接種于加有氨芐霉素(50yg/ml)的LB培 養(yǎng)基中。經(jīng)37°C搖床培養(yǎng)擴(kuò)增至吸光度A600為0. 4 0. 5時(shí)，加入終濃度為0. lmmol/L的 IPTG，37°C誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心(8000gX10min)收獲菌體，將細(xì)胞破碎后用12%的SDS-PAGE 檢測(cè)分析融合蛋白的表達(dá)情況。5、融合蛋白IL7-L-SA_6His的表達(dá)融合蛋白IL7-L-SA_6His在菌體中主要以包涵體的形式存在，其表達(dá)量達(dá)20 30%。6、從包涵體中獲得融合蛋白IL7-L-SA_6Hisa.制備包涵體5克菌體懸于100ml IxPBS中，冰浴中超聲(電流270mA)，30 秒X 10次(每次間隔30秒)；接著于4 °C離心10分鐘(SOOOg)，將沉淀懸浮于IOOml IxPBS(內(nèi)含 4mol/L 尿素，0. 5% Triton X-100, 20mmol/L EDTA)中進(jìn)行漂洗，隨后離心 (IOOOgX 10分鐘)收集沉淀；漂洗兩次后，溶于lOOmmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素(pH 8.0)中，15000gX 15分鐘，取上清液。b. Ni-NTA柱層析將步驟a得到的上清液上樣于Ni-NTA柱(2. 6 X 5cm)，用平衡液 (lOOmmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，pH8. 0)進(jìn)行沖洗至樣品A280恢復(fù)至基線(xiàn)；然后用 洗脫液(100mmol/L磷酸鈉緩沖液，8mol/L尿素，pH4. 5)進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)SDS-PAGE鑒 定，收集融合蛋白質(zhì)峰(融合蛋白IL7-L-SA-6His的分子量為36. 3KD)。c.透析復(fù)性將Ni-NTA柱層析純化獲得的IL7-L-SA_6His融合蛋白調(diào)至0D280 = 0. 2，在大于20倍體積的透析液(100mmol/L NaHC03,1. 0mol/L尿素，lmmol/L還原型谷胱苷 肽，0. 2mmol/L氧化型谷胱苷肽，pH 9. 0)中4°C透析復(fù)性12小時(shí)；然后在50mmol/LNaHC03， 500mmol/LNaCl, pH 11中繼續(xù)透析6小時(shí)；離心除去不溶物，收集上清。d. 2-Iminobiotin 親和柱層析用平衡液(50mmol/L NaHC03, 500mmol/L NaCl，pH 11)洗脫5個(gè)柱體積后(柱體積0.5X2cm)，將收集的已復(fù)性融合蛋白質(zhì)液上親和層析柱， 并用平衡液洗脫至樣品A280恢復(fù)至基線(xiàn)；然后，用50mmol/L NaAc，pH4. 0洗脫，分管收集各 洗脫峰，并用IOx平衡液(500mmOl/LNaHC03，5mOl/LNaCl，pH 11)將收集的融合蛋白質(zhì)液調(diào) 至pH8. 0，并過(guò)濾除菌分裝，儲(chǔ)存于_20°C。所得融合蛋白IL7-L-SA_6His用SDS-PAGE鑒定，結(jié)果如圖3所示。7、利用ConA刺激小鼠胸腺細(xì)胞對(duì)IL_7的活性進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的IL_7活性為 lX106U/mg。例2融合蛋白6His-SA-L_IL7的制備1、制備成熟鏈親和素cDNA 方法與例1同。引物5’ GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG3’ (55nt)禾口5 ’ GGAATTCGGCGGATCCGCCCCCGCCGCTGCCTCCGCCCCCGCTGCCCCCGCTCGTCTGCTGAACGGC GTCGAGCGGGTTGCC 3， (82nt)。2、制備成熟IL_7cDNA 方法與例1同。
引物5， CGGGATCCGATTGTGATATTGAAGGT 3， (26nt)和5， CGCTCGAGTCAGTGTTCTTTAGTGCC 3， (26nt)。3、構(gòu)建 6His-SA-L-IL7_pET24 重組質(zhì)粒制備的SA cDNA(不含終止碼，兩端分別含NdeI和BamHI限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn))和 IL-7cDNA(兩端分別含BamHI和XhoI限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn))，將上述SA和IL-7基因片段克 隆于 pET-24a載體中，獲得6His-SA-L-IL7-pET24重組表達(dá)質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖2所示)。其中L 為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定，驗(yàn)證其正確無(wú)誤。4、構(gòu)建 6His-SA-L-IL7-pET24/BL21 (DE3)工程菌方法與例 1 同。5、融合蛋白6His-SA-L_IL7的表達(dá)融合蛋白6His-SA-L_IL7在菌體中主要以包涵體的形式存在，6His-SA-L_IL7融 合蛋白的分子量為34. 5KD，其表達(dá)量達(dá)20 30%。6、從包涵體中獲得融合蛋白6His-SA-L_IL7 方法與例1同。7、利用ConA刺激小鼠胸腺細(xì)胞對(duì)IL_7的活性進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得的IL_7活性為 lX106U/mg，與 IL7-L-SA-6His 融合蛋白相當(dāng)。例3IL7-L-SA_6His或6His-SA-L_IL7融合蛋白修飾的腫瘤疫苗的制備將IO7 個(gè) B16. FlO 細(xì)胞懸浮在 Iml IXPBS 中，加入 0. 5mg Sulfo-NHS-LC-Biotin 并混勻后，室溫下作用30分鐘；用IXPBS洗滌細(xì)胞3次后，每IO6個(gè)B16. FlO細(xì)胞加入 200ngIL7-L-SA-6His或6His-SA-L-IL7融合蛋白，冰上作用30分鐘；IXPBS洗滌細(xì)胞1次 后，然后用Y射線(xiàn)滅活(20000rad)即可。例4本發(fā)明融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞的修飾效果及其穩(wěn)定性檢測(cè)用抗IL-7單克隆抗體及熒光標(biāo)記的二抗經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)錨定在生物素化的 B16.F10表面上的IL7-L-SA-6His或6His-SA-L_IL7融合蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖4，幾 乎100%的腫瘤細(xì)胞被修飾，且腫瘤細(xì)胞表面有大量的IL-7。對(duì)錨定在腫瘤細(xì)胞表面的 IL7-L-SA-6His融合蛋白的穩(wěn)定性經(jīng)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析表明，在一周內(nèi)這些錨定的融合 蛋白在細(xì)胞表面的數(shù)量無(wú)顯著下降。例5對(duì)錨定在生物素化的B16. FlO表面上的本發(fā)明融合蛋白進(jìn)行IL_7生物活性 的測(cè)定首先將表面已錨定了 IL7-L-SA-6His或6His-SA-L-IL7融合蛋白的IO6個(gè)B16. FlO經(jīng)超聲破碎，離心收集其不溶的膜性成分；然后將其懸浮于100 μ 1完全培養(yǎng)基中，用 ConA刺激小鼠胸腺細(xì)胞MTT法對(duì)其中的IL-7進(jìn)行生物活性測(cè)定，結(jié)果如圖5所示，活化的 淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖依賴(lài)于已錨定修飾細(xì)胞的不溶膜性成分的劑量，表明IL7-L-SA-6His 或6His-SA-L-IL7融合蛋白錨定在細(xì)胞表面后仍然能保持IL-7的生物活性。例6本發(fā)明融合蛋白修飾的B6. FlO腫瘤細(xì)胞疫苗預(yù)防腫瘤的效果(1)材料本發(fā)明腫瘤疫苗制備方法見(jiàn)實(shí)施例3 ；SA-GFP(即綠色熒光蛋白和鏈親和素的融 合蛋白)修飾的、Y射線(xiàn)滅活(20000rad)的B6. FlO腫瘤細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。(2)方法
分別將IO6個(gè)SA-GFP修飾的、Y射線(xiàn)滅活(20000rad)的B6. FlO腫瘤細(xì)胞以及本 發(fā)明腫瘤疫苗接種于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內(nèi)，14天后加強(qiáng)一次；7天后，將IO5未經(jīng) 任何處理的B6. FlO腫瘤細(xì)胞接種于小鼠右肋腹部的皮下，然后觀(guān)察腫瘤的生長(zhǎng)情況和小 鼠在40天內(nèi)的成活情況(3)結(jié)果有20%的免疫小鼠獲得100%的保護(hù)(即無(wú)腫瘤生長(zhǎng))，陰性對(duì)照組全部有腫瘤生 長(zhǎng)(圖6)。同時(shí)，本發(fā)明腫瘤疫苗的預(yù)防接種組的生存數(shù)及生存期顯著高于GFP修飾的陰 性對(duì)照組(圖7)。例7本發(fā)明融合蛋白治療小鼠表淺膀胱癌的效果。(1)材料見(jiàn)實(shí)施例6。(2)方法制備小鼠表淺膀胱癌模型，攻擊所用MB49細(xì)胞數(shù)量為1 X IO6,攻擊后第三天，開(kāi)始 治療。腹腔注射麻醉小鼠，膀胱插管，灌注IOOul lmg/ml活化生物素，保留30分鐘，然后應(yīng) 用PBS沖洗3遍，灌注0. 15mg/ml的SA-IL7治療，同時(shí)應(yīng)用SA-GFP或IL7為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，PBS 為陰性對(duì)照，保留1小時(shí)。治療每周2次，共治療3周。然后觀(guān)察腫瘤的生長(zhǎng)情況和小鼠的
存活情況。
(3)結(jié)果
如圖7所示，本發(fā)明融合蛋白治療組的生存數(shù)及生存期顯著高于陰性對(duì)照組。
SEQUENCE LISTING
<110>溫州醫(yī)學(xué)院
<120>鏈親和素/白細(xì)胞介素7融合蛋白
<160>4
<170>PatentIn version 3. 5
<210>1
<211>327
<212>PRT
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>人工序列
<220>
<221>CHAIN
<222>⑴·· (153)
<223>人成熟IL-7
<220>
<221>D0MAIN
<222>(156). . (170)
<223>甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽(L)，此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元
蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白的雙重活性。
<220>
<221>CHAIN
<222>(180)..(327)
<223>鏈親和素(SA)
<400>1
MetAspCysAsplieGluGlyLysAspGlyLysGlnTyrGluSerVal
151015
LeuMetValSerlieAspGlnLeuLeuAspSerMetLysGlulieGly
202530
SerAsnCysLeuAsnAsnGluPheAsnPhePheLysArgHislieCys
354045
AspAlaAsnLysGluGlyMetPheLeuPheArgAlaAlaArgLysLeu
505560
ArgGlnPheLeuLysMetAsnSerThrGlyAspPheAspLeuHisLeu
65707580
LeuLysValSerGluGlyThrThrlieLeuLeuAsnCysThrGlyGln
859095
ValLysGlyArgLysProAlaAlaLeuGlyGluAlaGlnProThrLys
100105110
SerLeuGluGluAsnLysSerLeuLysGluGlnLysLysLeuAsnAsp
115120125
LeuCysPheLeuLysArgLeuLeuGlnGlulieLysThrCysTrpAsn
130135140
LyslieLeuMetGlyThrLysGluHisGluPheSerSerGlyGlySer
145150155160
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerProTrpProHisHisHis
165170175
HisHisHisGluAlaGlylieThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGly
180185190
SerThrPhelieValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThr
195200205
TyrGluSerAlaValGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGly
210215220
ArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGly
225230235240
TrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThr
245250255
ThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArglieAsnThr
260265270
GlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSer
90146]2752802850147]Thr Leu Val GlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAla0148]2902953000149]Ser lie Asp AlaAlaLysLysAla GlyValAsnAsnGlyAsnProLeu0150]3053103153200151]Asp Ala Val GlnGlnlieGlu0152]3250153]<210>20154]<211>3140155]<212>PRT0156]<213>ArtificialSequence0157]<220>0158]<223>人工序列0159]<220>0160]<221>CHAIN0161]<222>(1). . (147)0162]<223>鏈親和素0163]<220>0164]<221>D0MAIN0165]<222>(148). . (162)0166]<223>連接肽，并且其3’端含有BamHI的酶切位點(diǎn)O0167]<220>0168]<221>CHAIN0169]<222>(163).. (314)0170]<223>人成熟IL7)0171]<400>20172]Met Glu Ala GlylieThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGlySerThr0173]1510150174]Phe lie Val ThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThrTyrGlu0175]2025300176]Ser Ala Val GlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGlyArgTyr0177]3540450178]Asp Ser Ala ProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeuGlyTrpThr0179]5055600180]Val Ala Trp LysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThrThrTrp0181]657075800182]Ser Gly Gln TyrValGlyGlyAlaGluAlaArglieAsnThrGlnTrp0183]8590950184]Leu Leu Thr SerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSerThrLeu
100185]1001051100186]Val Gly HisAspThrPheThrLysValLysProSerAlaAlaSerlie0187]1151201250188]Asp Ala AlaLysLysAlaGlyValAsnAsnGlyAsnProLeuAspAla0189]1301351400190]Val Gln GlnSerSerGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly0191]1451501551600192]Gly Ser AspCysAsplieGluGlyLysAspGlyLysGlnTyrGluSer0193]1651701750194]Val Leu MetValSerlieAspGlnLeuLeuAspSerMetLysGlulie0195]1801851900196]Gly Ser AsnCysLeuAsnAsnGluPheAsnPhePheLysArgHislie0197]1952002050198]Cys Asp AlaAsnLysGluGlyMetPheLeuPheArgAlaAlaArgLys0199]2102152200200]Leu Arg GlnPheLeuLysMetAsnSerThrGlyAspPheAspLeuHis0201]2252302352400202]Leu Leu LysValSerGluGlyThrThrlieLeuLeuAsnCysThrGly0203]2452502550204]Gln Val LysGlyArgLysProAlaAlaLeuGlyGluAlaGlnProThr0205]2602652700206]Lys Ser LeuGluGluAsnLysSerLeuLysGluGlnLysLysLeuAsn0207]2752802850208]Asp Leu CysPheLeuLysArgLeuLeuGlnGlulieLysThrCysTrp0209]2902953000210]Asn Lys lieLeuMetGlyThrLysGluHis0211]3053100212]<210>30213]<211>3330214]<212>PRT0215]<213>ArtificialSequence0216]<220>0217]<223>人工序列0218]<220>0219]<221>CHAIN0220]<222>⑴·· (153)0221]<223>人成熟IL〃 的 cDNA0222]<220>0223]<221>D0MAIN
<222>(156). . (170)<223>富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽(L)，此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各 單元蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白的雙重活性。<220>
<221>CHAIN
<222>(180)..(327)
<223>鏈親和素。
<220>
<221>PEPTIDE
<222>(328)..(333)
<223> 組氨酸標(biāo)簽
<400>3
MetAspCysAsplieGluGlyLysAspGlyLysGlnTyrGluSerVal
151015
LeuMetValSerlieAspGlnLeuLeuAspSerMetLysGlulieGly
202530
SerAsnCysLeuAsnAsnGluPheAsnPhePheLysArgHislieCys
354045
AspAlaAsnLysGluGlyMetPheLeuPheArgAlaAlaArgLysLeu
505560
ArgGlnPheLeuLysMetAsnSerThrGlyAspPheAspLeuHisLeu
65707580
LeuLysValSerGluGlyThrThrlieLeuLeuAsnCysThrGlyGln
859095
ValLysGlyArgLysProAlaAlaLeuGlyGluAlaGlnProThrLys
100105110
SerLeuGluGluAsnLysSerLeuLysGluGlnLysLysLeuAsnAsp
115120125
LeuCysPheLeuLysArgLeuLeuGlnGlulieLysThrCysTrpAsn
130135140
LyslieLeuMetGlyThrLysGluHisGluPheSerSerGlyGlySer
145150155160
GlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerProTrpProHisHisHis
165170175
HisHisHisGluAlaGlylieThrGlyThrTrpTyrAsnGlnLeuGly
180185190
SerThrPhelieValThrAlaGlyAlaAspGlyAlaLeuThrGlyThr
195200205
TyrGluSerAlaValGlyAsnAlaGluSerArgTyrValLeuThrGly[0262210215220[0263Arg Tyr AspSerAlaProAlaThrAspGlySerGlyThrAlaLeu Gly[0264225230235240[0265Trp Thr ValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAlaHisSerAlaThr[0266245250255[0267Thr Trp SerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAlaArglieAsnThr[0268260265270[0269Gln Trp LeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsnAlaTrpLysSer[0270275280285[0271Thr Leu ValGlyHisAspThrPheThrLysValLysProSerAla Ala[0272290295300[0273Ser lie AspAlaAlaLysLysAlaGlyValAsnAsnGlyAsnProLeu[0274305310315320[0275Asp Ala ValGlnGlnlieGluHisHisHisHisHisHis[0276325330[0277<210>4[0278<211>320[0279<212>PRT[0280<213>ArtificialSequence[0281<220>[0282<223>人工序列[0283<220>[0284<221>PEPTIDE[0285<222>(2). . (7)[0286<223>組氨酸標(biāo)簽[0287<220>[0288<221>CHAIN[0289<222>(8). . (153)[0290<223>鏈親和素[0291<220>[0292<221>D0MAIN[0293<222>(154)..(168)[0294<223>連接肽，并且其3’端含有BamHI的酶切位點(diǎn)O[0295<220>[0296<221>CHAIN[0297<222>(169)..(320)[0298<223>人成熟IL7[0299<400>4[0300Met His His His His His His Glu Ala GlylieThrGlyThrTrpTyr[0301151015[0302AsnGlnLeuGlySerThrPhelieValThrAlaGlyAlaAspGlyAla[0303202530[0304LeuThrGlyThrTyrGluSerAlaValGlyAsnAlaGluSerArgTyr[0305354045[0306ValLeuThrGlyArgTyrAspSerAlaProAlaThrAspGlySerGly[0307505560[0308ThrAlaLeuGlyTrpThrValAlaTrpLysAsnAsnTyrArgAsnAla[030965707580[0310HisSerAlaThrThrTrpSerGlyGlnTyrValGlyGlyAlaGluAla[0311859095[0312ArglieAsnThrGlnTrpLeuLeuThrSerGlyThrThrGluAlaAsn[0313100105110[0314AlaTrpLysSerThrLeuValGlyHisAspThrPheThrLysValLys[0315115120125[0316ProSerAlaAlaSerlieAspAlaAlaLysLysAlaGlyValAsnAsn[0317130135140[0318GlyAsnProLeuAspAlaValGlnGlnSerSerGlyGlySerGlyGly[0319145150155160[0320GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerAspCysAsplieGluGlyLysAsp[0321165170175[0322GlyLysGlnTyrGluSerValLeuMetValSerlieAspGlnLeuLeu[0323180185190[0324AspSerMetLysGlulieGlySerAsnCysLeuAsnAsnGluPheAsn[0325195200205[0326PhePheLysArgHislieCysAspAlaAsnLysGluGlyMetPheLeu[0327210215220[0328PheArgAlaAlaArgLysLeuArgGlnPheLeuLysMetAsnSerThr[0329225230235240[0330GlyAspPheAspLeuHisLeuLeuLysValSerGluGlyThrThrlie[0331245250255[0332LeuLeuAsnCysThrGlyGlnValLysGlyArgLysProAlaAlaLeu[0333260265270[0334GlyGluAlaGlnProThrLysSerLeuGluGluAsnLysSerLeuLys[0335275280285[0336GluGlnLysLysLeuAsnAspLeuCysPheLeuLysArgLeuLeuGln[0337290295300[0338GlulieLysThrCysTrpAsnLyslieLeuMetGlyThrLysGluHis[0339305310315320
權(quán)利要求
一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細(xì)胞介素 7構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的N端。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ.NO 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的C端。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的的鏈親和素部分的末端連接有 純化標(biāo)簽。
6.一種基因，該基因編碼權(quán)利要求1、2、3或4融合蛋白。
7.—種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求5所述的基因。
8.—種工程菌，該工程菌轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。
9.權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合蛋白在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
10.一種腫瘤疫苗，該腫瘤疫苗是將權(quán)利要求1、2、3或4所述的融合蛋白錨定到經(jīng)過(guò)生 物素化的腫瘤細(xì)胞的表面獲得的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一白細(xì)胞介素-7構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer。本發(fā)明融合蛋白同時(shí)具有鏈親和素和白細(xì)胞介素-7的活性，可通過(guò)鏈親和素與生物素的強(qiáng)力結(jié)合將白細(xì)胞介素-7錨定在生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，且能在γ射線(xiàn)滅活腫瘤細(xì)胞表面穩(wěn)定存在，并仍保持白細(xì)胞介素-7的活性。經(jīng)本發(fā)明融合蛋白表面修飾的腫瘤疫苗具有預(yù)防和治療腫瘤的作用，可用于制備預(yù)防和治療腫瘤的疫苗。
文檔編號(hào)C12R1/19GK101942020SQ20101000337
公開(kāi)日2011年1月12日 申請(qǐng)日期2010年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月16日
發(fā)明者張振, 許曉玲, 高基民 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院