專利名稱：：用于減小核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的分散的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增核酸的方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于擴(kuò)增核酸的方法，其特征在于聚合酶反應(yīng)通過利用DNA聚合酶溫育反應(yīng)溶液來進(jìn)行。
背景技術(shù)：
：在分子生物學(xué)研究中，核酸的擴(kuò)增通常通過使用DNA聚合酶的酶促方法進(jìn)行。作為用于擴(kuò)增核酸的方法，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)已被廣泛已知。為了擴(kuò)增目的靶核酸序列，PCR法包括以下三個(gè)步驟變性作為模板使用的雙鏈DNA以將其轉(zhuǎn)變?yōu)閱捂淒NA的步驟(變性步驟)；針對(duì)所述單鏈DNA將引物退火的步驟(退火步驟)；和利用引物作為起點(diǎn)延伸互補(bǔ)鏈的步驟(延伸步驟)。在一般的PCR法中，使用熱循環(huán)儀，且變性步驟、退火步驟和延伸步驟以不同的溫度進(jìn)行。然而，所述以3種不同類型的溫度進(jìn)行的核酸擴(kuò)增反應(yīng)需要復(fù)雜的溫度控制。而且，PCR法也已經(jīng)引起一些問題，因?yàn)殡S著循環(huán)次數(shù)的增力Π，時(shí)間損失也增加。在前述情況下，已經(jīng)開發(fā)了可以在等溫條件下進(jìn)行的核酸擴(kuò)增方法。這樣的核酸擴(kuò)增方法的實(shí)例包括RCA(滾環(huán)循環(huán)擴(kuò)增Pr0C.Natl.Acad.Sci(國家科學(xué)院學(xué)報(bào))，卷92，4641-4645(1995))，ICAN(等溫和嵌合引物起始的核酸擴(kuò)增)，LAMP(環(huán)-介導(dǎo)的等溫DNA擴(kuò)增；BioIndustry(生物工業(yè))，卷18，第2期(2001))，NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增法；Nature(自然)，350，91-(1991))，和TMA(轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增法J.ClinMicrobiol(臨床微生物學(xué)雜志).卷31，3270-(1993))。SDA法(日本專利公開(Kokai)號(hào)5-130870A(1993))是使用核酸外切酶的循環(huán)測(cè)定法，其是一種用于利用聚合酶延伸反應(yīng)擴(kuò)增靶核酸片段的目的位點(diǎn)的擴(kuò)增方法。這是一種利用與靶核酸片段的所述目的位點(diǎn)特異性雜交的引物作為起點(diǎn)進(jìn)行聚合酶延伸反應(yīng)，并同時(shí)，容許5’一3’核酸外切酶在其上作用，從而從反向降解引物的方法。代替降解的引物，新引物與該位點(diǎn)雜交，并再用DNA聚合酶進(jìn)行延伸反應(yīng)。連續(xù)周期性重復(fù)這種使用聚合酶的延伸反應(yīng)和隨后的使用核酸外切酶解離延伸的鏈的降解反應(yīng)。于此，使用聚合酶的延伸反應(yīng)和使用核酸外切酶的降解反應(yīng)可以在等溫條件下進(jìn)行。然而，在該方法中，應(yīng)該使用了核酸外切酶以及聚合酶。因此，這需要高成本，且還需要設(shè)計(jì)引物的裝置。LAMP方法是擴(kuò)增靶核酸片段的目的位點(diǎn)的方法，其是近期開發(fā)的。該方法使用互補(bǔ)識(shí)別靶核酸片段的至少6個(gè)特定位點(diǎn)的至少4種類型的引物和不具有5’一3’核酸外切酶活性的鏈置換型BstDNA聚合酶，并在釋放模板上的雙鏈DNA作為單鏈DNA的同時(shí)催化延伸反應(yīng)，以使得可以在等溫條件下將靶核酸片段的目的位點(diǎn)擴(kuò)增為特定結(jié)構(gòu)。然而，應(yīng)該使用了識(shí)別6個(gè)特定位點(diǎn)的至少4種類型的引物，且因此非常難以設(shè)計(jì)所述引物。ICAN法也是用于擴(kuò)增靶核酸片段的目的位點(diǎn)的方法，其是近期開發(fā)的。這是一種在等溫條件下，使用RNA-DNA嵌合引物，具有鏈置換活性和模板交換活性的DNA聚合酶，和RNA酶H的方法。在所述嵌合引物結(jié)合模板后，通過DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈。其后，RNA酶H裂解嵌合引物-來源的RNA部分，并由裂解位點(diǎn)開始，延伸反應(yīng)伴隨鏈置換反應(yīng)和模板交換反應(yīng)發(fā)生。通過重復(fù)該反應(yīng)，擴(kuò)增基因。然而，該方法也需要使用特殊的引物，即嵌合引物，且因此很難設(shè)計(jì)該引物。日本專利公開(Kohyo)號(hào)11_509406A(1999)描述在等溫條件下，通過使目的區(qū)域內(nèi)的DNA在存在具有鏈置換能力的DNA聚合酶的條件下與至少一對(duì)寡核苷酸引物反應(yīng)而對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增的方法。然而，日本專利公開(Kohyo)號(hào)11-509406A(1999)中所述的方法已經(jīng)引起了問題，因?yàn)槠湫枰喈?dāng)長的反應(yīng)時(shí)間。日本專利公開(Kokai)號(hào)2002-233379描述在等溫條件下，通過使目的區(qū)域內(nèi)的DNA在存在具有鏈置換能力的DNA聚合酶的條件下與至少一對(duì)寡核苷酸引物反應(yīng)而對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增的方法。然而，日本專利公開(Kohyo)號(hào)2002-233379中所述的方法已經(jīng)在顯著水平的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物生成方面引起了問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供用于擴(kuò)增核酸的方法，其不要求復(fù)雜的溫度控制且其可以在不使用特殊酶或特殊引物的條件下進(jìn)行。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于擴(kuò)增核酸的方法，其中反應(yīng)中的分散(dispersion)得到抑制。作為針對(duì)實(shí)現(xiàn)前述目的的深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)成功地特異性擴(kuò)增靶核酸序列和進(jìn)一步抑制擴(kuò)增速率的分散，這是通過將反應(yīng)溶液溫育在擴(kuò)增反應(yīng)中高度特異性所必需的溫度(Tl)下，和然后將反應(yīng)溶液溫育在擴(kuò)增反應(yīng)中的高效率所必需的溫度(T2)下進(jìn)行，由此完成本發(fā)明。本發(fā)明提供用于擴(kuò)增核酸的方法，其包括以下步驟(1)和(2)(1)在溫度(Tl)下溫育反應(yīng)溶液的步驟，所述反應(yīng)溶液含有至少一種類型的脫氧核苷酸三磷酸酯，至少一種類型的DNA聚合酶，至少2種類型的寡核苷酸引物，和起模板作用的核酸片段；和(2)在步驟(1)后，在溫度(T2)下溫育所述反應(yīng)溶液的步驟，所述溫度(T2)高于溫度(Tl)并在50°C以上至100°C以下之間。優(yōu)選地，溫度(Tl)在10°C以上至50°C以下之間。優(yōu)選地，溫度(Tl)和溫度(T2)之間的溫度差異在5°C以上。優(yōu)選地，步驟(1)在60分鐘內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選地，步驟⑵在60分鐘內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選地，只有寡核苷酸引物的3’_端區(qū)域與作為模板的核酸片段基本互補(bǔ)。優(yōu)選地，寡核苷酸引物僅在一個(gè)連續(xù)位點(diǎn)處與起模板作用的核酸片段基本互補(bǔ)。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溶液另外包括至少0.01%以上的表面活性劑。優(yōu)選地，所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。優(yōu)選地，所述非離子型表面活性劑選自聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯烷基醚。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溶液還包括二價(jià)陽離子。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溶液還包括解鏈溫度調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選地，所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑是二甲亞砜，甜菜堿，甲酰胺，或甘油，或它們中的兩種以上類型的混合物。優(yōu)選地，所述DNA聚合酶具有鏈置換活性。優(yōu)選地，具有鏈置換活性的聚合酶選自由源自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的5，一3，核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)的5，一3，核酸外切酶缺陷型BcaDNA聚合酶，源自TermococcusIitoralis的5’一3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶，和源自酸熱脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的DNA聚合酶組成的組。按照本發(fā)明，擴(kuò)增靶核酸序列的特異性可以通過在擴(kuò)增反應(yīng)中高度特異性所必需的溫度(Tl)下溫育反應(yīng)溶液，和然后在擴(kuò)增反應(yīng)中高效率所必需的溫度(T2)下溫育反應(yīng)溶液而提高。而且，作為反應(yīng)中提高的特異性的結(jié)果，可以減小檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物所需時(shí)間的分散。此外，按照本發(fā)明，由于靶核酸序列可以在不要求復(fù)雜的溫度控制、不要求使用特殊的酶和復(fù)雜的引物設(shè)計(jì)的條件下擴(kuò)增，所以可以提供以高靈敏度簡(jiǎn)單快速擴(kuò)增核酸的方法。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示關(guān)于CYP2C9基因的實(shí)施例中使用的引物的位置關(guān)系。圖2顯示通過使反應(yīng)溶液A(無步驟(1)的溫育)在60°C反應(yīng)60分鐘和然后進(jìn)行隨時(shí)間熒光檢測(cè)獲得的結(jié)果。圖3顯示通過使反應(yīng)溶液B(有步驟(1)的溫育(11=25°0，10分鐘)在601(=T2)反應(yīng)60分鐘和然后進(jìn)行隨時(shí)間熒光檢測(cè)獲得的結(jié)果。圖4顯示通過使反應(yīng)溶液C(有步驟(1)的溫育(11=25°0，20分鐘)在601(=T2)反應(yīng)60分鐘和然后進(jìn)行隨時(shí)間熒光檢測(cè)獲得的結(jié)果。圖5顯示通過使反應(yīng)溶液D(有步驟(1)的溫育(11=25°0，30分鐘)在601(=T2)反應(yīng)60分鐘和然后進(jìn)行隨時(shí)間熒光檢測(cè)獲得的結(jié)果。圖6顯示通過使用樣品進(jìn)行電泳獲得的結(jié)果，所述樣品是通過使反應(yīng)溶液A(無步驟⑴的溫育)在60°C(=T2)反應(yīng)60分鐘獲得的。圖7顯示通過使用樣品進(jìn)行電泳獲得的結(jié)果，所述樣品是通過使反應(yīng)溶液B(有步驟(1)的溫育(Tl=250C)，10分鐘)在60°C(=T2)反應(yīng)60分鐘獲得的。圖8顯示通過使用樣品進(jìn)行電泳獲得的結(jié)果，所述樣品是通過使反應(yīng)溶液C(有步驟(1)的溫育(Tl=250C)，20分鐘)在60°C(=T2)反應(yīng)60分鐘獲得的。圖9顯示通過使用樣品進(jìn)行電泳獲得的結(jié)果，所述樣品是通過使反應(yīng)溶液D(有步驟(1)的溫育(Tl=250C)，30分鐘)在60°C(=T2)反應(yīng)60分鐘獲得的。具體實(shí)施例方式在下文中，更詳細(xì)地描述本發(fā)明。按照本發(fā)明用于擴(kuò)增核酸的方法包括以下步驟⑴和(2)(1)在溫度(Tl)溫育反應(yīng)溶液的步驟，所述反應(yīng)溶液含有至少一種類型的脫氧核苷酸三磷酸酯，至少一種類型的DNA聚合酶，至少2種類型的寡核苷酸引物，和起模板作用的核酸片段；和(2)在步驟(1)后，在溫度(T2)溫育所述反應(yīng)溶液的步驟，所述溫度(T2)高于溫度(Tl)并在50°C以上至100°C以下。在本發(fā)明中，擴(kuò)增反應(yīng)效率在溫度Tl時(shí)低，且在溫度T2時(shí)高。同時(shí)，重要的是，寡核苷酸引物針對(duì)起模板作用的核酸片段雜交的特異性在溫度Tl時(shí)高。在這樣的條件下，溫度Tl和溫度T2之間的關(guān)系是Tl<T2。優(yōu)選地，溫度Tl和溫度T2之間的差異在5°C以上。更優(yōu)選地，溫度Tl和溫度T2之間的差異在10°C以上。進(jìn)一步優(yōu)選地，溫度Tl和溫度T2之間的差異在20°C以上。溫度T2在50°C以上至100°C以下。另外，溫度Tl不受特別的限制，且其優(yōu)選在10°C以上至50°C以下。優(yōu)選地，步驟(1)在60分鐘內(nèi)進(jìn)行。步驟(1)更優(yōu)選地在5-60分鐘內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選地在10-60分鐘內(nèi)，和更進(jìn)一步優(yōu)選地15-60分鐘內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)選地，步驟(2)在60分鐘內(nèi)進(jìn)行。步驟(2)更優(yōu)選地在5-60分鐘內(nèi)，進(jìn)一步優(yōu)選地在10-60分鐘內(nèi)，和更進(jìn)一步優(yōu)選地15-60分鐘內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的擴(kuò)增方法可以通過任何機(jī)制進(jìn)行，條件是其以溫度(Tl)和以溫度(T2)進(jìn)行。例如，可以僅擴(kuò)增夾在引物之間的區(qū)域。另外，還可以通過經(jīng)由用引物延伸的核酸序列的重組現(xiàn)象來擴(kuò)增高分子量產(chǎn)物。而且，還可以通過經(jīng)由加入到所述引物中的Tag序列的重組現(xiàn)象來擴(kuò)增高分子量產(chǎn)物。以下，將在下文中描述本發(fā)明中使用的成分。(1)脫氧核苷酸三磷酸酯脫氧核苷酸三磷酸酯用作延伸反應(yīng)的底物。具體地，優(yōu)選使用dATP，dCTP，dGTP和dTTP的混合物。脫氧核苷酸三磷酸酯可以包括dNTP的類似物(例如，7-脫氮-dGTP，等)。另外，所述脫氧核苷酸三磷酸酯(dATP，dCTP，dGTP和dTTP的混合物)的終濃度在0.lmM-3.OmM，優(yōu)選0.75mM_3.OmM，更優(yōu)選1.OmM-2.OmM，和特別優(yōu)選1.OmM-1.5mM的范圍內(nèi)。(2)DNA聚合酶在本發(fā)明中，使用具有鏈置換能力的聚合酶。術(shù)語“鏈置換能力”在本說明書中用于意指利用核酸序列作為模板進(jìn)行DNA復(fù)制，同時(shí)置換DNA鏈從而釋放與模板鏈退火的互補(bǔ)鏈的活性；即進(jìn)行鏈置換的活性。所述具有鏈置換能力的聚合酶的具體實(shí)例包括源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的5’一3’核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自熱堅(jiān)芽孢桿菌的5’一3’核酸外切酶缺陷型BcaDNA聚合酶，源自TermococcusIitoralis的5’一3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶，和源自酸熱脂環(huán)酸桿菌的DNA聚合酶，但實(shí)例不僅限于此。所述具有鏈置換能力的聚合酶可以是天然存在的蛋白或通過遺傳工程生成的重組蛋白。(3)二價(jià)陽離子在本發(fā)明中，為了所用酶等的金屬需求而使用二價(jià)陽離子。作為這樣的二價(jià)陽離子，可以使用鎂鹽、鈣鹽、和其他金屬鹽。例如，可以使用氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂等。所述二價(jià)陽離子的終濃度在優(yōu)選lmM-20mM，和更優(yōu)選2mM-10mM的范圍內(nèi)。(4)表面活性劑在本發(fā)明中，可以將表面活性劑加入到反應(yīng)溶液中。使用這樣的表面活性劑，可以獲得本發(fā)明的有利效果，即防止核酸的非特異性擴(kuò)增。本發(fā)明中使用的表面活性劑的類型不受特別的限制。本發(fā)明中可以使用的表面活性劑的實(shí)例包括陰離子表面活性劑諸如烷基苯磺酸鈉，十二烷基硫酸鈉(SDS)，辛基磺基琥珀酸鹽或硬脂酸皂；非離子型表面活性劑諸如蔗糖脂肪酸酯，POE失水山梨糖醇脂肪酸酯(吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫80，等)，脂肪酸鏈烷醇酰胺，POE烷基醚(Brij35，Brij58，等)，POE烷基苯基醚TritonX-100，TritonX-114,NonidetP40，等)，壬基苯酚，月桂醇，聚乙二醇，聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，POE烷基胺或POE脂肪酸二苯基醚；和陽離子表面活性劑諸如十六烷基氯化吡啶鐺，月桂基二甲基芐基氯化銨或硬脂基三甲基氯化銨。所用表面活性劑的量不受特別的限制，條件是可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的效果。所用表面活性劑的量是優(yōu)選0.01%以上，更優(yōu)選0.05%以上，和進(jìn)一步優(yōu)選0.1%以上。所用表面活性劑的量的上限不受特別的限制。通常是10%以下，優(yōu)選5%以下，和更優(yōu)選以下。在所述表面活性劑中，使用非離子型表面活性劑是特別優(yōu)選的。在非離子型表面活性劑中，具有強(qiáng)親水性的非離子型表面活性劑是優(yōu)選的，且在HLB值方面，具有12以上的HLB值的非離子型表面活性劑是優(yōu)選的。所述HLB值更優(yōu)選是14以上。優(yōu)選應(yīng)用的HLB值的上限是20。HLB值的上限更優(yōu)選是17或以下，和進(jìn)一步優(yōu)選是14-17。在結(jié)構(gòu)上，本發(fā)明中使用的表面活性劑優(yōu)選選自聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯烷基醚。在所述聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯中，僅具有一個(gè)脂肪酸酯的那些是優(yōu)選的。這種化合物的實(shí)例通過以下結(jié)構(gòu)式表示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>R具有12-18個(gè)碳原子的烷基基團(tuán)烷基基團(tuán)的位置不受特別的限制。還可以優(yōu)選使用以下結(jié)構(gòu)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>(x+y+z+w=20，R具有12-18個(gè)碳原子的烷基基團(tuán))由上述通式表示的表面活性劑包括稱為聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯的非離子型表面活性劑。所述聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯非離子型表面活性劑的實(shí)例包括聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單月桂酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單棕櫚酸酯，聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單硬脂酸酯，和聚氧乙烯(20)失水山梨糖醇單油酸酯。(產(chǎn)品名吐溫20，吐溫40，吐溫60，吐溫80，等)。使用的所述非離子型表面活性劑的量不受特別的限制。優(yōu)選是0.01%以上，更優(yōu)選0.05%以上，和進(jìn)一步優(yōu)選0.以上。(5)寡核苷酸引物本發(fā)明中使用的寡核苷酸具有基本與模板DNA互補(bǔ)的核苷酸序列，并容許DNA鏈從其3’端開始延伸。因此，由于所述寡核苷酸具有基本與模板DNA互補(bǔ)的核苷酸序列，所以其可以與作為模板使用的DNA退火。作為本發(fā)明中使用的寡核苷酸，可以使用由脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成的寡核苷酸，且所述寡核苷酸還可以包括修飾的核糖核苷酸或修飾的脫氧核糖核苷酸。優(yōu)選地，只有寡核苷酸引物的3’-端區(qū)域與起模板作用的核酸片段基本互補(bǔ)。優(yōu)選地，寡核苷酸引物僅在一個(gè)連續(xù)位點(diǎn)處與起模板作用的核酸片段基本互補(bǔ)。優(yōu)選地，將以下核苷酸序列作為標(biāo)記物加入到寡核苷酸引物的5’端側(cè)，所述核苷酸序列存在于與寡核苷酸引物的3’端側(cè)部分(其是其中寡核苷酸與模板核酸退火的部分)基本同源的序列的3’端側(cè)上，在起模板作用的核酸片段的核苷酸序列上。寡核苷酸的長度不受特別的限制。所述長度由通常約10-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選約15-50個(gè)核苷酸，和更優(yōu)選約15-40個(gè)核苷酸組成。所述寡核苷酸可以通過使用可商購的DNA合成儀(例如，由AppliedBiosystems(應(yīng)用生物系統(tǒng))制造的394型DNA合成儀，等)的亞磷酰胺(phosphoamidite)法合成。反應(yīng)溶液中使用的所述寡核苷酸的量是優(yōu)選0.1μM以上，更優(yōu)選1μM以上，和特別優(yōu)選1.5μΜ以上。(6)起模板作用的核酸片段本發(fā)明中起模板作用的核酸(DNA或RNA)可以是基因組DNA，cDNA,合成DNA，mRNA，和總RNA中的任意一種?？梢允褂糜煽赡馨鹉０遄饔玫暮怂岬臉悠分苽涞暮怂?，或可以直接使用可能包含起模板作用的核酸的樣品。所述包含起模板作用的核酸的樣品的類型不受特別的限制。所述樣品的實(shí)例包括體液(例如，全血、血清、尿液、腦脊髓液、精液、唾液，等)；組織(例如，癌組織，等)；生物體來源的樣品諸如拭子和細(xì)胞培養(yǎng)物；含有核酸的樣品諸如病毒、細(xì)菌、霉菌、酵母、植物、和動(dòng)物；其中可能混合微生物的樣品(例如，食品，等)，和環(huán)境諸如土壤和排水中存在的樣品。當(dāng)由前述樣品制備核酸時(shí)，用于制備所述核酸的方法不受特別的限制。例如，可以應(yīng)用本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的方法，諸如用表面活性劑處理、超聲波處理、和使用玻璃珠純化?？梢酝ㄟ^苯酚提取、層析法、凝膠電泳、密度梯度離心等，從樣品中純化核酸。當(dāng)擴(kuò)增具有源自RNA的序列的核酸時(shí)，本發(fā)明的方法可以利用通過關(guān)于前述作為模板的RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成的cDNA作為模板來進(jìn)行。所述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的引物可以是具有與特定模板RNA互補(bǔ)的核苷酸序列的引物，或寡dT引物或具有隨機(jī)序列的引物。反轉(zhuǎn)錄中使用的所述引物的長度是優(yōu)選約6-100個(gè)核苷酸，和更優(yōu)選約9-50個(gè)核苷酸。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用的酶的類型不受特別的限制，條件是當(dāng)RNA作為模板使用時(shí)，其具有cDNA合成活性。本文中可以使用的所述酶的實(shí)例包括禽類成髓細(xì)胞性白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(AMVRTase)，莫洛尼鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(MMLVRTase)，和勞斯相關(guān)病毒2反轉(zhuǎn)錄酶(RAV-2-RTase)。而且，還可以使用也具有反轉(zhuǎn)錄活性的鏈置換型DNA聚合酶。在本發(fā)明中，雙鏈DNA諸如基因組DNA或核酸擴(kuò)增片段或單鏈DNA諸如通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)從RNA制備的cDNA可以用作模板DNA。前述雙鏈DNA可以通過變性轉(zhuǎn)化為單鏈DNA，并可以然后用于本發(fā)明的方法。否則，所述雙鏈DNA可以在不進(jìn)行所述變性的條件下直接用于本發(fā)明的方法。(7)預(yù)處理起模板作用的核酸片段本發(fā)明中起模板作用的核酸可以在經(jīng)歷預(yù)處理后，作為擴(kuò)增模板使用。所述預(yù)處理中使用的試劑可以包括，例如表面活性劑、抗凝血藥、蛋白酶、和脂質(zhì)降解酶。該液體可以是酸性或堿性的。所述預(yù)處理過程可以包括將核酸片段加熱到高溫(例如，98°C)的步驟或用變性試劑對(duì)其進(jìn)行處理的步驟。而且，其還可以包括在加熱到高溫后，將所述核酸片段驟冷到4°C以下的溫度的步驟。(8)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑可以將解鏈溫度調(diào)節(jié)劑加入到本發(fā)明的反應(yīng)溶液中。所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑的具體實(shí)例包括二甲亞砜(DMSO)，甜菜堿，甲酰胺，甘油，四烷基銨鹽，和這些化合物中兩種以上類型的混合物。使用的所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑的量不受特別的限制。當(dāng)解鏈溫度調(diào)節(jié)劑是DMS0，甲酰胺，或甘油時(shí)，通常可以以10%以下的百分比包含在反應(yīng)溶液中。甜菜堿或四烷基銨鹽可以以約0.2-3.0M，和優(yōu)選約0.5-1.5M的濃度添加到反應(yīng)溶液中。(9)緩沖成分本發(fā)明中使用的反應(yīng)溶液可以包括緩沖成分。所述緩沖成分的類型不受特別的限制。例如，可以使用N-二(羥乙基)甘氨酸，tricine,H印es，三羥甲基氨基甲烷(Tris)，磷酸鹽(磷酸鈉，磷酸鉀，等)，等。緩沖成分的終濃度是5mM-100mM，和特別優(yōu)選10mM-50mM的范圍內(nèi)。緩沖成分的PH值取決于擴(kuò)增反應(yīng)中使用的酶的最適pH。通常是pH6.0-9.0，和特別優(yōu)選是PH7.0-9.0。(10)熒光染料本發(fā)明中使用的反應(yīng)溶液可以包括熒光染料。所述熒光染料的類型不受特別的限制。例如，可以使用SYBR綠I等。(11)本發(fā)明的用于擴(kuò)增核酸的方法的應(yīng)用按照本發(fā)明的擴(kuò)增核酸的方法可以在用于檢測(cè)核酸，標(biāo)記、確定核苷酸序列，檢測(cè)核苷酸突變(包括檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性等)，等。由于本發(fā)明的用于擴(kuò)增核酸的方法不需要使用能夠控制溫度的反應(yīng)容器，因此擴(kuò)增反應(yīng)可以利用大量反應(yīng)溶液進(jìn)行。通過本發(fā)明的擴(kuò)增核酸的方法獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的方法檢測(cè)。例如，根據(jù)凝膠電泳，可以通過使用溴化乙錠染色凝膠來檢測(cè)特定大小的反應(yīng)產(chǎn)物。作為用于檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)系統(tǒng)，可以使用熒光偏振、免疫測(cè)定、熒光能量轉(zhuǎn)移、酶標(biāo)記(例如，過氧化物酶、堿性磷酸酶，等)、熒光標(biāo)記(例如，熒光素、羅丹明，等)、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光等。還可能利用Taqman探針或分子信標(biāo)(MolecularBeacon)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。還可能利用用生物素等標(biāo)記的標(biāo)記核苷酸來檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。在這種情形中，擴(kuò)增產(chǎn)物中包含的生物素可以利用熒光標(biāo)記的抗生物素蛋白或酶標(biāo)記的抗生物素蛋白檢測(cè)。而且，使用本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的氧化還原嵌入劑，可以用電極檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。此外，擴(kuò)增產(chǎn)物還可以利用sra檢測(cè)。通過檢測(cè)焦磷酸鎂，可以檢測(cè)核酸擴(kuò)增。在這種情形中，擴(kuò)增產(chǎn)物可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的其他方法，諸如檢測(cè)濁度來檢測(cè)。本發(fā)明將在以下實(shí)施例中更加具體地描述。然而，這些實(shí)施例不意欲限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例<實(shí)施例1>核酸的擴(kuò)增反應(yīng)(1)制備含有靶核酸片段的核酸樣品溶液將3.Ong人血液來源的DNA在98°C加熱3分鐘，以生成單鏈。隨后，在以下條件下擴(kuò)增CYP2C9基因中的序列?！匆铩翟O(shè)計(jì)引物，以靶向CYP2C9基因。各個(gè)引物的序列顯示如下。引物(1)(正向)5，-GGTCCAGAGATACC-3，(SEQIDNO1)引物(2)(反向)5，-CAGGCTGGTGGGGAGA-3，(SEQIDNO2)前述引物和CYP2C9基因的位置關(guān)系的詳細(xì)信息顯示在圖1中。(2)制備反應(yīng)溶液制備具有以下組成的反應(yīng)溶液。〈反應(yīng)溶液的組成〉IOXBst緩沖液(DF)LOyLIOOmMMgS040.6μL10%(ν/ν)吐溫200.1μL100%DMSO0.5μL25mM各種dNTP0.56μLSYBR綠I(2000-倍稀釋)0·2μL50μM引物(1)0·64μL50μM引物(2)0·64μLBst.聚合酶0.4yL在(1)中獲得的核酸片段樣品3.Ong純化水4.96μL_10.0μL(3)溫育反應(yīng)溶液(步驟⑴)在以上⑵中制備的反應(yīng)溶液在室溫(Tl=250C)下溫育0-30分鐘。反應(yīng)溶液A不溫育(0分鐘)反應(yīng)溶液B溫育10分鐘反應(yīng)溶液C溫育20分鐘反應(yīng)溶液D溫育30分鐘(4)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)(步驟(2))利用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)器(Μχ3000ρ；由Stratagene制造)，以上(3)中獲得的反應(yīng)溶液在60°C(=T2)反應(yīng)60分鐘，并隨時(shí)間檢測(cè)熒光。關(guān)于反應(yīng)溶液A的結(jié)果顯示在圖2中。關(guān)于反應(yīng)溶液B的結(jié)果顯示在圖3中。關(guān)于反應(yīng)溶液C的結(jié)果顯示在圖4中。關(guān)于反應(yīng)溶液D的結(jié)果顯示在圖5中。應(yīng)當(dāng)注意，實(shí)驗(yàn)以N=4進(jìn)行(即，對(duì)四份相同的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。發(fā)現(xiàn)可以實(shí)時(shí)檢測(cè)來自核酸樣品來源的樣本的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。于此，利用Μχ3000ρ分析軟件計(jì)算在前述圖表中熒光水平達(dá)到250時(shí)的時(shí)間(Ct值)。作為結(jié)果，獲得表1中所示的結(jié)果。表1:T1=25°C，Τ2=60°C<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>Ct值的分散通過設(shè)定溫育時(shí)間而減小。即，擴(kuò)增速率中的分散減小。(5)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳利用3wt%瓊脂糖凝膠和0.5ΧΤΒΕ緩沖液(50mMTris，45mM硼酸，0.5mMEDTA,ρΗ8.4)，以IOOV將擴(kuò)增反應(yīng)后獲得的樣品進(jìn)行電泳60分鐘。關(guān)于反應(yīng)溶液A的結(jié)果顯示在圖6中。關(guān)于反應(yīng)溶液B的結(jié)果顯示在圖7中。關(guān)于反應(yīng)溶液C的結(jié)果顯示在圖8中。關(guān)于反應(yīng)溶液D的結(jié)果顯示在圖9中。在沒有進(jìn)行溫育(圖6)的樣品的情形中，它們展現(xiàn)出不同的條帶圖譜(N=4)。在另一方面，在溫育10分鐘(圖7)的樣品的情形中，四份樣品中的兩份(樣品a和d)展現(xiàn)出相同的條帶圖譜。而且，在溫育20分鐘(圖8)和30分鐘(圖9)的樣品的情形中，所有樣品展現(xiàn)出幾乎相同的圖譜(N=4)。由電泳圖譜的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)作為溫育結(jié)果而產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物也變得均一。即，發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增反應(yīng)的特異性得到提高。<實(shí)施例2>溫育溫度的改變(1)制備含有靶核酸片段的核酸樣品溶液將3.Ong人血液來源的DNA在98°C加熱3分鐘，以生成單鏈。隨后，在以下條件下擴(kuò)增CYP2C9基因中的序列?！匆铩翟O(shè)計(jì)引物，以靶向CYP2C9基因。各個(gè)引物的序列顯示如下。引物(1)(正向)5，-GGTCCAGAGATACC-3，(SEQIDNO1)引物(2)(反向)5，-CAGGCTGGTGGGGAGA-3，(SEQIDNO2)前述引物和CYP2C9基因的位置關(guān)系的詳細(xì)信息顯示在圖1中。(2)制備反應(yīng)溶液制備具有以下組成的反應(yīng)溶液。〈反應(yīng)溶液的組成〉IOXBst緩沖液(DF)LOyLIOOmMMgS040.6μL10%(ν/ν)吐溫200.1μL100%DMSO0.5μL25mM各種dNTP0.56μLSYBR綠I(2000-倍稀釋)0·2μL50μM引物(1)0·64μL50μM引物(2)0·64μLBst.聚合酶0.4yL在(1)中獲得的核酸片段樣品3.Ong純化水4.96μL_10.0μL(3)溫育反應(yīng)溶液(步驟⑴)在以上⑵中制備的反應(yīng)溶液在(Tl=)301，401或501下溫育5，10或15分鐘。(4)核酸的擴(kuò)增反應(yīng)(步驟(2))利用實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)器(Μχ3000ρ；由Stratagene制造)，以上(3)中獲得的反應(yīng)溶液在60°C(=T2)反應(yīng)60分鐘，并隨時(shí)間檢測(cè)熒光。實(shí)驗(yàn)以Ν=4進(jìn)行(即，對(duì)四份相同的樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn))。發(fā)現(xiàn)可以實(shí)時(shí)檢測(cè)來自核酸樣品來源的樣本的核酸擴(kuò)增反應(yīng)。于此，利用Μχ3000ρ分析軟件計(jì)算在前述圖表中熒光水平達(dá)到250時(shí)的時(shí)間(Ct值)。作為結(jié)果，獲得表2-4中所示的結(jié)果。使用Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差來評(píng)估擴(kuò)增速率的分散。通過在30°C，40°C和50°C下溫育15分鐘或以下而獲得的標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于在不溫育下獲得的標(biāo)準(zhǔn)偏差(3.6分鐘)。S卩，通過進(jìn)行溫育而減小擴(kuò)增速率的分散。表2:T1=30°C，T2=60°C<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表3:T1=40°C，T2=60°C<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>序列表<110>富士膠片株式會(huì)社<120>用于減小核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的分散的方法<130>FA9175A<160>2<210>1<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>1ggtccagagatacc14<210>2<211>16<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述合成的DNA<400>2caggctggtggggaga1權(quán)利要求用于擴(kuò)增核酸的方法，其包括以下步驟(1)和(2)(1)在溫度(T1)下溫育反應(yīng)溶液的步驟，所述反應(yīng)溶液含有至少一種類型的脫氧核苷酸三磷酸酯，至少一種類型的DNA聚合酶，至少2種類型的寡核苷酸引物，和起模板作用的核酸片段；和(2)在步驟(1)后，在溫度(T2)下溫育所述反應(yīng)溶液的步驟，所述溫度(T2)高于所述溫度(T1)并在50℃以上至100℃以下之間。2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述溫度(Tl)在10°C以上至50°C以下之間。3.按照權(quán)利要求1的方法，其中在所述溫度(Tl)和所述溫度(T2)之間的溫度差異在5°C以上。4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(1)在60分鐘內(nèi)進(jìn)行。5.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟⑵在60分鐘內(nèi)進(jìn)行。6.按照權(quán)利要求1的方法，其中只有所述寡核苷酸引物的3’-端區(qū)域與所述起模板作用的核酸片段基本互補(bǔ)。7.按照權(quán)利要求6的方法，其中所述寡核苷酸引物僅在一個(gè)連續(xù)位點(diǎn)處與所述起模板作用的核酸片段基本互補(bǔ)。8.按照權(quán)利要求1中任一項(xiàng)的方法，其中所述反應(yīng)溶液另外包括至少0.01%以上的表面活性劑。9.按照權(quán)利要求8的方法，其中所述表面活性劑是非離子型表面活性劑。10.按照權(quán)利要求9的方法，其中所述非離子型表面活性劑選自聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯和聚氧乙烯烷基醚。11.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)溶液還包括二價(jià)陽離子。12.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述反應(yīng)溶液還包括解鏈溫度調(diào)節(jié)劑。13.按照權(quán)利要求12的方法，其中所述解鏈溫度調(diào)節(jié)劑是二甲亞砜，甜菜堿，甲酰胺，或甘油，或它們的兩種以上類型的混合物。14.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述DNA聚合酶具有鏈置換活性。15.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述具有鏈置換活性的聚合酶選自由以下組成的組源自嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)的5’一3’核酸外切酶-缺陷型Bst.DNA聚合酶，源自熱堅(jiān)芽孢桿菌(Bacilluscaldotenax)的5，一3，核酸外切酶缺陷型BcaDNA聚合酶，源自TermococcusIitoralis的5’一3’核酸外切酶缺陷型Vent.DNA聚合酶，和源自酸熱脂環(huán)酸桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的DNA聚合酶。全文摘要本發(fā)明公開了用于減小核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的分散的方法。本發(fā)明的目的是提供用于擴(kuò)增核酸的方法，其不要求復(fù)雜的溫度控制且可以在不使用特殊酶或特殊引物的條件下進(jìn)行。本發(fā)明提供用于擴(kuò)增核酸的方法，其包括以下步驟(1)和(2)(1)在溫度(T1)下溫育反應(yīng)溶液的步驟，所述反應(yīng)溶液含有至少一種類型的脫氧核苷酸三磷酸酯，至少一種類型的DNA聚合酶，至少2種類型的寡核苷酸引物，和起模板作用的核酸片段；和(2)在步驟(1)后，在溫度(T2)下溫育所述反應(yīng)溶液的步驟，所述溫度(T2)高于溫度(T1)并在50℃以上至100℃以下之間。文檔編號(hào)C12P19/34GK101824449SQ20101000350公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年1月12日優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日發(fā)明者三好隼人,巖木義英申請(qǐng)人:富士膠片株式會(huì)社