專利名稱：鏈親和素/綠色熒光融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程和蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域，具體涉及來源于細(xì)菌的鏈親和素 (str印tavidin， SA)和水母的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)。
背景技術(shù)：
綠色熒光蛋白是1962年由下村修等人在一種維多利亞水母中發(fā)現(xiàn)的，由238個(gè)氨基酸殘 基組成，經(jīng)490nm波長激發(fā)發(fā)出綠色熒光。該蛋白最大特點(diǎn)是能在活體生物體內(nèi)或活細(xì)胞中 表達(dá)，并能動(dòng)態(tài)觀察被標(biāo)記目標(biāo)的分布及代謝情況。因此，GFP己作為分子標(biāo)簽廣泛應(yīng)用于 分子及細(xì)胞生物學(xué)的研究。鏈親和素(SA)是由鏈霉菌產(chǎn)生的非糖基化同源四聚體蛋白，故一個(gè)鏈親和素蛋白可結(jié)合 四個(gè)生物素。它能與生物素緊密非共價(jià)結(jié)合(Kd-10—15M),結(jié)合力是抗原一抗體間作用力的一 千至一百萬倍。由于鏈親和素可與生物素發(fā)生快速且?guī)缀醪豢赡娴膹?qiáng)力結(jié)合，以及生物素較 容易參入各種生物分子(如蛋白質(zhì)，核酸和脂多糖)中，即生物素化，故鏈親和素一生物素間 的強(qiáng)力作用早己用于生物醫(yī)學(xué)的許多領(lǐng)域。本發(fā)明將綠色熒光蛋白(GFP)與鏈親和素(SA)連接構(gòu)建融合蛋白，在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了高 效表達(dá)，并經(jīng)分離、純化和復(fù)性后，能得到純度較高且有雙重活性的GFP/SA融合蛋白(即 鏈親和素對生物素(biotin)高效特異的超強(qiáng)結(jié)合活性和GFP發(fā)射綠色熒光的活性)。該融合蛋 白可高效錨定在靶細(xì)胞已生物素化的細(xì)胞表面，用于研究其在靶細(xì)胞表面的定量結(jié)合和代謝 規(guī)律。最近，我們?yōu)檠兄菩滦湍[瘤細(xì)胞疫苗建立了細(xì)胞膜表面錨定修飾技術(shù)平臺(tái)利用生物 素化試劑將生物素化學(xué)交聯(lián)到目標(biāo)腫瘤細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)氨基(即-NH。上，再將鏈親和素 與免疫刺激分子構(gòu)建成的雙功能融合蛋白，通過鏈親和素與生物素高效特異的超強(qiáng)結(jié)合，將 免疫刺激分子錨定在目標(biāo)腫瘤細(xì)胞表面，以增強(qiáng)腫瘤疫苗誘導(dǎo)主動(dòng)免疫反應(yīng)的能力。因此， GFP/SA雙功能融合蛋白可作為這類新型腫瘤疫苗研究體系的對照系統(tǒng)。我們所采用的pET原核表達(dá)載體是最有效的原核表達(dá)系統(tǒng)之一，它利用噬菌體T7啟動(dòng)子 與T7 RNA聚合酶之間作用的高度特異性及高效性使得外源基因在細(xì)菌體中的表達(dá)效率提高， 表達(dá)蛋白以包涵體形式存在，約占菌體蛋白的20%。 GFP/SA融合蛋白在N-或C-端含有6個(gè) 組氨酸的標(biāo)簽，利用二價(jià)陽離子與組氨酸結(jié)合的性質(zhì)，用一步螯合層析即可將表達(dá)的蛋白純 度提高至95%。復(fù)性后的GFP/SA融合蛋白穩(wěn)定性較好，可以在-20。C保存半年。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是制備綠色熒光蛋白與鏈親和素的雙功能融合蛋白，作為新型 腫瘤細(xì)胞疫苗研究體系的對照系統(tǒng)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素蛋白和一綠色熒光蛋白構(gòu)成，其中所述 的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。本發(fā)明融合蛋白中的鏈親和素位于接頭肽的N端(SEQN0.2)或C端(SEQNO.l)。 本發(fā)明融合蛋白可通過將鏈親和素基因、綠色熒光蛋白基因以及連接二者的接頭多核苷 酸通過基因重組、轉(zhuǎn)化構(gòu)建工程菌表達(dá)獲得，其中基因重組和轉(zhuǎn)化的方法均為本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員所熟識(shí)的技術(shù)。為了便于融合蛋白的分離純化，本發(fā)明所述的融合蛋白的鏈親和素部分的末端還可以連 接有純化標(biāo)簽，如本發(fā)明融合蛋白SEQ N0.3的鏈親和素的C端連有組氨酸標(biāo)簽、本發(fā)明融 合蛋白SEQN0.4的鏈親和素的N端連有組氨酸標(biāo)簽。本發(fā)明還提供一種編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸，該多核苷酸由成熟鏈親和素DNA、 成熟綠色熒光蛋白■通過TCG AGC GGG GGC AGC GGG GGC GGA GGC AGC GGC GGG GGC GGATCC連接而成；該多核苷酸中成熟鏈親和素DNA的末端還可以連接有CAT CAT CAC CAT CAC CAT。將所述的編碼本發(fā)明融合蛋白的多核苷酸通過基因重組構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，然后轉(zhuǎn) 化大腸桿菌可獲得高效表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的工程菌；所述的原核表達(dá)載體可以是pET24a 或pET24d，宿主菌為大腸桿菌為BL21 (DE3)。本發(fā)明融合蛋白在上述工程菌中主要以包涵體的形式存在，從包涵體中分離純化蛋白并 復(fù)性處理后，即可獲得本發(fā)明融合蛋白。本發(fā)明融合蛋白采用富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽連接綠色熒光蛋白和鏈親和素，此15 肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的生物活性， 使融合蛋白具有鏈親和素和綠色熒光蛋白的雙重活性。鏈親和素和綠色熒光蛋白的雙功能融 合蛋白，通過鏈親和素與生物素的強(qiáng)力結(jié)合，可錨定在生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，且能在y 射線滅活腫瘤細(xì)胞表面穩(wěn)定存在，并仍保持綠色熒光蛋白的活性。


圖1. pET24d-GFP-L-SA-6His重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。 圖2. pET24a-6His-SA-L-GFP重組質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)圖。圖3.重組表達(dá)質(zhì)粒pET24d-GFP-L-SA-6His的酶切鑒定圖，.其中第1泳道是分子量標(biāo)準(zhǔn)，第2泳道為Ncol和EcoRI酶切，第3泳道為Ncol和Xhol酶切。 圖4.融合蛋白GFP-L-SA-6His的SDS-PAGE電泳圖，其中1是低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)，2是未誘導(dǎo)表達(dá)菌株，3是用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后菌株，4是表達(dá)菌破碎后沉淀，5是純化后的峰值蛋白，6是復(fù)性后氧化型，7是復(fù)性后還原型。 圖5.熒光顯微鏡觀察GFP-L-SA-6His融合蛋白對B16細(xì)胞表面的錨定修飾圖，其中A是可見光下，B是熒光下。圖6.流式分析GFP-L-SA-6His融合蛋白對B16細(xì)胞的錨定修飾,，其中左峰為未修飾的細(xì)胞(陰性對照)，而右峰為錨定修飾的細(xì)胞。 圖7.GM-CSF-L-SA-6His融合蛋白錨定的腫瘤疫苗的預(yù)防接種組的生存數(shù)及生存期顯著高于GFP修飾的陰性對照組。 圖8.GM-CSF-L-SA-6His錨定的腫瘤疫苗治療組的生存數(shù)及生存期顯著高于GFP修飾的陰性對照組。下面將通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明以及本發(fā)明具有的技術(shù)效果。
具體實(shí)施方式
實(shí)施實(shí)例和實(shí)驗(yàn)所用的材料及設(shè)備如下表達(dá)菌株E. coli BL21 (DE3)、原核表達(dá)質(zhì)粒pET24a購自Novagen公司；pEGFP質(zhì)粒購 自Clontech公司；鏈霉菌、小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16.F10均購自ATCC。 DNeasy組織試劑盒和 質(zhì)粒DNA的制備試劑盒(Qiagen);寡核苷酸的合成(Sigma); Trizol， Superscript II逆轉(zhuǎn) 錄酶，dNTP、 IPTG購自Sigma公司；Platinum戶/> DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自 Invitrogen;各種限制性內(nèi)切酶購自Promega公司；PCR引物訂購自IDT公司；PCR產(chǎn)物純化 試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Qiagen公司；Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin購自Pierce公司； Ni-NTA螯合層析填料購自Qiagen公司。DNA片段的連接、轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化菌株篩選、限制性內(nèi)切酶分析、SDS-聚丙烯酰胺凝膠點(diǎn)泳 等常規(guī)方法均參照文獻(xiàn)(Sambrook J> et aL Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Manual, 3rd edition, 2001)或廠家提供的產(chǎn)品說 明書；DNA序列分析在大連寶生物工程公司的DNA測序服務(wù)中心完成。例1. GFP-L-SA-6His融合蛋白的制備1、 以pEGFP質(zhì)粒為模板，用Platinum DNA聚合酶進(jìn)行PCR，制備GFP DNA。 引物為5， CATGCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG 3' (30nt)和5， GGAATTCCTTGTACAGCTCGTCCATGC 3， (27nt)反應(yīng)條件變性94。C， 2min;循環(huán)(94°C， lmin — 56°C， lmin — 68°C, 1 min)， 30 輪；延伸68'C， 5分鐘。2、 用DNeasy組織試劑盒從親和素鏈霉菌中抽提出細(xì)菌的基因組DNA，然后用其作為模 板，通過Platinum p/V DNA聚合酶進(jìn)行PCR制備成熟鏈親和素DNA 。引物5' GGAATTCTCAAGCGGGGGCAGCGGGGGCGGAGGCAGCGGCGGGGGCGGATCCGCCGACCCCTCC AAGGACTCGAAGGC 3, (78nt)和5， GTGGTGCTCGAGCTGCTGAACGGCGTCGAGCGGGTTGCC 3' (39nt)。反應(yīng)條件變性94。C， 2min;循環(huán)(94°C， 15s — 60°C， 15s — 68°C， 30s)， 30輪； 延伸68。C， 5min。3、 構(gòu)建pET24d-GFP-L-SA-6His重組質(zhì)粒制備的GFP cDNA (不含終止密碼子，兩端分別含Ncol和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))和 SA DNA (不含終止密碼子，兩端分別含EcoRI和Xhol限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))，將上述GFP和 SA基因片段克隆于pET24d載體中，獲得pET24d-GFP-L-SA-6His重組表達(dá)質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖 l所示)。其中L為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定，驗(yàn)證 其正確無誤。4、 構(gòu)建pET24d-GFP-L-SA-6His/BL21 (DE3)工程菌pET24d-GFP-L-SA-6His重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌后用含氨芐青霉素的LB平板篩選。隨機(jī) 挑單菌落，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，用12%SDS-PAGE檢測GFP-L-SA_6His融合蛋白的表達(dá)情況。5、 GFP-L-SA-6His融合蛋白的表達(dá)挑取高表達(dá)的單菌落進(jìn)行大量培養(yǎng):將細(xì)菌接種于加有卡那霉素(30ug/ml)的LB液體培 養(yǎng)基中，經(jīng)37°C， 250轉(zhuǎn)培養(yǎng)擴(kuò)增至吸光度A卿為0. 4 0. 5時(shí)，加入終濃度為0. l咖ol/L 的IPTG， 37'C誘導(dǎo)表達(dá)4h，離心收獲菌體稱重，用12呢SDS-PAGE檢測融合蛋白的表達(dá)情況。 GFP-L-SA-6His融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式存在，其表達(dá)量達(dá)15-20%。6、 從包涵體中獲得GFP-L-SA-6His雙功能融合蛋白a.菌體按l : 10重懸于超聲緩沖液(100mmol/L磷酸鈉緩沖液、10mmol/LTris.Cl、pH8.0): 冰浴超聲20sX70次(間隔15s)， 4。C離心收集沉淀即包涵體。包涵體分別用A、 B、 C、 D、 E 液(A: 20mM Tris.HCl， 2mM EDTA ， 0. 5M NaCl， pH=8. 0; B: 20mM Tris.HCl, lOmM EDTA, 2mM 2ME, 0.1% Triton X-100， pH=8. 0; C: 20mM Tris.HCl, 2mM EDTA， 2M尿素，pH=8. 0; D: 20mM Tris.HCl, 2mM EDTA， 50%乙丙醇，pH=8.0; E: 20mM Tris.HCl, pH=8.0。)充分洗滌，每次10tnin。用溶解液(100mmol/L磷酸鈉緩沖液、10腦ol/LTris. Cl、 1,1/L EDTA、8mol/L尿素、0. lmol/L 2-巰基乙醇，pH8. 0)溶解，離心去沉淀。b. Ni-NTA柱層析純化將歩驟a得到的上清液用6M尿素(含2-ME)稀釋一倍上樣于Ni-NTA柱(2. 6X5 cm)，柱用平衡液(100mraol/L磷酸鈉緩沖液，6mol/L尿素，10mmol/L咪 唑pH8.0)先平衡，然后依次用含30、 50、 lOOmmol/L咪唑的平衡液洗脫，收集洗脫峰，12% SDS-PAGE檢測融合蛋白純化情況，收集GFP-L-SA-6His融合蛋白(分子量為44. 3KD)。。c. 透析復(fù)性將純化的GFP-L-SA-6His融合蛋白濃度調(diào)至0D2s。二0,2，在大于20倍體積 的透析液(50mmol/L磷酸鈉緩沖液，1.0mol/L尿素，lmmol/L還原型谷胱苷肽，0. 2mmol/L 氧化型谷胱苷肽，pH 8.0)中4'C透析復(fù)性12小時(shí)；然后在PBS中繼續(xù)透析6小時(shí)；離心除 去不溶物，收集上清除菌保存。d. 2-Iminobiotin親和柱層析用平衡液(50mmol/L NaHC03， 500mmol/L NaCl， pHll)洗脫5個(gè)柱體積后(柱體積0. 5X2cm)，將收集的已復(fù)性的GFP-L-SA-6His融合蛋白溶液上親和層析柱，并用平衡液洗脫至樣品A，恢復(fù)至基線；然后，用50mmol/LNaAc, pH4.0洗脫，分管收集各洗脫峰，并用10x平衡液(500mmol/L NaHC03， 5mol/L NaCl， pH 11)將收集的融合蛋白質(zhì)液調(diào)至pH8.0，并過濾除菌分裝，儲(chǔ)存于一2(TC。所得GFP-L-SA-6His融合蛋白用SDS-PAGE分析鑒定，結(jié)果如圖4所示。7、 GFP-L-SA-6His雙功能融合蛋白表面錨定修飾腫瘤細(xì)胞的測定傳代培養(yǎng)的B16細(xì)胞，胰酶消化，用PBS洗3次，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度1X106，加入Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin使終濃度為0、 lmg/ml,室溫下作用30分鐘;用1XPBS洗漆細(xì)胞3次后，每106個(gè)B16.F10細(xì)胞加入200ng IL2-L-SA-6His或6His-SA-L-IL2融合蛋白，冰上作用30分鐘；1 XPBS洗滌細(xì)胞1次后，用 y-射線滅活(20000rad)。然后，分別用熒光顯微鏡觀察和B-D FACScan流式細(xì)胞儀檢測。結(jié) 果如圖5、 6所示。例2. 6His-SA-L-GFP融合蛋白的制備1、 制備成熟SA DNA:方法與例1同。引物5， GGAATTCCATATGCATCATCACCATCACCATGAGGCCGGCATCACCGGCACCTGG 3' (55nt)CGGGTTGCC 3，(82nt)。2、 制備成熟GFP cDNA:方法與例1同。引物5' GGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG 3'(31nt)和5' CGCCATGGCTTGTACAGCTC GTCCATGC 3， (28nt)3、 構(gòu)建pET24a-6His-SA-L-GFP重組質(zhì)粒制備的SA DNA (兩端分別含Ndel和EcoRI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))和GFP cDNA (不含終 止碼，兩端分別含EcoRI和HindIII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn))，將上述SA和GFP基因片段克隆于 pET-24a載體中，獲得pET24a-6His-SA-L-GFP重組表達(dá)質(zhì)粒(結(jié)構(gòu)圖如圖2所示)。其中L 為富含甘氨酸、絲氨酸的連接肽。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列分析鑒定，驗(yàn)證其正確無誤。4、 構(gòu)建pET24a-6His-SA-L-GFP/BL21 (DE3)工程菌方法與例1同。5、 6His-SA-L-GFP融合蛋白的表達(dá)6His_SA-L-GFP融合蛋白在菌體中主要以包涵體的形式 存在，其表達(dá)量達(dá)20 30%。6、 從包涵體中獲得6His-SA-L-GFP雙功能融合蛋白方法同例1 。7、 6His-SA-L-GFP雙功能融合蛋白表面錨定修飾腫瘤細(xì)胞的測定方法同例1。例3.本發(fā)明融合蛋白對腫瘤細(xì)胞的表面錨定修飾效果及其穩(wěn)定性檢測經(jīng)流式細(xì)胞儀，對錨定在生物素化的B16. F10表面上的GFP-L-SA-6His或6His-SA-L-GFP 雙功能融合蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖6，幾乎100%的腫瘤細(xì)胞被錨定修飾；對錨定在Y-射線 滅活的腫瘤細(xì)胞表面的GFP/SA雙功能融合蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行分析表明，在一周內(nèi)這些錨定在 細(xì)胞表面的的融合蛋白數(shù)量無顯著下降。例4.作為表面錨定修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗的對照體系。1. 作為表面錨定修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗預(yù)防腫瘤效果的陰性對照分別將106個(gè)GFP-L-SA-6His錨定修飾的的B6. F10腫瘤細(xì)胞疫苗和GM-CSF-L-SA-6His 錨定修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗(均經(jīng)20000rad"r射線滅活)接種于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內(nèi)， 14天后加強(qiáng)一次；7天后，將105未經(jīng)任何處理的B6. F10腫瘤細(xì)胞接種于小鼠右肋腹部的皮 下，然后觀察腫瘤的生長情況和小鼠在40天內(nèi)的成活情況。GM-CSF錨定修飾的腫瘤疫苗預(yù) 防接種組的生存數(shù)及生存期顯著高于GFP錨定修飾的陰性對照組，如圖7所示。2. 作為表面錨定修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗治療腫瘤效果的陰性對照將10S個(gè)未經(jīng)任何處理的B6.F10腫瘤細(xì)胞接種于小鼠右肋腹部的皮下；4, 11和18天后， 分別將106個(gè)GFP-L-SA-6His修飾的B6. F10腫瘤細(xì)胞疫苗和GM-CSF-L-SA-6His錨定修飾的 B6.F10腫瘤細(xì)胞疫苗(均經(jīng)20000rady-射線滅活)接種于C57BL/6小鼠左肋腹部的皮內(nèi)，然 后觀察腫瘤的生長情況和小鼠在40天內(nèi)的成活情況。GM-CSF錨定修飾的腫瘤疫苗治療組的 生存數(shù)及生存期顯著高于GFP錨定修飾的陰性對照組，如圖8所示。SEQUENCE LISTING<110>溫州醫(yī)學(xué)院<120>鏈親和素/綠色熒光蛋白融合蛋白〈160〉 4<170><210〉 1<211> 412〈212〉 PRT <213>人工序列〈220〉<221> CHAIN<222> (1)..(238)<223>綠色熒光蛋白(GFP) 〈220〉<221〉 DOMAIN<222〉 (239)..(253)<223>甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽(L)，此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各單元蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白的雙 重活性。〈220><221> CHAIN<222> (254)..(412)<223>潘驪S勢^3^沐藩^苦洲(SA)<400> 1set Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr G一y Val <al Pro lie Leu Val5 10 5Glu Leu Asp Gly Asp va一 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu20 25 30oly Glu G一y Asp Ala Thr Tyr G一y Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie Cys35 40 45Thr Thr Gly llys廠eu Pro Val Iuro Trp Iuro Thr lieu Val Thr Thr Iuhe50 5^ S3Ser Tyr G一y Val G一n Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys G一n65 70 75 80His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu G_y Tyr <al Gin Glu Arg85 90 95Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu <al100 105 110廠ys Phe Glu Gly Asp Thr Leu va一 Asn Arg lie G一u Leu Lys Gly lie115 120 125Asp Phe Lys Glu Asp G一y Asn lie Leu Gly His Lys Leu G一u Tyr Asn130 135 140Tyr Asn Ser His Asn va一 Tyr lie Met Ala Asp Lys G一n Lys Asn Gly145 150 15^ 160lle Lys <al Asn Phe Lys lie Arg His Asn lie Lys Asp Gly Ser va一165 170 175Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin G一n Asn Thr Pro lie Gly Asp G一y Iuro180 185 190va一廠eu L.eu Pro Asp Asp- His Tyr廠eu Ser Thr G一n Ser Ala廠eu ser195 200 205Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val210 215 220Thr Ala Ala Gly lie Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Ser 225 230 235 240Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ser 245 250 255Lys Asp Ser Lys Ala Gin Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly lie Thr Gly 260 265 270Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala275 280 285Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu290 295 300Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp 305 310 315 320Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr 325 330 335Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly340 345 350Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr355 360 365Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr370 375 380Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly 385 390 395 400Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin405 410 415<210> 2 <211> 403 <212> PRT <213> 人工序列<220〉<221> CHAIN<222> (1)..(147)<223>鏈親和素(SA);與成熟的全長相比，在N-端缺失了 13個(gè)氨基酸。 <220><221〉 DOMAIN<222> (148)..(165)<223> 連接肽(L),并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點(diǎn)。 <220><221〉 CHAIN<222〉 (166)..(403)<223>綠色熒光蛋白(GFP)。<400> 2Met Glu Ala Gly lie Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr 5 10 15Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu20 25 30Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr35 40 45Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr50 55 60Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp 65 70 75 80Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp 85 90 95Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu100 105 110Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser lie115 120 125Asp Ala Ala Lys廠ys Ala Gly Val Asn Asn oly Asn Pro Leu Asp Ala130 135 140va一 G一n oln Ser Ser G一y〇ly Ser〇ly Gly o一y o一y Ser〇ly Gly Gly145 150 155 160G一y Ser Ala Glu Phe Met Ser Lys Gly G一u G一u Leu Phe Thr Gly Val165 170 175<al Pro lie Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys刀he180 185 190Ser Val Ser〇ly Glu o一y OIL-〇ly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu叫hr195 200 205廠eu Lys Phe lie Cys Thr Thr〇ly Lys Leu Pro Val Pro Trp pr.o Thr210 215 220廠eu va一 Thr Thr Iuhe Ser Tyr Gly Val Gin Cys _uhe Ser Arg Tyr Iuro22^ 230 235 2臺(tái)Asp His Met Lys Gin His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly245 250 255Tyr va一 Gin Glu Arg Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr廠ys260 265 270Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg lie275 280 285Glu Leu Lys Gly lie Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn lie Leu Gly His290 295 300廠ys Leu. Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn va一 Tyr lie Met Ala Asp305 310 315 320廠ys Gin Lys Asn G一y lie Lys Val Asn Phe Lys lie Arg His Asn lie325 330 335廠ys Asp Gly Ser va一 G一n Leu Ala Asp His Tyr G一n Gh Asn Thr _us340 345 350lie Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr
355 360 365
Gin Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val
370 375 380
Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly lie Thr His Gly Met Asp Glu 385 390 395 400
Leu Tyr Lys
405
<210> 3 <211〉 420 <212〉 PRT <213〉 人工序列
<220>
<221〉 CHAIN <222> (1)..(238)
<223>綠色熒光蛋白(GFP) <220>
<221> DOMAIN <222> (239),.(253)
<223>富含甘氨酸和絲氨酸的鏈接肽(L),此15肽非常靈活，有助于融合蛋白中各 單元蛋白質(zhì)分子的獨(dú)立折疊，從而保存各自的生物活性，最終提高融合蛋白 的雙重活性。
<220>
<221> CHAIN <222> (254)..(412)<223〉鏈霉菌成熟的全長鏈親和素(SA)。 <220〉
<221〉 PEPTIDE
<222> (415)..(420)
<223>組氨酸標(biāo)簽 <400〉 3
Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro lie Leu Val 5 10 15
Glu Leu AsP Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu
20 25 30
Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe lie Cys
35 40 45
Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe
50 55 60
Ser Tyr Gly Val Gin Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gin 65 70 75 80
His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gin Glu Arg 85 90 95
Thr lie Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val
100 105 110
Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg lie Glu Leu Lys Gly lie
115 120 125
Asp Phe Ly's Glu Asp Gly Asn lie Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn
130 135 140
Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr lie Met Ala AsP Lys Gin Lys Asn Gly 145 150 155 160
lie Lys Val Asn Phe Lys lie Arg His Asn lie Lys Asp Gly Ser Val 165 170 175Gin Leu Ala Asp His Tyr Gin Gin Asn Thr Pro lie Gly Asp Gly Pro
180 185 190
Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gin Ser Ala Leu Ser
195 200 205
Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val
210 215 220
Thr Ala Ala Gly lie Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Ser 225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Pro Ser 245 250 255
Lys Asp Ser Lys Ala Gin Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly lie Thr Gly
260 265 270
Thr Trp Tyr Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala
275 280 285
Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu
290 295 300
Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp 305 310 315 320
Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr 325 330 335
Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly
340 345 350
Ala Glu Ala Arg lie Asn Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr
355 360 365
Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr
370 375 380
Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly 385 390 395 400
Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Leu Glu His His 405 410 415
His His His His420
<210〉 4
<2"> 409
<212〉 PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (2)..(7)
<223〉組氨酸標(biāo)簽 <220>
<221> CHAIN
<222> (8)..(153)
<223〉 鏈親和素(SA);與成熟的全長相比，在Nh端缺失了 13個(gè)氨基酸。 <220〉
<221〉 DOMAIN
<222> (154)..(171)
<223〉 連接肽(L),并且其3'端含有BamHI和EcoRI的酶切位點(diǎn)。 <220>
<221> CHAIN
<222> (172)..(409)
<223> 綠色熒光蛋白(GFP)
<400> 4Met His His His His His His Glu Ala Gly lie Thr Gly Thr Trp Tyr 5 10 15
Asn Gin Leu Gly Ser Thr Phe lie Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala
20 25 30
Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr
35 40 45
Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly
50 55 60
Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala 65 70 75 80
His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gin Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala 85 90 95
Arg lie Asn Thr Gin Trp Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn
100 105 110
Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys
115 120 125
Pro Ser Ala Ala Ser lie Asp Ala Ala Lys Lys Ala Gly Val Asn Asn
130 135 140
Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gin Gin Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly 145 150 155 '160
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Phe Met Ser Lys Gly Glu 165 170 175
Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro lie Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp
"180 185 190
Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala
195 200 205
Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe ll.e Cys Thr Thr Gly Lys Leu
210 215 220
Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Phe Ser Tyr Gly Val Gin225 230 235 240
〇ys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gin His Asp Phe Phe廠ys
245 250 255
Ser Ala Met Pro Glu G一y Tyr Val〇h Glu Arg Thr lie Phe Phe Lys
260 265 270
Asp Asp G一y Asn Tyr Lys Thr Arg Ala G一u Val Lys Phe Glu G一y Asp
280
Thr廠eu Val Asn Arg lie Glu廠eu廠ys Gly lie Asp F-he廠ys Glu Asp
290 295 300
Gly Asn lie Leu〇ly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn
305 310 315 320
Val Tyr lie Met Ala Asp Lys Gin Lys Asn Gly lie Lys Val Asn Phe
325 330 335
廣ys lie Arg His Asn lie llys Asp Gly Ser Val Gin廠eu Ala Asp His
340 350
Tyr Gin Gin Asn Thr Pro lie Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp
355 360 365
Asn His Tyr lieu Ser Thr Gin Ser Ala廠eu Ser llys Asp Pro Asn〇lu
370 375 380
Lys Arg Asp His Met va一 Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly lie
381 385 390 395
Thr His G一y Met Asp Glu Leu Tyr Lys
400 40權(quán)利要求
1. 一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一綠色熒光蛋白構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的N端。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ.N0 2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種融合蛋白，其特征在于所述的鏈親和素位于接頭肽的C端。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述的的鏈親和素部分的末端連接有純化 標(biāo)簽。
6. —種基因，該基因編碼權(quán)利要求l、 2、 3或4融合蛋白。
7. —種表達(dá)載體，該表達(dá)載體含有權(quán)利要求5所述的基因。
8. —種工程菌，該工程菌轉(zhuǎn)化了權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。
9. 權(quán)利要求l、 2、 3或4所述的融合蛋白在制備腫瘤疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種融合蛋白，該蛋白由接頭肽連接一鏈親和素和一綠色熒光蛋白構(gòu)成，其中所述的接頭肽的氨基酸序列為Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer。本發(fā)明融合蛋白同時(shí)具有鏈親和素和綠色熒光蛋白的活性，可通過鏈親和素與生物素的強(qiáng)力結(jié)合將綠色熒光蛋白錨定在生物素化的腫瘤細(xì)胞表面，且能在γ-射線滅活的腫瘤細(xì)胞表面穩(wěn)定存在，并仍保持綠色熒光蛋白的活性。本發(fā)明融合蛋白可用于研究其在靶細(xì)胞表面的定量結(jié)合和代謝規(guī)律，并作為表面修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗預(yù)防和治療腫瘤效果的陰性對照。
文檔編號A61K39/00GK101531720SQ20091000346
公開日2009年9月16日 申請日期2009年1月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月1日
發(fā)明者琳 張, 林來新妹, 華 蘇, 高基民 申請人:溫州醫(yī)學(xué)院