專(zhuān)利名稱(chēng)：源自大麥和麥芽的低dms水平的飲料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及源自大麥的飲料，其特征在于二甲基硫醚(DMS)和/或其前體S-甲基-L-甲硫氨酸(SMM)的水平均顯著降低或者缺乏所述化合物中的一種或優(yōu)選缺乏所述兩種化合物。此外，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)上述飲料的方法以及用于制備此飲料的大麥植物和由所述植物制備的其它植物產(chǎn)品。本發(fā)明不但能夠產(chǎn)生特征在于具有改良風(fēng)味譜的飲料，還促成了熱能輸入(特別是煮沸麥芽汁的熱能輸入)顯著降低的新式生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
飲料，特別是啤酒可以以大麥(Hordeum vulgare,L)為基礎(chǔ)生產(chǎn)，大麥?zhǔn)窃耘嘤谑澜缭S多地方的單子葉植物。大麥具有非常重要的經(jīng)濟(jì)地位，其不僅作為用于包括啤酒在內(nèi)的工業(yè)產(chǎn)品的原材料，還作為動(dòng)物飼料的來(lái)源。在啤酒以及包括茶、可可、乳、葡萄酒、蒸餾酒(例如朗姆酒)、甜玉米和多種烹飪蔬菜在內(nèi)的許多蔬菜和食品中，DMS給產(chǎn)品添加了突出且通常是有益的氣味和風(fēng)味韻調(diào) (flavor note)。然而，高水平的DMS產(chǎn)生可能是不期望的風(fēng)味，其通常被描述為“熟甜玉米 (cooked sweet corn) ”或者有時(shí)被描述為“黑醋栗樣”的風(fēng)味。根據(jù)啤酒的類(lèi)型，DMS水平通常可達(dá)到144 μ g/L并且有時(shí)可高達(dá)150ppb (150 μ g/ L)，其中所述DMS化合物通常產(chǎn)生不期望的“熟蔬菜”或“甘藍(lán)樣”風(fēng)味。然而，有時(shí)期望在儲(chǔ)藏啤酒(lager beer)中具有低水平的所述化合物，原因是其可有利于口感醇厚(palate fullness)和整體的啤酒芳香；感覺(jué)閾值為 25_50ppb，例如約30-45 μ g/L(Meilgaard, 1982)。當(dāng)DMS水平為< IOppb時(shí)，通常感覺(jué)不到DMS風(fēng)味。SMM在本文也稱(chēng)為DMS前體(DMSP)，它是通過(guò)SMM循環(huán)(圖1A)功能性組件的作用而在萌芽的大麥粒中合成的。其中，甲硫氨酸(Met)-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(MMT)催化S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)的甲基轉(zhuǎn)移至Met，形成SMM。化合物SMM可進(jìn)而作為由高半胱氨酸(Hcy) 合成Met的甲基供體(由Hcy-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)催化的反應(yīng))。雖然對(duì)于MMT的明確作用存在爭(zhēng)議，但最初提出其作用是防止用于蛋白合成的Met池被AdoMet的過(guò)度合成而耗盡(Mudd and Datko, 1990)。還提出SMM循環(huán)在植物的長(zhǎng)距離硫傳輸中發(fā)揮作用，其涉及葉中從Met至SMM的主流動(dòng)(major flux)、SMM的韌皮部傳輸以及在發(fā)育籽?；蚱渌鼉?chǔ)存組織(sink tissues)中SMM恢復(fù)為Met (Bourgis et al.，1999)。但稍后的放射性示蹤劑試驗(yàn)表明，所述循環(huán)操縱用于控制AdoMet水平而不是用于防止Met耗盡(Ranocha et al., 2001)。SMM在植物中的生理學(xué)作用的另一種解釋涉及乙烯合成的調(diào)節(jié)(Ko et al. ,2004), 其主要涉及通過(guò)使用來(lái)自比赤酵母的重組ι-氨基環(huán)丙烷-ι-羧酸酯合成酶的研究而揭示的觀(guān)點(diǎn)。McElroy和Jacobsen (19%)指出，可通過(guò)利用例如反義技術(shù)調(diào)節(jié)SMM合成，然而其沒(méi)有提供有關(guān)待反義處理的相關(guān)靶基因的指導(dǎo)，但是預(yù)期獲得陽(yáng)性結(jié)果的可能性值得懷疑，原因是SMM水平的大幅降低可能對(duì)大麥生長(zhǎng)和發(fā)育有害。McElroy和Jacobsen (見(jiàn)上) 并沒(méi)有討論獲得較低水平SMM的其它方案。此外，如下文將詳細(xì)討論的，用以完全消除基因表達(dá)的反義技術(shù)還沒(méi)有成功地應(yīng)用在大麥中。遺憾的是，還沒(méi)有用于制備指定蛋白表達(dá)完全缺失的轉(zhuǎn)基因大麥植物的方法。對(duì)于大麥，應(yīng)用反義技術(shù)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物通常仍然表達(dá)一些指定蛋白(參見(jiàn)，例如RcAbins et al. 1998 ；Stahl et al. ,2004 ；Hansen et al.，2007)。此外，還沒(méi)有開(kāi)發(fā)出應(yīng)用于大麥植物的利用嵌合RNA/DNA或定點(diǎn)突變而制備特異突變體的有效方法。與此相符，盡管進(jìn)行了大量工作，本申請(qǐng)的發(fā)明人還是沒(méi)有獲知成功地在大麥中進(jìn)行由寡核苷酸引導(dǎo)的基因靶向的任何公開(kāi)實(shí)例。雖然沒(méi)有在大麥中繼續(xù)進(jìn)行，但I(xiàn)ida和Terad乂2005)發(fā)現(xiàn)已經(jīng)在玉米、煙草和水稻中測(cè)試了由寡核苷酸引導(dǎo)的基因靶向，只是在所有情況下都使用除草劑抗性基因乙酰乳酸合成酶(ALQ作為靶標(biāo)。根據(jù)Iida和Terada(Ii)的結(jié)論，仍未確定對(duì)上述策略的適當(dāng)改進(jìn)是否可應(yīng)用于除可直接選擇的那些基因(例如ALS)以外的基因。利用鋅指核酶的靶向突變代表了可潛在地用于基礎(chǔ)植物生物學(xué)或農(nóng)作物改進(jìn)的未來(lái)研究的另一類(lèi)工具(Durai et al.，2005 ；Tzfira and White, 2005 ；Kumar et al. ,2006) 即便在這種情況下，突變也沒(méi)有在大麥中繼續(xù)進(jìn)行或者成功地應(yīng)用于大麥。雖然如此，仍可以利用輻射或化學(xué)處理，例如利用疊氮化鈉(NaN3)處理，通過(guò)隨機(jī)誘變法制備大麥突變體。一個(gè)實(shí)例涉及致力于通過(guò)利用NaR誘變大麥粒(kernel)，隨后篩選高水平游離磷酸鹽(phosphate)，來(lái)鑒定低肌醇六磷酸鹽(phytate)突變體(Rasmussen and Hatzack, 1998)；從2，000個(gè)篩選的大麥粒中總共鑒定出10個(gè)突變體。雖然并非總是如此，但在NaN3處理后的發(fā)現(xiàn)特定突變依賴(lài)于持續(xù)和有效的篩選方法，因此，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能總是成功。在傳統(tǒng)植物育種中，與鑒定有希望的分子靶標(biāo)相關(guān)的難點(diǎn)在于難以確定應(yīng)當(dāng)干擾指定生物化學(xué)通路中的何種成分才能產(chǎn)生系統(tǒng)讀數(shù)的期望變化，以及由此建立有用篩選方法的能力。與啤酒生產(chǎn)相關(guān)的高溫溫育，例如麥芽的烘干(kiln drying)，或麥芽汁的加熱和煮沸可能誘導(dǎo)SMM至DMS的化學(xué)轉(zhuǎn)化。由于DMS本身的性質(zhì)，特別是其沸點(diǎn)僅為37°C _38°C， 在烘干和麥芽汁煮沸過(guò)程中形成的大部分DMS可能流失至空氣中。在高于 70°C的溫度下，DMS的揮發(fā)性降低至非常低的水平(Scheuren and Sommer，2008)，但這也是用于進(jìn)一步氧化成二甲基亞砜(DMSO)的條件。當(dāng)煮沸麥芽汁的持續(xù)時(shí)間或者效力不足以轉(zhuǎn)化殘余SMM 時(shí)，DMS可在麥芽汁冷卻過(guò)程中繼續(xù)形成，隨后被傳送至啤酒中。已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了用于降低啤酒中的DMS水平的技術(shù)方法。例如，AU 38578/93 描述了用于降低麥芽中DMS水平的方法，其包括對(duì)所述麥芽進(jìn)行蒸汽處理。在 Bisgaard-Frantzen, H. et al.的專(zhuān)利申請(qǐng) US 2006/0057684 中描述了包括在 70°C 以上的溫度下對(duì)醪液(mash)進(jìn)行熱處理的釀造方法。而在Reuther，H.的美國(guó)專(zhuān)利No. 5，242, 694 中描述了用于制備低碳水化合物的啤酒的方法，其中所述方法包括全面煮沸麥芽汁，然后用二氧化碳洗滌所述麥芽汁。然而，上述所有處理都消耗大量能量，并且還可能改變麥芽或麥芽汁的特征。發(fā)明概述本發(fā)明公開(kāi)了由大麥或其部分制備的飲料，特別是具有改良風(fēng)味的啤酒。本文公開(kāi)的飲料具有非常低的DMS水平或者完全沒(méi)有DMS，特別是DMS水平低于感覺(jué)閾值的飲料， 因此，其特征在于沒(méi)有DMS的味道。此外，本發(fā)明的飲料具有上好的味道性質(zhì)。因此，本發(fā)明飲料的特征在于特別均衡、可飲用、高度新鮮且芬芳的植物風(fēng)味。因此，本發(fā)明提供了由于不存在DMS或者DMS水平低而具有顯著風(fēng)味性質(zhì)的飲料。 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，DMS顯著影響了人對(duì)啤酒中酯味(estery)化合物的感知(參見(jiàn)圖1B)，這符合本發(fā)明人提出的DMS掩蓋所述化合物味道的模型。特別重要的是，本發(fā)明提供了具有特異阻斷DMS前體形成的缺陷的大麥或麥芽粒。由此，可以避免上文所述的DMS對(duì)酯味道的掩蓋，其為大麥和麥芽的工業(yè)應(yīng)用提供了新機(jī)會(huì)。此外，具有特異阻礙DMS前體形成的缺陷的大麥或麥芽粒還具有由DMS本身的缺乏引起的味道性質(zhì)。特別地，所述大麥或麥芽類(lèi)型可被開(kāi)發(fā)為實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中的原料，這有助于建立遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)當(dāng)前性能的定制生產(chǎn)設(shè)置。具體而言，改良涉及到啤酒質(zhì)量和啤酒生產(chǎn)的環(huán)境可持續(xù)性，特別是(i)具有低水平的DMS特異性味道的啤酒；(ii)具有改良的酯味道譜的啤酒；(iii)用于啤酒生產(chǎn)的能量輸入降低；和(iv)在麥芽汁生產(chǎn)中的能量消耗降低。本發(fā)明提供了實(shí)現(xiàn)所述改良的大麥植物和大麥粒。因此，不受有關(guān)SMM代謝如何能與其它生物過(guò)程交互的理論因素的束縛，本申請(qǐng)?zhí)峁┝擞糜陂_(kāi)發(fā)和探究SMM合成缺陷型大麥植物的釀酒和工業(yè)應(yīng)用的機(jī)會(huì)，這在此前從未被提出過(guò)。本發(fā)明公開(kāi)了由攜帶了引起MMT活性完全喪失的MMT編碼基因突變的大麥植物或者其部分制備的特征在于低水平DMS特異性味道和改良的酯味道譜的飲料，和/或特別均衡且可飲用，即高度新鮮且具有芬芳的植物風(fēng)味的飲料。此類(lèi)植物在本文中稱(chēng)為“MMT無(wú)效 (無(wú)效MMT) ”大麥。因此，本發(fā)明在一方面涉及由大麥植物或其部分制備的飲料，其中，所述飲料含有的DMS水平低于30bbp (例如小于30ppb DMS)，并且其中所述大麥植物攜帶引起MMT活性完全喪失的MMT編碼基因突變。另一方面，本發(fā)明提供了用于制備所述飲料的大麥植物。因此，本發(fā)明的目的還在于提供大麥植物或其部分，其中，所述大麥植物攜帶引起MMT活性完全喪失的MMT編碼基因突變。此外，本發(fā)明涉及由所述MMT無(wú)效大麥植物產(chǎn)生的植物產(chǎn)品，包括例如麥芽和麥芽汁組合物，或基于大麥的糖漿或提取物，或者基于麥芽的糖漿或提取物，或者輔料。在本發(fā)明中，所述輔料可以為未發(fā)芽的大麥，其可以單獨(dú)使用或者與發(fā)芽大麥組合用于制備麥芽汁。此外，本發(fā)明還提供了制備所述大麥植物的方法以及制備所述飲料和其它植物產(chǎn)品的方法。另外，在當(dāng)今世界，環(huán)境破壞已提上國(guó)際議程，社會(huì)和工業(yè)應(yīng)該致力于降低全球溫室氣體排放和環(huán)境效益。因此，本發(fā)明的目的是提供用于利用低能耗方法的啤酒生產(chǎn)的大麥植物。因此，本發(fā)明的大麥植物可用于利用與常規(guī)的釀造方法相比，其加熱步驟的時(shí)間跨度縮短，或者加熱步驟的溫度降低的方法進(jìn)行啤酒生產(chǎn)。本發(fā)明的重要意義在于，在烘干和麥芽汁煮沸工序的步驟中的受益，與標(biāo)準(zhǔn)的釀造和啤酒生產(chǎn)方案相比，這些步驟可以被顯著縮短或者在較低的溫度進(jìn)行，由此降低能量消耗，從而提供更可持續(xù)的啤酒生產(chǎn)方法。序列表根據(jù)以下詳細(xì)描述和構(gòu)成本申請(qǐng)一部分的附屬序列表(總結(jié)在表10中)能夠更全面地理解本發(fā)明。表10列出了本文描述的核酸和多肽，所述寡核苷酸引物和CDNA以及 gDNA克隆的命名，其包括編碼代表這些多肽的全部或者大部分的多肽的核酸片段和相應(yīng)的標(biāo)識(shí)符(SEQ ID NO:)。所附序列描述和序列表符合專(zhuān)利申請(qǐng)中核苷酸和/或氨基酸序列公開(kāi)的管理標(biāo)準(zhǔn)。


圖1顯示了 SMM循環(huán)的所選成分和平均風(fēng)味分值。(A) SMM循環(huán)的所選成分，其中通過(guò)由Met-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(MMT)催化的從S-腺苷甲硫氨酸(SAM)至甲硫氨酸(Met)的甲基轉(zhuǎn)移而合成SMM。SMM可以進(jìn)而在由Hcy-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)催化的反應(yīng)中作為由高半胱氨酸(Hcy)合成Met的甲基供體。該圖顯示了本質(zhì)上可逆的反應(yīng)是如何相關(guān)連的。所述循環(huán)的每一輪都是無(wú)益的，原因是其在消耗并隨后重新產(chǎn)生兩個(gè)Met的同時(shí)將ATP轉(zhuǎn)化為腺苷、PPi和Pi (未顯示)。(B)顯示的是專(zhuān)業(yè)啤酒品嘗小組在所列性質(zhì)(主味(body)、 酯味和DMS)方面對(duì)啤酒樣品給出的平均風(fēng)味打分士標(biāo)準(zhǔn)偏差。標(biāo)準(zhǔn)啤酒的對(duì)照樣本僅攙入啤酒(標(biāo)記為“0”的柱)，或者攙入酯混合物，以在啤酒中產(chǎn)生以下濃度5ppm乙酸乙酯、1. 5ppm乙酸異戊酯、0. 05ppm己酸乙酯、0. 13ppm辛酸乙酯(標(biāo)記為“1”的柱)，和包含 IOOppb DMS的上述酯混合物(標(biāo)記為“2”的柱)。圖2顯示了參與熒光化合物SMM-OPA的堿性形成的分子。圖3顯示了用以證明突變體8063和突變體14018的MMT無(wú)效表型的HPLC 和western印跡試驗(yàn)的結(jié)果。(A)基于HPLC分離cv. Prestige (其中cv.是栽培品種 culti (vated)var(iety)的縮寫(xiě))的嫩芽提取物的實(shí)例，其中顯示了天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(kr)和SMM的洗脫。在340nm激發(fā)OPA衍生化的大麥嫩芽提取物的熒光，并測(cè)定450nm處的發(fā)光。(B)基于HPLC分離指定突變體和野生型 cv. Sebastian的提取物。由突變體提取物中成分的分離產(chǎn)生了沒(méi)有SMM特異性峰的色譜圖。(C)根據(jù)大小從野生型I^restige (泳道2)、突變體8063 (泳道幻、野生型Sebastian (泳道5)和突變體14018(泳道6)的嫩芽提取物中分離的蛋白的western印跡結(jié)果。在泳道1、 4和7中分離了具有所示質(zhì)量(kDa)的參考蛋白，同時(shí)使用來(lái)自大腸桿菌細(xì)胞的重組MMT作為對(duì)照并在泳道8中分離。如實(shí)施例12中的詳細(xì)描述，120-kDa的蛋白染色條帶代表MMT， 但大腸桿菌提取物中的80-kDa條帶不是源自MMT，原因是該條帶還存在于用載體pET19b轉(zhuǎn)化的陰性對(duì)照細(xì)胞的提取物中(參見(jiàn)圖14B、C)。圖4顯示了突變體8063的4日齡嫩芽中不存在MMT活性，但在類(lèi)似萌芽長(zhǎng)度的野生型嫩芽中具有突出的活性。利用[3H] SAM作為底物測(cè)定MMT活性。在利用活性炭除去殘留的[3H] SAM后，通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)MMT催化的甲基由[3H] SAM轉(zhuǎn)移至Met形成SMM。其與底物結(jié)合，但不與新合成的標(biāo)記產(chǎn)物SMM結(jié)合。該圖示還顯示SMM不存在于突變體的嫩芽中，但存在于野生型的嫩芽中。分析了突變體和野生型植物的共30個(gè)嫩芽(突變體和野生型植物各15個(gè)嫩芽)。圖5顯示了野生型和MMT無(wú)效型的麥芽、麥芽汁和啤酒中游離DMSP和游離DMS含量的比較。(A)突變體8063的綠色麥芽和烘干麥芽的DMSP和游離DMS水平均顯著降低。 (B)突變體8063的甜麥芽汁和煮沸麥芽汁幾乎都缺乏DMSP和游離DMS，并且利用突變體 8063的麥芽制備的啤酒的游離DMS也非常低。圖6顯示了由10人啤酒品嘗小組建立的風(fēng)味譜的比較；試驗(yàn)包括用野生型 cv. Power的麥芽和突變體8063 (MMT無(wú)效)的麥芽釀造的啤酒。這種類(lèi)型的分析利用了圖中所示的可以在0-5的分值上計(jì)量的多個(gè)預(yù)定的風(fēng)味特征。只有當(dāng)其性質(zhì)被認(rèn)為在所分析的啤酒類(lèi)型中是最高的時(shí)，才將該風(fēng)味評(píng)判為“極高”(分值對(duì)應(yīng)于5)。(A)啤酒品嘗小組對(duì)攙有酯和醇的啤酒的評(píng)價(jià)總結(jié)列于表1。(B)詳述品嘗小組對(duì)無(wú)攙加啤酒的評(píng)價(jià)總結(jié)。圖7顯示了繁殖NaN3-誘變的大麥粒的方式的圖示。MO代的大麥粒生長(zhǎng)為形成Ml 代大麥粒的植物。可以播種這些Ml大麥粒，并生長(zhǎng)為產(chǎn)生M2代新大麥粒的Ml植物。接下來(lái)，培育M2代植物并產(chǎn)生M3代大麥粒。也可以使M3代大麥粒萌芽，并利用其樣本例如胚芽鞘進(jìn)行分析。還可以播種M3種子并利用對(duì)應(yīng)植物的花進(jìn)行雜交獲取M4代植物。圖8顯示了優(yōu)選的啤酒生長(zhǎng)工藝的簡(jiǎn)單圖示概要，其包括浸泡大麥谷粒(1)、萌芽 O)、烘干(3)、研磨干燥的麥芽、糖化(5)、過(guò)濾(6)、在添加酒花的情況下煮沸麥芽汁 (7)、在存在酵母的情況下發(fā)酵(8)、啤酒熟化(9)、啤酒過(guò)濾(10)、包裝到如瓶、罐等中(11) 和貼標(biāo)簽(1 。這些獨(dú)立的步驟可以集合成包括生產(chǎn)麥芽(1-3)、生產(chǎn)麥芽汁G-7)、發(fā)酵 (8-9)和制備成品啤酒(10-1 的部分。雖然圖示的是優(yōu)選的方法，但可以包括省略一些所述步驟(例如可以省略過(guò)濾或者可以不加入酒花)的可選方式，或者可加入一些額外步驟 (例如添加輔料或碳酸鹽/酯)。還可以利用發(fā)芽和未發(fā)芽大麥的混合物，或者僅用未發(fā)芽大麥產(chǎn)生啤酒，在后一情況下通常在糖化過(guò)程中加入外源酶。圖9以圖示形式顯示了編碼MMT的大麥基因的構(gòu)造。所圖示的是跨越翻譯起始密碼子和終止密碼子的長(zhǎng)度為6368-bp的基因組序列(SEQ ID NO :3)。外顯子和內(nèi)含子分別以編號(hào)的盒和未編號(hào)的線(xiàn)表示。外顯子12用箭頭表示以顯示轉(zhuǎn)錄和翻譯的整體方向。核苷酸編號(hào)是指相對(duì)于翻譯起始密碼子第一堿基的所示外顯子的5'和3'末端。還圖示了對(duì)應(yīng)于使用表2所示引物對(duì)的擴(kuò)增的PCR延伸段的大致位置。圖10顯示了與翻譯序列(SEQ ID NO :6，利用單字母代碼表示氨基酸)并行排列的cv. Prestige大麥MMT的cDNA序列，其跨越了翻譯起始密碼子和終止密碼子，即編碼區(qū) (SEQ ID NO 4)ο圖11 顯示了大麥品種 cv. Haruna Nijo (SEQ ID NO :2)和 cv. Prestige (SEQ ID NO 6)的幾乎相同的MMT酶的序列比對(duì)。兩個(gè)單獨(dú)的氨基酸殘基差別用黑底白字突出顯示。圖12顯示了大麥突變體8063如何激活MMT基因內(nèi)的隱藏剪接位點(diǎn)。(A)在MMT 基因的基因組結(jié)構(gòu)圖示下方的小水平箭頭表示引物對(duì)15 (參見(jiàn)表4)的近似退火位置。(B) 對(duì)利用來(lái)自野生型cv. Prestige或者突變體8063的RNA模板的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (RT-PCR)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后的可視化DNA條帶。(C)利用與A相同的圖示元素， 顯示圖12B中PCR產(chǎn)物的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)的圖示。產(chǎn)物4的外顯子5比野生型的短。 垂直箭頭指向翻譯提前終止密碼子(premature stop codon)的近似位置。由于選擇的引物，所述產(chǎn)物不包含外顯子1和2。然而，預(yù)測(cè)mRNA也包含外顯子1和2。(D)由內(nèi)含子5內(nèi)的突變(Mut.)和野生型(WT)5'剪接位點(diǎn)(突變位點(diǎn)用帶下劃線(xiàn)的堿基表示)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的詳細(xì)圖示。用3和4標(biāo)記的連接實(shí)線(xiàn)的箭頭分別標(biāo)記了在產(chǎn)物3和產(chǎn)物4(參見(jiàn)圖 12C)的剪接過(guò)程中使用的供體和受體位點(diǎn)。標(biāo)記為2*的虛線(xiàn)指向野生型轉(zhuǎn)錄本(圖12C 的產(chǎn)物1)的剪接和未剪接的產(chǎn)物2(參見(jiàn)圖12C)。外顯子和內(nèi)含子5的堿基分別用小寫(xiě)和大寫(xiě)字母表示。nt:核苷酸。(E)與突變體8063的MMT基因中內(nèi)含子5的序列相比，單子葉植物中5'和3'剪接位點(diǎn)的組成的概述(Sinibaldi and Mettler，1992)。圖13顯示了用于突變體8063的異常MMT的異源表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒，和編碼蛋白的比對(duì)。(A)包括所選限制性位點(diǎn)的pET19b-MMT的NcoI-BamHI片段的圖示，所述片段編碼在帶有腸激酶位點(diǎn)；序列SSGHIDDDDKH;SEQ ID NO :70)的框中與指定His-標(biāo)簽的序列 (* ；序列MGHHHHHHHHHH ;SEQ ID NO :69)融合的野生型MMT。刪除構(gòu)建體示于(B)、(C)和 (D)中。(E)所編碼的匪T序列(圖A、B、C禾Π D中所示的構(gòu)建體分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs 6、11、13、15)的比對(duì)。使用對(duì)應(yīng)于星號(hào)標(biāo)記序列段的合成肽來(lái)產(chǎn)生針對(duì)大麥MMT的多克隆抗體。對(duì)于野生型酶(SEQ ID NO :6)，沒(méi)有顯示跨越第333位殘基至第1084位殘基的序列。圖14顯示了在大腸桿菌中異源表達(dá)分別來(lái)自cv. I^restige和突變體8063的野生型MMT和突變型MMT的結(jié)果，其試驗(yàn)細(xì)節(jié)描述在實(shí)施例12中。利用由載體pET19b轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的提取物以及純SMM試樣作為試驗(yàn)對(duì)照樣本。掃描后通過(guò)電子方式抹去兩個(gè)印跡中泳道4和5之間包含了與本申請(qǐng)無(wú)關(guān)的數(shù)據(jù)的凝膠面積。㈧純SMM以及來(lái)自用所示質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的提取物的HPLC-圖譜。出于比較目的，所示圖譜還是圖18的實(shí)體部分。(B)利用質(zhì)粒pET-MMT(泳道2)、pET19b-Line8063_Prod3 (泳道3)、 PET19b-Line8063-Prod4 (泳道4)和pET19b (泳道幻轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的可溶性細(xì)胞提取物的根據(jù)大小分離的蛋白的Western印跡結(jié)果。泳道1中分離的是具有所示質(zhì)量(kDa) 的參照蛋白。(C)用上文圖14B部分所示的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的包涵體提取物的根據(jù)大小分離的蛋白的Western印跡結(jié)果。在Western分析中使用的多克隆一抗是針對(duì)合成的大麥MMT的長(zhǎng)15個(gè)殘基的肽而產(chǎn)生的，其對(duì)應(yīng)于圖13中用星號(hào)標(biāo)記的氨基酸延伸段。圖15顯示了用于鑒定以突變體8063的MMT基因中的G3076 — A突變?yōu)樘卣鞯墓攘５姆椒▓D示。如在相應(yīng)反應(yīng)(C)的瓊脂糖凝膠電泳后溴化乙錠染色的條帶圖案所示，引物對(duì)20 (參見(jiàn)表7)在設(shè)定的反應(yīng)1和反應(yīng)2 (A)中分別產(chǎn)生了 271-bp PCR片段和沒(méi)有產(chǎn)生條帶。在設(shè)定的反應(yīng)3和4中(B)，僅后者產(chǎn)生PCR片段。水平箭頭表示與模板DNA的全序列匹配，而具有銳彎曲的箭頭顯示錯(cuò)配。(D)利用抗-MMT抗體的Western印跡分析識(shí)別了野生型cv. Prestige麥粒中的120_kDa MMT酶(泳道2、，而突變體8063中則沒(méi)有識(shí)別。 在泳道1中分離的是標(biāo)準(zhǔn)蛋白，并顯示相應(yīng)的質(zhì)量(kDa)。圖16顯示大麥突變體14018如何激活MMT基因中的隱藏剪接位點(diǎn)。(A)MMT基因的基因組結(jié)構(gòu)圖示下方的小水平箭頭表示引物對(duì)16(參見(jiàn)表4)的近似退火位置。(B)對(duì)利用來(lái)自野生型(cv. Sebastian)或突變體14018的RNA模板的RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后的可視化DNA條帶。(C)利用與A相同的圖示元素，顯示16B中PCR產(chǎn)物的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)的描述。與野生型的外顯子2相比，產(chǎn)物8的外顯子2被截短。垂直箭頭指向翻譯提前終止密碼子的近似位置。由于選擇的引物，產(chǎn)物不包含外顯子1。然而，可以預(yù)測(cè)mRNA也包含外顯子1。(D)對(duì)由內(nèi)含子2中的突變(Mut.)和野生型(WT) 5'剪接位點(diǎn)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本的詳細(xì)圖示，其中用帶下劃線(xiàn)的堿基表示突變位點(diǎn)。用7和8標(biāo)記的連接實(shí)線(xiàn)的箭頭分別標(biāo)記了在產(chǎn)物7和產(chǎn)物8 (參見(jiàn)圖16C)的剪接過(guò)程中使用的供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)。標(biāo)記6*的虛線(xiàn)指向野生型轉(zhuǎn)錄本(圖16C的產(chǎn)物幻的剪接和未剪接的產(chǎn)物6(參見(jiàn)圖16C)。外顯子和內(nèi)含子2的堿基分別用小寫(xiě)和大寫(xiě)字母表示。nt:核苷酸。(E)與突變體14018的MMT基因中內(nèi)含子2的序列相比，單子葉植物中5'和3'剪接位點(diǎn)的組成的概述(Sinibaldi and Mettler，見(jiàn)上文)。圖17顯示了用于突變體14018的異常MMT的異源表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒，和編碼蛋白的比對(duì)。(A)包括所選擇的限制性位點(diǎn)的pET19b-MMT的NcoI-BamHI片段的圖示，所述片段編碼在帶有腸激酶位點(diǎn)；序列SSGHIDDDDKH ；SEQ ID NO 70)的框中與指定His-標(biāo)簽的序列(* ；序列MGHHHHHHHHHH ;SEQ ID NO :69)融合的野生型MMT。刪除構(gòu)建體示于(B)、 (C)和(D)中。(E)所編碼的MMT序列(圖A、B、C和D中所示的構(gòu)建體分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NOs :18,22,24,26)的比對(duì)。對(duì)于野生型酶(SEQ ID NO 18)，沒(méi)有顯示跨越第213位殘基至第1084位殘基的序列。圖18顯示在大腸桿菌中異源表達(dá)分別來(lái)自cv. Prestige和突變體14018的野生型和突變型MMT的基于HPLC的試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)細(xì)節(jié)描述在實(shí)施例15中。利用純SMM和由載體pET19b轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的提取物作為試驗(yàn)對(duì)照樣本。出于比較目的，用星號(hào)標(biāo)記的色譜圖也是圖14A的實(shí)體部分。圖19顯示了用于鑒定以突變體14018的MMT基因中的G1462 — A突變?yōu)樘卣鞴攘５倪z傳方法的圖示。如相應(yīng)反應(yīng)(C)的瓊脂糖凝膠電泳后溴化乙錠染色的條帶圖案所示， 引物對(duì)29 (參見(jiàn)表9)在設(shè)定的反應(yīng)1和反應(yīng)2(A)中分別產(chǎn)生了 121-bp PCR片段和沒(méi)有產(chǎn)生條帶。在設(shè)定的反應(yīng)3和4中(B)，僅后者產(chǎn)生PCR片段(123bp)。水平箭頭表示與模板DNA的全序列匹配，而具有銳彎曲的箭頭顯示錯(cuò)配。(D)利用抗-MMT抗體的Western印跡分析識(shí)別了野生型cv. Sebastian麥粒中的120_kDa MMT酶(泳道2)，但突變體14018中則沒(méi)有識(shí)別。在泳道1中分離標(biāo)準(zhǔn)蛋白，并顯示相應(yīng)的質(zhì)量(kDa)。發(fā)明詳述定義在隨后的說(shuō)明書(shū)、附圖和表中使用了許多術(shù)語(yǔ)。為了提供包括給出這些術(shù)語(yǔ)的范圍的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，提供了下列定義本文使用的“一”可以指一個(gè)或多個(gè)，這取決于其使用的上下文。術(shù)語(yǔ)“農(nóng)學(xué)特征”描述了有助于形成所述植物的性能或經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物表型或遺傳特征。這種特征包括抗病性、抗蟲(chóng)性、抗病毒性、抗線(xiàn)蟲(chóng)性、抗旱性、高鹽度耐受性、產(chǎn)量、 株高、成熟天數(shù)、麥粒分級(jí)(即麥粒的大小分級(jí))和麥粒的含氮量等。與啤酒制造過(guò)程，特別是用于描述麥粒發(fā)芽(malting)過(guò)程時(shí)，相關(guān)術(shù)語(yǔ)“大麥” 指大麥粒。在其它所有情況下，除非另有說(shuō)明，否則“大麥”是指包括任何品種的大麥植物 (Hordeum vulgare, L.)，而大麥植物的部分可以是大麥植物的任何部分，例如任何組織或細(xì)胞。在本文中限定的“谷類(lèi)”植物是禾本科(Graminae)植物家族的成員，其中培養(yǎng)禾本科植物主要是為了獲取其含淀粉的種子。谷類(lèi)植物包括，但不限于大麥(Hordeum屬)、小麥(Triticum屬)、稻(Oryza屬)、玉米(Zea屬)、黑麥(Secale)、燕麥(Avena屬)、高粱 (Sorghum屬)和黑小麥(Triticale,黑麥-小麥雜交種)。
本文使用的“DMSP”是DMS前體或者潛在DMS的縮寫(xiě)，即可在飲料的生產(chǎn)過(guò)程中能夠轉(zhuǎn)化為DMS的分子。SMM代表DMSP的主要部分(若非全部)。本文將DMSP的水平定義為可以通過(guò)在堿性條件下煮沸1個(gè)小時(shí)，由指定植物材料或其產(chǎn)品中的DMSP產(chǎn)生的DMS的量。根據(jù)本文的定義，IppbDMSP可以被轉(zhuǎn)化為Ippb DMS0在有關(guān)特定核酸的上下文中，“編碼”或“所編碼的”表示包含用于翻譯成特定蛋白的信息。編碼蛋白的核酸可在核酸翻譯區(qū)內(nèi)包含非翻譯序列(例如內(nèi)含子)，或者可以缺乏這種插入的非翻譯序列(例如在cDNA中)。利用密碼子對(duì)編碼蛋白的信息進(jìn)行說(shuō)明。本文在有關(guān)核酸的上下文中使用的“表達(dá)”應(yīng)理解為來(lái)源于核酸片段的正義mRNA 或者反義RNA的轉(zhuǎn)錄和集聚。在有關(guān)蛋白質(zhì)的上下文中使用的“表達(dá)”指將mRNA翻譯成多肽。術(shù)語(yǔ)“基因”指參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA片段；其包括在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域 (啟動(dòng)子和終止子)。此外，編碼蛋白的植物基因是不連續(xù)的，由被內(nèi)含子中斷的外顯子組成。在轉(zhuǎn)錄成RNA之后，通過(guò)剪接除去內(nèi)含子以產(chǎn)生成熟的信使RNA(mRNA)。通常通過(guò)作為剪接過(guò)程的剪接信號(hào)的共有序列確定外顯子之間的“剪接位點(diǎn)”，剪接過(guò)程包括從初級(jí)RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物刪除內(nèi)含子和在切除內(nèi)含子的任一側(cè)連接或融合剩余RNA的末端。本文使用的術(shù)語(yǔ)“萌芽(germination)”表示大麥粒在各種組合物中，例如在見(jiàn)于自然界的普通土壤中開(kāi)始或恢復(fù)生長(zhǎng)。萌芽也可以在置于培養(yǎng)室等的盆內(nèi)土壤中進(jìn)行，或者，例如可以在置于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室皮氏培養(yǎng)皿的濕過(guò)濾紙上進(jìn)行，或者在麥粒發(fā)芽過(guò)程中進(jìn)行(例如麥芽制造廠(chǎng)的浸泡罐或萌芽盒內(nèi)進(jìn)行)。按照一般理解，萌芽包括麥粒的水合作用、麥粒的膨脹和誘導(dǎo)胚生長(zhǎng)。影響萌芽的環(huán)境因素包括濕度、溫度和含氧量。觀(guān)察根和嫩芽的發(fā)育。本文使用的術(shù)語(yǔ)“分離(的)”表示從所述物質(zhì)是從其原始環(huán)境中移出的。例如， 存在于活生物中的天然存在的多核苷酸或者多肽不是分離的，而從天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分離的相同多核苷酸或多肽是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/ 或這種多核苷酸或者多肽可以是組合物的一部分，但它們?nèi)匀皇欠蛛x，原因是這種載體或組合物不是其天然環(huán)境的一部分。術(shù)語(yǔ)“麥?！北幌薅榘ü阮?lèi)穎果，也稱(chēng)為內(nèi)部種子(internal seed)、外稃和內(nèi)稃。在大多數(shù)大麥品種中，外稃和內(nèi)稃附著于穎果上，而且是脫粒后的麥粒的一部分。但是，還存在裸麥(naked barley)品種。在這些品種中，穎果沒(méi)有外稃和內(nèi)稃，因此像小麥一樣脫粒。術(shù)語(yǔ)“麥?！焙汀肮攘！痹诒疚闹锌梢曰ビ?。“谷粒發(fā)育”是指開(kāi)始于受精且終止于麥粒成熟和干燥的大麥生命周期，其中借助或不借助液泡尋靶(vacuole targeting)將諸如糖、寡糖、淀粉、酚類(lèi)、氨基酸和蛋白的代謝儲(chǔ)備物貯備至麥粒的各種組織，例如胚乳、外種皮、糊粉和角質(zhì)鱗片(scutellum)，導(dǎo)致麥粒膨脹、麥粒飽滿(mǎn)。術(shù)語(yǔ)“功能性MMT的完全喪失”(完全喪失功能性MMT)和“MMT活性的完全喪失”(完全喪失MMT活性)是指缺乏MMT酶活性，即當(dāng)使用下文實(shí)施例2描述的試驗(yàn)時(shí)沒(méi)有可檢測(cè)到的MMT活性的大麥植物?；蛘咄ㄟ^(guò)分離所述大麥的MMT cDNA，并測(cè)定由所述cDNA 編碼的蛋白是否能夠催化甲基基團(tuán)從SAM轉(zhuǎn)移至Met，并由此形成SMM來(lái)測(cè)定大麥植物的 MMT活性。
術(shù)語(yǔ)“麥芽飲料”是指利用任選與其它成分混合的麥芽(例如發(fā)芽大麥和未發(fā)芽大麥的混合物)制備的飲料，優(yōu)選由包括用熱水溫育麥芽的步驟的方法制備的飲料。麥芽飲料可以為，例如啤酒或無(wú)酒精麥芽飲料(maltinas)。術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵的麥芽飲料”是指已經(jīng)發(fā)酵的，例如與酵母溫育的麥芽飲料。術(shù)語(yǔ)“MMT活性”是指大麥甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶的酶促活性。在本發(fā)明中，“MMT 活性”是MMT催化的Met的硫原子的甲基化以產(chǎn)生SMM。即使MMT酶可能能夠催化其它反應(yīng)，出于測(cè)定本發(fā)明的MMT活性的目的，僅應(yīng)該考慮形成SMM的活性。圖IB概述了通過(guò)甲基化將Met轉(zhuǎn)化成SMM的生物化學(xué)反應(yīng)。“ (麥粒)發(fā)芽”是在不限于麥芽制造廠(chǎng)的浸泡池和萌芽箱內(nèi)的受控環(huán)境條件下進(jìn)行的特殊萌芽形式。根據(jù)本發(fā)明的方法，麥粒發(fā)芽在浸泡大麥粒期間和/或之后開(kāi)始發(fā)生。 可以通過(guò)干燥大麥粒，例如在烘干過(guò)程中終止麥粒發(fā)芽過(guò)程。在未經(jīng)烘干的情況下，麥芽被稱(chēng)為“綠色麥芽”。應(yīng)理解，由MMT無(wú)效大麥制備的麥芽組合物包含MMT無(wú)效麥芽，例如純的 MMT無(wú)效麥芽或者包含MMT無(wú)效麥芽的任何麥芽混合物?？梢詫?duì)麥芽進(jìn)行加工，例如通過(guò)碾磨而加工，在這種情況下，還可將其稱(chēng)為“經(jīng)碾磨的麥芽”或“面粉”。“糖化”是經(jīng)碾磨的麥芽在水中的溫育。優(yōu)選在特定溫度和特定體積的水中進(jìn)行糖化以對(duì)底物進(jìn)行期望的酶促解聚合。水的溫度和體積是重要的，因?yàn)槠淠軌蛴绊憗?lái)源于麥芽的酶活性的下降速率，由此特別能夠影響能夠發(fā)生的淀粉水解的量。蛋白酶作用也可具有重要性。糖化可以在輔料存在下發(fā)生，應(yīng)該理解輔料包含除麥芽以外的任何碳水化合物源，例如但不限于作為完整麥粒或者經(jīng)加工的產(chǎn)品(例如粗面粉或淀粉)的大麥(包括MMT 無(wú)效大麥)或玉米或稻米，所有都主要用作提取物的其它來(lái)源(在麥芽汁煮沸的過(guò)程中常添加糖漿)。釀酒廠(chǎng)內(nèi)輔料的加工要求取決于所用輔料的狀態(tài)和類(lèi)型，并且特別是淀粉膠化或液化的溫度。如果膠化溫度超過(guò)正常的麥芽糖化溫度，則淀粉在添加至麥芽漿(mash)中之前就被膠化和液化。當(dāng)給定突變與純合遺傳特征鎖定時(shí)，例如在> M3代中，相應(yīng)的大麥植物在本文中可交換地稱(chēng)為“突變體”或者“突變系”或者“系”?！巴蛔儭卑ɑ虻木幋a和非編碼區(qū)的缺失、插入、取代、顛換(transversion)和點(diǎn)突變，其中非編碼區(qū)優(yōu)選為啟動(dòng)子區(qū)或內(nèi)含子。缺失可以是整個(gè)基因或者僅基因的一部分的缺失。點(diǎn)突變涉及一個(gè)堿基或者一個(gè)堿基對(duì)的變化，并且可產(chǎn)生終止密碼子、移框突變或氨基酸取代。體細(xì)胞突變是指僅發(fā)生在植物的某些細(xì)胞或組織中的且不遺傳至下一代的那些突變。生殖細(xì)胞突變可見(jiàn)于植物的任何細(xì)胞中并且是遺傳的。參考本文的圖7，其顯示了在育種程序中如何繁殖突變大麥谷粒的概述，M3代谷粒和其直接繁殖的谷?；蛘甙ㄆ渲参镌趦?nèi)的任意子代可以稱(chēng)為“原始突變體(raw mutant)”。此外，仍然參照本文圖7，術(shù)語(yǔ)“育種系”是指M4代的谷粒和包括其植物在內(nèi)的任意子代，其可能是與栽培品種的雜交結(jié)果，或者是與具有單獨(dú)的特定特征的另一育種系雜交的結(jié)果。本文使用的術(shù)語(yǔ)“MMT無(wú)效(無(wú)效MMT) ”是指功能性甲硫氨酸S-甲基轉(zhuǎn)移酶的完全喪失。因此，"MMT無(wú)效(無(wú)效MMT)大麥植物”是在編碼MMT的基因中包含導(dǎo)致功能性 MMT完全喪失的突變的大麥植物。類(lèi)似地，“MMT無(wú)效(無(wú)效MMT)麥粒”是在編碼MMT的基因中包含導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的突變的麥粒，等等以此類(lèi)推。術(shù)語(yǔ)“大麥植物的部分”，例如包含在短語(yǔ)“大麥植物或其部分”的含義中的術(shù)語(yǔ)“大麥植物的部分”包括大麥植物細(xì)胞、大麥植物原生質(zhì)體、可以再生出大麥植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、大麥植物愈傷組織(calli)和在植物或大麥植物的較大部分，例如胚、花粉、胚珠、花、麥粒、葉、根、根尖、花藥或植物的任意部分中的完整大麥植物細(xì)胞?！癙CR”或“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的用于擴(kuò)增特定DNA片段的技術(shù)(Mullis，K. B. et al.的美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，683，195 和 No. 4，800，159)。此外，反轉(zhuǎn)錄 (RT)-PCR也是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。對(duì)生物樣本進(jìn)行RT-PCR的目的是檢測(cè)特定基因的表達(dá)mRNA。當(dāng)與MMT有關(guān)時(shí)，RT-PCR通常包括獲得疑似含有MMT的mRNA的樣本，利用反轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶和一對(duì)特異性引物對(duì)樣本進(jìn)行RT-PCR以擴(kuò)增如果存在的所述RNA，并檢測(cè)作為樣本中存在MMT編碼RNA的標(biāo)志的擴(kuò)增產(chǎn)物。引物成對(duì)發(fā)揮作用“正向引物”(或“上鏈引物”或“直接引物”)和“反向引物”(或“下鏈引物“)。本文給出的引物序列為5'-至-3' 方向。術(shù)語(yǔ)“植物產(chǎn)品”表示由植物或植物部分的加工產(chǎn)生的產(chǎn)品。例如，所述植物產(chǎn)品可以是麥芽、麥芽汁、發(fā)酵或未發(fā)酵飲料、食品或飼料。本申請(qǐng)含義內(nèi)的“啤酒品嘗專(zhuān)家小組”是在品嘗和表述啤酒風(fēng)味(主要集中于酯、 高級(jí)醇、脂肪酸、硫成分和主味(body))方面受過(guò)全面訓(xùn)練的專(zhuān)家小組。雖然存在許多用于評(píng)價(jià)風(fēng)味成分的分析工具，但難以通過(guò)分析來(lái)評(píng)價(jià)風(fēng)味活性組分的相對(duì)顯著性。但是，此類(lèi)復(fù)雜的性質(zhì)可以由品嘗專(zhuān)家進(jìn)行評(píng)價(jià)。品嘗專(zhuān)家的持續(xù)訓(xùn)練包括品嘗并評(píng)價(jià)摻入了特定濃度的啤酒成分，例如乙酸異戊酯、乙酸乙酯、己酸乙酯和異戊醇的標(biāo)準(zhǔn)啤酒樣本。術(shù)語(yǔ)“剪接位點(diǎn)”表示基因的外顯子和內(nèi)含子之間的界限。因此，剪接位點(diǎn)可以是從外顯子至內(nèi)含子的邊界，也被稱(chēng)為“供體位點(diǎn)”，或者是從外顯子分隔內(nèi)含子的邊界，也被稱(chēng)為“受體位點(diǎn)”。植物的剪接位點(diǎn)通常包括共有序列。內(nèi)含子的5'末端通常由保守性GT 二核苷酸(mRNA中為⑶)組成，內(nèi)含子的3'末端通常由保守性二核苷酸AG組成。因此，內(nèi)含子的5'剪接位點(diǎn)包含內(nèi)含子的5'末端，而3'剪接位點(diǎn)包含內(nèi)含子的3'末端。優(yōu)選地，在本發(fā)明中，內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)是(i)由內(nèi)含子的最5'端的二核苷酸(通常為GT)組成的5'剪接位點(diǎn)；或者(ii)由內(nèi)含子的最3'端的二核苷酸(通常為AG)組成的3'剪接位點(diǎn)?！半[藏的剪接位點(diǎn)”在正常條件下不被識(shí)別并因此通常不引起剪接。然而，在具有位于天然元件內(nèi)的點(diǎn)突變的轉(zhuǎn)錄本中，此位點(diǎn)可以被激活用于剪接事件。“組織培養(yǎng)物”表示包含相同或不同類(lèi)型的分離細(xì)胞的組合物，和組織成為植物的部分(例如原生質(zhì)體、愈傷組織、胚、花粉和花藥等)中的那些細(xì)胞的集合。“野生大麥”，即Hordeum vulgare ssp. Spontaneum被認(rèn)為是當(dāng)今栽培大麥的祖先。認(rèn)為大麥從野生態(tài)至栽培態(tài)的轉(zhuǎn)變與該植物向“大麥當(dāng)?shù)仄贩N”的馴化同時(shí)發(fā)生。與野生大麥相比，這些大麥在遺傳上與現(xiàn)代栽培品種更緊密相關(guān)。術(shù)語(yǔ)“野生(型)”大麥?zhǔn)侵赴凑諔T例產(chǎn)生的大麥植物，優(yōu)選該術(shù)語(yǔ)是指衍生出本發(fā)明大麥植物的大麥植物，即親本植物。野生型大麥粒通?？勺鳛椤霸耘嗥贩N”(通常簡(jiǎn)稱(chēng)為“CVS”，即由國(guó)家植物育種組織列出的在遺傳上相似的麥粒)而得自例如種子公司。術(shù)語(yǔ) “栽培品種”和“品種”在本文中可以交換使用。術(shù)語(yǔ)“麥芽汁”表示麥芽，例如碾磨麥芽或綠色麥芽或者碾磨的綠色麥芽的液體提取物。除所述麥芽外，還可以由麥芽和額外的成分，例如部分轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的其它含淀粉物質(zhì)制備所述液體提取物。麥芽汁通常通過(guò)糖化，隨后任選的“噴射提取(sparging) ”(即在用熱水糖化后從用過(guò)的谷粒提取殘留糖和其它化合物的過(guò)程)而獲得。噴射提取通常在濾桶、麥芽漿過(guò)濾器或可以從用過(guò)的谷粒分離提取液體的另一種設(shè)備內(nèi)進(jìn)行。糖化后獲得的麥芽汁通常被稱(chēng)為“第一麥芽汁”，而噴射提取后獲得的麥芽汁通常被稱(chēng)為“第二麥芽汁”。如非特別指明，術(shù)語(yǔ)麥芽汁可以是第一麥芽汁、第二麥芽汁或者二者的組合。在啤酒生產(chǎn)過(guò)程中，麥芽汁通常與酒花一起煮沸。沒(méi)有與酒花一起煮沸而制備的麥芽汁還可以稱(chēng)為“甜麥芽汁”，而無(wú)論有或沒(méi)有與酒花一起，煮沸的麥芽汁都可以被稱(chēng)為“煮沸的麥芽汁”。大麥植物大麥?zhǔn)且活?lèi)植物。Sf生大麥(Hordeum vulgare ssp. Spontaneum)被認(rèn)為是當(dāng)今栽培大麥的祖先。認(rèn)為大麥從野生態(tài)至栽培態(tài)的轉(zhuǎn)變與多個(gè)基因座的等位基因頻率的重要變化同時(shí)發(fā)生。農(nóng)場(chǎng)主積極選擇稀少的等位基因和新突變事件，并很快在稱(chēng)作“大麥當(dāng)?shù)仄贩N”的馴化植物群體中確立新特征。與野生大麥相比，這些大麥在遺傳上與現(xiàn)代栽培品種更密切相關(guān)。直至十九世紀(jì)晚期，大麥當(dāng)?shù)仄贩N才作為近交系和雜種分離子的高度異源混合物出現(xiàn)，其包括由較早世代的隨機(jī)雜交而來(lái)的少數(shù)植物。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，大多數(shù)當(dāng)?shù)仄贩N已經(jīng)被純系栽培品種取代。剩余當(dāng)?shù)仄贩N的特征在于中等水平或高水平的遺傳多樣性。最初， “現(xiàn)代大麥”栽培品種代表了自當(dāng)?shù)仄贩N的選擇。后來(lái)，這些栽培品種來(lái)源于確定的純系，例如不同地理來(lái)源的純系之間連續(xù)多輪的雜交。最后，導(dǎo)致在許多，也可能是所有現(xiàn)代農(nóng)作物的遺傳基礎(chǔ)顯著縮小。與當(dāng)?shù)仄贩N相比，現(xiàn)代大麥栽培品種有多個(gè)改良的性質(zhì)(Nevo，1992 ； von Bothmer, 1992)，例如但不限于(i)隱藏和裸露的麥粒；(ii)種子休眠；(iii)抗病性；(iv)環(huán)境耐受性(例如對(duì)干旱或土壤pH的耐受性)；(ν)賴(lài)氨酸和其它氨基酸的比例；(Vi)蛋白含量；(vii)氮含量；(viii)碳水化合物組成；(ix)大麥醇溶蛋白組成。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“大麥”包括任何大麥植物。因此，本發(fā)明涉及在編碼MMT的基因中具有導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的突變的任何大麥植物。然而，優(yōu)選用于本發(fā)明的大麥植物是現(xiàn)代大麥栽培品種或純系。本發(fā)明使用的大麥栽培品種可以是，例如選自 Sebastian、Celeste、Tangent、Lux、Prestige、Saloon、 Neruda、Harrington、Klages、Manley、Schooner、Stirling、Clipper、Franklin、Alexis、 Blenheim、Ariel、Lenka> Maresi> Steffi、Gimpel、Cheri> Krona、Camargue> Chariot、 Derkado> Prisma、Union、Beka、Kym> Asahi 5、KOU A、Swan Hals、Kanto Nakate Gold、 Hakata No. 2、Kirin-choku No. 1、Kanto late Variety Gold、Fuji Ni jo、New Golden、 Satukio Ni jo、Seijo No. 17、Akagi Ni jo、Azuma Golden、Amagi Ni jpo、Nishino Gold、 Misato golden、Haruna Ni jo、Scarlett、Quench、NFC Tipple 禾口 Jersey 組成的組，優(yōu)選來(lái)自 Haruna Ni jo、Sebastian、Tangent、Lux、Prestige、Saloon、Neruda、Power > Quench 禾口NFC Tipple組成的組。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述植物是在編碼MMT的基因中具有導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的突變的現(xiàn)代大麥栽培品種，優(yōu)選選自上文所述大麥栽培品種的組的一個(gè)栽培品種。因此，在該實(shí)施方式中優(yōu)選所述大麥植物不是大麥當(dāng)?shù)仄贩N。所述大麥植物可以是任何適合的形式。例如，本發(fā)明的大麥植物可以是能活的大麥植物、干燥的植物、均質(zhì)化的植物或者經(jīng)碾磨的大麥粒。所述植物可以是成熟的植物、胚、 萌芽的麥粒、發(fā)芽的麥?；蚪?jīng)碾磨的發(fā)芽麥粒等。大麥植物的部分可以是所述植物的任何合適的部分，例如麥粒、胚、葉、莖、根、花或其小部分(fraction)。所述小部分可以是，例如麥粒、胚、葉、莖、根或花的部分。大麥植物的部分還可以是勻漿的小部分、提取物的小部分、或者經(jīng)碾磨的大麥植物或麥粒的小部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，大麥植物的部分可以是所述大麥植物的細(xì)胞，優(yōu)選可以在體外，例如細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中繁殖的活細(xì)胞。特別地，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述細(xì)胞瀬躲育ρ匕成歡雜側(cè)麵，即礎(chǔ)輔驢_胞』。功能性MMT酶的喪失本發(fā)明涉及植物產(chǎn)品，例如由大麥植物或其部分制備的飲料，所述大麥植物在MMT 基因中具有導(dǎo)致功能性MMT酶喪失的突變，例如與野生型大麥的相應(yīng)水平相比，優(yōu)選與上文描述的任意野生型大麥栽培品種相比，更優(yōu)選與cv. Prestige品種的野生型大麥相比， 喪失至少90 %的MMT活性，優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少99 %，還更優(yōu)選至少99. 5 %的MMT 活性。最優(yōu)選地，所述大麥植物在編碼MMT的基因中具有導(dǎo)致MMT功能完全喪失的突變。功能性MMT酶的完全喪失可以基于不同的機(jī)制。例如，功能性MMT酶的完全喪失可能是由所述植物中的異常蛋白產(chǎn)生，即異常MMT酶，例如沒(méi)有可檢測(cè)到的活性的突變MMT 蛋白。例如，突變體的MMT蛋白可以是截短的蛋白。MMT活性的喪失可以類(lèi)似地基于不同的機(jī)制，例如異常MMT蛋白。優(yōu)選地，通過(guò)催化甲基從SAM轉(zhuǎn)移至Met由此形成SMM的能力來(lái)測(cè)定突變MMT蛋白的活性?？梢愿鶕?jù)，例如下文實(shí)施例4的描述進(jìn)行這種測(cè)定。優(yōu)選地，通過(guò)測(cè)定分離的相應(yīng)大麥cDNA的翻譯序列獲得突變MMT的氨基酸序列。這可以基本按照下文實(shí)施例8的描述進(jìn)行。或者，通過(guò)如下文實(shí)施例11和實(shí)施例12所述，在細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)物中異源表達(dá)，然后驗(yàn)證重組蛋白作為MMT酶是沒(méi)有活性的而獲得本發(fā)明大麥植物的突變MMT?？梢酝ㄟ^(guò)MMT蛋白的缺失而實(shí)現(xiàn)功能性MMT的完全喪失。MMT蛋白的缺失將導(dǎo)致 MMT功能的喪失。因此，所述大麥植物可以不包含，或者僅包含非常少的，優(yōu)選不包含可檢測(cè)到的MMT蛋白。可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的手段測(cè)定MMT蛋白存在與否。 然而，優(yōu)選通過(guò)利用識(shí)別MMT的特異抗體檢測(cè)MMT蛋白的技術(shù)對(duì)所述蛋白進(jìn)行分析。所述技術(shù)可以是，例如Western印跡或者酶聯(lián)免疫吸收試驗(yàn)，所述特異性抗體可以是單克隆或者多克隆抗體。然而，優(yōu)選所述抗體是識(shí)別MMT蛋白中的數(shù)個(gè)不同表位的多克隆抗體。也可以通過(guò)間接檢測(cè)，例如通過(guò)用于MMT活性測(cè)定的方法間接檢測(cè)。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，當(dāng)在所述植物中不能檢測(cè)到MMT蛋白時(shí)，大麥植物被描述為編碼MMT的基因中具有突變，由此引起MMT活性的完全喪失。特別地，根據(jù)Western印跡分析，當(dāng)在所述大麥植物，優(yōu)選在所述大麥植物的麥粒中沒(méi)有檢測(cè)到質(zhì)量約為120kD，士 10%的MMT蛋白時(shí)，即是不能檢測(cè)到MMT蛋白的情況。功能性MMT的完全喪失也可能是沒(méi)有MMT mRNA轉(zhuǎn)錄，或者M(jìn)MT mRNA轉(zhuǎn)錄非常少的結(jié)果，優(yōu)選沒(méi)有MMT mRNA轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，MMT轉(zhuǎn)錄本的缺失也將導(dǎo)致 MMT蛋白的缺失。然而，優(yōu)選地，功能性MMT的完全喪失是表達(dá)異常MMT轉(zhuǎn)錄本的結(jié)果。所述轉(zhuǎn)錄本可以?xún)?yōu)選由初始轉(zhuǎn)錄本的異常剪接事件，例如由于剪接位點(diǎn)內(nèi)的突變引起的?？梢裕缤ㄟ^(guò)Northern印跡，或者通過(guò)RT-PCR方法檢測(cè)編碼MMT的轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)。本發(fā)明的大麥植物中功能性MMT的完全喪失是由一個(gè)或多個(gè)突變引起的。因此， 本發(fā)明的大麥植物通常在MMT基因中具有至少一個(gè)突變。所述突變可以在調(diào)控區(qū)內(nèi)，例如在啟動(dòng)子或內(nèi)含子內(nèi)，或者所述突變可以在大麥的編碼區(qū)。因此，還可以通過(guò)分析MMT編碼基因中的突變來(lái)檢測(cè)功能MMT的喪失?？梢酝ㄟ^(guò)，例如對(duì)所述基因進(jìn)行測(cè)序然后將其與野生型序列，優(yōu)選本文給出的cv. I^restige野生型序列(SEQ ID NO :3)，或者cv. Sebastian野生型序列(SEQ ID NO 16)進(jìn)行比較而檢測(cè)MMT編碼基因中的突變。優(yōu)選地，如實(shí)施例2或?qū)嵤├?的描述，在鑒定突變后，通過(guò)檢測(cè)MMT活性確定功能的喪失。術(shù)語(yǔ)MMT蛋白意在包括SEQ ID NO :6所示的全長(zhǎng)大麥MMT蛋白，或其功能同源物。 在本文中，功能同源物是與SEQ ID NO :6所示的大麥MMT蛋白具有相同水平士25%的MMT 活性的MMT蛋白，其中所述MMT活性是按照下文實(shí)施例2或?qū)嵤├?中的描述測(cè)定的。喪失至少90 %，例如95 %，例如99 %，例如99. 5 %的MMT活性或者完全喪失MMT活性的大麥植物可以包括具有部分功能的，或者優(yōu)選沒(méi)有功能的截短形式的MMT，例如N-末端或C-末端的截短形式。大麥植物可以包含多于一個(gè)截短形式的MMT，例如2個(gè)，或者例如3個(gè)，或者例如大于3個(gè)不同截短形式的MMT，其可能是由異常剪接的轉(zhuǎn)錄本引起的。所述截短形式僅包括MMT的N-末端片段。除了野生型MMT的N-末端片段外，所述MMT的截短形式還可以包括在未見(jiàn)于野生型MMT中的其它C-末端序列。所述其它C-末端序列可以例如被翻譯的內(nèi)含子序列，例如由于異常剪接而包含在突變mRNA中的那些序列。優(yōu)選地， 所述截短MMT形式包含SEQ ID NO :6的至多500個(gè)，更優(yōu)選至多450個(gè)，甚至更優(yōu)選至多 400個(gè)，還更優(yōu)選至多350個(gè)，甚至更優(yōu)選至多320個(gè)，還更優(yōu)選至多311個(gè)，或者至多288 個(gè)N-末端氨基酸殘基。當(dāng)所述大麥植物的MMT活性完全喪失時(shí)，特別如此。然而，MMT還可以包含較少的SEQ ID NO :6的N-末端氨基酸，例如不多于300個(gè)，例如不多于250個(gè)，例如不多于200個(gè)，例如至多150個(gè)，例如不多于147個(gè)，例如不多于133個(gè)SEQ ID NO 6的 N-末端氨基酸。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述截短的MMT形式可以由SEQ ID NO :6的第 1-311個(gè)氨基酸或者第1-288個(gè)氨基酸和任選的不存在于野生型MMT中的其它C-末端序列組成。優(yōu)選地，所述其它C-末端序列由至多50個(gè)，更優(yōu)選至多30個(gè)，甚至更優(yōu)選至多10 個(gè)，還更優(yōu)選至多4個(gè)，或者至多1個(gè)氨基酸組成。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，截短形式的 MMT 可以是 SEQ ID N0:11 或 SEQ ID N0:13 或 SEQ ID N0:15 的蛋白。SEQ ID NO 11 或SEQ ID N0:13或SEQ ID NO :15的蛋白都不是功能性MMT酶。在另一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，截短的MMT形式可以由SEQ ID NO 18的第 1-147個(gè)氨基酸或者第1-133個(gè)氨基酸和任選的不存在于野生型MMT中的其它C-末端序列組成。優(yōu)選地，所述其它C-末端序列由至多50個(gè)，更優(yōu)選至多40個(gè)，甚至更優(yōu)選至多39個(gè)，或至多33個(gè)，或至多30個(gè)氨基酸組成。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，截短形式的MMT 可以是 SEQ ID N0:22 或 SEQ ID N0:24 或 SEQ ID NO :26 的蛋白。SEQ ID N0:22 或 SEQ ID NO 24 ^ SEQ ID NO 26的蛋白都不是功能性MMT酶。上述截短形式的MMT可以存在于，例如編碼MMT的基因具有突變的大麥植物中，其中所述突變引入了翻譯提前終止密碼子，導(dǎo)致形成編碼上述截短形式MMT的基因。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述大麥植物包含被轉(zhuǎn)錄成mRNA的基因，其包含被剪接在一起且沒(méi)有插入的部分而非全部野生型MMT基因(野生型的大麥MMT基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)示于圖9)。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選本發(fā)明大麥植物的MMT mRNA包含被剪接在一起且沒(méi)有插入的至多外顯子1、2、3、4和5，或者例如被剪接在一起且沒(méi)有插入的至多外顯子1和2。除了所述剪接在一起的外顯子外，本發(fā)明大麥植物的MMT mRNA還可以包含源自野生型內(nèi)含子和/或外顯子的其它3'末端序列，其中內(nèi)含子將外顯子序列分隔開(kāi)來(lái)。通過(guò)RT-PCR測(cè)定的并且具有相應(yīng)片段長(zhǎng)度(bp)的本發(fā)明大麥植物的異常MMT mRNA的優(yōu)選實(shí)例示于圖12和圖16。更優(yōu)選地，本發(fā)明大麥植物的異常mRNA是圖12所示的5'端進(jìn)一步包含外顯子1和2的mRNA，或者圖16所示的5'端進(jìn)一步包含外顯子1的 mRNA。在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，MMT基因具有突變的大麥植物在MMT基因內(nèi)的剪接位點(diǎn)內(nèi)包含突變，其導(dǎo)致異常剪接的mRNA。更優(yōu)選地，所述突變位于MMT基因的內(nèi)含子內(nèi)，甚至更優(yōu)選位于內(nèi)含子的5'剪接位點(diǎn)中，例如內(nèi)含子1(分隔外顯子1和2的內(nèi)含子)上的5'剪接位點(diǎn)中，例如內(nèi)含子2(分隔外顯子2和3的內(nèi)含子)上的5'剪接位點(diǎn)中，例如內(nèi)含子3(分隔外顯子3和4的內(nèi)含子)上的5'剪接位點(diǎn)中，例如內(nèi)含子4(分隔外顯子4和5的內(nèi)含子)上的5'剪接位點(diǎn)中，例如內(nèi)含子5 (分隔外顯子5和6的內(nèi)含子)上的5'剪接位點(diǎn)中，內(nèi)含子6(分隔外顯子6和7的內(nèi)含子)上的5'剪接位點(diǎn)中，最優(yōu)選在內(nèi)含子2或者內(nèi)含子5上的5'剪接位點(diǎn)中。優(yōu)選所述突變是上述內(nèi)含子的末端5'堿基的G —A突變。因此，非常優(yōu)選的突變是內(nèi)含子2的末端5'堿基的G —A突變，或者內(nèi)含子5的最5'堿基的G —A突變。本發(fā)明的大麥植物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的方法制備，優(yōu)選通過(guò)下文“功能性MMT完全喪失的大麥植物的制備”部分描述的方法制備。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選本發(fā)明的MMT活性完全喪失的大麥植物在生理學(xué)和發(fā)育學(xué)上具有與野生型大麥相當(dāng)?shù)墓攘：椭参锾卣鳌Ｒ虼?，在本文中?yōu)選MMT無(wú)效大麥植物在對(duì)農(nóng)學(xué)具有重要性的特征上類(lèi)似于野生型大麥，例如株高、每株的分蘗數(shù)、開(kāi)始開(kāi)花和/或每穗的谷粒數(shù)。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明大麥植物的MMT編碼基因具有SEQ ID NO 8所示的序列。因此，優(yōu)選本發(fā)明大麥植物在SEQ ID NO :3的第3076位堿基具有G — A突變(其中，SEQ ID NO 3是大麥cv. Prestige的MMT的野生型基因組序列)。MMT活性完全喪失的大麥植物的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是2008年10月13日保藏在美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，美國(guó)馬納薩斯(VA20110)大學(xué)街10801號(hào)專(zhuān)利存放處)，被稱(chēng)為"大麥，Hordeum vuIgare ；8063 系(Barley, Hordeum vuIgare ；Line 8063)“的大麥植物。因此，本發(fā)明的大麥植物可以是2008年10月13日保藏在A(yíng)TCC的大麥系8063 (ATCC 專(zhuān)利保藏名稱(chēng)PTA-%4;3)，或其任何子代大麥植物，其中本發(fā)明大麥植物的MMT編碼基因具有SEQ ID NO 8所示的序列。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明大麥植物的MMT編碼基因具有SEQ ID NO 19所示的序列。因此，優(yōu)選本發(fā)明的大麥植物在SEQ ID NO 16的第1462位堿基具有G — A 突變(其中，SEQ ID NO 16是大麥cv. Sebastian的匪T的野生型基因組序列)。功能性MMT完全喪失的大麥植物的制備根據(jù)本發(fā)明，功能性MMT完全喪失的大麥植物可由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何合適的方法制備。優(yōu)選地，本發(fā)明的大麥植物通過(guò)包括以下步驟的方法制備誘變大麥植物或其部分(例如大麥麥粒)，然后逐個(gè)篩選和選擇MMT活性完全喪失的大麥植物。有趣的是， 本發(fā)明一方面涉及可以鑒定所述大麥植物的非常高效率的新篩選方法。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是提供制備MMT基因具有引起MMT活性完全喪失的突變的大麥植物的方法。所述方法包括以下步驟(i)誘變大麥植物，和/或大麥細(xì)胞，和/或大麥組織，和/或大麥粒，和/或大麥胚，由此獲得MO代大麥；和(ii)繁殖(例如培育)》2代的所述誘變大麥植物、麥粒和/或胚，由此獲得Mx 代的大麥植物，其中X為彡2的整數(shù)；和(iii)獲得所述Mx大麥植物的樣本；和(iv)測(cè)定所述樣本中SMM的水平；和(ν)選擇植物，其中所述樣本包含小于IOppb SMM，優(yōu)選小于5ppb SMM，更優(yōu)選不能檢測(cè)到SMM ；和(vi)對(duì)至少一部分MMT基因進(jìn)行測(cè)序；和(vii)選擇MMT基因中具有突變的植物。由此獲得MMT基因中具有引起功能性MMT完全喪失的突變的大麥植物。上述列表中的步驟(i)可以涉及誘變活的大麥材料，其選自大麥植物、大麥細(xì)胞、 大麥組織、大麥粒和大麥胚組成的組，優(yōu)選選自大麥植物、大麥粒和大麥胚組成的組，更優(yōu)選大麥粒?？梢酝ㄟ^(guò)任何適合的方法進(jìn)行誘變。在一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)將誘變劑和大麥植物或其部分一起溫育，例如和大麥?；騺?lái)自大麥的單個(gè)細(xì)胞一起溫育而進(jìn)行誘變。這種誘變劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可以例如選自疊氮化鈉(NaN3)、甲磺酸乙酯(EMS)、 疊氮丙三醇(AG)、甲基亞硝基脲(MNU)和馬來(lái)酰胼(MH)組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)照射，例如通過(guò)紫外線(xiàn)照射大麥植物或其部分，例如麥粒來(lái)進(jìn)行誘變。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，依照下文“化學(xué)誘變”部分中列出的任何方法進(jìn)行誘變。合適的誘變方案的非限制實(shí)例公開(kāi)在Breddam，K.et al.的美國(guó)專(zhuān)利 No. 7，420，105號(hào)的實(shí)施例1以及下文的實(shí)施例2中。優(yōu)選以以下方式進(jìn)行誘變，即在篩選M3代的大麥時(shí)，期望突變的預(yù)期頻率達(dá)到每 10，000谷粒最少0. 5，例如0. 5-5的范圍，例如0. 9-2. 3的范圍。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，對(duì)大麥粒實(shí)施誘變，并將其被命名為MO代(另參見(jiàn)圖7)。在誘變后，選擇沒(méi)有可檢測(cè)到的MMT活性的大麥植物或其部分。優(yōu)選地，選擇過(guò)程包括從大麥植物，優(yōu)選從萌芽的大麥植物，甚至更優(yōu)選從已經(jīng)萌芽4天的大麥植物獲取樣本。優(yōu)選所述樣本來(lái)自胚芽鞘和/或初生葉，優(yōu)選來(lái)自葉。因此，所述樣本可以為，例如 lcm-3cm范圍的葉組織。
可以根據(jù)本文描述的新開(kāi)發(fā)的多步驟方案提取并分析樣本，所述方案涉及不同溶劑和結(jié)合物質(zhì)的連續(xù)使用。通常，可以利用溶劑或溶劑混合物，優(yōu)選水和/或有機(jī)溶劑提取樣本。所述有機(jī)溶劑可以是，例如醇，優(yōu)選甲醇，或者所述有機(jī)溶劑可以為，例如鹵代烷，優(yōu)選氯仿。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述溶劑是水、甲醇和氯仿的混合物。有利地，可以在例如利用振蕩器或混合器混合的同時(shí)進(jìn)行所述提取?？梢韵蛩鋈軇?樣本混合物中加入固體支持物，例如珠，如玻璃珠。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，上述葉樣本取自Mx代麥粒，其中1是> 2的整數(shù)，優(yōu)選在 2-10的范圍，更優(yōu)選在3-8的范圍。在非常優(yōu)選的實(shí)施方式中，測(cè)定M3萌芽植物或其樣本 (例如葉)中SMM的水平。在所述實(shí)施方式中，優(yōu)選培養(yǎng)MO代的誘變大麥粒以獲得大麥植物，其隨后進(jìn)行雜交以獲得Ml代麥粒。重復(fù)所述過(guò)程直至獲得M3代麥粒(參見(jiàn)圖7)。優(yōu)選SMM水平的測(cè)定基于下文描述的新方法。有趣的是，該方法可以高通量地篩選，從而使其可以鑒定以功能性MMT完全喪失為特征的大麥植物。概括地，所述方法優(yōu)選涉及使按照上文描述制備的樣本或優(yōu)選所述樣本的提取物與能夠結(jié)合SMM的化合物反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)OPA試劑(下文簡(jiǎn)稱(chēng)為OPA，Sigma, cat. no. P7914 ；參見(jiàn)圖2)特別適用于測(cè)定SMM水平。其中，OPA與SMM反應(yīng)形成被稱(chēng)為SMM-OPA (參見(jiàn)圖2) 的分子。所述反應(yīng)優(yōu)選涉及使按照上文描述制備的樣本的提取物與OPA—起溫育。此外， 優(yōu)選向反應(yīng)混合物中加入3-巰基丙酸。優(yōu)選將所述混合物保持在堿性pH，優(yōu)選在pH 8-pH 11的范圍，更優(yōu)選在PH 9-pH 11的范圍，甚至更優(yōu)選在pH 9. 5-pH 10. 5的范圍，例如在pH 10。優(yōu)選在0°C -10°C的范圍，優(yōu)選在1°C -8°C的范圍，甚至更優(yōu)選在2°C _6°C的范圍，甚至更優(yōu)選在3°C _5°C的范圍，例如4°C的溫度下進(jìn)行溫育。溫育時(shí)間優(yōu)選彡10分鐘。基于S匪-OPA分別吸收和發(fā)射340nm和450nm的光的現(xiàn)象，可利用熒光分光鏡對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的最初步驟優(yōu)選包括在柱子上，優(yōu)選在30X2mm Gemini 3 μ C18柱子 (Phenomenex, cat. no. 00A-4439-80 ；Phenomenex, 2006)上分離提取物，然后利用高通量液體色譜系統(tǒng)，優(yōu)選 Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC system, Waters,其是經(jīng)設(shè)計(jì)用以鑒定和測(cè)量在340nm激發(fā)且在450nm發(fā)射的分子的熒光水平)檢測(cè)熒光。當(dāng)利用該方法時(shí)，“沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM”表示不存在與SMM共洗脫的可檢測(cè)的化合物。在這種情況下，色譜峰的小“肩峰”被認(rèn)為是假峰。因此，參見(jiàn)圖3，在A(yíng)snAer峰右手側(cè)的小肩峰被認(rèn)為不代表SMM峰。因此，例如，圖:3B中所示的上面兩個(gè)色譜被認(rèn)為是描述了“沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM”，而該圖下部色譜則代表了包含SMM的樣本的分離。可以?xún)?yōu)選按照實(shí)施例2的描述進(jìn)行SMM的檢測(cè)。本發(fā)明的用于選擇大麥植物的優(yōu)選方法描述在下文的實(shí)施例2中。萌芽大麥植物，甚至更優(yōu)選已經(jīng)萌芽4天的大麥植物。值得注意的是，上文提及的篩選方法特別有用。首先，分析方法全都是新的。此外，上述方法的顯著進(jìn)步在于其能夠測(cè)定萌芽大麥植物中，例如萌芽大麥植物的葉中的SMM水平。從萌芽大麥取樣的時(shí)間選擇產(chǎn)生了用于基于UPLC的SMM檢測(cè)的預(yù)料不到地純凈制備物。其它樣本，例如上文所述類(lèi)似谷粒的麥芽汁樣本的組成太復(fù)雜，并且通常不能用于所提及的用于檢測(cè)SMM水平的色譜方法。在鑒定出具有小于IOppb SMM,優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM的大麥植物后，通常對(duì)相應(yīng)的MMT基因或其部分進(jìn)行測(cè)序以測(cè)定所述大麥植物是否能夠被歸類(lèi)為MMT基因中具有突變的類(lèi)型。然后選擇特征在于沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM并且其中MMT編碼基因的一個(gè)或多個(gè)堿基不同于野生型序列的大麥植物。在這種情況下，優(yōu)選野生型序列是見(jiàn)于相應(yīng)的野生型大麥栽培品種的序列，優(yōu)選本文給出的SEQ ID NO :3的序列。優(yōu)選所述突變?nèi)缟衔乃觥？梢赃M(jìn)一步繁殖所選擇的大麥突變體，并根據(jù)SMM含量對(duì)子代植物進(jìn)行再篩選。 在篩選出有用的大麥植物后，可將其用于使用在下文“植物育種”部分描述的那些傳統(tǒng)方法的育種計(jì)劃中。植物產(chǎn)品本發(fā)明一方面涉及由MMT基因具有引起MMT功能完全喪失的突變的大麥植物或其部分制備的，具有低DMS水平的飲料或其它植物產(chǎn)品。有趣的是，此類(lèi)植物產(chǎn)品通常包含非常低水平的DMS。此外，此類(lèi)植物產(chǎn)品通常還包含非常低水平的SMM，并且還優(yōu)選包含非常低水平的DMS0。不受理論束縛，本申請(qǐng)人確認(rèn)缺少源自大麥和麥芽的SMM導(dǎo)致由所述特征在于喪失功能性MMT酶的大麥制備的飲料和其它植物產(chǎn)品中的DMS水平非常低。下文描述了由MMT活性完全喪失的大麥植物制備的有用植物產(chǎn)品的實(shí)例，例如飲料。優(yōu)選所述飲料，或所述植物產(chǎn)品包含的DMS或SMM含量分別為由野生型大麥植物制備的類(lèi)似飲料或植物產(chǎn)品的⑴小于30%，優(yōu)選小于20%，更優(yōu)選小于15%，甚至更優(yōu)選小于10%的DMS ；和 /或(i i)小于30 %，優(yōu)選小于20 %，更優(yōu)選小于15 %，甚至更優(yōu)選小于10 %，例如小于 5%，如小于2%的S匪。甚至更優(yōu)選所述飲料或所述植物產(chǎn)品包含⑴小于30ppb，優(yōu)選小于25ppb，更優(yōu)選小于20ppb，甚至更優(yōu)選小于15ppb，還更優(yōu)選小于lOppb，甚至更優(yōu)選小于5ppb，還更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的DMS ；和/或(ii)小于50ppb，優(yōu)選小于40ppb，更優(yōu)選小于30ppb，甚至更優(yōu)選小于20ppb，還更優(yōu)選小于lOppb，甚至更優(yōu)選小于5ppb，甚至更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM。此外，優(yōu)選所述植物產(chǎn)品包含的DMSO含量為由野生型大麥植物制備的類(lèi)似飲料或植物產(chǎn)品的小于30%，優(yōu)選小于20%，更優(yōu)選小于15%，甚至更優(yōu)選小于10%?！矫?，本發(fā)明的植物產(chǎn)品可以是具有導(dǎo)致功能性MMT完全喪失的突變的大麥粒。所述植物產(chǎn)品還可以是包含所述麥粒的組合物和由所述麥粒制備的組合物，以及由所述麥粒制備的其它植物產(chǎn)品。一方面，本發(fā)明的植物產(chǎn)品是通過(guò)MMT編碼基因具有引起MMT活性完全喪失的突變的大麥植物的發(fā)芽麥粒而制備的麥芽組合物。術(shù)語(yǔ)“發(fā)芽”應(yīng)該理解為浸泡的大麥粒在受控制的環(huán)境條件下(例如圖8所示)發(fā)生的萌芽。麥粒發(fā)芽是受控的浸泡和萌芽，隨后對(duì)大麥谷粒進(jìn)行干燥(優(yōu)選烘干)的過(guò)程。在干燥前，浸泡和萌芽的大麥谷粒被稱(chēng)為“綠色麥芽”，其也可以是本發(fā)明的植物產(chǎn)品。這一作業(yè)順序?qū)τ谠S多酶的合成都很重要，所述這些酶在主要用以解聚死胚乳細(xì)胞的細(xì)胞壁并動(dòng)員麥粒營(yíng)養(yǎng)的過(guò)程中引起谷粒改變。在干燥過(guò)程中，作為化學(xué)反應(yīng)的結(jié)果而產(chǎn)生風(fēng)味和顏色(例如褐色)。雖然麥芽的主要用途是生產(chǎn)飲料，但是其還可以用在其它工業(yè)工藝中，例如作為烘烤業(yè)的酶來(lái)源，或者作為食品工業(yè)的調(diào)味品和著色劑，例如作為麥芽或麥芽粉，或間接作為麥芽糖漿等。一方面，本發(fā)明涉及產(chǎn)生所述麥芽組合物的方法。所述方法優(yōu)選包括以下步驟
(i)由MMT編碼基因具有引起MMT活性完全喪失的突變的大麥植物提供大麥粒；(ii)浸泡所述麥粒；(iii)在預(yù)定的條件下使浸泡的麥粒萌芽；(iv)干燥所述萌芽的麥粒；從而產(chǎn)生SMM和/或DMS水平低的麥芽組合物。例如可以由Briggs et al. (1981) 和Hough et al. (1982)描述的任意方法產(chǎn)生所述麥芽。然而，適合產(chǎn)生麥芽的任何其它方法也可以用在本發(fā)明中，例如用于產(chǎn)生特色麥芽的方法，包括但不限于焙燒(roasting)麥芽的方法。有趣的是，DMS是相當(dāng)易揮發(fā)的化合物，沸點(diǎn)為37 V -38°C (Imashuku，見(jiàn)上文)，并且在麥芽產(chǎn)生過(guò)程中，例如在烘干過(guò)程中，所述組合物通常被加熱，從而使大量的DMS經(jīng)蒸發(fā)去除。然而，在正常的麥芽組合物冷卻過(guò)程中，可以由DMS前體(DMSP)產(chǎn)生更多的DMS。 本發(fā)明的一個(gè)重要優(yōu)勢(shì)在于在麥芽組合物中沒(méi)有或者僅產(chǎn)生非常少的DMS(參見(jiàn)實(shí)施例6， 圖 5A)。用于降低麥芽中的DMS濃度的方法已有描述。這些方法中的很多依賴(lài)于麥芽的熱處理。所述熱處理可以是簡(jiǎn)單地加熱麥芽，例如在烘干過(guò)程中通過(guò)采用蒸汽而蒸發(fā)出游離 DMS0因此，麥芽的蒸汽處理可以降低麥芽中游離DMS的水平。然而，這些方法主要降低了麥芽中游離DMS的水平，但對(duì)SMM的水平僅有較低程度的影響。如上文所述，優(yōu)選本發(fā)明的植物產(chǎn)品，例如麥芽組合物包含低水平的DMS和SMM。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的麥芽組合物僅經(jīng)過(guò)包括通過(guò)蒸汽揮發(fā)并除去游離DMS在內(nèi)的有限處理，或者可選地在烘干過(guò)程中沒(méi)有經(jīng)過(guò)包括利用蒸汽揮發(fā)并除去游離DMS的處理。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，優(yōu)選本發(fā)明的麥芽沒(méi)有用溴酸鹽，例如溴酸鉀或溴酸鈣處理?？梢酝ㄟ^(guò)，例如碾磨，對(duì)麥芽進(jìn)行進(jìn)一步加工，由此獲得經(jīng)碾磨的麥芽。因此，本發(fā)明的植物產(chǎn)品可以是任何種類(lèi)的麥芽，例如未加工的麥芽，或者經(jīng)碾磨的麥芽，或者其粉末。經(jīng)碾磨的麥芽和其粉末包含麥芽的化學(xué)成分，包括缺乏再萌芽能力的死細(xì)胞。本發(fā)明的麥芽組合物優(yōu)選包含至多3 μ g/g，優(yōu)選至多2 μ g/g，更優(yōu)選至多1 μ g/ g，甚至更優(yōu)選至多0. 5μ g/g，例如至多0. 2 μ g/g的游離DMS。此外，優(yōu)選本發(fā)明的麥芽組合物優(yōu)選包含至多2 μ g/g,優(yōu)選至多1 μ g/g,更優(yōu)選至多0. 5 μ g/g SMM。在優(yōu)選方面本發(fā)明提供了麥芽組合物，其包含至多200ppb，優(yōu)選至多150ppb，更優(yōu)選至多l(xiāng)OOppb，甚至更優(yōu)選至多50ppb，例如至多25ppb的游離DMS。此外，還優(yōu)選本發(fā)明的麥芽組合物優(yōu)選包含至多l(xiāng)OOOppb，優(yōu)選至多500ppb，更優(yōu)選至多250ppb，甚至更優(yōu)選至多l(xiāng)OOppb，還更優(yōu)選至多50ppb SMM。還優(yōu)選本發(fā)明的麥芽組合物包含至多l(xiāng)OOOppb，優(yōu)選至多500ppb，更優(yōu)選至多l(xiāng)OOppb ppb，還更優(yōu)選至多50ppb DMSP。在另一方面本發(fā)明涉及綠色麥芽組合物，其包含至多5000ppb，更優(yōu)選至多 2500ppb，還更優(yōu)選至多l(xiāng)OOOppb，甚至更優(yōu)選至多500ppb，還更優(yōu)選至多250ppb，例如至多 150ppb DMSP。還優(yōu)選所述綠色麥芽組合物包含至多200ppb，優(yōu)選至多150ppb，更優(yōu)選至多 lOOppb，甚至更優(yōu)選至多50ppb，例如至多25ppb的游離DMS。另一方面，本發(fā)明的植物產(chǎn)品是糖漿，例如大麥糖漿或者大麥芽糖漿。所述植物產(chǎn)品還可以是大麥或麥芽的提取物。
另一方面，本發(fā)明的植物產(chǎn)品是麥芽汁組合物，其由源自MMT基因具有引起MMT活性完全喪失的突變的大麥粒的麥芽組合物制備(參見(jiàn)實(shí)施例6 ；圖5B)。所述麥芽汁可以?xún)H由MMT無(wú)效麥粒制備，或者由還包含其它麥粒的混合物制備。本發(fā)明還涉及利用MMT無(wú)效大麥或其部分(單獨(dú)或與其它組分混合)制備的麥芽汁組合物。所述麥芽汁組合物可以是第一麥芽汁，和/或第二麥芽汁，和/或進(jìn)一步的麥芽汁。所述麥芽汁組合物可以是甜麥芽汁，煮沸的麥芽汁或其混合物。通常，麥芽汁組合物包含高水平的氨基氮和可發(fā)酵的碳水化合物，后者主要是麥芽糖。圖8中例示說(shuō)明了由麥芽制備麥芽汁的常規(guī)方法。通常，通過(guò)在糖化過(guò)程中使麥芽和水一起溫育而制備麥芽汁。在糖化過(guò)程中，可向麥芽/水組合物補(bǔ)充其它富含碳水化合物的組合物，例如大麥、玉米或稻米輔料。已知未發(fā)芽的谷類(lèi)輔料通常包含水平非常低的酶，為了糖轉(zhuǎn)化和/或產(chǎn)生提取物(包括產(chǎn)生游離氨基氮)，必須補(bǔ)充麥芽或外源酶。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所述植物產(chǎn)品可以是未發(fā)芽的大麥，其可以例如在糖化過(guò)程中用作輔料。通常，麥芽汁生產(chǎn)工藝的第一個(gè)步驟是碾磨麥芽，從而使水可以在糖化階段中進(jìn)入谷粒顆粒中，其中糖化階段可以被認(rèn)為是利用底物的酶促解聚作用的麥粒發(fā)芽過(guò)程的延續(xù)。在糖化過(guò)程中，經(jīng)碾磨的麥芽與液體，例如水一起溫育。溫育溫度保持恒定(恒溫糖化) 或者逐漸提高。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，初始的糖化溫度不超過(guò)70°C，優(yōu)選不超過(guò)69°C，因此，例如初始糖化溫度可以在50°C _69°C的范圍，例如55°C _69°C的范圍，例如55°C -65°C 的范圍。如果初始糖化溫度過(guò)高，其將影響醪液中的酶活性并可能降低，甚至消除期望的酶活性，這將導(dǎo)致麥芽汁質(zhì)量的變化。在任一情況下，在麥粒發(fā)芽和糖化中產(chǎn)生的可溶物質(zhì)都被釋放至所述液體部分中。隨后的過(guò)濾可分離麥芽汁液體和殘余的固體麥粒(稱(chēng)為用過(guò)的谷粒)。所述麥芽汁還可以被稱(chēng)為“第一麥芽汁”。過(guò)濾后，可通過(guò)用熱水噴射提取獲得“第二麥芽汁”。Briggs et al. (1981)和Hough et al. (1982)描述了適合用于制備麥芽汁的工藝的非限制性實(shí)例?？梢詫⒌谝畸溠恐?、第二麥芽汁和進(jìn)一步的麥芽汁合并并隨后進(jìn)行煮沸。未煮沸的麥芽汁(純的第一麥芽汁或者合并的麥芽汁)也被稱(chēng)為“甜麥芽汁”，而煮沸之后，可將其稱(chēng)為“煮沸的麥芽汁”。如果麥芽汁將用于生產(chǎn)啤酒，則通常在煮沸前加入酒花。還可以通過(guò)將MMT無(wú)效大麥植物或其部分(例如未發(fā)芽的MMT無(wú)效植物或其部分)和一種或多種合適的酶(例如酶組合物或者酶混合組合物，如Ultraflo或 Cereflo (Novozymes)) 一起溫育，而制備麥芽汁組合物。還可以利用麥芽和未發(fā)芽大麥植物或其部分，或者僅未發(fā)芽大麥而制備麥芽汁組合物，任選在所述制備過(guò)程中加入一種或多種合適的酶，特別是淀粉酶、葡聚糖酶(優(yōu)選(1-4)-和/或(1-3，1-4)-β-葡聚糖酶)，和 /或木聚糖酶(例如阿拉伯木聚糖酶)，和/或蛋白酶，或者包含一種或多種上述酶的酶混合物，例如在所述制備過(guò)程中加入酶混合物Ondea Pro (Novozymes)?？梢詫⒈景l(fā)明的大麥加入至麥芽醪液中并用作輔料。更具體地，可以在有或沒(méi)有外源釀造酶的情況下，將本發(fā)明的大麥與麥芽汁以任意組合一起用于糖化，例如但不限于大麥麥芽=100 O 或 75 25 或 50 50 或 25 75。在傳統(tǒng)的釀造方法中，將麥芽汁長(zhǎng)時(shí)間煮沸，通常煮沸60-120分鐘，一個(gè)原因是長(zhǎng)時(shí)間煮沸降低了揮發(fā)性DMS的量。然而，出于很多其它原因，例如長(zhǎng)時(shí)間煮沸需要大量能量供給，而并不希望長(zhǎng)時(shí)間煮沸。此外，所述煮沸可能導(dǎo)致產(chǎn)生不期望的Wrecker醛異味。 根據(jù)本發(fā)明，甚至在沒(méi)有長(zhǎng)時(shí)間煮沸的情況下，也可以由MMT無(wú)效大麥產(chǎn)生具有低水平DMS 的麥芽汁。因此，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式，麥芽汁煮沸至多45分鐘，甚至更優(yōu)選煮沸至多 30分鐘，例如至多15分鐘。值得注意的是，即使麥芽汁全面煮沸，仍然可以隨著時(shí)間由DMSP 產(chǎn)生DMS。有趣的是，本發(fā)明的麥芽汁保持低水平的DMS，其顯著低于煮沸常規(guī)麥芽汁后獲得的水平。在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，優(yōu)選在麥芽汁煮沸后和發(fā)酵前沒(méi)有對(duì)麥芽汁進(jìn)行二氧化碳洗滌。優(yōu)選地，本發(fā)明的麥芽汁組合物包含小于30ppb、優(yōu)選小于25ppb、更優(yōu)選小于 20ppb、甚至更優(yōu)選小于15ppb、還更優(yōu)選小于lOppb、甚至更優(yōu)選小于5ppb、還更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的DMSdP /或小于50ppb、優(yōu)選小于40ppb、更優(yōu)選小于30ppb、甚至更優(yōu)選小于 20ppb、還更優(yōu)選小于lOppb、甚至更優(yōu)選小于5ppb、甚至更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM。本發(fā)明的植物產(chǎn)品或其部分還可以是包含編碼MMT的基因具有引起MMT活性完全喪失的突變的大麥植物的食物組合物、飼料組合物以及香料組合物(fragrance raw material composition)。食物組合物可以是，例如但不限于發(fā)芽或未發(fā)芽的大麥粒、大麥粉、面包、粥、包含大麥的谷類(lèi)混合物、保健品如包含大麥的飲料、大麥糖漿，以及薄片狀、碾碎的或擠出的大麥組合物。飼料組合物包括例如，包含大麥粒和/或粗粉的組合物。下文將對(duì)香料組合物進(jìn)行描述。本發(fā)明還涉及本文描述的植物產(chǎn)品的混合物。例如，本發(fā)明一方面涉及通過(guò)以下物質(zhì)的混合物制備的組合物(i)包含編碼MMT的基因具有引起MMT活性完全喪失的突變的大麥植物或其部分的組合物；和(ii)由MMT無(wú)效麥粒制備的麥芽組合物在優(yōu)選的方面，本發(fā)明涉及飲料，更優(yōu)選涉及源自麥芽的飲料，甚至更優(yōu)選涉及醇飲料，例如含低水平DMS的啤酒，其中所述飲料是使用MMT無(wú)效大麥或其部分制備的。因此，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及飲料，更優(yōu)選涉及源自麥芽的飲料，甚至更優(yōu)選涉及醇飲料，例如啤酒，所述飲料或啤酒包含⑴小于30ppb、優(yōu)選小于25ppb、更優(yōu)選小于20ppb、甚至更優(yōu)選小于15ppb、還更優(yōu)選小于lOppb、甚至更優(yōu)選小于5ppb、還更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的DSM ；和/或(i i)小于50ppb、優(yōu)選小于40ppb、更優(yōu)選小于30ppb、甚至更優(yōu)選小于20ppb、還更優(yōu)選小于lOppb、甚至更優(yōu)選小于5ppb、甚至更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM。優(yōu)選通過(guò)發(fā)酵MMT無(wú)效大麥或其部分或其提取物，例如通過(guò)利用由MMT無(wú)效大麥產(chǎn)生的麥芽產(chǎn)生的麥芽汁(單獨(dú)或與其它成分的組合)進(jìn)行發(fā)酵而制備所述飲料。然而，在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，所述飲料為未發(fā)酵的飲料，例如麥芽汁，優(yōu)選由MMT無(wú)效麥芽制備的麥芽汁。所述飲料可以由未發(fā)芽大麥植物或其部分，優(yōu)選由未發(fā)芽的MMT無(wú)效大麥植物或其部分制備，這也包括在本發(fā)明中。所述飲料可以是無(wú)醇飲料，例如無(wú)醇啤酒或其它種類(lèi)的無(wú)醇飲料，例如無(wú)醇麥芽飲料，例如無(wú)酒精麥芽飲料(maltina)。然而，優(yōu)選所述飲料由包含MMT無(wú)效大麥粒的麥芽組合物制備。更優(yōu)選地，所述飲料是啤酒，其可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何種類(lèi)的啤酒。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述啤酒是，例如儲(chǔ)藏啤酒。優(yōu)選使用包含萌芽的MMT無(wú)效大麥的麥芽組合物釀造啤酒。然而，所述麥芽組合物還可以包含其它成分，例如其它萌芽或未萌芽的谷類(lèi)，例如野生型大麥、小麥和 /或黑麥，或者包含糖的未萌芽原料或源自發(fā)芽或未發(fā)芽原料的組合物，包括糖漿組合物。通常認(rèn)為DMS可以隨時(shí)間由包括SMM的DMSP產(chǎn)生。因此，即使飲料中最初不含或者含有非常少的DMS，DMS也會(huì)隨時(shí)間而累積。然而，本發(fā)明的目的是提供甚至在儲(chǔ)藏后也僅含少量或不含DMS的飲料。因此，本發(fā)明的目的是提供源自大麥植物的飲料(例如啤酒)，其在儲(chǔ)藏至少1周、 優(yōu)選至少2周、更優(yōu)選至少3周、甚至更優(yōu)選至少4周，例如1-3個(gè)月、如3-6個(gè)月、如6-12 個(gè)月、如大于1年后包含小于30ppb、優(yōu)選小于25ppb、更優(yōu)選小于20ppb、甚至更優(yōu)選小于 15ppb、還更優(yōu)選小于lOppb、甚至更優(yōu)選小于5ppb、還更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的DSM。進(jìn)行儲(chǔ)藏的溫度在5°C -40°C的范圍，例如15°C -40°C的范圍。此外，優(yōu)選本發(fā)明飲料的特征在于優(yōu)越的味道性質(zhì)。特別地，優(yōu)選本發(fā)明的飲料的特征在于比相應(yīng)的“常規(guī)”啤酒更加芬芳(aromatic)和芳香(fragrant)(參見(jiàn)實(shí)施例7，圖 6)。不受理論束縛，本發(fā)明提供了低水平DMS和SMM或者甚至不存在DMS和SMM使芬芳和芳香氣味感增強(qiáng)的理論。優(yōu)選地，由專(zhuān)業(yè)品嘗小組確定芬芳和芳香風(fēng)味。在飲料為啤酒的實(shí)施方式中，測(cè)試小組優(yōu)選由專(zhuān)業(yè)的啤酒品嘗師組成。在本文中“專(zhuān)業(yè)啤酒品嘗小組”也被稱(chēng)為“經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的品嘗小組”或者“啤酒品嘗專(zhuān)家小組”。盡管已知DMS本身對(duì)啤酒的味道性質(zhì)具有深刻的影響，但一些品嘗小組可出現(xiàn)出對(duì)多層面的硫樣風(fēng)味產(chǎn)生不準(zhǔn)確評(píng)價(jià)的傾向。原因僅僅是由于風(fēng)味感知的差異而導(dǎo)致小組成員保持不恰當(dāng)?shù)摹皹?biāo)準(zhǔn)(calibrated)”。如本文所描述的， 通過(guò)成立接受全面培訓(xùn)的至少9位啤酒品嘗員的專(zhuān)家小組而使這個(gè)復(fù)雜的難題得到解決， 其中所述品嘗員可熟練地對(duì)啤酒的酯、高級(jí)醇、硫組分和啤酒主味的味道性質(zhì)作出評(píng)價(jià)。因此，品嘗小組應(yīng)該由至少9人組成，優(yōu)選9-20人的范圍，例如9-12人，如10 人。每個(gè)品嘗小組成員應(yīng)該優(yōu)選地接受全面的培訓(xùn)，特別是每個(gè)成員都應(yīng)該熟練地對(duì)啤酒的酯、高級(jí)醇、硫組分和啤酒主味的味道性質(zhì)作出評(píng)價(jià)。因此，每個(gè)品嘗小組成員可以按照0-5分的分級(jí)對(duì)不同的風(fēng)味韻調(diào)進(jìn)行評(píng)價(jià)。所述風(fēng)味品質(zhì)優(yōu)選選自苦味強(qiáng)度、苦味性質(zhì)、主味、均衡度(balanced)、新鮮度、可飲性、芳香、酯味、醇味(alcoholic) /溶劑、花味 (floral)、啤酒花味(hoppy)、樹(shù)脂味(resinous)、麥芽味(malty)、谷粒味(grainy)、焦糖味(caramel)、燒焦味(burnt)、酚醛味(phenolic)、硫磺味(sulfury)、酸味(acidity)和甜味。在使用上述方法的過(guò)程中，當(dāng)將兩種飲料的酯/醇譜調(diào)整為相似并且以相同方式制備所述飲料時(shí)，與具有相似乙醇含量并且由野生型大麥(優(yōu)選cv. Power)制備的飲料相比，優(yōu)選本發(fā)明的飲料在選自芳香、酯味、醇味/溶劑、花味和啤酒花味組成的組中至少1 個(gè)、優(yōu)選至少2個(gè)、甚至更優(yōu)選至少3個(gè)、還更優(yōu)選至少4個(gè)、甚至更優(yōu)選全部的芬芳/芳香性質(zhì)都具有較高分值。此外，使用上述方法，當(dāng)將兩種飲料的酯/醇譜調(diào)整至相似時(shí)，與具有相似乙醇含量并且由野生型大麥(優(yōu)選cv. Power)制備的飲料相比，優(yōu)選本發(fā)明的飲料在選自平衡度、 新鮮度和可飲性組成的組中至少1個(gè)、優(yōu)選至少2個(gè)、甚至更優(yōu)選全部三個(gè)整體性質(zhì)都具有較高分值。使用上述方法，當(dāng)將兩種飲料的酯譜(ester profile)調(diào)整至相似時(shí)，與具有相似乙醇含量并且由野生型大麥(優(yōu)選cv. Power)制備的飲料相比，優(yōu)選本發(fā)明的飲料在新鮮度和酯味方面的分值高出至少0. 1、更優(yōu)選高出至少0. 2或更多。在本申請(qǐng)中，當(dāng)表1提及的12種化合物被調(diào)整為類(lèi)似水平時(shí)，即所述飲料包含相同量士20%的表1所提及的12種化合物時(shí)，認(rèn)為酯/醇譜是相似的(還可參見(jiàn)實(shí)施例7)。 如果乙醇含量是相同量士20%，優(yōu)選相同量士 10%，則認(rèn)為乙醇含量是相似的。因此，優(yōu)選如果調(diào)整以下12種化合物(參見(jiàn)表1和實(shí)施例7中的列表)的含量至(i)乙酸 1. 20ppm士 20% ；(ii)甲酸乙酯 0. 24ppm士20% ；(iii)乙酸乙酯 23. 40ppm士20% ；(iv)乙酸異丁酯 0. 05ppm士 20% ；(ν) 1-丙醇 13. 80ppm士 20% ；
(vi)異丁醇 9. 60ppm士 20 % ；(vii)乙酸異戊酯 3. 43ppm士 20% ；(viii) 1- 丁醇 0. 23ppm士 20% ；(ix)異戊醇 52. OOppm士 20% ；(χ)己酸乙酯 0. 13ppm士20% ；(xi)乙酸正己酯 0. Olppm士20% ；(xii)辛酸乙酯 0. 33ppm士20% ·則本發(fā)明飲料的特征是至少1個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，更優(yōu)選至少3個(gè)，甚至更優(yōu)選至少4個(gè)，還更優(yōu)選至少5個(gè)，甚至更優(yōu)選所有以下性質(zhì)都具有如下分值(當(dāng)按照實(shí)施例7的描述進(jìn)行測(cè)定時(shí))(i) “平衡度”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7)；(ii) “新鮮度”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7，更優(yōu)選至少2. 9，還更優(yōu)選至少 3. 1)；(iii) “可飲性”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7，更優(yōu)選至少2. 9，還更優(yōu)選至少 3. 0)；(iv) “芬芳”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7，更優(yōu)選至少2. 9)；(ν) “酯味”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7，更優(yōu)選至少2. 9，還更優(yōu)選至少3. 0)；(vi) “醇味/溶劑”(分值至少1. 5)；(vii) “花味”(分值至少1. 7，優(yōu)選至少1. 9)；(viii) “啤酒花味”(分值至少1. 8)；更優(yōu)選在以下性質(zhì)方面(當(dāng)按照實(shí)施例7的描述進(jìn)行測(cè)定時(shí))(i) “新鮮度”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7，更優(yōu)選至少2. 9，還更優(yōu)選至少3. 1)；(ii) “可飲性”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7，更優(yōu)選至少2. 9，還更優(yōu)選至少 3. 0)；(iii) “芬芳”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7，更優(yōu)選至少2. 9)；
(iv) “酯味”(分值至少2. 5，優(yōu)選至少2. 7，更優(yōu)選至少2. 9，還更優(yōu)選至少3. 0)。因此，優(yōu)選本發(fā)明的飲料具有⑴當(dāng)品嘗專(zhuān)家小組以0-5分的分級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，“新鮮度”分值至少為2. 5 ；和/ 或(ii)當(dāng)品嘗專(zhuān)家小組以0-5分的分級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，“可飲性”分值至少為2. 5 ；和 /或(iii)當(dāng)品嘗專(zhuān)家小組以0-5分的分級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，“芬芳風(fēng)味”分值至少為2. 5 ； 和/或(iv)當(dāng)品嘗專(zhuān)家小組以0-5分的分級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，“酯風(fēng)味”分值至少為2. 5 ；前提是飲料的酯/醇譜如實(shí)施例7，表1中加入了混合物1和混合物2的“MMT無(wú)效”列所示。特別地，本發(fā)明公開(kāi)了飲料中存在的DMS可以掩蓋酯味道。因此，本發(fā)明的目的是提供，與以相同方式制備但包含至少I(mǎi)OOppb的DMS、例如100-200ppb范圍的DMS的飲料相比，或者與以相同方式制備但包含至少50ppb的DMS、例如50-100ppb范圍的DMS的飲料相比，酯味分值更高的飲料，其中所述味道是由經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的品嘗小組評(píng)價(jià)的，優(yōu)選由經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的至少9位成員的品嘗小組評(píng)價(jià)。所述酯味道分值更高表示，當(dāng)按照上述以0-5分的分級(jí)進(jìn)行測(cè)定酯味道時(shí)，優(yōu)選高出至少0. 5分，優(yōu)選高出至少0. 7分，如高出至少0. 9分。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)上述飲料的方法，所述方法優(yōu)選包括以下步驟(i)提供包含萌芽的MMT無(wú)效麥粒的麥芽組合物；(ii)將所述麥芽組合物加工成飲料；由此獲得包含小于30ppb，優(yōu)選小于25ppb，更優(yōu)選小于20ppb，甚至更優(yōu)選小于 15ppb，還更優(yōu)選小于lOppb，甚至更優(yōu)選小于5ppb，還更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的DMS的飲料。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述飲料是啤酒。在這種情況下，所述加工步驟優(yōu)選包括例如通過(guò)上文描述的任何方法由所述麥芽組合物制備麥芽汁，并發(fā)酵所述麥芽汁?！銇?lái)說(shuō)，可以用發(fā)芽和/或未發(fā)芽的大麥谷粒制備醇飲料，例如啤酒。除了酒花和酵母外，麥芽也促成了啤酒的風(fēng)味和顏色。此外，麥芽還充當(dāng)可發(fā)酵糖的來(lái)源和酶的來(lái)源。啤酒生產(chǎn)的一般工藝的示意圖示于圖8，而用于發(fā)芽和釀酒的方法的詳細(xì)描述可見(jiàn)于， 例如Briggs et al. (1981)和Hough et al. (1982)的文獻(xiàn)?？色@得多種用于分析大麥、 麥芽和啤酒產(chǎn)物的定時(shí)更新的方法。這些方法包括，例如但不限于A(yíng)merican Association of Cereal Chemists (1995), American Society of Brewing Chemists(1992), European Brewery Convention (1998)和 Institute of Brewing(1997)。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到特定的啤酒廠(chǎng)使用了許多帶有顯著差異的具體過(guò)程，這些差異與當(dāng)?shù)叵M(fèi)者的喜好有關(guān)。本發(fā)明可以使用任何此類(lèi)制造啤酒的方法。可以通過(guò)例如，上文描述的任何方法獲取上述飲料，包括例如啤酒、麥芽飲料或非發(fā)酵麥芽汁的麥芽組合物?？梢杂伤鳆溠拷M合物制備麥芽汁。從麥芽汁生產(chǎn)啤酒的第一步優(yōu)選涉及煮沸所述麥芽汁。在煮沸期間，可以添加其它組分，例如谷類(lèi)糖漿或酒花，其中酒花組分可以提供典型的苦啤酒和芳香啤酒特征。煮沸麥芽汁也會(huì)導(dǎo)致多酚和變性蛋白質(zhì)之間形成可在啤酒生產(chǎn)的后續(xù)階段中沉淀的聚集物。此外，煮沸麥芽汁也會(huì)導(dǎo)致包括DMS在內(nèi)的可揮發(fā)化合物的蒸發(fā)。然而，如上文所述，由MMT無(wú)效大麥制備的麥芽汁包含少量或不包含DMS，因此，可顯著降低此麥芽汁的煮沸時(shí)間。冷卻后，麥芽汁被轉(zhuǎn)移到包含酵母，優(yōu)選卡爾酵母(Saccharomyces carlsbergensis)種啤酒酵母的發(fā)酵罐中。可以將麥芽汁發(fā)酵任何適當(dāng)時(shí)間，通常在1-100天的范圍。在持續(xù)數(shù)天的發(fā)酵過(guò)程中，糖被轉(zhuǎn)變成醇和CO2,同時(shí)伴隨產(chǎn)生一些香味物質(zhì)。隨后可以對(duì)啤酒進(jìn)行進(jìn)一步加工，例如冷卻啤酒。也可以過(guò)濾和/或貯藏啤酒，貯藏是產(chǎn)生令人愉快的芳香以及較少酵母(yeasty)味的過(guò)程。也可以加入添加劑。此外，還可以加入CO2。最后可以在裝瓶或裝罐前，對(duì)啤酒進(jìn)行巴氏滅菌或過(guò)濾。有很多方法可用于確定大麥植物產(chǎn)品或植物產(chǎn)品是否由MMT基因具有引起MMT功能完全喪失的突變的大麥植物制備。植物產(chǎn)品通常會(huì)包含至少一些來(lái)自用于生產(chǎn)該植物產(chǎn)品的植物的基因組DNA。因此，麥芽將包含大量的基因組DNA，但即便是大麥或麥芽提取物 (例如麥芽汁)也可以包含來(lái)自所述大麥或麥芽的基因組DNA。此外，基于大麥的飲料，例如啤酒也可包含來(lái)自所述植物的基因組DNA。通過(guò)分析植物產(chǎn)品中的DNA，可以確定用于制備植物產(chǎn)品的植物的MMT基因是否具有引起MMT功能完全喪失的突變。所述突變可以是， 例如上文在“功能性MMT酶的喪失”部分描述的MMT基因的任何突變。可以通過(guò)任何可用的方法，例如通過(guò)測(cè)序或者通過(guò)基于擴(kuò)增的方法(包括基于PCR的方法)分析所述基因組 DNA。如果假定MMT基因具有特定突變，則可以采用多態(tài)性分析，例如SNP分析。此類(lèi)分析可以按照下文實(shí)施例13和17的描述而進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)@些實(shí)施例中描述的具體SNP分析進(jìn)行適應(yīng)性改進(jìn)以用于其它突變或者其它起始材料。如果上述植物產(chǎn)品僅由MMT基因具有引起MMT功能完全喪失的突變的大麥植物制備，則大麥MMT mRNA和/或MMT蛋白的存在與否也可以表明所述植物產(chǎn)品是否由匪T無(wú)效大麥制備。因此，可以利用Western印跡分析，或者其它蛋白分析，或者利用RT-PCR，或者利用Northern印跡分析，或者利用其它mRNA分析進(jìn)行植物產(chǎn)品的檢測(cè)。當(dāng)所述植物產(chǎn)品為麥芽時(shí)，此類(lèi)分析特別有用。SMM 和 DMS可以通過(guò)任何合適的方法測(cè)定植物產(chǎn)品中SMM和DMS的量。SMM可以基本按照上文中描述了大麥樣本中SMM水平測(cè)定的“功能性MMT完全喪失的大麥植物的制備”部分的描述進(jìn)行測(cè)定。因此，可以通過(guò)使SMM與化合物(例如ΟΡΑ)偶聯(lián)并通過(guò)例如使用UPLC系統(tǒng)測(cè)定熒光而測(cè)定SMM。對(duì)于定量測(cè)定，可以測(cè)定與SMM峰對(duì)應(yīng)的色譜面積。對(duì)于更準(zhǔn)確的測(cè)定，優(yōu)選利用高分辨毛細(xì)管氣相色譜對(duì)DMS和DMSP (例如SMM)兩者的量進(jìn)行測(cè)定，其中后一化合物在活化后作為DMS而測(cè)定。本文將麥芽汁或啤酒樣本中的總DMS定義為游離DMS和其前體形式(稱(chēng)為DMSP)的數(shù)量之和。利用該定義，可以以總 DMS (在煮沸樣本，優(yōu)選在堿性條件下煮沸1小時(shí)的樣本中測(cè)定)和游離DMS (在未煮沸樣本中測(cè)定)之間的差異測(cè)定麥芽汁或啤酒樣本中DMSP的量。實(shí)施例6詳細(xì)描述了用于測(cè)量總DMS和游離DMS水平的優(yōu)選方式?；瘜W(xué)誘變?yōu)榱水a(chǎn)生本發(fā)明的MMT編碼基因具有引起MMT活性完全喪失的突變的大麥植物， 可以通過(guò)任何合適的誘變方法，例如通過(guò)使用大麥粒的化學(xué)誘變(已知隨機(jī)誘導(dǎo)突變的方法)制備非常大量的大麥突變體?？梢岳萌魏位瘜W(xué)誘變物質(zhì)進(jìn)行大麥的誘變。然而，優(yōu)選利用Ni^3處理谷粒(參見(jiàn)圖7)，使存活的谷粒萌芽，然后分析子代植物。由誘變的谷粒長(zhǎng)成植物世代(稱(chēng)為M0)包含任何給定突變的雜合嵌合體。在自花傳粉之后收集的子代植物稱(chēng)為Ml代，在Ml代中，給定突變分離至相應(yīng)的雜合子和純合子中。利用Ni^3*理大麥粒不等同于處理單個(gè)大麥細(xì)胞，原因是處理之后的谷粒可包含一些未突變的細(xì)胞和多種具有DNA突變的細(xì)胞。在不產(chǎn)生種系的細(xì)胞譜系中，突變會(huì)丟失， 因此，目標(biāo)就是將誘變劑靶向發(fā)育為生殖組織的少數(shù)細(xì)胞，這有助于Ml代的產(chǎn)生。為了評(píng)價(jià)總突變效率，可分別計(jì)數(shù)MO和Ml代中的白化(albino)嵌合體和白化植物。由作為存活植物的函數(shù)的計(jì)分突變體數(shù)量(scoring mutant number)得出對(duì)突變效率的估計(jì)，而作為已處理種子的函數(shù)的計(jì)分突變體數(shù)量提供了突變效率和谷粒死亡二者的組合測(cè)定。值得注意的是，在基因表達(dá)的幾乎每個(gè)步驟，細(xì)胞都具有可緩和損害突變影響的質(zhì)量保證機(jī)制。真核生物中的一個(gè)經(jīng)過(guò)深入研究的實(shí)例是無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解(稱(chēng)為 NMD)，其阻止合成潛在有害的提前截短蛋白(Maquat and Carmichael，2001 ；Wu et al.， 2007)。在NMD中，通過(guò)末位密碼子相對(duì)于下游脫穩(wěn)定元件的位置將其鑒定為翻譯提前終止密碼子。產(chǎn)生翻譯提前終止(無(wú)義)密碼子(稱(chēng)為PTC)的突變有時(shí)提高了選擇性剪接轉(zhuǎn)錄本的水平，由此跳過(guò)有害突變，從而潛在地挽救了蛋白的功能(Mendell and Dietz，2001)。植物育種農(nóng)作物發(fā)育可以看做是始于引入新特征的長(zhǎng)期過(guò)程。從植物育種家的觀(guān)點(diǎn)看，這一步驟通常產(chǎn)生與現(xiàn)在的市場(chǎng)品種相比，農(nóng)業(yè)性狀總體譜圖不甚理想的植物。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，目的是提供MMT基因具有引起功能性MMT完全喪失的突變且在農(nóng)藝學(xué)上有用的大麥植物。除了 MMT無(wú)效特征之外，在產(chǎn)生商業(yè)發(fā)芽大麥品種的領(lǐng)域還要考慮其他因素，包括但不限于麥粒產(chǎn)量、麥粒大小以及與發(fā)芽性能或釀造性能相關(guān)的其它參數(shù)。因?yàn)?即便不是所有)許多此類(lèi)特征都處于遺傳控制下，本發(fā)明還提供了現(xiàn)代的純合且高產(chǎn)量的大麥栽培品種，其可以通過(guò)與MMT無(wú)效大麥植物雜交而制備。此類(lèi)大麥植物的麥粒提供了沒(méi)有功能性MMT酶的新原料。有經(jīng)驗(yàn)的大麥育種者將能夠使本發(fā)明的MMT無(wú)效大麥植物與其它大麥植物雜交，隨后選擇并發(fā)展具有產(chǎn)生出眾栽培品種的特征的子代。此類(lèi)子代也被認(rèn)為是本發(fā)明的一部分?；蛘?，大麥育種者可以利用本發(fā)明的植物用于進(jìn)一步的誘變，以產(chǎn)生源自MMT無(wú)效大麥的新栽培品種。可以根據(jù)任何合適的方案，將本發(fā)明的大麥植物用在育種中。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供包含MMT無(wú)效特征，且在農(nóng)藝上優(yōu)良的大麥植物。因此，本發(fā)明還涉及通過(guò)使第一親本大麥植物與第二親本大麥植物雜交而產(chǎn)生新的MMT無(wú)效大麥植物的方法，其中所述第一或第二植物是MMT無(wú)效大麥。此外，第一和第二親本大麥植物代表了 MMT無(wú)效大麥品種。因此，利用MMT無(wú)效大麥品種的任何以下此類(lèi)方法都是本發(fā)明的一部分自花授粉、回交和群體雜交等。利用MMT無(wú)效大麥品種作為親代產(chǎn)生的所有植物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括由源自MMT無(wú)效大麥品種的品種發(fā)展出的那些植物。在將外源DNA引入至MMT無(wú)效植物或植物組織并在其中表達(dá)的情況下，MMT無(wú)效大麥還可以用于遺傳轉(zhuǎn)化。本發(fā)明可以使用回交方法以將突變大麥植物的MMT無(wú)效特征引入至另一個(gè)品種， 例如另一個(gè)栽培品種中，例如cv. Scarlett或cv. Jersey，它們都是當(dāng)代高產(chǎn)發(fā)芽大麥栽培品種。在標(biāo)準(zhǔn)的回交操作中，將原始目標(biāo)品種(即輪回親本目標(biāo)植物)與攜帶單個(gè)待轉(zhuǎn)移目標(biāo)基因的第二品種(非輪回親本植物)雜交。隨后，將這次雜交產(chǎn)生的MMT無(wú)效子代植物與輪回親本植物雜交，重復(fù)這一過(guò)程直至獲得這樣的大麥植物，即其中除轉(zhuǎn)入了非輪回親本植物的MMT無(wú)效特征的遺傳設(shè)置之外，輪回親本植物的基本所有特有特征都在所產(chǎn)生的植物中得到恢復(fù)。最后，將最后產(chǎn)生的回交植物自交以產(chǎn)生純合的MMT無(wú)效育種子代植物。優(yōu)選在成功的回交過(guò)程中具有合適的輪回親本，回交過(guò)程的目的包括將MMT無(wú)效特征引入原始品種。為了完成這一過(guò)程，在保留來(lái)自原有品種的基本所有遺傳性質(zhì)的同時(shí)， 使用來(lái)自非輪回親本植物的MMT無(wú)效特征的遺傳設(shè)置來(lái)修飾輪回品種的遺傳設(shè)置。雖然當(dāng)被轉(zhuǎn)移的遺傳性質(zhì)表現(xiàn)顯性等位基因時(shí)，回交方法得到簡(jiǎn)化，但也可回交隱性MMT無(wú)效特征。加快植物育種過(guò)程的方法包括通過(guò)應(yīng)用組織培養(yǎng)和再生技術(shù)對(duì)所產(chǎn)生的突變體進(jìn)行初始增殖。因此，本發(fā)明另一個(gè)方面提供了生長(zhǎng)和分化后產(chǎn)生具有MMT無(wú)效特征的大麥植物的細(xì)胞。例如，育種可以包括傳統(tǒng)雜交、制備源自可育花藥的植物或利用小孢子培養(yǎng)方法。本發(fā)明的實(shí)施方式還提供了不僅在MMT編碼基因具有引起MMT活性完全喪失的突變，而且還具有一個(gè)或多個(gè)其它有用的突變的大麥植物。此類(lèi)額外的突變可以包括，例如在編碼脂氧合酶-I(LOX-I)的大麥基因中的突變，例如引起L0X-1活性水平降低的突變(例如Douma，Α. C.等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 6，660，915中描述的突變)，或者引起L0X-1功能完全喪失的突變，例如Breddam，K.等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，420，105或PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2005/087934中公開(kāi)的任何突變體，特別是Breddam. K.等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，420, 105中的包含SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :6所示的編碼L0X-1基因的基因組序列的突變體。如上述專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)中的描述，L0X-1無(wú)效麥芽本身可提供用于在大麥的發(fā)芽過(guò)程中低溫烘干的原料。然而，組合的L0X-1無(wú)效-MMT無(wú)效雙突變體更為優(yōu)異，并且由于L0X-1和MMT活性均被失活，而釀造業(yè)中特別有用?？梢酝ㄟ^(guò)將本發(fā)明的大麥植物與 Breddam, K.等人的美國(guó)專(zhuān)利No. 7，420, 105或PCT專(zhuān)利申請(qǐng)WO 2005/087934描述的大麥植物雜交而獲得此類(lèi)大麥植物。
實(shí)施例本文的實(shí)施例部分例示說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但不應(yīng)被認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。除非另有說(shuō)明，否則用于操作核酸、蛋白和細(xì)菌的基本分子生物學(xué)技術(shù)均按照 Sambrook and Russel (2001)中的描述進(jìn)行。實(shí)施例1DMS掩蓋了啤酒的酯味通常被認(rèn)為難以表征硫樣風(fēng)味韻調(diào)，即便是在常規(guī)啤酒品嘗小組成員中也是如此。通常，啤酒品嘗小組成員使用專(zhuān)業(yè)術(shù)語(yǔ)“硫味”來(lái)表征硫味韻調(diào)，而不使用更具體的硫味評(píng)論，例如“硫醇”、“硫化氫”和“DMS”。在成立9人品嘗小組后，對(duì)成員進(jìn)行有關(guān)于追蹤含硫組分氣味的全面培訓(xùn)，意外地發(fā)現(xiàn)加入硫組分強(qiáng)列地影響其它氣味組分的感知，這是導(dǎo)致例如酯味和啤酒主味分值較低的性質(zhì)。在另一套試驗(yàn)中，選擇DMS用于培訓(xùn)品嘗小組。為品嘗小組提供摻有高濃度的所述含硫組分的啤酒樣本，要求小組成員品嘗并以0(無(wú))至5分(極度)的分級(jí)對(duì)“主味”、 “酯味”和“DMS”特征進(jìn)行分級(jí)。每輪測(cè)試都包括標(biāo)準(zhǔn)的市售啤酒和品嘗小組成員未知的兩個(gè)樣本。在圖IB中例示了來(lái)自包括分別摻有酯和酯/DMS的啤酒樣本的系列測(cè)試的平均分值結(jié)果。意外的結(jié)果是，與通過(guò)僅摻有酯所獲得的結(jié)果相比，當(dāng)與酯組合時(shí)DMS的添加對(duì)所感知的酯味分值產(chǎn)生不利的影響。同樣地，啤酒主味評(píng)分下降。意料之中的是，DMS的摻入增強(qiáng)了該性質(zhì)的分值。上述結(jié)果證明，專(zhuān)業(yè)化品嘗小組品嘗單個(gè)風(fēng)味組分的能力表現(xiàn)為高度依賴(lài)于由其它氣味組分決定的“風(fēng)味背景”。圖IB中概括的來(lái)自所述品嘗測(cè)試的意外發(fā)現(xiàn)也為本發(fā)明提供了基礎(chǔ)，通過(guò)提供具有低水平DMS的飲料和可用于制備此種飲料的大麥突變體(即缺乏SMM合成能力的大麥突變體)，這樣，在飲料生產(chǎn)中利用相應(yīng)原料不僅能夠產(chǎn)生含較少或不含DMS的產(chǎn)品，還有望于改善酯味韻調(diào)。實(shí)施例2篩選設(shè)置，方案1按照Kleinhofs et al. (1978)提供的試驗(yàn)詳述，將從 cv. Prestige 和 cv. Sebastian大麥植物收集的麥粒分別與誘變劑NaN3 —起溫育。選擇此方法的原因是已知其具有在大麥基因組DNA中誘導(dǎo)點(diǎn)突變的潛能。在該實(shí)驗(yàn)中，在試驗(yàn)點(diǎn)繁殖Ml代的突變谷粒，通過(guò)連續(xù)兩代，最后產(chǎn)生高比例的 M3代純合植物以用于篩選目的。預(yù)期M3代突變體包含基因突變的頻率為0. 9-2. 3/10，000 個(gè)谷粒(Kleinhofs et al.，見(jiàn)上文)。值得注意的是，M2谷粒未經(jīng)篩選。有趣的是，本發(fā)明描述了用于檢測(cè)缺乏MMT活性的M3突變大麥谷粒的高通量的快速篩選方法，前提是在發(fā)芽過(guò)程中沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM合成。因此，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)SMM主要聚集在萌芽大麥的胚芽鞘和初生葉中，并且可以通過(guò)從4日齡的萌芽谷粒的壓碎葉組織提取氨基酸，隨后使所提取的氨基酸與OPA反應(yīng)已形成高熒光產(chǎn)物，而進(jìn)行SMM的檢測(cè)(參見(jiàn)圖 2)。實(shí)際上，各實(shí)驗(yàn)在具有一張Whatmanill濾紙Q96X20.9mm)的密閉塑料盒中進(jìn)行，其中使來(lái)自94種潛在突變體和兩種野生型植物中每種植物的各兩粒谷粒萌芽。對(duì)多個(gè)潛在突變谷粒重復(fù)實(shí)驗(yàn)(參見(jiàn)下文)。在萌芽開(kāi)始時(shí)，向所述塑料盒中加入25mL自來(lái)水，然后在萌芽的第2天加入額外的15mL自來(lái)水。在萌芽4天后，將l-3cm葉組織轉(zhuǎn)移至儲(chǔ)藏板(ABgene)中，其中在該儲(chǔ)藏板的96個(gè)1. 2mL孔中都分別含有直徑為5mm的玻璃珠和500 μ L 12 5 6 (ν/ν/ν)的水甲醇氯仿混合物。然后以30Hz的頻率在匪300 實(shí)驗(yàn)?zāi)?Retsch)中振蕩45秒。此后，將平板轉(zhuǎn)移至離心機(jī)(Rotanta 460R, Hettich)中， 并以4，OOOrpm在室溫下離心15分鐘以沉淀不溶物質(zhì)。將10 μ L上清轉(zhuǎn)移至96孔儲(chǔ)藏板 (Waters, cat no. 186002481)中，并與 200yL H2O 和包含 15，000 45 (ν/ν)的 OPA 試劑 (Sigma, cat. no. P7914) :3_ 巰基丙酸(Aldrich，cat. no. M5801)的 60 μ L 反應(yīng)溶液混合。將混合物在4°C溫育至少10分鐘以獲得樣本氨基酸和OPA的定量衍生。利用裝配有熒光檢測(cè)儀的基于Waters的UPLC系統(tǒng)，通過(guò)混合流動(dòng)相A (調(diào)整至pH 7. 8的40mM NaH2PO4緩沖液)和移動(dòng)相耵乙腈甲醇水為45 45 10(v ν ν)的溶液，如(Phenomenex, 2006)的描述]，以梯度洗脫在 3-μ m顆粒的 2. 1 X 30-mm C18 Gemini 柱(Phenomenex，cat. no. 00A-4439-80)上分離出2 μ L衍生的混合物。在340nm激發(fā)所洗脫的OPA衍生物，并測(cè)定450nm的光發(fā)射。圖3A顯示了色譜圖的示例，以例示說(shuō)明天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、 天冬酰胺(Asn)、絲氨酸(kr)和SMM的洗脫譜。由于整個(gè)試驗(yàn)計(jì)劃的目的是鑒定缺乏SMM 合成能力的大麥植物，即相應(yīng)的色譜峰非常小或者優(yōu)選沒(méi)有相應(yīng)的色譜峰的植物，因此將化合物SMM包含在內(nèi)。篩選設(shè)置，方案2與本實(shí)施例中的上述試驗(yàn)平行，嘗試建立用于鑒定缺乏活性MMT酶的大麥苗的非?？焖俚暮Y選方法?；谝韵率聦?shí)，即如果所述植物包含用于轉(zhuǎn)化亞硒酸鈉的活性MMT， 那么所述麥苗可以在存在250 μ M亞硒酸鈉的條件下生長(zhǎng)，設(shè)計(jì)了篩選方案，以對(duì)所述濃度的亞硒酸鈉存在下生長(zhǎng)下降的麥苗進(jìn)行目測(cè)評(píng)分。實(shí)際上，將NaN3-誘變的Μ3代大麥 cv. Prestige的22，704個(gè)穗(各由20-30個(gè)麥粒組成)置于裝有補(bǔ)充了 250 μ M亞硒酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)Vermeculite生長(zhǎng)培養(yǎng)基的塑料盤(pán)中。使所述穗的麥粒萌芽并發(fā)育成約15cm長(zhǎng)的麥苗。將特征為生長(zhǎng)下降(即麥苗長(zhǎng)度< 15cm)的總計(jì)812株植物轉(zhuǎn)移到新鮮土壤中并使其進(jìn)一步發(fā)育。然而，通過(guò)與野生型SMM水平相比確定，發(fā)現(xiàn)所述植物都不具有降低的MMT 活性。因此，上述篩選方法沒(méi)有產(chǎn)生突變體，并因此終止。實(shí)施例3潛在突變對(duì)總數(shù)分別為10，248和3，858個(gè)的NaR-誘變的大麥cv. Prestige和 cv. Sebastian的麥粒的SMM含量進(jìn)行篩查(參見(jiàn)實(shí)施例2中的方案1)，目的是鑒定所述 SMM含量比與野生型谷粒大幅減少的那些大麥。僅鑒定出兩個(gè)M3代的潛在突變體，即樣本號(hào)為8，063的谷粒(源自cv. I^estige并在下文稱(chēng)為突變體8063，該命名也用于其子代的谷粒，圖3B)和樣本號(hào)為14，018的谷粒(源自cv. Sebastian并在下文稱(chēng)為突變體14018， 該命名也用于其子代的谷粒，圖3B)。將每個(gè)突變體的谷粒繁育至M4代，然后收獲并最后進(jìn)行再分析。結(jié)果證明突變體8063和突變體14018的谷粒的SMM含量極低，可能完全喪失了 SMM0在獨(dú)立的試驗(yàn)中，利用Western印跡分析證明突變體8063和突變體14018缺乏 MMT酶。使突變體和相應(yīng)野生型植物的谷粒在浸泡在水中的濾紙上避光萌芽4天。將每個(gè)樣本的一個(gè)谷粒轉(zhuǎn)移至含有250 μ L H2O的Eppendorf管中，并利用雌蕊(pistil)勻質(zhì)。 以13，OOOrpm離心10分鐘后，將15 μ L液體提取物與5 μ L標(biāo)準(zhǔn)的4倍濃縮的SDS樣本緩沖液混合。通過(guò)使用與實(shí)施例12中描述的相同的免疫方法和與所述實(shí)施例中詳述的相同的抗-MMT抗體試樣，根據(jù)大小通過(guò)電泳使上述萌芽麥粒的樣本提取物的蛋白分離，并應(yīng)用于Wfestern印跡分析。注意到突變體8063和突變體14018的按大小分離的提取物不存在對(duì)應(yīng)于MMT的120-kDa蛋白染色條帶。然而，在萌芽的野生型麥粒的提取物中清楚地看到 120-kDa蛋白條帶(圖3C)。結(jié)合突變體8063和突變體14018的提取物中不存在SMM，但野生型麥粒的提取物中存在SMM的Wfestern印跡分析結(jié)果(圖，證明了突變體8063和突
33變體14018代表與MMT特征相關(guān)的無(wú)效突變體。
實(shí)施例4 突變體8063的MMT活性測(cè)定MMT酶催化甲基基團(tuán)從SAM轉(zhuǎn)移至Met，形成SMM(參見(jiàn)圖1B)。利用其中的甲基基團(tuán)帶有氚標(biāo)記的[3H]SAM作為底物，可以在利用活性炭除去剩余的[3H]SAM后，通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)所述甲基基團(tuán)的轉(zhuǎn)移?；钚蕴炕衔锱c底物結(jié)合但不與新合成的標(biāo)記產(chǎn)物SMM結(jié)合(Pimenta et al.，1995)，從而允許對(duì)MMT活性和SMM含量進(jìn)行測(cè)定，按照實(shí)施例2的描述，測(cè)定突變體8063和cv. Prestige的各15個(gè)芽提取物中的SMM含量(圖4)。數(shù)據(jù)測(cè)定證明了在野生型麥粒中MMT催化SMM的形成，而在突變體8063的谷粒中不存在這個(gè)性質(zhì)。實(shí)施例5突變體8063的MMT無(wú)效麥粒的中試規(guī)模發(fā)芽和釀造對(duì)突變體8063的麥芽和cv. Power的對(duì)照麥芽進(jìn)行的發(fā)芽和釀造分析包括以下步驟(i)萌芽，包括浸泡以產(chǎn)生綠色麥芽，有時(shí)隨后進(jìn)行烘干以獲烘干麥芽；(ii)制備麥芽汁；(iii)分離麥芽汁；(iv)煮沸麥芽汁；(ν)利用卡爾酵母發(fā)酵麥芽汁；(vi)儲(chǔ)藏啤酒；(Vii)過(guò)濾淡色啤酒(bright beer)；(viii)啤酒裝瓶。對(duì)于突變體8063和cv. Power (對(duì)照樣本)，均使用30kg麥芽用于釀造。碾磨麥芽樣本，然后向每個(gè)樣本中加入自來(lái)水至150L。在60°C的溫度糖化(MaShing-in)20分鐘，然后5分鐘升溫至65°C，在該溫度下持續(xù)溫育55分鐘。然后使醪液在15分鐘升溫至78°C， 在5分鐘溫育后結(jié)束糖化。隨后的釀造工序包括過(guò)濾麥芽汁，1小時(shí)的煮沸步驟和在旋渦中分離。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)釀造操作的說(shuō)明，例如Briggs et al. (1981)和Hough et al. (1982)的描述，進(jìn)行7天發(fā)酵、 儲(chǔ)藏并將成品啤酒裝入綠色玻璃瓶中。制備了總計(jì)100瓶(33-cL)源自野生型麥芽和突變麥芽的啤酒。實(shí)施例6MMT無(wú)效麥芽制備的啤酒中的DMS和DMSP水平按照實(shí)施例5的描述，由MMT無(wú)效的麥芽和cv. Power的麥芽釀造啤酒。在發(fā)芽和釀造過(guò)程中，測(cè)定綠色麥芽和烘干麥芽(圖5A)以及相應(yīng)的甜麥芽汁和煮沸麥芽汁中，以及成品啤酒中(圖5B)中的游離DMS和DMSP的水平?；景凑誋ysert et al. (1980)的描述，利用通過(guò)靜態(tài)頂空氣相色譜在350B硫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器(Sievers)上，通過(guò)硫特異性檢測(cè)法來(lái)測(cè)定DMS和DMSP的水平。利用自動(dòng)設(shè)備(HS-40 Automated Headspace Sampler, Perkin Elmer)進(jìn)行取樣。通過(guò)將各樣本在堿性條件下煮沸1小時(shí)獲得DMS的總水平，即麥芽汁，以及綠色麥芽和烘干麥芽的提取物中的游離DMS和DMSP之和。然后對(duì)樣本進(jìn)行頂空分析以確定DMS水平。如上文所述，將煮沸樣本中的總DMS水平與相應(yīng)的未煮沸樣本中游離DMS之間的差異定義為等于樣本DMSP的量。 基本按照在麥芽汁中的程序(Hysert et al.，見(jiàn)上文)測(cè)定啤酒中的游離DMS量。
實(shí)施例7 品嘗用MMT無(wú)效麥芽釀造的啤酒為了確定專(zhuān)業(yè)啤酒品嘗小組如何評(píng)價(jià)用MMT無(wú)效麥芽釀造的中試規(guī)模產(chǎn)生的啤酒，對(duì)經(jīng)測(cè)定包含4ppb DMS的啤酒進(jìn)行層次品嘗(profile tasting)。利用76ppb DMS的常規(guī)啤酒作為對(duì)照，這種啤酒是利用cv. Power的麥芽生產(chǎn)的。在品嘗分析之前，通過(guò)氣相色譜分析獲得啤酒酯和高級(jí)醇的譜圖。在所分析的12 個(gè)化合物中，MMT無(wú)效麥芽的啤酒中有3個(gè)化合物具有較低的水平(表1)。在第一品嘗測(cè)試中，將由乙酸乙酯、乙酸異戊酯和辛酸乙酯組成的混合物1摻入至用MMT無(wú)效麥芽釀造的啤酒中，以確保兩種儲(chǔ)藏啤酒中這些促成標(biāo)準(zhǔn)酯譜的風(fēng)味活性化合物的水平相似(參見(jiàn)表 1)。第二測(cè)試的目的是制備具有增強(qiáng)的風(fēng)味韻調(diào)的高酯啤酒。因此，將由乙酸異戊酯、己酸乙酯和辛酸乙酯組成的混合物2摻入到cv. Power麥芽的啤酒中(表1)，而向MMT無(wú)效麥芽的啤酒中摻入混合物1和混合物2。然后由經(jīng)培訓(xùn)的10人品嘗小組對(duì)上述啤酒進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)了 20個(gè)具體的風(fēng)味特征，每個(gè)風(fēng)味特征都分成0-5分的級(jí)別(圖6)。如圖6A中對(duì)高酯啤酒的詳述，與摻至相同水平的標(biāo)準(zhǔn)啤酒相比，對(duì)由MMT無(wú)效麥芽釀造的“DMS非常低的啤酒”中芬芳-芳香風(fēng)味的感知具有顯著作用。對(duì)所評(píng)價(jià)的所有芬芳-芳香風(fēng)味都記錄了較高的分值。即使在經(jīng)摻入達(dá)到正常酯譜的MMT無(wú)效麥芽的啤酒中(圖6B)，也記錄到對(duì)芬芳-芳香風(fēng)味的感知增強(qiáng)，這再次表明低水平DMS對(duì)芬芳啤酒化合物的感知具有積極作用。對(duì)這種現(xiàn)象的簡(jiǎn)單解釋是啤酒中的DMS掩蓋了令人愉快的芬芳-芳香風(fēng)味的味道，而這種味道代表了在評(píng)價(jià)飲料新鮮度時(shí)的重要因素。表1:啤酒的酯和醇分析風(fēng)味化合物的濃度麥芽類(lèi)型所添加的風(fēng)味物
風(fēng)味化合物cv. Power MMT無(wú)效混合物1 混合物2
ppm
乙醛1.001.20甲酸乙酯0.260.24乙酸乙酯23.4019.404.00乙酸異丁酯0.060.051-丙醇13.8013.80異丁醇9.009.60乙酸異戊酯*2.051.430.501.501-丁醇0.210.23異戊醇**59.0052.00己酸乙酯0.090.080.05乙酸正己酯0.010.01辛酸乙酯0.200.130.070.13*2-甲基-丁基乙酸酯和乙酸異戊酯濃度之和。**2-甲基-1- 丁醇和異戊醇濃度之和。實(shí)施例8大麥cv. Prestige中編碼匪T的基因的序列測(cè)定為了確定導(dǎo)致野生型大麥植物和突變大麥植物之間MMT活性差異的遺傳多樣性， 在跨越相應(yīng)大麥基因的起始密碼子和終止密碼子的DNA序列測(cè)定中進(jìn)行了大量工作。為了確定此前未知的大麥MMT基因的基因組序列，第一步是按照植物DNA提取試劑盒(Roche， cat. no. 1667319)供應(yīng)商提供的說(shuō)明書(shū)，從6日齡cv. Prestige大麥苗的葉中純化基因組 DNA(gDNA)。隨后，設(shè)計(jì)寡核苷酸引物以與編碼MMT的cDNA序列(GenBank登陸號(hào)AB028870 ； SEQ ID NO 1)結(jié)合。以大麥gDNA作為模板，利用6組不同的引物對(duì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增，所述引物對(duì)的DNA序列列于表2中。發(fā)現(xiàn)所述引物成對(duì)地在外顯子1 (包括翻譯起始密碼子和其下游)和2，外顯子2和4，外顯子4和5，外顯子5和9，外顯子9和11以及外顯子11 和12 (包括翻譯終止密碼子和其上游)中退火。上述6個(gè)反應(yīng)中有5個(gè)產(chǎn)生了跨越外顯子 2-4、外顯子4-5、外顯子5-9、外顯子9-11和外顯子11-12的DNA片段(參見(jiàn)圖9)。還有設(shè)計(jì)了一個(gè)反應(yīng)，其產(chǎn)生跨越翻譯起始密碼子和外顯子2的DNA片段(即與表2和圖9中所列引物對(duì)1的反應(yīng))，但僅觀(guān)察到反應(yīng)人工產(chǎn)物(reaction artifact) 0雖然造成這個(gè)難點(diǎn)的原因仍不清楚，但目的基因片段中顯著高含量的G和C堿基可能是造成正確序列擴(kuò)增失敗的原因。因此，采用了聲稱(chēng)有助于擴(kuò)增富含G-C基因區(qū)域的多個(gè)市售PCR反應(yīng)補(bǔ)充物，以嘗試擴(kuò)增編碼MMT的大麥基因的起始密碼子下游且仍包含該起始密碼子的DNA片段。盡管?chē)L試多次，但利用gDNA模板的所有嘗試都沒(méi)能在表2所列的反應(yīng)1中通過(guò)引物擴(kuò)增出特異性片段。
除了利用gDNA的擴(kuò)增試驗(yàn)，還研究了大麥苗葉的源自RNA的cDNA是否可能構(gòu)成用于擴(kuò)增MMT基因的難點(diǎn)外顯子1序列的功能性模板。因此，采用!^astRNA ProGreen試劑盒(Q-BIOgene, cat. no. 6045-050)的組分和使用說(shuō)明，從4日齡cv. Prestige大麥苗的嫩葉提取并純化總RNA。按照OneSt印RT-PCR試劑盒(Qiagen, cat. no. 210212)使用說(shuō)明書(shū)的詳述，將其等分試樣用在8X2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的RT-PCR反應(yīng)中(即8種引物對(duì)組合(表3)，每個(gè)組合使用兩個(gè)反應(yīng)緩沖液]。在瓊脂糖凝膠上分離片段，隨后的分析表明只有利用所述試劑盒的緩沖液1才能獲得反應(yīng)產(chǎn)物。然后利用QiaexII凝膠提取試劑盒Oliagen，cat. no. 20051)純化目標(biāo)DNA條帶。在上述RT-PCR試劑盒的Q-溶液存在下，利用引物對(duì)7、10 和11 (參見(jiàn)表幻進(jìn)行單獨(dú)的RT-PCR擴(kuò)增。在這種情況下，也純化出了目標(biāo)DNA片段。將各個(gè)DNA片段插入至載體pCR2. 1-T0P0(Invitrogen, cat. no. K4500-01)中，并用構(gòu)建體轉(zhuǎn)染大腸桿菌細(xì)胞之后，測(cè)定質(zhì)粒插入物的相應(yīng)DNA序列。綜上所述，合并上述工作的成果拼接出了跨越cv. Prestige大麥MMT基因的翻譯起始密碼子和終止密碼子的基因組序列(SEQ ID N0:3)。通過(guò)比對(duì)cDNA和基因組序列(即比對(duì)SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :1)，確定如圖9例示的大麥MMT基因包含被11個(gè)內(nèi)含子 (共3192bp)分隔的12個(gè)外顯子(總共3267bp)。由此衍生的cv. Prestige的MMT氨基酸序列示于圖10，并且表示為SEQ ID NO :6。在上述衍生的cv. Prestige的MMT氨基酸序列中，除了 Prol57 — Ala 和 Met985 — Tyr 夕卜，與 cv. Haruna Nijo 的序列(GenBank 登錄號(hào) AB028870 ；SEQ ID NO 2)的比較表明完全相同(圖11)。表2 用于擴(kuò)增編碼大麥MMT的基因組序列的引物
引物 對(duì)號(hào)PCR 產(chǎn)物末端 *正向引物 (5'—3' DNA 序列)**反向引物 (5'—3'0!\1八序列)***11-1462ATGGCTGCGGCGGCGGGGGACGTGG (SEQ ID NO: 37)CCTTCGAAGGGCACCACTTTTCTGC (SEQ ID NO:43)21268-2214AGGATTCCAGCAAAGAAAGAAGC (SEQ ID NO:38)CTGGAGAGCACAGTAGTTGCTCAAG (SEQE) NO: 44)32118-3075GATTCTTAACCCCAATCCAGAGGC (SEQ ID NO: 39)CTGCATAATTTTTGTTTGCCAGAGC (SEQ ID NO :45)42886-4409GGGTTTTGTTGAGGACCAATTTGGC (SEQ ID NO: 40)TACACCATTTGAGCTTGGCAGACT (SEQ ID NO: 46)54301-5188TGCTGCTTTCGTGAACTTATT (SEQ ID NO: 41)AAAATGGAGGCGTTTACTGCAGAA (SEQ ID NO: 47)65130-6459CATATGGATCTGGAeCGCAGCTTCTT (SEQ ID NO: 42)CTAGTTGCTACCATTCACCTTAGCACC (SEQ ID NO: 48)*)MMT的基因組序列的堿基對(duì)編號(hào)(SEQ ID NO :3 ；另參見(jiàn)圖9)。**)標(biāo)記為“PCR產(chǎn)物末端”的列中所列的片段的5'端的序列。***)標(biāo)記為“PCR產(chǎn)物末端”的列中所列的片段3'端的互補(bǔ)序列。
37
表3 用于擴(kuò)增編碼大麥MMT的cDNA序列的引物
權(quán)利要求
1.由大麥植物或其部分制備的飲料，其中，所述飲料包含水平低于30ppb的二甲基硫醚(DMS)，并且其中所述大麥植物或其部分的甲硫氨酸-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(MMT)編碼基因中具有使功能性MMT完全喪失的突變。
2.如權(quán)利要求1所述的飲料，其中，所述飲料為麥芽飲料。
3.如權(quán)利要求1和2中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，所述飲料為發(fā)酵的麥芽飲料。
4.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，所述飲料為啤酒。
5.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，所述飲料包含小于25ppb，更優(yōu)選小于 20ppb，還更優(yōu)選小于15ppb，更優(yōu)選小于lOppb，甚至更優(yōu)選小于5ppb，例如沒(méi)有可檢測(cè)到的 DMS。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，所述飲料包含小于20ppb的DMS。
7.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，所述飲料包含小于50ppb，優(yōu)選小于 40ppb，更優(yōu)選小于30ppb，甚至更優(yōu)選小于20ppb，還更優(yōu)選小于lOppb，甚至更優(yōu)選小于 5ppb，甚至更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的S-甲基-L-甲硫氨酸(SMM)。
8.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，所述飲料包含小于30ppb，優(yōu)選小于 25ppb，更優(yōu)選小于20ppb，甚至更優(yōu)選小于15ppb，還更優(yōu)選小于lOppb，甚至更優(yōu)選小于 5ppb，還更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的DMS，和小于50ppb，優(yōu)選小于40ppb，更優(yōu)選小于30ppb，甚至更優(yōu)選小于20ppb，還更優(yōu)選小于lOppb，甚至更優(yōu)選小于5ppb，甚至更優(yōu)選沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM。
9.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，所述飲料包含小于20ppb的DMS和小于 20ppb的SMM，優(yōu)選所述飲料包含小于5ppb的DMS和小于5ppb的SMM。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，當(dāng)將所述飲料與以相似方式由野生型大麥，優(yōu)選野生型cv. Power大麥制備的飲料的酯譜調(diào)整至相似時(shí)，根據(jù)經(jīng)訓(xùn)練的品嘗小組的評(píng)價(jià)，所述飲料在新鮮度和/或酯味方面的分值高于所述以相似方式由野生型大麥制備的飲料。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的飲料，其中，根據(jù)由經(jīng)訓(xùn)練的品嘗小組的評(píng)價(jià)，所述飲料在酯味方面的分值高于所述以相似方式由野生型大麥，優(yōu)選野生型cv. Power大麥制備的飲料。
12.大麥植物或其部分，其中，所述大麥植物的編碼甲硫氨酸-S-甲基轉(zhuǎn)移酶(MMT)的基因中具有導(dǎo)致MMT功能完全喪失的突變。
13.如權(quán)利要求12所述的大麥植物或其部分，其中，所述突變?cè)贛MT編碼基因的剪接位點(diǎn)內(nèi)。
14.如權(quán)利要求12和13中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述MMT編碼基因中的突變?cè)趦?nèi)含子的剪接位點(diǎn)內(nèi)。
15.如權(quán)利要求12-14中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述MMT編碼基因中的突變是在內(nèi)含子的5'剪接位點(diǎn)內(nèi)的突變，例如內(nèi)含子的5'末端堿基的G —A突變。
16.如權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述MMT編碼基因中的突變是在選自?xún)?nèi)含子2和內(nèi)含子5組成的組中的內(nèi)含子的5'剪接位點(diǎn)內(nèi)的突變。
17.如權(quán)利要求12-16中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述MMT編碼基因中的突變是SEQ ID NO 3的第3076位堿基的G — A突變。
18.如權(quán)利要求12-16中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述MMT編碼基因中的突變是SEQ ID NO 16的第1462位堿基的G — A突變。
19.如權(quán)利要求12-18中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述突變產(chǎn)生編碼截短形式的MMT的基因，所述截短形式的MMT包含野生型MMT的N-末端片段并任選地包含未見(jiàn)于野生型MMT的C-末端序列，其中，所述N-末端片段包含SEQ ID NO 6的至多500個(gè)， 更優(yōu)選至多450個(gè)，甚至更優(yōu)選至多400個(gè)，還更優(yōu)選至多350個(gè)，甚至更優(yōu)選至多320個(gè)， 還更優(yōu)選至多311個(gè)，或者至多288個(gè)N-末端氨基酸殘基。
20.如權(quán)利要求12和19中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述突變?cè)贛MT編碼基因中引入翻譯提前終止密碼子，優(yōu)選所述終止密碼子產(chǎn)生編碼權(quán)利要求19所述的任一截短形式MMT的基因。
21.如權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述植物選自2008年 10月13日保藏在A(yíng)TCC，命名為"大麥，Hordeum vuIgare ；8063系"，保藏名稱(chēng)為PTA-卯43 的植物和其子代組成的組。
22.如權(quán)利要求12-21中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述大麥植物的部分為麥粒。
23.如權(quán)利要求12-22中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分，其中，所述植物通過(guò)包括以下步驟的方法生產(chǎn)的植物；或者所述植物為通過(guò)包括以下步驟的方法生產(chǎn)的植物的子代(i)誘變大麥植物，和/或大麥粒，和/或大麥胚，和/或大麥細(xì)胞，和/或大麥組織，由此獲得MO代大麥；和( )繁殖所述經(jīng)誘變的大麥植物、麥粒、細(xì)胞、組織和/或胚至少2代，由此獲得Mx代的大麥植物，其中χ為彡2的整數(shù)；和(iii)由所述Mx代大麥粒獲得葉組織；和(iv)測(cè)定所述麥粒或其部分中SMM的水平；和(ν)選擇沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM的植物；和(vi)對(duì)MMT基因的至少一部分進(jìn)行測(cè)序；和(vii)選擇MMT編碼基因中具有突變的植物。
24.如權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的飲料，其中，所述飲料是由權(quán)利要求12-23任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分制備的。
25.一種組合物，其包含權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分。
26.一種植物產(chǎn)品，其包含經(jīng)加工的大麥植物或其部分，其中所述大麥植物為權(quán)利要求 12-23中任一項(xiàng)所述的大麥植物。
27.如權(quán)利要求沈的植物產(chǎn)品，其中，所述植物產(chǎn)品為包含經(jīng)加工的大麥植物或其部分的麥芽組合物，其中所述大麥植物為權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)所述的大麥植物。
28.如權(quán)利要求27所述的麥芽組合物，其中，所述大麥植物的所述部分為麥粒。
29.如權(quán)利要求27和觀(guān)中任一項(xiàng)所述的麥芽組合物，其中，所述麥芽組合物選自綠色麥芽和烘干麥芽組成的組。
30.如權(quán)利要求27和觀(guān)中任一項(xiàng)所述的麥芽組合物，其中，所述麥芽組合物為經(jīng)碾磨的麥芽。
31.如權(quán)利要求27-30中任一項(xiàng)所述的麥芽組合物，其中，所述麥芽組合物包含至多200ppb，優(yōu)選至多150ppb，更優(yōu)選至多l(xiāng)OOppb，甚至更優(yōu)選至多50ppb，例如至多25ppb的游離 DMS。
32.如權(quán)利要求27-31中任一項(xiàng)所述的麥芽組合物，其中，所述麥芽組合物包含至多 lOOOppb，優(yōu)選至多500ppb，更優(yōu)選至多150ppb的SMM。
33.如權(quán)利要求27-32中任一項(xiàng)所述的麥芽組合物，其中，所述麥芽組合物包含至多 200ppb的游離DMS和至多IOOOppb的SMM，例如至多25ppb的游離DMS和至多150ppb的 SMM0
34.如權(quán)利要求沈所述的植物產(chǎn)品，其中，所述植物產(chǎn)品為利用權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分制備的麥芽汁組合物，或者為利用由所述大麥植物或其部分制備的麥芽組合物所制備的麥芽汁組合物，或其混合物。
35.如權(quán)利要求34所述的麥芽汁組合物，其中，通過(guò)在不超過(guò)70°C，優(yōu)選不超過(guò)69°C的溫度下糖化而生產(chǎn)所述麥芽汁組合物。
36.如權(quán)利要求34和35中任一項(xiàng)所述的麥芽汁組合物，其中，所述麥芽汁組合物已被煮沸的時(shí)間為至多45分鐘，更優(yōu)選為至多30分鐘。
37.如權(quán)利要求34-36中任一項(xiàng)所述的麥芽汁組合物，其中，所述植物的所述部分為麥粒。
38.如權(quán)利要求34-37中任一項(xiàng)所述的麥芽汁組合物，其中，所述麥芽組合物為權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)所述的麥芽組合物。
39.如權(quán)利要求沈所述的植物產(chǎn)品，其中，所述植物產(chǎn)品為權(quán)利要求34-38中任一項(xiàng)所述的麥芽汁組合物，或由所述組合物制備的飲料。
40.由以下的混合物制備的組合物(i)包含權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分的組合物；和( )權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)所述的麥芽組合物。
41.如權(quán)利要求1-11所述的飲料，其中，所述飲料由權(quán)利要求27-33中任一項(xiàng)所述的麥芽組合物制備，或由權(quán)利要求34-38中任一項(xiàng)所述的麥芽汁組合物制備。
42.如權(quán)利要求沈所述的植物產(chǎn)品，其中，所述植物產(chǎn)品為選自大麥糖漿、麥芽糖漿、 大麥提取物和麥芽提取物組成的組。
43.一種生產(chǎn)飲料的方法，所述飲料包含小于30ppb的DMS，所述方法包括以下步驟(i)制備包含權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分的組合物；( )將(i)所述的組合物加工成飲料；由此獲得包含小于30ppb DMS的飲料。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中，所述方法為生產(chǎn)包含小于20ppbDMS，甚至優(yōu)選小于5ppb DMS的飲料的方法。
45.如權(quán)利要求43和44中任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(i)包括由所述大麥植物或其部分的麥粒制備麥芽組合物。
46.如權(quán)利要求43-45中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述組合物加工成飲料包括糖化步驟，由此產(chǎn)生麥芽汁組合物。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中，所述糖化步驟在不超過(guò)70°C，優(yōu)選不超過(guò)69°C的溫度下進(jìn)行。
48.如權(quán)利要求43-47中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述組合物加工成飲料包括糖化步驟、麥芽汁過(guò)濾步驟和噴射提取步驟，由此生產(chǎn)麥芽汁組合物。
49.如權(quán)利要求46-48中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述組合物加工成飲料包括煮沸所述麥芽汁的步驟，其中，將所述麥芽汁煮沸至多45分鐘，優(yōu)選至多30分鐘。
50.如權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)所述的方法，其中，將所述組合物加工成飲料包括所述麥芽汁的發(fā)酵。
51.一種生產(chǎn)麥芽組合物的方法，所述麥芽組合物包含至多200ppb游離DMS，所述方法包括以下步驟(i)提供權(quán)利要求22所述的麥粒；( )浸泡所述麥粒；(iii)使所述浸泡的麥粒在指定條件下萌芽；(iv)利用熱處理所述萌芽的麥粒；由此生產(chǎn)包含至多200ppb游離DMS的麥芽組合物。
52.一種制備大麥植物的方法，所述大麥植物的MMT編碼基因中具有引起MMT活性完全喪失的突變，其包括如下步驟(i)誘變大麥植物，和/或大麥粒，和/或大麥胚，和/或大麥細(xì)胞，和/或大麥組織，由此獲得MO代大麥；和( )繁殖所述經(jīng)誘變的大麥植物、麥粒、細(xì)胞、組織和/或胚至少2代，由此獲得Mx代的大麥植物，其中χ為彡2的整數(shù)；和(iii)獲得所述Mx大麥植物的樣本；和(iv)測(cè)定所述樣本中SMM的水平；和(ν)選擇沒(méi)有可檢測(cè)到的SMM活性的植物；和(vi)對(duì)MMT基因的至少一部分進(jìn)行測(cè)序；和(vii)選擇MMT基因中具有突變的植物；由此獲得MMT基因中具有引起MMT活性完全喪失的突變的大麥植物。
53.大麥植物或其部分，其中，所述大麥植物(i)在MMT編碼基因中具有引起MMT活性全部喪失的突變；和( )在脂氧合酶-1編碼基因中具有引起脂氧合酶-1活性完全喪失的突變。
54.如權(quán)利要求53所述的大麥植物或其部分，其中，所述MMT編碼基因的突變?yōu)闄?quán)利要求13-20中任一項(xiàng)所定義的突變。
55.一種植物產(chǎn)品，其由權(quán)利要求53和M中任一項(xiàng)所述的大麥植物或其部分制備。
56.如權(quán)利要求55所述的植物產(chǎn)品，其中，所述植物產(chǎn)品為飲料，優(yōu)選為啤酒。
全文摘要
本發(fā)明提供了源自大麥的飲料，其特征在于二甲基硫醚(DMS)和/或其前體S-甲基-L-甲硫氨酸(SMM)的水平均顯著降低或者缺乏所述化合物。此外，本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)上述飲料的方法以及用于制備此飲料的大麥植物和由所述植物制備的其它植物產(chǎn)品。本發(fā)明的應(yīng)用為進(jìn)行具有改良風(fēng)味譜的飲料的改良生產(chǎn)工序排除了障礙，并且還有望顯著降低啤酒生產(chǎn)的熱能輸入。
文檔編號(hào)C12C7/00GK102291982SQ200980155247
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2009年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月3日
發(fā)明者伯吉特·斯卡德豪奇, 克勞斯·布雷達(dá)姆, 古斯塔夫·漢布雷烏斯, 奧利·奧爾森, 斯藤·貝克·瑟倫森, 索倫·克努森, 萊恩·M·貝克 申請(qǐng)人:嘉士伯釀酒有限公司, 海尼肯供應(yīng)鏈股份有限公司