專利名稱：染色質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測的制作方法
染色質(zhì)結(jié)構(gòu)檢測相關(guān)專利申請的交叉引用本申請要求于2008年12月2日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/119，280的優(yōu)先權(quán)，該申請通過弓I用結(jié)合用于所有目的。
背景技術(shù)：
在已知為核小體的結(jié)構(gòu)中細胞中的大多數(shù)DNA包裝在一組組蛋白周圍。此核小體 DNA可以進一步被包裝進緊密壓緊DNA的卷曲結(jié)構(gòu)中。此緊密包裝可以限制DNA接觸轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄機器。以此方式包裝的基因組DNA有時被稱為染色質(zhì)(chromatin)。染色質(zhì)分為兩類，常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，在常染色質(zhì)中DNA疏松地包裝，是可接近的并且通常但不總是有轉(zhuǎn)錄活性的，在異染色質(zhì)中DNA是緊密包裝的，不可接近的且通常但不總是轉(zhuǎn)錄沉默的?？刂七@兩種染色質(zhì)狀態(tài)之間轉(zhuǎn)變的是表觀遺傳學。存在兩種主要的表觀遺傳學事件DNA甲基化和組蛋白修飾。這些事件影響DNA如何被包裝以及DNA是否是有轉(zhuǎn)錄活性的或轉(zhuǎn)錄沉默的。發(fā)明的簡述本發(fā)明提供了分析染色體DNA的方法，包括但不限于，確定染色體上的DNA區(qū)與 DNA修飾劑的可接近性，任選地將所述可接近性與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中， 該方法包括a.同時地i.透化或破壞細胞的細胞膜；和 使所述細胞與DNA切割劑或修飾劑在一定的條件下接觸，所述條件使得所述試劑切割或修飾所述細胞中的基因組DNA，其中所述基因組DNA的不同區(qū)域被所述試劑切割或修飾至不同的程度，從而產(chǎn)生切割的和完整的DNA區(qū)，或修飾的和未修飾的DNA區(qū)；和
b.檢測至少一個完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)的物理特性或量或?qū)χ辽僖粋€完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)進行克隆、分離或核苷酸測序。在一些實施方案中，該方法還包括將所述量與所述細胞中所述DNA區(qū)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，該方法包括檢測至少第一染色體完整的或未修飾的或修飾的 DNA區(qū)和第二染色體完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)的物理特性或量；和比較所述第一和第二 DNA區(qū)的物理特性或量。在一些實施方案中，該方法包括定量第一染色體DNA區(qū)和第二染色體DNA區(qū)的完整拷貝數(shù)，從而評估所述第一和第二 DNA區(qū)與所述DNA切割劑的相對可接近性。在一些實施方案中，在所述接觸步驟之后和檢測步驟之前分離所述基因組DNA。在一些實施方案中，所述細胞被透化并與所述DNA切割劑或修飾劑接觸，同時所述細胞直接或間接地附著于人工培養(yǎng)表面。在一些實施方案中，所述透化步驟包括使所述細胞與透化細胞膜的試劑接觸。在一些實施方案中，透化細胞膜的所述試劑是溶血脂質(zhì)(Iysolipid)。在一些實施方案中，所
5述溶血脂質(zhì)是溶血卵磷脂。在一些實施方案中，所述透化或破壞步驟包括用非離子型洗滌劑破壞細胞膜。在一些實施方案中，所述非離子型洗滌劑選自由NP40、Tween20和Triton X-100組成的組。在一些實施方案中，所述細胞與DNA切割劑接觸，且所述DNA切割劑是酶。 在一些實施方案中，所述細胞與DNA修飾劑接觸，且所述DNA修飾劑選自由甲基轉(zhuǎn)移酶和修飾DNA的化學制劑組成的組。在一些實施方案中，所述DNA切割劑是DNA切割酶； 所述基因組DNA中的修飾是切割位點；并且所述檢測步驟包括定量切割后DNA區(qū)的完整拷貝的量。在一些實施方案中，所述檢測步驟包括定量擴增。在一些實施方案中，定量擴增選自由定量聚合酶鏈反應(yīng)(任選地實時的)和定量連接介導聚合酶鏈反應(yīng)(任選地實時的) 組成的組。在一些實施方案中，所述DNA切割劑選自DNase和限制酶組成的組。在一些實施方案中，所述DNA修飾劑是甲基轉(zhuǎn)移酶；所述修飾是不會被所述細胞的天然甲基化酶甲基化的核苷酸序列中核苷酸上的甲基；并且所述檢測步驟包括檢測所述修飾存在與否的方法。 在一些實施方案中，所述甲基轉(zhuǎn)移酶是DAM甲基轉(zhuǎn)移酶并且所述定量步驟包括用限制酶切割所述修飾的DNA，所述限制酶識別被DAM甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化的DNA序列。在一些實施方案中，所述甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基結(jié)構(gòu)部分添加至DNA中的胞嘧啶，并且所述檢測步驟包括用甲基化特異性限制酶切割所述修飾的DNA和/或用亞硫酸氫鹽處理所述修飾的DNA。在一些實施方案中，所述DNA修飾劑是具有相對于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的空間位阻的分子，其中所述分子連接修飾DNA的化學制劑。一些實施方案中，所述修飾DNA的化學制劑選自由硫酸二甲酯和胼組成的組。在一些實施方案中，所述檢測步驟包括定量靶DNA區(qū)的至少一部分和對照DNA區(qū)的至少一部分，其中所述對照DNA區(qū)包含這樣的序列，所述序列i.在動物的基本上所有細胞中是可接近的；或 在動物的大多數(shù)細胞中是不可接近的；或iii.根據(jù)細胞的類型或生長環(huán)境具有可變的可接近性。在一些實施方案中，所述對照DNA區(qū)使用下列的每一種定量擴增引發(fā)所述對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分不包括所述 DNA修飾劑的可能修飾位點；和引發(fā)所述對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分確實包括所述DNA修飾劑的至少一個可能修飾位點。在一些實施方案中，所述物理特性是DNA甲基化。一些實施方案中，步驟a包括使所述DNA與DNA切割劑接觸，并且步驟b包括使所述完整的DNA與亞硫酸氫鹽接觸。在一些實施方案中，該方法還包括確定亞硫酸氫鹽處理的DNA的解鏈溫度，并且將所述解鏈溫度與DNA甲基化的存在、不存在或程度相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，步驟b包括制備下列的文庫完整DNA區(qū)；或修飾的DNA區(qū)； 或未修飾的DNA區(qū)。在一些實施方案中，步驟b包括使至少一個完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)與多核苷酸文庫在允許所述DNA區(qū)與所述文庫的一個或多個成員雜交的條件下接觸，并且檢測所述DNA區(qū)與所述一個或多個成員的雜交。在一些實施方案中，所述文庫組織在微陣列上。在一些實施方案中，步驟b包括擴增至少一個完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)。在一些實施方案中，步驟b包括對至少一個完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)進行核苷酸測序。本發(fā)明還提供了用于確定染色體上的基因座與DNA修飾劑的可接近性的試劑盒。 在一些實施方案中，該試劑盒包含細胞膜透化劑或破壞劑；和限制酶、DNase或其他DNA修飾劑。在一些實施方案中，所述細胞膜透化劑或破壞劑和所述限制酶或DNase處于同一容器中的同一緩沖液中。在一些實施方案中，所述細胞膜透化劑或破壞劑和所述限制酶或DNase處于單獨的容器中。 在一些實施方案中，該試劑盒還包含亞硫酸氫鹽。在一些實施方案中，該試劑盒還包含用于擴增真核生物的基因組DNA的區(qū)的引物對。在一些實施方案中，該試劑盒還包含a.弓I發(fā)對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分不包括所述 DNA修飾劑的可能修飾位點；和/或b.引發(fā)對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分確實包括所述 DNA修飾劑的至少一個可能修飾位點。在一些實施方案中，該試劑盒包含a.引發(fā)對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分不能接近所述修飾劑；和/或b.引發(fā)對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分可接近所述修飾劑。通過閱讀本文件的其余部分，本發(fā)明的其他實施方案將是明顯的。定義本文使用的“透化(Permeabilizing)，，細胞膜是指降低細胞膜的完整性從而允許修飾劑進入細胞中。具有透化的細胞膜的細胞通常保留細胞膜使得細胞的結(jié)構(gòu)仍然基本上是完整的。相反，本文使用的“破壞”細胞膜是指降低細胞膜的整合性使得細胞的結(jié)構(gòu)不保持完整性。例如，使細胞膜與非離子型洗滌劑接觸將去除和/或溶解細胞膜，從而允許修飾劑進入保留了至少一些染色體結(jié)構(gòu)的基因組DNA中。本文使用的“DNA修飾劑”是指以可檢測到的方式改變DNA的分子。示例性的修飾包括DNA切口形成或DNA切割或?qū)⒒瘜W結(jié)構(gòu)部分引入至DNA或從DNA去除化學結(jié)構(gòu)部分。 不導致DNA切割的DNA修飾劑包括，但不限于DNA甲基化酶。本文使用的“DNA區(qū)”是指基因組DNA內(nèi)的目的靶序列。所述DNA區(qū)可以具有任意的目的長度，所述長度可以被使用的DNA修飾劑所接近。在一些實施方案中，所述DNA區(qū)可以包括單個堿基對，但也可以是基因組DNA內(nèi)的短序列節(jié)段(例如，2-100，2-500，50-500bp) 或較大的節(jié)段(例如，100—10，000，100-1000，或1000-5000bp)。DNA區(qū)中DNA的量有時通過要在PCR反應(yīng)中擴增的序列的量來確定。例如，標準PCR反應(yīng)通?？梢詳U增約35-5000 個堿基對。不同“程度”的修飾是指樣品間或一個或多個樣品中兩個或多個DNA區(qū)之間一個或多個DNA區(qū)的修飾的拷貝數(shù)不同(實際不同或相對不同)。例如，如果100拷貝的兩個 DNA區(qū)(為了方便起見標為“A區(qū)”和“B區(qū)”)各自存在于細胞中的染色體DNA中，則修飾至不同的程度的實例為如果10個拷貝的A區(qū)被修飾而70個拷貝的B區(qū)被修飾。術(shù)語“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸”可互換使用，是指單體的聚合物，其可以對應(yīng)于核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)聚合物，或其類似物。這包括核苷酸諸如 RNA和DNA，以及其修飾形式，肽核酸(PNAs)，鎖核酸(LNA )和類似物的聚合物。在某些應(yīng)用中，核酸可以是包括多種單體類型的聚合物，例如，包括RNA和DNA亞單位兩者。核酸典型是單鏈的或雙鏈的并且通常包含磷酸二酯鍵，盡管在一些情況下， 如本文所概述的，包括這樣的核酸類似物，其可以具有備選的主鏈，包括，例如和不限于，磷酰胺(Beaucage等(1993) ^Tetrahedron (四面體)49 (10) :1925和本文的參考文獻；Letsinger (1970) J. Org. Chem.(有機化學雜志)35 :3800 ；Sprinzl 等(1977) Eur. J. Biochem.(歐洲生物化學雜志)81 :579 ；Letsinger 等(1986)Nucl. Acids Res.(核酸研究)14 3487 ；Sawai 等(1984) Chem. Lett.(化學快報)805 ；Letsinger 等(1988) J. Am. Chem. Soc.(美國化學會會志)110 :4470 ；和 Pauwels 等(1986) Chemica Scripta 26 1419),硫代磷酸鹽(phosphorothioate) (Mag 等(1991)Nucleic Acids Res.(核酸研究)19 1437和美國專利申請?zhí)?，644，048)，二硫代磷酸鹽(Briu等(1989) J. Am. Chem. Soc.(美國化學會會志)111 :2321)，Ο-methylphophoroamidite 鍵(Eckstein, Oligonucleotides and Analogues :A Practical Approach,(寡核苷酸禾口類似物實踐方法)0xford University I^ress (牛灃大學出版社)(199 )，和肽核酸主鏈和鍵 (Egholm (1992) J.Am. Chem. Soc.(美國化學會會志)114 :1895 ；Meier 等(1992) Chem. Int. Ed. Engl.(化學英文版)31 :1008 ；Nielsen(1993)Nature (自然)365 :566 ；禾口 Carlsson 等 (1996)Nature (自然)380 :207)，這些參考文獻的每一篇均通過引用結(jié)合。其他類似物核酸包括帶正電荷主鏈的那些(Denpcy等(1995)Proc. Natl. Acad. Sci. USA(美國國家科學院學報)92 6097)；帶非離子主鏈的那些(美國專利號5，386，023，5，637，684，5，602，240， 5,216，141 和 4，469,863 ；Angew (1991) Chem. Intl. Ed. English (應(yīng)用化學英文版)30 :423 ； Letsinger 等(1988) J.Am. Chem. Soc.(美國化學會會志)110 :4470 ;Letsinger 等(1994) Nucleoside & Nucleotide (核苷和核苷酸)13 :1597 ；第 2 章和第 3 章，ASC Symposium Series 580 (ASC MU^M H 580), “ Carbohydrate Modifications in Antisense Research (反義研究中的碳水化合物修飾)“，Y. S. Sanghvi和P. Dan Cook編輯；Mesmaeker 等(1994)Bioorganic & Medicinal Chem. Lett.(生物有機化學和醫(yī)藥化學通訊)4 :395 ； Jeffs 等(1994) J. Biomolecular NMR(生物分子 NMR 雜志)34 :17 ;Tetrahedron Lett. (四面體通訊)37 :743(1996))和帶非核糖主鏈的那些，包括美國專利號5，235，033和 5，034，506，以及第 6 章和第 7 章，ASC Symposium Series 580 (ASC 研討會系列 580)， Carbohydrate Modifications in Antisense Research (Sj^ff^^ W^/jC^^ljfftr|5) Y. S. Sanghvi和P. Dan Cook編輯中所述的那些，這些參考文獻的每一篇均通過引用結(jié)合。 包含一種或多種碳環(huán)糖的核酸也包括在核酸的定義內(nèi)(Jenkins等(19%)Chem. Soc. Rev.(化學會評論)169-176頁，該文獻通過引用結(jié)合)。幾種核酸類似物也描述在例如，Rawls， C & E News(C&E新聞)6月2日，1997，35頁中，該文獻通過引用結(jié)合。核糖-磷酸鹽主鏈的這些修飾可以被用來促進附加的結(jié)構(gòu)部分諸如標記結(jié)構(gòu)部分的添加，或用來改變這些分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期。除了天然存在的雜環(huán)堿基(它們典型地存在于核酸中)(例如，腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)以外，核酸類似物也包括具有非天然存在的雜環(huán)或其他修飾的堿基的那些，它們中的許多記載在本文中，或另外提及。具體地，許多非天然存在的堿基還記載在，例如，Seela 等(1991) Helv. Chim. Acta (瑞士化學學報)74 :1790，Grein 等(1994) Bioorg. Med. Chem. Lett.(生物有機化學與醫(yī)藥化學通訊)4 :971_976，和Seela等(1999) Helv. Chim. Acta(瑞士化學學報)82 :1640，它們的每一篇均通過引用結(jié)合。為了進一步說明，任選地包括在核苷酸中使用的充當解鏈溫度(Tm)修飾劑的某些堿基。例如，這些中的一些包括7-去氮雜嘌呤(deazapurines)(例如，7-去氮雜鳥嘌呤，7-去氮雜腺嘌呤等)，吡唑并[3，4-d]嘧啶，丙炔基_dN(例如，丙炔基-dU，丙炔基-dC 等)，等等。參見，例如，美國專利號5，990，303，題目為“7-去氮雜-2’-脫氧鳥苷核苷酸的合成”，該專利于1999年11月23日授權(quán)并通過引用結(jié)合。其他代表性的雜環(huán)堿基包括，例如，次黃嘌呤，肌苷，黃嘌呤；2-氨基嘌呤，2,6- 二氨基嘌呤，2-氨基-6-氯嘌呤， 次黃嘌呤，肌苷和黃嘌呤的8-氮雜衍生物；腺嘌呤，鳥嘌呤，2-氨基嘌呤，2，6_ 二氨基嘌呤， 2-氨基-6-氯嘌呤，次黃嘌呤，肌苷和黃嘌呤的7-去氮雜-8-氮雜衍生物；6-氮雜胞嘧啶； 5-氟胞嘧啶；5-氯胞嘧啶；5-碘胞嘧啶；5-溴胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；5-丙炔基胞嘧啶； 5-溴乙烯基尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔基尿嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶等。本文使用的DNA區(qū)與DNA修飾劑的“可接近性(accessibility) ”是指特定的DNA 修飾劑接觸和修飾細胞的染色體中的特定DNA區(qū)的能力。不希望限制本發(fā)明的范圍，相信包含該DNA區(qū)的特定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)將影響DNA修飾劑修飾該特定DNA區(qū)的能力。例如，該DNA 區(qū)可以纏繞在組蛋白周圍并且可以進一步具有其他的核小體結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)防止或減少 DNA修飾劑接近目的DNA區(qū)?！癐I-S型限制酶”使用其本領(lǐng)域中的通常含義，指識別DNA中的特定識別序列，然后切割該識別序列外部的DNA分子的限制酶。示例性的II-S型限制酶包括，但不限于， MnII，F(xiàn)okIJP AlwI。附圖簡要說明

圖1圖示了染色質(zhì)的示意性圖示。真核生物DNA可以分成兩種一般狀態(tài)，常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，在常染色質(zhì)中DNA疏松地包裝，是可接近的和有轉(zhuǎn)錄活性的，在異染色質(zhì)中 DNA是緊密包裝的，不可接近的和轉(zhuǎn)錄沉默的。表觀遺傳學控制這兩種狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。本文所述的測定可以評估染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，表觀遺傳學事件的功能結(jié)果。圖2圖示了測定的示意性圖示。吸取培養(yǎng)基并且加入透化/消化緩沖液。核酸酶擴散至細胞中，進入細胞核中并消化可接近的染色質(zhì)，但不消化不可接近的染色質(zhì)(表示為朝向圖底部的粗線)。圖3圖示了示例性工作流程的示意性圖示。圖4圖示了一種評估當Mnl 1用作探針時生成的數(shù)據(jù)的分析方法。在每個測定中分析兩個DNA樣品，一個DNA樣品是對照，其分離自用不含核酸酶的緩沖液處理的細胞，另一個樣品分離自用緩沖液和核酸酶處理的細胞。兩個樣品使用總引物組和完整引物組通過實時PCR分析。(A)使用對照DNA樣品數(shù)據(jù)通過從總Ct中減去完整的Ct計算Δ Ct (未切割的)。(B)使用核酸酶處理的DNA樣品數(shù)據(jù)通過從總Ct中減去完整的Ct計算Δ Ct (切割的)?？山咏幕蛟贛nlI位點處被切割，其具有較少的完整DNA和較大的Δ Ct (切割的)，該ACt與消化的程度成正比并反映較大的染色質(zhì)可接近性。不可接近的或“鎖定的 (locked-down) ” DNA的量通過公式2Λ ( Δ Ct (未切割的)-Δ Ct (切割的))來計算。圖5是分析的靶基因的圖。灰色區(qū)域代表轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。指出了 Mnl 1位點和TATA 盒的位置。GAPDH是一種管家基因，其在大多數(shù)細胞系中表達并且預期位于可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。血紅蛋白β鏈(HBB)在大多數(shù)細胞中是沉默的并且預期位于不可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi (GSTPl)在前列腺癌中表觀遺傳地失活，其在非癌性RWPE-I 前列腺細胞中表達，但在癌性LNCaP前列腺細胞中是沉默的。圖6圖示了分析的靶基因和引物組的位置。使用總引物組和完整引物組分析所有基因，所述總引物組不跨越任何MnlII位點并且擴增所有DNA鏈，所述完整引物組跨越2_4 個MnlI位點的完整引物組并僅擴增在這些位點處未被切割的DNA鏈。圖7提供了對使用瓊脂糖凝膠電泳分析gDNA完整性的概述。Hela細胞用不含核酸酶的透化/消化緩沖液(M，MnlI ；D, DNase I)，不含溶血卵磷脂的透化/消化緩沖液，或含有核酸酶和溶血卵磷脂兩者的透化/消化緩沖液處理。通過瓊脂糖凝膠電泳分離和分析 gDNA。結(jié)果表明核酸酶和溶血卵磷脂兩者對于顯著的gDNA消化均是必需的。圖8圖示了作為MnlI處理的Hela細胞中HBB的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。Hela細胞如指示的那樣處理。用擴增HBB基因的引物分離和分析gDNA。當使用HBB完整引物組時完全反應(yīng)(+，x)的Ct值類似于對照反應(yīng)。這提示在Hela細胞中HBB處于不可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。圖9圖示了作為MnlI處理的Hela細胞中GAPDH的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。Hela細胞如指示的那樣處理。用擴增GAPDH基因的引物分離和分析gDNA。當使用GAPDH完整引物組時完全反應(yīng)(+，x)的Ct值高于對照反應(yīng)(曲線右移)。這提示在Hela細胞中GAPDH處于可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。圖10圖示了作為MnlI處理的Hela細胞的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。Hela細胞如指示的那樣處理。用擴增GSTPl基因的引物分離和分析gDNA。當使用GSTPl完整引物組時完全反應(yīng)(+，χ)的Ct值高于對照反應(yīng)(曲線右移)。這提示在Hela細胞中GSTPl處于可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。圖11以圖表的形式圖示了三個DNA區(qū)(HBB，GAPDH和GSTPl)的數(shù)據(jù)，輸出值計算為不可接近的總DNA的百分比。圖12圖示了作為MnlI處理的前列腺細胞中HBB的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。在兩種細胞系中，使用HBB完整引物組(χ)的+酶反應(yīng)的Ct值類似于使用HBB總引物組(ο)的+ 酶反應(yīng)。這提示在RWPE-I和LNCaP細胞中HBB處于不可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。圖13圖示了作為MnlI處理的前列腺細胞中GAPDH的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。在兩種細胞系中，使用GAPDH完整引物組(χ)的+酶反應(yīng)的Ct值高于(曲線右移)使用GAPDH 總引物組(ο)的+酶反應(yīng)。這提示在RWPE-I和LNCaP細胞中GAPDH處于可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。圖14圖示了作為MnlI處理的前列腺細胞中GSTPl的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。在 RWPE-I細胞中，使用GSTPl完整引物組(χ)的+酶反應(yīng)的Ct值高于(曲線右移)使用GSTPl 總引物組(ο)的+酶反應(yīng)。這提示在RWPE-I細胞中GSTPl處于可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。相反，在LNCaP細胞中，使用GSTPl完整引物組(χ)的+酶反應(yīng)的Ct值類似于使用GSTPl總引物組(ο)的+酶反應(yīng)。這提示在LNCaP細胞中GSTPl處于不可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。圖15圖示了來自前列腺細胞的數(shù)據(jù)的概述。如材料和方法章節(jié)中所述計算不可接近的DNA的百分比。結(jié)果表明在兩種細胞系中，HBB處于不可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中，GAPDH 處于可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。GSTPl在RWPE-I細胞中處于可接近的染色質(zhì)中，并在LNCaP 細胞中處于不可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。圖16圖示了一種評估當DNase I用作染色質(zhì)結(jié)構(gòu)探針時生成的數(shù)據(jù)的分析方法。 在每個測定中分析兩個DNA樣品，一個DNA樣品是對照，其分離自用不含核酸酶的緩沖液處理的細胞，另一個樣品分離自用緩沖液和核酸酶處理的細胞。兩個樣品使用擴增不可接近的參照基因(HBB)的引物組通過實時PCR分析。Δ Ct (參照)代表不可接近的染色質(zhì)的核酸酶消化程度，并且通過從與+核酸酶曲線相關(guān)的Ct中減去與無核酸酶曲線相關(guān)的Ct來計算。ACt (靶)代表靶染色質(zhì)區(qū)的核酸酶消化程度，并且通過從與+核酸酶曲線相關(guān)的 Ct減去與無核酸酶曲線相關(guān)的Ct來計算。不可接近的或“鎖定的(l0Cked-d0wn)”DNA的量通過公式2Λ ( Δ Ct (參照)-Δ Ct (靶))來計算。圖17是分析的靶基因和引物組的位置的圖?；疑珔^(qū)域代表轉(zhuǎn)錄的區(qū)域。帶有箭頭的黑色區(qū)域代表每個引物的位置和方向。圖18圖示了作為DNase I處理的細胞系中HBB的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。在所有細胞系中，+核酸酶反應(yīng)(灰線)的Ct值類似于無核酸酶反應(yīng)(黑線)。這提示在所有細胞系中HBB處于不可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。圖19圖示了作為DNase I處理的細胞系中GAPDH的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。在所有細胞系中，+核酸酶反應(yīng)(灰線)的Ct值明顯高于無核酸酶反應(yīng)(黑線)的Ct值。這提示在所有細胞系中GAPDH處于可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。圖20圖示了作為DNase I處理的細胞系中GSTPl的循環(huán)數(shù)的函數(shù)的熒光。我們觀察到ACt (GSTPl)值的細胞系依賴性差異。在Hela和HCT15細胞中，ACt (GSTPl)很大， 表明在這些細胞系中，GSTPl處于可接近的構(gòu)型中。在LNCaP細胞中，ACt (GSTPl)很小，表明GSTPl處于不可接近的染色質(zhì)中。在PC3細胞中，ACt(GSTPl)具有中等值，表明GSTPl 處于部分可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。這些結(jié)果與在不同細胞系中檢測到的GSTPlmRNA表達的水平高度一致(參見圖21)。圖21圖示了來自使用DNase I作為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)探針的實驗的數(shù)據(jù)的概述。不可接近的DNA的百分比如圖16中所述進行計算。GAPDH和GSTP1RNA表達的相對水平通過 qRT-PCR分析分離自不同細胞系的mRNA來計算。結(jié)果表明靶基因染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與靶基因表達的水平的相關(guān)性良好。這提示所述的測定是評估對基因調(diào)控的表觀遺傳作用的有用工具。詳述I.介紹本發(fā)明允許通過透化或破壞細胞膜和修飾細胞中的基因組DNA，然后定量不同基因座中的修飾程度來分析染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。特定基因座處的修飾程度反映了染色體的該部分與修飾劑的可接近性，并且因此反映了染色質(zhì)的狀態(tài)。本發(fā)明的一個優(yōu)點是發(fā)現(xiàn)了可以同時地透化和修飾細胞中的完整染色質(zhì)，例如， 通過使細胞與一種緩沖液接觸，所述緩沖液包含透化劑和DNA修飾劑或切割劑。這允許非?？焖俚禺a(chǎn)生結(jié)果。此外，此方法消除了繁瑣的和可能人工施加的步驟諸如細胞核的分離， 等等，這些步驟在一些以前的染色質(zhì)分析方法中是必需的。II. 一般方法本發(fā)明的方法涉及同時透化細胞并使細胞與DNA修飾劑在一定的條件下接觸，所述條件使得細胞中的基因組DNA與所述修飾劑具有不同的可接近性(由于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)差異所導致)，然后定量DNA區(qū)中修飾的量。DNA的不同的可接近性可以反映基因組DNA的核小體結(jié)構(gòu)。例如，在一些實施方案中，較易接近DNA修飾劑的DNA區(qū)有可能處于較“疏松”的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。在本發(fā)明中可以使用多種真核細胞。在一些實施方案中，所述細胞是動物細胞，包括但不限于，人，或非人哺乳動物細胞。非人哺乳動物細胞包括但不限于，靈長類細胞，小鼠細胞，大鼠細胞，豬細胞和牛細胞。在一些實施方案中，所述細胞是植物細胞。細胞可以是， 例如，培養(yǎng)的原代細胞，永生化培養(yǎng)細胞或可以來自活組織檢查或組織樣品，所述樣品在測定前任選地被培養(yǎng)和刺激以發(fā)生分裂。培養(yǎng)細胞在透化和/或DNA修飾步驟之前和/或期間可以處于懸液中或是粘附的。細胞可以來自動物組織、活組織檢查等。例如，所述細胞可以來自腫瘤活組織檢查。本發(fā)明的方法可以包括將DNA區(qū)的可接近性與來自該相同區(qū)域的轉(zhuǎn)錄相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，進行實驗以確定可接近性和基因表達之間的相關(guān)性，并且隨后DNA修飾劑與特定DNA區(qū)的可接近性可以用來預測來自該DNA區(qū)的轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，來自 DNA區(qū)的轉(zhuǎn)錄和該區(qū)與DNA修飾劑的可接近性兩者均被確定。已知有大量測量轉(zhuǎn)錄的方法， 所述方法包括但不限于northern印跡和RT-PCR的應(yīng)用。在一些實施方案中，一個區(qū)域的DNA甲基化狀態(tài)可以與DNA區(qū)與DNA修飾劑的可接近性相關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，進行實驗以確定該區(qū)域的可接近性和DNA甲基化之間的相關(guān)性，隨后DNA修飾劑與特定DNA區(qū)的可接近性可以用來預測來自該DNA區(qū)的DNA 甲基化。在一些實施方案中，DNA區(qū)的甲基化和該區(qū)與DNA修飾劑的可接近性兩者均被確定。已知有大量測量DNA甲基化的方法，所述方法包括但不限于應(yīng)用亞硫酸氫鹽(例如， 用于測序中和/或與甲基化敏感的限制酶結(jié)合使用(參見，例如，feds等，Nucleic Acids Research (核酸研究)28 (8) :E32 (2002))和高分辨率熔解測定(HRM)(參見。例如，Wodjacz 等，Nucleic Acids Research (核酸研究)35 (6) :e41 (2007)) 本發(fā)明在透化/DNA修飾后，提供了細胞基因組中第一 DNA區(qū)與第二 DNA區(qū)的量或其他物理特性的比較。備選地，或另外地，可以比較兩種不同的細胞中第一 DNA區(qū)的量或其他物理特性。例如，所述兩種細胞可以代表患病的和健康的細胞或組織，不同的細胞類型， 發(fā)育的不同階段(包括但不限于干細胞或祖細胞)等。因此，通過使用本發(fā)明的方法，可以檢測細胞之間染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的差異和/或確定一個細胞內(nèi)兩個或多個DNA區(qū)(例如，基因) 之間相對的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。另外，可以確定藥物、化學制劑或環(huán)境刺激物對相同細胞或不同細胞中的特定區(qū)域的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。
III.透化和破壞細胞細胞膜可以以本領(lǐng)域中已知的任何方式被透化或破壞。如本文所解釋的那樣，本發(fā)明的方法包括在分離基因組DNA之前接觸所述基因組DNA，因此透化或破壞細胞膜的方法將不會破壞細胞的基因組DNA的結(jié)構(gòu)從而破壞核小體或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，細胞膜與透化或破壞細胞膜的試劑接觸。溶血磷脂是示例類型的透化細胞膜的試劑。示例性的溶血磷脂包括，但不限于，溶血卵磷脂(在本領(lǐng)域中也稱為溶血卵磷脂)或單棕櫚酰磷脂酰膽堿。多種溶血磷脂也記載在，例如，W0/2003/052095 中。非離子型洗滌劑是示例類型的破壞細胞膜的試劑。示例的非離子型洗滌劑包括但不限于，NP40、Tween 20 和 Triton X-IOO0本發(fā)明的一個優(yōu)勢是同時遞送透化劑和DNA切割劑或DNA修飾劑。因此，在一些實施方案中，包含兩種試劑的緩沖液與細胞接觸。緩沖液應(yīng)當適于保持兩種試劑的活性，同時維持細胞染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。備選地，可以使用電穿孔或基因槍法來透化細胞膜，使得DNA修飾劑引入至細胞中，并且因此接觸基因組DNA。大量的電穿孔法是公知的，并且可以適于遞送如本文所述的 DNA修飾劑。示例性的電穿孔法包括但不限于，W0/2000/062855中所述的那些?；驑尫òǖ幌抻诿绹鴮＠?，179，022中所述的那些。IV. DNA 修飾劑在透化后，或與透化同時(例如，在電穿孔期間或與透化劑溫育期間)，引入DNA修飾劑，使得該試劑接觸基因組DNA，從而在DNA中引入修飾作用。根據(jù)本發(fā)明可以使用大量的DNA修飾劑。在一些實施方案中，在去除透化劑后，DNA修飾劑與被透化的細胞接觸，任選地更換緩沖液。備選地，在一些優(yōu)選的實施方案中，DNA修飾劑與基因組DNA接觸，而沒有一個或多個中間步驟(例如，不更換緩沖液，不洗滌細胞等)。如上所述，此后一種方法可以便于減少必需的勞力和時間的量，并且還去除了測定中潛在的誤差和污染的來源。使用的DNA修飾劑的量，以及與DNA修飾劑反應(yīng)的時間將取決于使用的試劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到如何根據(jù)使用的試劑來調(diào)整條件。通常，DNA修飾步驟的條件被調(diào)節(jié)為使得不達到“完全的”消化。因此，例如，在一些實施方案中，設(shè)定修飾步驟的條件使得陽性對照(即，其中修飾是可接近的并發(fā)生修飾的對照)以高水平但小于100%的水平，例如，80-95 %，80-99 %, 85-95%, 90-98 % 等之間的水平出現(xiàn)。A.限制酶在一些實施方案中，DNA修飾劑是限制酶。因此，在這些實施方案中，引入至基因組DNA中的修飾是序列特異的單鏈(例如，切口)或雙鏈切割劑。大量的限制酶是已知的并且可以用于本發(fā)明中?？梢允褂萌魏晤愋偷南拗泼?。I型酶遠離其識別序列隨機地切割DNA。II型酶在靠近其識別序列或其識別序列內(nèi)的限定位置處切割DNA。一些II型酶在其識別序列內(nèi)切割 DNA。II-S型酶切割其識別序列的外側(cè)成一側(cè)。第三種主要類型的II型酶，更確切地稱為 “IV型”，切割其識別序列的外側(cè)。例如，識別連續(xù)序列(例如，AcuI =CTGAAG)的那些僅在一側(cè)上切割；識別不連續(xù)序列(例如，BcgI :CGANNNNNNTGC)的那些在兩側(cè)上切割，釋放包含識別序列的小片段。III型切割其識別序列的外側(cè)，并且需要同一 DNA分子內(nèi)處于相反方向上的兩個這樣的序列以完成切割。本發(fā)明的方法可以適于使用任何類型的限制酶或其他DNA切割酶。在一些實施方案中，該酶是相對接近地(例如，5、10或20個堿基對內(nèi))切割識別序列的一種或多種酶。 這樣的酶可以特別地用于測定染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，因為必須是可接近的從而實現(xiàn)切割的DNA的跨度比識別序列本身更大，因此可能涉及較寬跨度的DNA，所述DNA不處于“緊密的”染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。序列特異的限制酶可以提供部分改善的定量結(jié)果，因為基于同一 DNA區(qū)的對照可以如本文所述那樣設(shè)計(例如，在實施例中)。因此，與例如用序列非特異的核酸內(nèi)切酶 ("DNase")消化相比，可以更精確地確定總的和消化的拷貝數(shù)。不象DNase I，II_S型限制酶的切割可以對組蛋白與一個或多個目標DNA區(qū)的結(jié)合敏感。示例性的切割其識別序列外側(cè)的酶包括，例如，II-S型、III型和IV型酶。II-S型限制酶包括，但不限于，MnII、FokI 禾口 AlwI0在一些實施方案中，使用超過一種的(例如，兩種、三種、四種等)限制酶。酶的組合可以包括所有均來自一種類型的酶的組合或可以是不同類型的混合物。隨后可以單獨地檢測和定量完整的或切割的DNA，并且可以如本文所述確定DNA 區(qū)的完整和/或切割拷貝數(shù)。在一些實施方案中，透化劑或膜破壞劑在加入限制酶之前加入。在一些實施方案中，限制酶和透化劑或破壞劑同時加入(例如，在適當?shù)木彌_液中或與適當?shù)木彌_液一起)。即使兩種試劑開始不在同一時刻與細胞接觸，仍然可以獲得同時透化和與DNA修飾劑的接觸，因為透化可以是一個一直進行的過程。因此，例如，在添加透化劑稍后(在透化基本完成之前)添加DNA修飾劑可以被認為“同時”透化細胞和將細胞與DNA修飾劑接觸。 “同時”是指在添加透化劑和修飾劑之間沒有中間操作發(fā)生(包括但不限于更換緩沖液，離心等)。在一些實施方案中，使用0.5%溶血卵磷脂(w/v)，50mM NaCl, IOmM Tris-HCl ρΗ7· 4，IOmM MgCl2, ImM DTT，100 μ g/ml BSA 和 0-500 單位 /ml MnlI (或其他限制酶)。在一些實施方案中，使用 0. 25%溶血卵磷脂(w/v)，50mM NaCl, IOmM Tris-HCl pH7. 4, IOmM MgC12,lmM ΤΤ,ΙΟΟμ g/ml BSA和0-500單位/ml MnlI (或其他限制酶)。在一些實施方案中，使用 0. 75%溶血卵磷脂(w/v)，50mM NaCl, IOmM Tris-HCl pH7. 4, IOmM MgCl2，ImM DTT,100 μ g/ml BSA和0-500單位/ml MnlI (或其他限制酶)。在一些實施方案中，使用
溶血卵磷脂(w/v), 50mM NaCl, IOmM Tris-HCl pH7. 4, IOmM MgCl2，ImM DTT, 100 μ g/ml BSA和0-800單位/ml MnlI (或其他限制酶)。在透化和消化后，任選地停止消化并且溶解細胞，所述溶解細胞任選地通過同時地添加溶解/終止緩沖液和/或增加溫度。示例性的溶解/終止緩沖液可以包含足量的螯合劑和洗滌劑以終止反應(yīng)和溶解細胞。例如，在一些實施方案中，溶解/終止緩沖液包含 IOOmM Tris-HCl pH8, IOOmM NaCl, IOOmM EDTA,5% SDS (w/v)禾口 3mg/ml 蛋白酶 K。在一些實施方案中，溶解/終止緩沖液包含IOOmM Tris-HCl pH8, IOOmM NaCl, IOOmM EDTA, 1% SDS (w/v)和:3mg/ml蛋白酶K。在一些實施方案中，溶解/終止緩沖液包含200mM Tris-HCl pH8, IOOmM NaCl,500mM EDTA, 5% SDS (w/v)和 5mg/ml 蛋白酶 K。B. DNase
在一些實施方案中，使用以序列非特異的方式切割或切口 DNA的酶作為DNA修飾劑。因此，在一些實施方案中，DNA修飾劑是序列非特異的核酸內(nèi)切酶(本文中也稱為 “DNase”)。根據(jù)本發(fā)明可以使用任何序列非特異的核酸內(nèi)切酶(例如，DNase I，II，III， IV，V，VI，VII中的任一種)。例如，可以使用任何DNase，包括但不限于DNase I。使用的 DNase可以包括天然存在的DNase以及修飾的DNase。修飾的DNase的一個實例是TURBO DNase(Ambion)，其包括允許“高活性(hyperactivity) ”和耐鹽性的突變。示例性的DNase 包括但不限于牛胰腺DNase I (可獲自，例如，New England Biolabs)。隨后可以單獨地檢測和定量完整的DNA，并且可以如本文所述確定DNA區(qū)的完整和/或切割拷貝數(shù)。在一些實施方案中，透化劑或膜破壞劑在加入DNase之前加入。在一些實施方案中，DNase和透化劑或破壞劑同時加入(例如，與適當?shù)木彌_液一起)。在一些實施方案中，透化/消化緩沖液包含0. 25%溶血卵磷月旨(w/v)，IOmM Tris-HCl pH7. 4,2. 5mM MgCl2, 0. 5mM CaC12和0-200單位/ml DNase I。在一些實施方案中，透化/消化緩沖液包含 0.5%溶血卵磷脂(w/v)，IOmM Tris-HCl pH7. 4,2. 5mM MgCl2,0. 5mM CaC12 和 0-200 單位 /ml DNase I。在一些實施方案中，透化/消化緩沖液包含0. 75%溶血卵磷脂(w/v)，IOmM Tris-HCl pH7. 4,2. 5mM MgCl2,0. 5mM CaC12 和 0-500 單位/ml DNase I。在一些實施方案中，透化/消化緩沖液包含0. 25%溶血卵磷月旨(w/v)，IOmM Tris-HCl pH7. 4,2. 5mM MgCl2, 0. 5mM CaC12和0-500單位/ml DNase I。透化和溶解可以例如，如上面對限制酶所述的那樣被終止。如其他地方所討論的那樣，通過監(jiān)測至少兩個不同的DNA區(qū)之間的切割程度來增強DNase或其他一般DNA切割劑的使用，所述一個DNA區(qū)是靶標，另一個是在任何測試條件下通?？偸强山咏腄NA區(qū)或通?？偸遣豢山咏腄NA區(qū)。這樣的基因的實例在本文其他地方討論，并且是已知的或可以被鑒定。例如，包括“管家”基因的DNA區(qū)通?？偸强山咏摹Ｆ溆喟袠伺c對照相比的相對量然后可以用來確定靶DNA區(qū)處的相對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。C.甲基轉(zhuǎn)移酶在本發(fā)明的一些實施方案中，DNA修飾劑對DNA產(chǎn)生共價修飾。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的DNA修飾劑是甲基轉(zhuǎn)移酶。許多甲基轉(zhuǎn)移酶在本領(lǐng)域中是已知的，并且可以在本發(fā)明中使用。在一些實施方案中，使用的甲基轉(zhuǎn)移酶向DNA中的腺苷添加甲基結(jié)構(gòu)部分。這樣的甲基轉(zhuǎn)移酶的實例包括，但不限于，DAM甲基轉(zhuǎn)移酶。因為在真核細胞中腺苷是被未甲基化，因此特定DNA區(qū)中甲基化腺苷的存在表明DAM甲基轉(zhuǎn)移酶(或具有類似活性的其他甲基轉(zhuǎn)移酶)能夠接近該 DNA區(qū)。腺苷甲基化可以被檢測到，例如，使用其識別序列包含甲基化腺苷的限制酶。此類酶的實例包括，但不限于，DpnI0然后可以如本文所述定量由限制酶進行的切割(例如，其中完整的DNA被擴增，但切割的DNA不被擴增，或使用LM-PCR來擴增切割的DNA但不擴增完整的DNA)。在一些實施方案中，甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化GC序列中的胞嘧啶。此類甲基轉(zhuǎn)移酶的實例包括但不限于MCviPI。參見，例如，Xu等，Nuc. Acids Res.(核酸研究)26 (17) 3961-3966 (1998)。因為在真核細胞中GC序列是未甲基化的，因此特定DNA區(qū)中甲基化GC序列的存在表明DNA修飾劑(即，甲基化GC序列中的胞嘧啶的甲基轉(zhuǎn)移酶)能夠接近該 DNA區(qū)?？梢允褂萌魏螖?shù)量的技術(shù)來鑒定甲基化的GC序列。在一些實施方案中，檢測甲基化GC序列的方法包括亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變。亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變包括使DNA與足量的亞硫酸氫鹽接觸從而將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。甲基化胞嘧啶未被轉(zhuǎn)變。因此，包含GC序列的 DNA區(qū)可以與甲基化GC序列中的胞嘧啶的甲基轉(zhuǎn)移酶接觸，分離，然后與亞硫酸氫鹽接觸。 如果GC序列中的C未被甲基化，則C將被轉(zhuǎn)變?yōu)閁 (如果隨后被擴增，則轉(zhuǎn)變?yōu)門)，而甲基化的C將仍然為C。任何數(shù)量的方法，包括但不限于，核苷酸測序和涉及引物延伸或基于引物的擴增和/或甲基化敏感的限制酶消化的方法可以用來檢測亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變的C的存在與否(例如，MSnuPE, MSP或Methyllight,高分辨率熔解分析；焦磷酸測序，等)。參見，例如，F(xiàn)raga等，Biotechniques (生物技術(shù))33 :632，634，和 636-649 Q002) ；El-Maarri O Adv Exp Med Biol (實驗醫(yī)學與生物學進展)544 :197-204^003) ；Laird, Nat Rev Cancer (自然評論癌癥)3 :253-266 000 ；和 Callinan，Hum Mol Genet (人類分子遺傳學)15 Spec No 1:R95-101(2006)。在一些實施方案中，甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化CG(也稱為“CpG”)序列中的胞嘧啶。此類甲基轉(zhuǎn)移酶的實例包括但不限于M. SssI。此類甲基轉(zhuǎn)移酶的使用通常限于用于未典型地甲基化的那些DNA區(qū)。這是因為在真核細胞中CG序列被內(nèi)源性地甲基化，因此除了在其中甲基化很少見的DNA區(qū)中以外，通常不可能假定CG序列被修飾劑甲基化而不是被內(nèi)源性甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化。如GC序列一樣，CG序列的甲基化可以通過任何數(shù)量的方法來檢測，包括涉及亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變的方法。D.化學制劑在一些實施方案中，DNA修飾劑包括修飾DNA的化學制劑。因為大多數(shù)修飾DNA 的化學制劑與染色質(zhì)相比相對較少，因此在不使用融合伴侶的條件下使用修飾DNA的化學制劑在一些情況下可能無效，因為如果不同DNA區(qū)的可接近性程度有任何差異也將是很小的。因此，在一些實施方案中，DNA修飾劑包含與修飾DNA的化學制劑連接的具有位阻的分子。具有位阻的分子可以是根據(jù)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)導致DNA修飾劑的可接近性產(chǎn)生差別的任何蛋白或其他分子。這可以例如，如本文所述通過將結(jié)果與使用DNase或限制酶的結(jié)果相比較來測試。在一些實施方案中，具有位阻的分子的大小為至少5，7，10或15kD。本領(lǐng)域技術(shù)人員將有可能發(fā)現(xiàn)使用多肽作為具有位阻的分子是很適宜的。可以使用不顯著地干擾DNA修飾劑修飾DNA的能力的任何多肽。在一些實施方案中，所述多肽是下面進一步詳述的雙鏈的序列非特異的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的修飾DNA的化學制劑可以與具有位阻的分子直接連接或經(jīng)由接頭連接。 多種同型和異型雙功能接頭是已知的，并且可以用于此目的。示例性的修飾DNA的化學制劑包括但不限于胼(及其衍生物，例如，如Mathison 等，^Toxicology and Applied Pharmacology (毒理學和實用藥理學)127 (1) :91-98(1994) 中所述)和硫酸二甲酯。在一些實施方案中，胼將甲基引入至DNA中的鳥苷或否則損壞DNA。 在一些實施方案中，硫酸二甲酯甲基化鳥嘌呤或通過破壞鳥嘌呤中存在的咪唑環(huán)導致DNA 中鳥嘌呤的堿基特異性切割。檢測修飾DNA的化學制劑的修飾作用將取決于發(fā)生的DNA修飾的類型。在一些實施方案中，為了檢測硫酸二甲酯或胼修飾，在高溫(90°C)下用哌啶處理DNA。DNA在DNA修飾的位點處斷裂，并且可以以與本文所述的檢測核酸酶切割的相同方式檢測到該斷裂。E.改善DNA修飾劑的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在一些實施方案中，本發(fā)明的DNA修飾劑或切割劑與雙鏈的序列非特異的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)融合或以其他的方式連接。在DNA修飾劑為多肽的情況下，雙鏈的序列非特異的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過重組DNA技術(shù)合成為，例如，與DNA修飾劑的蛋白融合體。雙鏈的序列非特異的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域是以序列非依賴性方式結(jié)合雙鏈核酸的蛋白或蛋白的指定區(qū)域，即，對于特定序列結(jié)合不顯示明顯的偏好性。在一些實施方案中，雙鏈的核酸結(jié)合蛋白顯示對雙鏈核酸的親和力為對單鏈核酸的親和力的10倍以上。 在本發(fā)明的一些實施方案中雙鏈的核酸結(jié)合蛋白是熱穩(wěn)定的。此類蛋白的實例包括，但不限于，古細菌的小堿性DNA結(jié)合蛋白Sac7c^P&o7d(參見，例如，Choli等，Biochimica et Biophysica Acta (生物化學與生物物理學報)950 193-203，1988 ；Baumann 等，Structural Biol.(結(jié)構(gòu)生物學)1 :808-819,1994 ；和 Gao 等，Nature Struc. Biol.(自然結(jié)構(gòu)生物學)5 :782-786，1998)，古細菌 HMf-樣蛋白(參見，例如，Starich 等，J. Molec. Biol.(分子生物學雜志)255 187-203，1996 ；Sandman 等，Gene (基因)150 :207-208,1994)，禾口 PCNA 類似物(參見，例如，Cann 等，J. Bacteriology (細菌學雜志)181 :6591-6599,1999 ；Shamoo 和 Steitz, Cell (細胞):99，155-166，1999 ；De Felice 等，J. Molec. Biol.(分子生物學雜志)291，47-57，1999 ；和 Zhang 等，Biochemistry (生物化學)34 10703-10712，1995)。對于關(guān)于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的其他信息還參見歐洲專利1283875B1。Sso7d 和 Sac7dSso7d和Sac7d是分別來自極端嗜熱的古細菌(hyperthermophilic archaeabacteria) ^Ji 石黃 ^Ji U Bf lif (Sulfolobus solfataricus) 和嗜硫菌 (S. acidocaldarius)的小的(約7，OOOkd MW)，堿性染色體蛋白。這些蛋白富含賴氨酸并且具有高度的熱、酸和化學制劑穩(wěn)定性。它們以序列非依賴性方式結(jié)合DNA，并且當結(jié)合時，在一些條件下將DNA的Tm增加至至多40°C (McAfee等，Biochemistry (生物化學)34 10063-10077，1995)。這些蛋白和它們的同源物一般被認為在高溫下參與穩(wěn)定基因組DNA。HMF-樣蛋白HMf-樣蛋白是古細菌的組蛋白，其在氨基酸序列和在結(jié)構(gòu)方面均與真核生物H4 組蛋白共享同源性，真核生物H4組蛋白被認為與DNA直接相互作用。HMf蛋白家族在溶液中形成穩(wěn)定的二聚體，并且已經(jīng)從熱穩(wěn)定的物種(例如，熾熱甲烷嗜熱菌(Methanothermus fervidus)和焦球菌屬(Pyrococcus)菌株GB_3a)中鑒定了幾種HMf同源物。HMf蛋白家族一旦與Taq DNA聚合酶或任何具有低的固有持續(xù)合成能力(intrinsic processivity)的 DNA修飾酶結(jié)合，就可以增強該酶沿DNA底物滑動的能力，并且因此增加其持續(xù)合成能力。 例如，二聚體HMf-樣蛋白可以與Taq DNA聚合酶的N末端共價連接，例如，通過化學修飾， 并且因此改善了聚合酶的持續(xù)合成能力。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到其他雙鏈的序列非特異的核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域在本領(lǐng)域中是已知的并且也可以如本文所述的那樣使用。F.在DNA修飾步驟后分離DNA在一些實施方案中，在DNA修飾/切割步驟后，根據(jù)可利用的任何方法將基因組DNA從細胞中分離?？梢允褂没旧先魏蜠NA純化方法只要其產(chǎn)生了可接受純度的DNA用于隨后的定量步驟。例如，可以使用標準的細胞溶解試劑來溶解細胞。任選地可以使用蛋白酶(包括但不限于蛋白酶K)。如本領(lǐng)域中已知的那樣，DNA可以從混合物中分離。在一些實施方案中，使用苯酚/氯仿萃取，并且DNA可以隨后被沉淀(例如，通過乙醇)和純化。 在一些實施方案中，如果需要，去除或降解RNA (例如，使用RNA酶或使用DNA純化柱)。任選地，擴增基因組DNA或否則從細胞溶胞產(chǎn)物中直接檢測基因組DNA，無需中間的純化步驟。在一些實施方案中，將完整的、修飾的或未修飾的DNA分離并克隆至文庫中。在一些情況下，分離和/或克隆一個或多個特異的完整的、修飾的或未修飾的序列。備選地，具有完整的、修飾的或未修飾的DNA區(qū)的樣品用來制備為這些區(qū)富集的文庫。在與DNA切割劑接觸后完整的DNA代表了不太容易接近該試劑的DNA。同樣，在與DNA修飾劑接觸后未修飾的DNA代表不太容易接近的DNA。相反，修飾的DNA代表較容易接近修飾劑的DNA。在上面的一些實施方案中，從切割的DNA中純化(例如，分離)完整的DNA和/或在克隆前從未修飾的DNA中純化修飾的DNA，從而為一類DNA富集克隆池。對修飾的/未修飾的DNA的富集將根據(jù)修飾作用的性質(zhì)而變化。在一些實施方案中，與修飾的(或未修飾的DNA)特異性結(jié)合的親合試劑用來從未修飾的DNA中分離修飾的DNA。在一些實施方案中，產(chǎn)生差減文庫(subtractive libraries)。例如，可以產(chǎn)生對患病細胞DNA區(qū)富集的文庫，在本發(fā)明的方法中所述DNA區(qū)是完整的、修飾的或未修飾的， 隨后該文庫用來自健康細胞的相應(yīng)文庫差減，從而產(chǎn)生差異DNA序列的文庫，所述DNA序列均是完整的、修飾的或未修飾的，并且對于特定疾病是特異的?？梢允褂萌魏位疾〖毎?，包括但不限于，癌細胞。也可以采用可選的差減策略，例如，在不同的細胞類型之間，細胞期， 治療期間，等等。G.檢測DNA的物理特性在使細胞與DNA修飾劑或DNA切割劑接觸后可以檢測DNA的任何數(shù)量的物理特性。物理特性包括，但不限于，DNA甲基化，解鏈溫度，GC含量，核苷酸序列和與多核苷酸雜交的能力。多種方法已知用于檢測此類特性，并且可以采用。在一些實施方案中，在DNA修飾/切割步驟后，確定的物理特性不包括確定DNA足跡(例如，一種或多種特定蛋白對DNA 的特定區(qū)域的能力)。例如，在非限制性的實施中，完整DNA的定量，例如，使用qPCR，不包括DNA足跡。在一些實施方案中，所述物理特性是DNA甲基化。例如，一旦相對可接近的DNA被 DNA切割劑切割，則可以分離其余的完整DNA(代表不太容易接近的DNA)，然后可以分析甲基化狀態(tài)。大量DNA甲基化檢測方法是已知的。在一些實施方案中，在與DNA修飾劑或切割劑接觸后，DNA與亞硫酸氫鹽接觸，從而將DNA中未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。然后可以通過任何數(shù)量的甲基化檢測方法，包括本文中討論的那些確定特定DNA區(qū)的甲基化。在一些實施方案中，采用高分辨率熔解測定(HR)來檢測亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變后的甲基化狀態(tài)。在此方法中，在亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變后擴增DNA區(qū)，并測定得到的擴增子的解鏈溫度。因為解鏈溫度根據(jù)胞嘧啶是否被亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變(并且隨后在擴增反應(yīng)中被拷貝為“T”)而不同，因此擴增子的解鏈溫度可與甲基化含量相關(guān)。V.靶 DNA 區(qū)
DNA區(qū)是基因組DNA內(nèi)的目的靶序列。可以如本文所述評價細胞的基因組DNA中的任何DNA序列的DNA修飾劑可接近性?？梢院Y選DNA區(qū)以鑒定目的DNA區(qū)，所述目的DNA 區(qū)例如在不同的細胞類型中，在未處理的細胞和暴露于藥物、化學制劑或環(huán)境刺激物的細胞之間，或正常和患病組織之間展示不同的可接近性。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的方法用來鑒定DNA區(qū)，所述DNA區(qū)的可接近性變化用作疾病的標志物(或缺少該變化)。示例性的疾病包括但不限于癌癥。已經(jīng)描述了大量基因，與非癌細胞相比，它們在癌細胞中改變DNA甲基化和/或染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，所述DNA區(qū)已知根據(jù)特定細胞的疾病或發(fā)育狀態(tài)而具有不同的可接近性。在這些實施方案中，本發(fā)明的方法可以用作診斷或預后工具。一旦使用本發(fā)明的方法確定了診斷或預后，則可以確定治療方案或考慮該診斷或預后而改變現(xiàn)有的治療方案。例如，根據(jù)本發(fā)明的方法檢測癌細胞可以導致向檢測到癌細胞的個體施用化療劑和 /或放射線。為了研究目的和/或作為對照DNA區(qū)可以檢測許多DNA區(qū)從而確認試劑正如期望的那樣發(fā)生作用。例如，在一些實施方案中，測定DNA區(qū)，該DNA區(qū)在動物的基本上所有細胞中均是可接近的。這樣的DNA區(qū)，例如，可用作可接近性的陽性對照。這樣的DNA區(qū)可以見于，例如，為組成性的或幾乎組成性的基因內(nèi)或鄰近該基因。這樣的基因包括通常被稱作 “管家”基因的那些，即，其表達對于維持基本細胞功能是必需的基因。這樣的基因的實例包括，但不限于甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)和β肌動蛋白(ACTB)。DNA區(qū)可以包括此類基因的全部或一部分，任選地包括啟動子的至少一部分。在一些實施方案中，DNA區(qū)包含在動物的大多數(shù)細胞中是不可接近的DNA的至少一部分。這樣的DNA區(qū)例如，可用作可接近性的陰性對照。在此背景中“不可接近的”是指這樣的DNA區(qū)，該DNA區(qū)的拷貝中的不超過約20%的拷貝被修飾。此類基因序列的實例包括通常被認為是“異染色質(zhì)”的那些，并且包括僅在非常特殊的細胞類型中表達的基因(例如，以組織或器官特異性方式表達)。通常不可接近的示例性基因(除了特殊細胞類型外) 包括，但不限于，血紅蛋白-β鏈(HBB)和免疫球蛋白輕鏈κ (IGK)。在一些實施方案中，DNA區(qū)這樣的基因序列，其根據(jù)細胞的疾病狀態(tài)具有不同的可接近性，或否則根據(jù)細胞的類型或生長環(huán)境具有可變的可接近性。例如，一些基因通常在非癌細胞中是不可接近的，但在癌細胞中是可接近的。具有可變的可接近性的基因的實例包括，例如，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi (GSTPl)。在一些實施方案中，本發(fā)明的DNA區(qū)選自來自下列基因中的一種或多種的基因序列(例如，啟動子序列)1型鈣粘蛋白(Cadherin)I (Ε-鈣粘蛋白)，細胞色素 Ρ450-1Α1 (CYPlAl)，Ras相關(guān)結(jié)構(gòu)域家族IA(RASSF1A)，ρ15，ρ16，死亡相關(guān)蛋白激酶 1 (DAPK)，結(jié)腸的腺瘤性息肉(APC)，甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)，乳腺癌1基因 (BRCAl)禾口 hMLHo 在一些實施方案中，隨機地選擇DNA區(qū)，例如，以鑒定在不同的細胞類型、不同的條件、正常細胞相對于患病細胞，等之間具有的差別的可接近性的區(qū)域。VI.定量靶基因座的拷貝定量DNA修飾的方法將取決于引入至基因組DNA中的DNA修飾的類型。例如，使用設(shè)計用來產(chǎn)生包含目的DNA區(qū)的擴增子的擴增反應(yīng)可以方便地檢測到雙鏈DNA切割事件(例如，通過限制酶或DNase弓丨入或在修飾后引入，例如，在甲基轉(zhuǎn)移酶處理后，或在如本文所述被修飾DNA的化學制劑修飾后通過甲基化敏感的或甲基化依賴的限制酶引入)。在確定的位點處發(fā)生切割事件的情況下，諸如當使用序列特異的限制酶時，設(shè)計產(chǎn)生跨越潛在切割位點的擴增子的引物。僅完整的DNA會被擴增。如果還知道總DNA的量，則可以將總 DNA和完整DNA之間的差值計算為切割的DNA的量?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域中已知的任何DNA定量方法來確定DNA的總量。在一些實施方案中，可以通過設(shè)計一組引物來方便地確定總DNA 的量，所述引物擴增DNA無論其是否存在修飾。這可以例如，通過設(shè)計同一基因區(qū)內(nèi)或另一 DNA區(qū)內(nèi)的不跨越潛在切割位點的引物來實現(xiàn)。在不確定的位點處發(fā)生切割事件的情況下， 諸如當使用非序列特異性核酸酶，諸如使用DNase I時，使用不可接近的參照基因應(yīng)當加入作為內(nèi)部對照。如下面所更詳細地討論的那樣，定量擴增(包括，例如，實時PCR)法允許確定DNA 區(qū)的完整拷貝量，并且當用多種對照使用時，可以用來確定與細胞中的總拷貝數(shù)相比完整 DNA的相對量。因此可以計算出該DNA區(qū)的修飾的或未修飾的實際或相對拷貝數(shù)(例如，相對于總拷貝數(shù)或相對于第二 DNA區(qū)的修飾的或未修飾的拷貝數(shù))。在本發(fā)明的一些實施方案中，直接測定DNA區(qū)的修飾的拷貝數(shù)。例如，也可以例如，通過檢測特定的連接事件，例如僅在存在特定粘端或鈍端時發(fā)生的事件來檢測和定量限制酶切割。例如，包含粘端的核酸適體可以與切割的基因組DNA連接，所述粘端與由限制酶產(chǎn)生的粘端是互補的。然后可以檢測和定量連接事件的次數(shù)(例如，通過定量擴增方法)。在一些實施方案中，采用連接介導的PCR(LM-PCR)來定量DNA區(qū)的切割拷貝數(shù)。 LM-PCR的方法在本領(lǐng)域中是已知的，并且最初記載在Pfeifer等，kience (科學)246 810-813(1989)中。如果需要，LM-PCR可以實時進行以獲得定量結(jié)果。定量擴增方法(例如，定量PCR或定量線性擴增)涉及擴增核酸模板，直接或間接地(例如，確定Ct值)確定擴增的DNA的量，然后基于擴增的循環(huán)次數(shù)計算初始模板的量。使用反應(yīng)擴增DNA基因座是公知的(參見美國專利號4，683，195和4，683，202 ;PCR PROTOCOLS :A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (PCR 實驗技術(shù)方法和應(yīng)用指南) (Irmis等，編輯，1990))。典型地，PCR用來擴增DNA模板。然而，已經(jīng)描述了可選的擴增方法并且也可以采用，只要該可選方法將完整DNA擴增至大于擴增切割的DNA的方法的程度。定量擴增的方法公開在，例如，美國專利號6，180, 349 ；6, 033, 854 ；和5，972，602，以及在，例如，Gibson 等，Genome Research (基因組研究)6 :995-1001(1996) ；DeGraves 等， Biotechniques (生物技術(shù))34(1) :106-10,112-5(2003) ；Deiman B 等，Mol Biotechnol. (分子生物技術(shù))20(2) :163-79 (2002)。擴增可以“實時地”監(jiān)測。在一些實施方案中，定量擴增基于對信號(例如，探針的熒光)的監(jiān)測，所述信號代表在擴增(例如，PCR)反應(yīng)的循環(huán)中模板的拷貝。在PCR的初始循環(huán)中，觀察到非常低的信號，因為形成的擴增子的量不支持從測定中輸出可測量到的信號。在初始循環(huán)后，當形成的擴增子的量增加時，信號強度增加至可測量到的水平，并且當PCR進入非對數(shù)期時在后面的循環(huán)中達到平臺期。通過信號強度相對于循環(huán)次數(shù)的作圖，可以推算出從PCR反應(yīng)獲得可測量到的信號時的特定循環(huán)，并且用來逆算出PCR開始前靶標的量。通過此方法確定的特定循環(huán)的次數(shù)典型地稱為循環(huán)閾值(Ct)。示例性方法記載在，例如，關(guān)于水解探針的Heid 等 Genome Methods (基因組方法)6 :986-94 (1996)中。一種檢測擴增產(chǎn)物的方法是5' -3'核酸外切酶〃水解〃 PCR測定(也稱為 TaqMan 測定)(美國專利號 5，210，015 和 5，487，972 ；Holland 等，PNAS USA88 7276-7280(1991) ；Lee 等，Nucleic AcidsRes.(核酸研究)21 :3761-3766 (1993))。此測定通過擴增反應(yīng)期間雙標記的熒光探針(“TaqMan 探針)的雜交和斷裂來檢測特定PCR產(chǎn)物的積累。該熒光探針由用熒光報告染料和淬滅劑染料兩者標記的寡核苷酸組成。在PCR 期間，如果，并且只有如果此探針與被擴增的區(qū)段雜交，則該探針被DNA聚合酶的5'-核酸外切酶活性切割。探針的斷裂產(chǎn)生報告染料的熒光強度增加。另一種檢測擴增產(chǎn)物的方法依賴于能量轉(zhuǎn)移的使用，其是由Tyagi和Kramer， Nature Biotech.(自然生物技術(shù))14 :303-309 (1996)描述的〃燈塔探針(beacon probe)“法，該方法也是美國專利號5，119,801和5，312，7 的主題。此方法采用了可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸雜交探針。在該雜交探針的一端上(5'或3'端)，存在給體熒光團，在另一端上為受體結(jié)構(gòu)部分。在Tyagi和Kramer方法的情況下，此受體結(jié)構(gòu)部分是淬滅劑，即，該受體吸收給體釋放的能量，但然后其本身不發(fā)熒光。因此，當燈塔處于開放構(gòu)型時，給體熒光團的熒光是可檢測到的，而當燈塔處于發(fā)夾(閉合)構(gòu)型時，給體熒光團的熒光被淬滅。當在PCR中使用時，與PCR產(chǎn)物的一條鏈雜交的分子燈塔探針處于開放構(gòu)型， 并且檢測到熒光，同時未雜交的那些不會發(fā)出熒光(Tyagi和KramenNature Biotechnol. (自然生物技術(shù))14:303-306(1996))。結(jié)果，當PCR產(chǎn)物的量增加時熒光的量將增加，并且因此熒光量可以用作PCR繼續(xù)進行的量度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到也可利用其他定量擴增方法。用于進行核酸的定量擴增的多種其他技術(shù)也是已知的。例如，一些方法學采用一種或多種探針寡核苷酸，所述探針寡核苷酸被構(gòu)造為當一種或多種寡核苷酸與靶核酸雜交時產(chǎn)生熒光變化。例如，一種此類方法包括一種雙熒光團法，該方法利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)，例如，LightCycler 雜交探針，其中兩個寡核苷酸探針復性成擴增子。寡核苷酸被設(shè)計為以頭對尾方向與熒光團雜交，所述熒光團以與有效能量轉(zhuǎn)移相容的距離相隔。被構(gòu)造成當與核酸結(jié)合或摻入至延伸產(chǎn)物中時發(fā)出信號的標記寡核苷酸的其他實例包括Scorpions 探針(例如，Whitcombe 等，Nature Biotechnology (自然生物技術(shù))17 =804-807,1999,和美國專利號 6，326，145)，Sunrise (或 Amplifluor )探針 (例如，Nazarenko 等，Nuc. Acids Res.(核酸研究)25 :2516_2521，1997，和美國專利號 6，117，635)，和形成二級結(jié)構(gòu)的探針，所述二級結(jié)構(gòu)在無淬滅劑的條件下導致信號減小并且當與靶標雜交時發(fā)出增加的信號(例如，Lux探針 )。在其他實施方案中，可以使用嵌入劑，所述嵌入劑當嵌入至雙鏈DNA中時產(chǎn)生信號。示例性的試劑包括STOR GREEN , SYBR GOLD 和EVAGREEN 。由于這些試劑不是模板特異的，因此假定基于模板特異的擴增產(chǎn)生信號。這可以通過監(jiān)測作為溫度的函數(shù)的信號來證實，因為模板序列的熔點通常比例如，引物-二聚體等高得多。在一些實施方案中，DNA區(qū)的量通過對樣品中的拷貝進行核苷酸測序，然后確定樣品中具有相同序列的拷貝的相對數(shù)或絕對數(shù)來確定。在一些實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法定量修飾的(或未修飾的)DNA區(qū)可以通過確定該DNA區(qū)的修飾的或未修飾的拷貝與該同一區(qū)的總拷貝數(shù)相比的相對量(例如，歸一化值諸如比率或百分比)來進一步改進。在一些實施方案中，一個DNA區(qū)的修飾的或未修飾的拷貝的相對量與第二個(或更多個)DNA區(qū)的修飾的或未修飾的拷貝數(shù)相比較。在一些實施方案中，當在兩個或多個DNA區(qū)之間比較時，每個DNA區(qū)的修飾的或未修飾的拷貝的相對量可以首先針對該DNA區(qū)的總拷貝數(shù)歸一化。備選地，在一些實施方案中，當獲自同一樣品時，可以假定每個DNA區(qū)的總拷貝數(shù)大致相同，并且因此，當在兩個或多個DNA區(qū)之間比較時，確定每個DNA區(qū)之間修飾的或未修飾的拷貝的相對量(例如，比率或百分比)而不用首先將每個值針對總拷貝數(shù)進行歸一化。在一些實施方案中，修飾的或未修飾的拷貝的實際或相對(例如，相對于總DNA) 量與對照值進行比較。對照值可以適宜地使用，例如，在想知道特定DNA區(qū)的可接近性是否超過或低于特定值的情況下。例如，在特定DNA區(qū)在正常細胞中典型地是可接近的，但在患病細胞中是不可接近的(或反之亦然)的情況下，可以簡單地將修飾的或未修飾的拷貝的實際數(shù)或相對數(shù)與對照值進行比較(例如，大于或小于20%修飾的或未修飾的，大于或小于80%修飾的或未修飾的，等)。備選地，對照值可以代表關(guān)于對照DNA區(qū)的歷史數(shù)據(jù)或預期數(shù)據(jù)。在這些情況下，確定對照DNA區(qū)的實際量或相對量(任選地確定多次)，得到的數(shù)據(jù)用來產(chǎn)生對照值，該對照值可以與對目的DNA區(qū)確定的修飾的或未修飾的拷貝的實際數(shù)或相對數(shù)進行比較。對本文所述的方法的計算可以涉及基于計算機的計算和工具。所述工具有利地以計算機程序的形式提供，所述計算機程序可由常規(guī)設(shè)計的通用計算機系統(tǒng)(本文中稱為 “主機(host computer)")執(zhí)行。該主機可以配置以許多不同的硬件元件并且可以以許多尺寸和樣式制造(例如，臺式PC，膝上型計算機，平板PC，掌上電腦，服務(wù)器，工作站，大型電腦)?？梢园藴试?，諸如監(jiān)視器、鍵盤、磁盤驅(qū)動器、⑶和/或DVD驅(qū)動器等。在主機與網(wǎng)絡(luò)連接時，所述連接可以通過任何合適的傳輸介質(zhì)(例如，有線的、光纖的、和/或無線的介質(zhì))和任何合適的通信協(xié)議(例如，TCP/IP)來提供；主機可以包括合適的網(wǎng)絡(luò)硬件(例如，調(diào)制解調(diào)器，以太網(wǎng)卡，WiFi卡)。主機可以執(zhí)行多種操作系統(tǒng)中的任一種，包括 UNIX, Linux, Microsoft Windows, MacOS，或任何其他操作系統(tǒng)。用于實現(xiàn)本發(fā)明的各個方面的計算機代碼可以以多種語言編寫，包括PERL，C， C++，Java，JavaScript,VBkript，AWK或任何其他腳本或編程語言，它們可以在主機上執(zhí)行或可以被編譯從而在主機上執(zhí)行。代碼還可以以低級語言編寫或分配，所述低級語言諸如匯編語言或機器語言。主機系統(tǒng)有利地提供界面，通過所述界面用戶控制所述工具的操作。在本文所述的實施例中，軟件工具作為腳本來實現(xiàn)(例如，使用PERL)，其執(zhí)行可以由用戶從操作系統(tǒng)諸如Linux或UNIX的標準命令行界面來啟動。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解命令可以根據(jù)需要被改編以適應(yīng)操作系統(tǒng)。在其他實施方案中，可以提供圖形用戶界，該界面允許用戶使用點擊設(shè)備控制操作。因此，本發(fā)明不限于任何特殊的用戶界面。加入了本發(fā)明的各種特征的腳本或程序可以編碼在多種計算機可讀介質(zhì)上用于保存和/或傳輸。合適的介質(zhì)的實例包括磁盤或磁帶，光存儲介質(zhì)諸如光盤(CD)或DVD (多功能數(shù)碼光盤)，快閃存儲器，和適于通過符合多種協(xié)議的有線、光纖和/或無線網(wǎng)絡(luò)包括互聯(lián)網(wǎng)(Internet)傳輸?shù)妮d波信號。VII.反應(yīng)混合物
本發(fā)明還提供了包含本文所述的一種或多種試劑的反應(yīng)混合物，任選地含有真核細胞(其染色質(zhì)狀態(tài)待確定)。在一些實施方案中，該反應(yīng)混合物包含，例如，DNA修飾劑 (例如，限制酶，DNase，甲基轉(zhuǎn)移酶或修飾DNA的化學制劑)和細胞透化劑和/或細胞破壞劑和真核細胞。本文所述的其他試劑(包括但不限于亞硫酸氫鹽)也可以包含在本發(fā)明的反應(yīng)混合物中。VIII.試劑盒本發(fā)明還提供了用于進行本發(fā)明的可接近性測定的試劑盒。試劑盒可以任選地包括書面說明書或電子說明書(例如，在CD-ROM或DVD上)。本發(fā)明的試劑盒可以包括，例如，DNA修飾劑和細胞透化劑和/或細胞破壞劑。DNA修飾劑可以包括本文詳述的那些，包括，例如，限制酶，DNase，甲基轉(zhuǎn)移酶或修飾DNA的化學制劑。在一些實施方案中，DNA修飾劑是II-S型限制酶，包括但不限于，MnII，F(xiàn)okI和AlwI。本發(fā)明的試劑盒可以在相同的瓶 /容器中包含透化劑和DNA修飾劑(并且因此在相同的緩沖液中)。備選地，透化劑和DNA 修飾劑可以處于單獨的瓶/容器中。本發(fā)明的試劑盒還可以包含一種或多種對照細胞和/或核酸。示例性的對照核酸包括，例如，包含在動物的基本上所有細胞中均是可接近的(例如，管家基因序列或其啟動子)或在動物的大多數(shù)細胞中均是不可接近的基因序列的那些。在一些實施方案中，該試劑盒包括一個或多個用于擴增所述基因序列的引物組(無論該基因序列或細胞是否實際包括在試劑盒中)。例如，在一些實施方案中，該試劑盒包括DNA修飾劑，和細胞透化劑和 /或細胞破壞劑，和一個或多個用于擴增對照DNA區(qū)的引物組，和任選地一個或多個用于擴增第二個DNA區(qū)(例如，靶DNA區(qū))的引物組。在其中DNA修飾劑是限制酶的實施方案中， 每個DNA區(qū)可以包括至少兩個引物組一個引物組用于擴增DNA區(qū)的一部分，所述部分包括限制酶的至少一個(例如，1個，2個，3個，4個等)潛在切割位點(例如，可用于計算未修飾的拷貝數(shù))，和至少第二引物組用于擴增DNA區(qū)的一部分，所述部分不包含任何潛在切割位點(例如，可用于計算總拷貝數(shù))。在一些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒包括下面各項中的一個或多個(i)細胞膜透化劑或破壞劑；(ii)限制酶，DNase,或其他DNA修飾劑；(iii)能夠防止修飾劑進一步修飾的“終止”溶液；(iv)用于提取和/或純化核酸的材料(例如，用于純化基因組DNA的離心柱(spin column)和/或去除非DNA成分諸如“終止”溶液的成分)；(vi)用于PCR/qPCR擴增DNA的試劑，任選地包含模板和/或聚合酶以外的PCR或 qPCR所必需的所有成分的一種混合物；(vii)用于PCR/qPCR擴增特定靶基因的引物組。
實施例提供下面的實施例以說明，但不限于要求保護的本發(fā)明。實施例1 一般方法本測定利用了 DNA修飾劑對細胞中染色質(zhì)的不同部分的可接近性差異。如圖2中所示，DNA修飾劑可以比其他部分更容易地接近染色質(zhì)的某些部分。圖3圖示了該測定的示例性工作流程。粘附細胞生長在M孔板中作為起始材料。在此實施方案中，對于每個實驗使用兩個孔一個孔用不含核酸酶的透化緩沖液處理；另一孔用含有核酸酶的透化緩沖液處理。整個過程，從細胞至實時PCR，需要約3個小時，并且在收獲細胞的當天就可得到結(jié)圖4圖示了當MnlI用作染色質(zhì)結(jié)構(gòu)探針時分析分離自細胞的DNA的示意圖。在此情況下該測定使用“無核酸酶”對照平行地進行。兩個引物組用于每個基因。一個引物組不跨越任何MnlI消化位點，而另一個引物組跨越至少一個MnlI位點。用透化試劑處理但不用核酸酶處理的細胞導致從兩個引物組完全擴增(即，所有拷貝被擴增)并且因此應(yīng)該具有類似的Ct值，如圖4左圖中所圖示。Δ Ct值(總Ct減去完整的Ct)反映了基于引物特性，未切割的DNA中這些引物組之間Ct值的差異。相反，在已經(jīng)用MnlI處理的細胞中，可接近的基因應(yīng)該在MnlI位點處被切斷。不跨越MnlI位點的引物組仍會擴增所有DNA分子(用作總拷貝數(shù)的量度)，因此Ct將反映 DNA的總拷貝的量。另一引物組(跨越至少一個MnlI位點)將僅能夠擴增未切割的或完整的序列。取決于消化的程度，Ct值將改變隨著消化的量而成比例地移動和增加。然后ACt 可以通過從總Ct中減去完整的Ct來計算，如果DNA是可接近的，則這將產(chǎn)生負數(shù)。為不可接近的MnlI位點的百分比通過圖4中顯示的方程來計算。將此技術(shù)應(yīng)用于不同類型的DNA區(qū)圖示在圖5-6中。圖5顯示GAPDH，HBB,和GSTPl 基因的至少一部分的圖示。顯示了 Mnl Ι、ΤΑΤΑ盒、啟動子區(qū)和外顯子。GAPDH用作陽性對照。GAPDH是管家基因，其在大多數(shù)細胞系中表達并且應(yīng)當是可接近的。血紅蛋白β鏈基因被選擇為陰性對照。血紅蛋白在大多數(shù)細胞中不表達，是表觀遺傳沉默的，并且預期處于不可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。最后分析谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶Pi，或GSTPl，其在前列腺癌中是表觀遺傳失活的。圖6顯示可以被靶向用于擴增的區(qū)。對于每種基因，使用不跨越任何 MnlI位點并且將擴增所有DNA鏈的總引物組。還使用跨越至少一個(例如，2_4個)MnlI 位點并且將僅擴增在這些位點處未被切割的DNA鏈的“完整”引物組。實施例2 在Hela細胞中使用MnlI的數(shù)據(jù)此實施例顯示了使用如上所概述的實驗方法產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的結(jié)果。材料和方法化學制劑· L-α -溶血磷脂酰膽堿(溶血卵磷脂)購自Sigma-Aldrich0 MnlI, DNase I，BSA和蛋白酶K購自New England Biolabs0 RNA酶A購自Qiagen。組織培養(yǎng)板購自 VWR。iQ SYBR 購自 Bio-Rad。細胞的處理.生長在M孔板中的細胞當達到90%匯合時被處理。吸取培養(yǎng)基并且將100 μ 1透化/消化緩沖液輕輕地鋪在細胞上。對于用MnlI處理的細胞，透化/消化緩沖液由溶血卵磷脂，NaCl，Tris-HCl，MgCl2，DTT，BSA和MnlI組成。對于用DNase I處理的細胞，透化/消化緩沖液由溶血卵磷脂，Tris-HCl，MgCl2，CaC12和DNase I組成。然后透化的細胞在37°C下孵育1小時。孵育后，25 μ 1溶解/終止溶液(IOOmM Tris-HCl ρΗ7. 4， IOOmM NaCl，IOOmM EDTA，5 % N-月桂酰肌苷酸(w/v)，80 μ g/ml RNA 酶 A 禾口 3mg/ml 蛋白酶 K)加入至透化/消化緩沖液中，并且細胞溶胞產(chǎn)物在37°C下孵育10分鐘。DNA的分離.收集細胞溶胞產(chǎn)物，并且使用市售的核酸純化試劑盒(Aurum， Bio-Rad)遵照標準方法分離DNA。DNA以100 μ 1洗脫，并且使用NanoDrop 1000分光光度計(Thermo Scientific)測定DNA的濃度。然后將樣品稀釋至1-lOng DNA/ μ 1的濃度。分析的基因.我們分析了三個人類基因的啟動子區(qū)甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)，血紅蛋白，β (HBB)和谷胱甘肽_s_轉(zhuǎn)移酶π (GSTPl)。GAPDH是一種管家基因； 其在大多數(shù)細胞中表達并且預期具有可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。HBB在大多數(shù)細胞中不表達，并且預期具有不可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。GSTPl在前列腺癌中是表觀遺傳失活的。在非癌性前列腺細胞系RWPE-I中，GSTPl處于可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中并且被表達，在癌性前列腺細胞系LNCaP中，GSTPl處于不可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中并且不表達(Okino，S. Τ.等，Chromatin changes on the GSTPI promoter associated with its mactivation in prostate cancer (GSTP1啟動子上的染色質(zhì)改變與其在前列腺癌中的失活有關(guān)).Mol Carcinog(分子癌癥發(fā)生)，2007.46(10) :ρ· 839-46)。GSTPlmRNA在Hela和HCT15細胞系中高度表達； 在PC3細胞系中，GSTPlmRNA表達的水平大約為Hela和HCT15細胞中發(fā)現(xiàn)的水平的一半。實時PCR.分離自用MnlI處理的細胞的DNA樣品使用每種引物組在裝有Chromo4 連續(xù)熒光檢測器(MJ Research)的PTC-200熱循環(huán)儀中分析。每個反應(yīng)的體積為20 μ 1，并且包含 50ng DNA，500nM 每種引物和 10μ 1 iQ SYBR green supermix (Bio-I ad)。PCR 條件為96°C 10分鐘；96°C 30秒和68°C 1分鐘進行40個循環(huán)；在72°C下5分鐘；在每個步驟中從72°C至98°C的熔解曲線以0. 2°C的間隔保持5秒。分離自用DNase I處理的細胞的 DNA樣品在CFX96實時PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad)中分析。每個反應(yīng)的體積為20 μ 1并且包含 5ng DNA，500nM每種弓 I物禾口 10μ 1 含有 ROX 的 iTaq Fast SYBR green supermix (Bio-Rad)。 PCR條件為95°C 5分鐘；95°C 30秒和72°C 1分鐘進行40個循環(huán)；72°C下5分鐘；在每個步驟中從72°C至95°C的熔解曲線以0. 2°C的間隔保持5秒。數(shù)據(jù)分析.為了使用MnlI作為核酸酶探針確定不可接近的染色質(zhì)的水平，我們進行了下列的計算。當分析分離自用缺少MnlI的消化/透化緩沖液處理的細胞的DNA時， Δ Ct (未切割的)計算為(完整的Ct-總Ct)。當分析分離自用MnlI處理的細胞的DNA時， Δ Ct (切割的)計算為(完整的Ct-總Ct)。不可接近的染色質(zhì)的水平計算為2Λ( Δ Ct (未切割的)_ACt(切割的))(參見圖4)。對于GAPDH和GSTPl為了使用DNase I確定不可接近的染色質(zhì)的水平，我們不能使用分析MnlI時使用的相同計算，因為DNase I在可接近的染色質(zhì)中的總擴增區(qū)和完整擴增區(qū)內(nèi)均進行切割。我們發(fā)現(xiàn)HBB啟動子高度耐受DNase I消化，我們使用HBB ACt作為內(nèi)參照標準，其反映了不可接近的染色質(zhì)的低水平消化(圖示在圖16中)。ACt (參照)計算為(HBB+核酸酶Ct-HBB無核酸酶Ct)。Δ Ct (靶)計算為GAPDH/GSTP1+核酸酶Ct-GAPDH/ GSTPl無核酸酶Ct。GAPDH或GSTPl靶基因的不可接近的染色質(zhì)的水平計算為2Λ ( Δ Ct (參照)-ACt(靶))。結(jié)果Hela細胞在下面任一種中孵育無核酸酶的消化緩沖液，缺少溶血卵磷脂(細胞透化試劑)和核酸酶的消化緩沖液，或含有溶血卵磷脂和核酸酶的完全消化緩沖液 (MnlI[Μ]或 DNase I[D])。然后基因組DNA(gDNA)從細胞中分離并且進行瓊脂糖凝膠電泳(參見圖7)。數(shù)據(jù)表明溶血卵磷脂和核酸酶是消化gDNA必不可少的。在缺少溶血卵磷脂或核酸酶中任一種的反應(yīng)中僅檢測到輕微的gDNA消化。這表明在被溶血卵磷脂透化的細胞中，內(nèi)源性核酸酶對染色質(zhì)的消化不明顯，并且在缺少溶血卵磷脂的條件下消化緩沖液中存在的核酸酶不進入細胞中。隨后，分離自MnlI處理的細胞的DNA樣品使用圖6中所示的引物組通過實時PCR 分析。如圖8中所示，陰性對照反應(yīng)分析血紅蛋白β鏈基因(其在Hela細胞中是沉默的)。 對于總引物組和完整引物組兩者，Ct值是大致相同的。這表明在Hela細胞中此基因區(qū)處于不可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。圖9顯示了陽性對照GAPDH的結(jié)果。GAPDH的Ct值與陰性對照中對HBB獲得的 Ct值大致是相同的，但使用“完整”引物組的擴增右移，表明與“總”DNA相比不太完整。這意味著MnlI接近GAPDH啟動子中的其識別位點并在該處消化。因此，我們推斷在Hela細胞中GAPDH啟動子處于可接近的染色質(zhì)中。圖10顯示了分析GST pi的結(jié)果。GST pi在前列腺癌中是失活的并且在Hela細胞中表達。在完整引物組反應(yīng)中完全反應(yīng)的Ct值右移，但在總引物組反應(yīng)中不右移。這表明在Hela細胞中GST pi處于可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。圖11在表中總結(jié)了上述數(shù)據(jù)。計算的值是與通過“總”引物組確定的總拷貝數(shù)相比完整的拷貝的百分比(并且因此對核酸酶是不可接近的)。實施例3 在前列腺癌細胞中使用MnlI的數(shù)據(jù)上述的方法也應(yīng)用于不同的細胞類型以確定可接近性是否與GSTPl的表達相關(guān)。 使用兩個細胞類型RffPE-I細胞，其來自非癌性人前列腺并且高度表達GSTPl ；和LNCaP細胞，其來自人前列腺癌并且其中GSTPl被表觀遺傳修飾沉默。分析這些細胞的方法基本上如上所述。圖12顯示了對照反應(yīng)(即，針對血紅蛋白基因)。在兩個細胞系中，無酶樣品中的ACt與有酶樣品的ACt大致相同。因此ACt大約為0，表明在兩個細胞系中此基因是不可接近的。圖13顯示分析GAPDH基因的陽性對照反應(yīng)的結(jié)果。對于無酶的反應(yīng)，總Ct和完整Ct兩種大致是相同的。然而，對于有酶的反應(yīng)，完整Ct右移，表明存在較少完整的DNA， 因此GAPDH基因處于可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。圖14顯示來自分析GST pi基因的數(shù)據(jù)。在非癌RWPE-I細胞系中，在酶的存在下完整Ct右移。相反，在癌性LNCaP細胞系中，完整Ct沒有改變至可察覺的程度。這表明在 RWPE-I細胞中GSTPl處于可接近的染色質(zhì)中，在LNCaP細胞中處于不可接近的染色質(zhì)中。這些實驗重復4次。結(jié)果的總結(jié)顯示在圖15中，其再次使用不可接近(或“鎖住”) 的拷貝的百分比計算。實施例4 使用DNase I的數(shù)據(jù)本實施例顯示使用下述方法獲得的數(shù)據(jù)，其中DNase I而非MnlI是核酸酶。在此實施例中，我們分析4種人癌細胞系Hela (宮頸癌)，PC3 (前列腺癌)，LNCaP (前列腺癌) 和HCT 15(結(jié)腸癌)。我們還分析在MnlI實施例中分析的相同基因:HBB,GAPDH^P GSTPl0因為DNase I不在限定位點處消化DNA，因此我們不能使用當MnlI為染色質(zhì)結(jié)構(gòu)探針時使用的相同數(shù)據(jù)分析策略。代之我們利用了表觀遺傳沉默的參照基因(HBB)作為內(nèi)部對照，其反映了不可接近的染色質(zhì)的消化程度。使用此策略，可以如圖16中所詳述確定特定靶基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。圖17是分析的基因和用來評估染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的引物的位置的示意性圖示。如圖18中所示，在所有細胞系中DNase I均未將HBB消化至可察覺的程度(無合成酶和+核酸酶曲線幾乎重疊)。此結(jié)果表明在所有細胞系中HBB處于不可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中，并且驗證了其作為參照基因?qū)φ盏膽?yīng)用。這些結(jié)果也是預期的，因為HBB mRNA在這些細胞系的任一個中均不表達(未顯示的數(shù)據(jù))。我們對GAPDH基因的分析顯示在圖19中。在所有細胞系中，我們觀察到+核酸酶曲線相對于無核酸酶曲線顯著右移。這提示在所有細胞系中GAPDH處于可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。這些結(jié)果是預期的，因為GAPDH是“管家”基因，其在大多數(shù)細胞系(如果不在所有細胞系中表達的話)中表達(未顯示的數(shù)據(jù))。GSTPlmRNA以不同的水平在分析的細胞系中表達。Hela和HCT 15細胞表達大量的GSTPlmRNA，PC3細胞表達中等量(約為Hela和HCT 15細胞中發(fā)現(xiàn)的一半)，LNCaP細胞不以可察覺的程度表達GSTP ImRNA (未顯示的數(shù)據(jù))。我們對GSTPl染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析顯示在圖20中。在Hela和HCT 15細胞中，我們觀察到+核酸酶曲線相對于無核酸酶曲線顯著右移，提示GSTPl處于可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。在PC3細胞中，我們觀察到+核酸酶曲線相對于無核酸酶曲線中等程度右移，提示GSTPl處于部分可接近的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)中。最后， 在LNCaP細胞中，我們觀察到+核酸酶曲線和無核酸酶曲線幾乎重疊。這提示在LNCaP細胞中，GSTPl處于不可接近的染色質(zhì)構(gòu)型中。很顯然，我們在分析的所有細胞系中觀察到了 GSTPl染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和GSTPlmRNA表達之間的良好相關(guān)性。圖21顯示了結(jié)果的總結(jié)。如圖16中所述計算不可接近的DNA的百分比，并且顯示為“鎖住的”染色質(zhì)。通過標準方法通過qRT-PCR分析分離自不同細胞系的mRNA來計算 GAPDH和GSTP1RNA表達的相對水平。結(jié)果表明靶基因染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與靶基因表達水平的相關(guān)性良好。這提示所述的測定代表了一種用來評估對基因表達的表觀遺傳作用的有用工具。總結(jié)我們已經(jīng)開發(fā)了一種快速的和靈敏的測定，該測定可以評估培養(yǎng)細胞中的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。我們的測定提供了幾個優(yōu)于其他染色質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的優(yōu)勢(Okino，ST.等， Mol Carcinog(分子癌癥發(fā)生)46(10) :839-46(2007) ；Okino, S. T.和 J. P. Whitlock， Jr.，Mol Cell Biol (分子細胞生物學)15 (7) :ρ· 3714-21 (1995) ；Rao, S.，E. Procko, 和 M. F. Shannon，J Immunol (免疫學雜志)167 (8) :4494-503(2001) ；Kilgore, J. A.等， Methods (方法)41 (3) :320-32 (2007))。最顯著地，在我們的方法中，我們在一個步驟中原位消化了透化的細胞中的染色質(zhì)。其他方法需要分離細胞核，這需要較多的勞力、較多的時間和較多的細胞作為起始材料。另外，我們的引物組設(shè)計得到了對染色質(zhì)可接近性的更準確的和內(nèi)部控制的評估。 實施例5 評估DNA甲基化的變型 本發(fā)明的另一應(yīng)用是確定不可接近的染色質(zhì)區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)。DNA甲基化是指在5-位處胞嘧啶的天然甲基化，產(chǎn)生5-甲基胞嘧啶。DNA甲基化參與調(diào)節(jié)基因活性和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)；DNA甲基化的異常譜型與人類病理學和特定疾病狀態(tài)有關(guān)。在此變型中，遵照以前所述的方法，但不包括PCR擴增的步驟。然后使用標準方法通過亞硫酸氫鹽修飾純化的基因組DNA，使得未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，并?-甲基胞嘧啶沒有變化。然后靶向特定DNA區(qū)的引物組用來擴增從已經(jīng)用核酸酶處理的細胞純化的亞硫酸氫鹽-修飾的DNA。因此，僅最初處于不可接近的染色質(zhì)構(gòu)型并且因此不被DNA修飾劑切割的DNA可以被擴增。然后通過標準方法諸如熔解曲線分析、高分辨率熔解分析、亞硫酸氫鹽-DNA測序、數(shù)字PCR、甲基化特異的PCR、焦磷酸測序等對擴增的DNA分析DNA甲基化。這樣的分析可以確定不可接近的染色質(zhì)區(qū)的DNA甲基化狀態(tài)，并且可以提供關(guān)于與表觀遺傳基因失活相關(guān)的DNA甲基化的特定譜型的有價值信息。 要理解本文所述的實施例和實施方案僅用于說明的目的，并且提議本領(lǐng)域技術(shù)人員據(jù)此作出多種修改或變化，并且這些修改或變化包括在本申請的精神和界限以及附帶的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本文引用的所有出版物、專利和專利申請的全部內(nèi)容通過引用合并于此用于所有目的。
權(quán)利要求
1.一種用于分析染色體DNA的方法，該方法包括a.同時地i.透化或破壞細胞的細胞膜；和ii使所述細胞與DNA切割劑或修飾劑在所述試劑切割或修飾所述細胞中基因組DNA的條件下接觸，其中所述基因組DNA不同的區(qū)被所述試劑切割或修飾至不同的程度，從而產(chǎn)生切割的和完整的DNA區(qū)，或修飾的和未修飾的DNA區(qū)；和b.檢測至少一個完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)的量或?qū)χ辽僖粋€完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)進行克隆、分離或核苷酸測序。
2.權(quán)利要求1所述的方法，包括將所述至少一個完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)的量與所述細胞中所述DNA區(qū)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)聯(lián)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，包括檢測至少第一染色體完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)和第二染色體完整的或未修飾的或修飾的DNA區(qū)的量；和比較所述第一和第二 DNA區(qū)的量。
4.權(quán)利要求1所述的方法，包括定量第一染色體DNA區(qū)和第二染色體DNA區(qū)的完整拷貝數(shù)，從而評估所述第一和第二 DNA區(qū)與所述DNA切割劑的相對可接近性。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述接觸步驟之后和所述檢測步驟之前分離所述基因組DNA。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述細胞直接或間接地附著于人工培養(yǎng)表面時，所述細胞被透化并與所述DNA切割劑或修飾劑接觸。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述透化步驟包括使所述細胞與透化細胞膜的試劑接觸。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述透化細胞膜的試劑是溶血脂質(zhì)。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述溶血脂質(zhì)是溶血卵磷脂。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述透化或破壞步驟包括用非離子型洗滌劑破壞細胞膜。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述非離子型洗滌劑選自NP40、Tween20和Triton X-100的組。
12.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞與DNA切割劑接觸，且所述DNA切割劑是酶。
13.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細胞與DNA修飾劑接觸，且所述DNA修飾劑選自由甲基轉(zhuǎn)移酶和修飾DNA的化學制劑組成的組。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述DNA切割劑是DNA切割酶；所述基因組DNA中的修飾是這樣的位點，在所述位點處DNA已經(jīng)被切割；和所述檢測步驟包括定量切割后DNA區(qū)的完整拷貝的量。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中所述檢測步驟包括定量擴增。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中定量擴增選自由定量聚合酶鏈反應(yīng)和定量連接介導聚合酶鏈反應(yīng)組成的組。
17.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述DNA切割劑選自DNase和限制酶。
18.權(quán)利要求13所述的方法，其中 所述DNA修飾劑是甲基轉(zhuǎn)移酶；所述修飾是不被所述細胞的天然甲基化酶甲基化的核苷酸序列中核苷酸上的甲基；和所述檢測步驟包括檢測所述修飾存在或不存在的方法。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述甲基轉(zhuǎn)移酶是DAM甲基轉(zhuǎn)移酶并且所述定量步驟包括用限制酶切割所述修飾的DNA，所述限制酶識別被DAM甲基轉(zhuǎn)移酶甲基化的DNA序列。
20.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基部分添加至DNA中的胞嘧唆， 并且所述檢測步驟包括用甲基化特異性限制酶切割所述修飾的DNA和/或用亞硫酸氫鹽處理所述修飾的DNA。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述DNA修飾劑是相對于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)具有空間位阻的分子，其中所述分子連接修飾DNA的化學制劑。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述修飾DNA的化學制劑選自由硫酸二甲酯和胼組成的組。
23.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述檢測步驟包括定量靶DNA區(qū)的至少一部分和對照DNA區(qū)的至少一部分，其中所述對照DNA區(qū)包含下列序列，所述序列i.在動物的基本上所有細胞中是可接近的；或 在動物的大多數(shù)細胞中是不可接近的。
24.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述對照DNA區(qū)使用下列每一種進行定量擴增 引發(fā)所述對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分不包括所述DNA修飾劑的可能修飾位點；和引發(fā)所述對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分確實包括所述DNA 修飾劑的至少一個可能修飾位點。
25.權(quán)利要求1所述的方法，其中確定所述DNA區(qū)的DNA甲基化。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中步驟a包括使所述DNA與DNA切割劑接觸，并且步驟 b包括使所述完整的DNA與亞硫酸氫鹽接觸。
27.權(quán)利要求沈所述的方法，還包括確定亞硫酸氫鹽處理的DNA的解鏈溫度，并且將所述解鏈溫度與DNA甲基化的存在、不存在或程度相關(guān)聯(lián)。
28.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b包括制備下列的文庫 完整DNA區(qū)；或或修飾的DNA區(qū)；或未修飾的DNA區(qū)。
29.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b包括使至少一個完整的或未修飾的或修飾的 DNA區(qū)與多核苷酸文庫在允許所述DNA區(qū)與所述文庫的一個或多個成員雜交的條件下接觸，并且檢測所述DNA區(qū)與所述一個或多個成員的雜交。
30.權(quán)利要求四所述的方法，其中所述文庫組織在微陣列上。
31.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b包括擴增至少一個完整的或未修飾的或修飾的 DNA 區(qū)。
32.權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟b包括對至少一個完整的或未修飾的或修飾的 DNA區(qū)進行核苷酸測序。
33.一種用于確定染色體上的基因座與DNA修飾劑的可接近性的試劑盒，所述試劑盒包含細胞膜透化劑或破壞劑； 限制酶或DNase。
34.權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述細胞膜透化劑或破壞劑和所述限制酶或 DNase處于同一容器中的同一緩沖液中。
35.權(quán)利要求33所述的試劑盒，其中所述細胞膜透化劑或破壞劑和所述限制酶或 DNase處于單獨的容器中。
36.權(quán)利要求33所述的試劑盒，還包含亞硫酸氫鹽。
37.權(quán)利要求33所述的試劑盒，還包含用于擴增真核生物的基因組DNA的區(qū)的引物對。
38.權(quán)利要求33所述的試劑盒，包含a.引發(fā)對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分不包括所述DNA修飾劑的可能修飾位點；和/或b.引發(fā)對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分確實包括所述DNA 修飾劑的至少一個可能修飾位點。
39.權(quán)利要求33所述的試劑盒，包含a.引發(fā)對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分不能接近所述修飾劑；和/或b.引發(fā)對照DNA區(qū)的一部分擴增的引物，所述對照DNA區(qū)的一部分可接近所述修飾劑。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于測定DNA修飾劑在基因組DNA中的可接近性的方法和組合物。
文檔編號C12Q1/68GK102292455SQ200980155221
公開日2011年12月21日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月2日
發(fā)明者史蒂夫·奧基諾, 程曼 申請人:伯樂實驗室公司