專利名稱：超聲波加強(qiáng)的微生物生長的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
細(xì)胞培養(yǎng)廣泛地應(yīng)用于科學(xué)和工業(yè)領(lǐng)域中各種目的的蛋白質(zhì)生產(chǎn)、制藥生產(chǎn)中的食物和飲料發(fā)酵。細(xì)胞培養(yǎng)在實(shí)驗(yàn)室條件下也經(jīng)常用于科研和疾病診斷，隨著基因工程的到來，各種基因改造的微生物也越來越常用于醫(yī)療蛋白、抗生素、胰島素、激素、和其他重要的生物醫(yī)學(xué)分子的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
發(fā)酵是制藥工業(yè)中最重要的生產(chǎn)過程之一。工業(yè)發(fā)酵機(jī)理大致理解為有機(jī)物質(zhì)的分解與重組為其他有機(jī)物質(zhì)。工業(yè)規(guī)模的發(fā)酵過程通常指高氧和耗氧的生長過程。例如， 引人注目的和有巨大利潤的青霉素就是以深度發(fā)酵過程來大量生產(chǎn)的。當(dāng)某一特別的微生物被放在一種經(jīng)特別選擇生長培養(yǎng)基中，這種微生物就被接種于這種培養(yǎng)基里。接種后的微生物并不是立即生長，而是滯后一段時(shí)間。隨后微生物的生長率穩(wěn)步增加，以對(duì)數(shù)指數(shù)方式增殖。指數(shù)增長期后，增長率會(huì)減慢，這是由于營養(yǎng)濃度的持續(xù)下降和持續(xù)增加的有害物質(zhì)。在此階段增長率的增加受到抑制，為下降期。下降期后增長停止，微生物培養(yǎng)基進(jìn)入穩(wěn)定靜止期。發(fā)酵工業(yè)依靠細(xì)菌和真菌培養(yǎng)基來生產(chǎn)飲用酒精、處理各種食物、將玉米和其他原材料轉(zhuǎn)化為生物燃料、以“生物治理”的過程來中和有毒泄露、降解液態(tài)和固態(tài)廢物、以及生產(chǎn)各種重要的生物學(xué)上的復(fù)合物。在幾乎所有運(yùn)用細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)中，相關(guān)產(chǎn)品的生產(chǎn)率僅受限于在生產(chǎn)過程中的蛋白質(zhì)表達(dá)的發(fā)生速率和細(xì)胞生長率。工業(yè)發(fā)酵通常在特別設(shè)計(jì)的環(huán)境下進(jìn)行，就是細(xì)胞在懸浮狀態(tài)下生長。通過小心的保持理想的溫度和攪動(dòng)混合物以期將營養(yǎng)物轉(zhuǎn)入細(xì)胞和將新陳代謝物轉(zhuǎn)移出細(xì)胞，從而發(fā)酵槽可以最大促進(jìn)細(xì)胞生長。然而，在微觀水平上，卻難以保證渦流在發(fā)酵罐中的均勻遍布而不能最大地影響細(xì)胞。在靠近細(xì)胞壁和發(fā)酵槽壁有一個(gè)相對(duì)凝滯的區(qū)域，從而導(dǎo)致營養(yǎng)物和有毒物質(zhì)不能有效地進(jìn)出生長在這個(gè)區(qū)域的細(xì)胞，降低蛋白質(zhì)表達(dá)率，從而在總體上降低了發(fā)酵過程的生產(chǎn)率由于發(fā)酵是種廣泛應(yīng)用的技術(shù)有許多工業(yè)用途，如果有某種促進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)率的技術(shù)與方法將會(huì)是有巨大意義的。超聲刺激產(chǎn)生“微汽孔”，即稱為“微孔”的液體中的小氣泡。每一輪聲波中氣泡會(huì)擴(kuò)張和收縮，在微觀水平上產(chǎn)生很大的動(dòng)力和攪動(dòng)。在某些情況下，聲波會(huì)導(dǎo)致空穴的崩塌，以至于產(chǎn)生更極端的攪動(dòng)、高溫、和空穴附近的自由基。這些崩塌有足夠力量驅(qū)除或甚至?xí)茐募?xì)胞。
就是運(yùn)用這些作用過程發(fā)展了許多超聲應(yīng)用技術(shù)，一個(gè)常用的超聲用途是做為一種有效的清潔手段；如果強(qiáng)度足夠高，微孔的破裂成為細(xì)胞周圍的主導(dǎo)因素。這將有害細(xì)菌從表面剝離，甚至殺死其中的大部分。此技術(shù)的有效性已經(jīng)被證實(shí)，施加超聲于玻璃試管的一端，頻率大約100kHz，強(qiáng)度大約40W/cm2，約88%的細(xì)菌從試管表面除去。類似的實(shí)驗(yàn)在各種情形下得到驗(yàn)證，包括從反向滲透薄膜上剝離生物膜。超聲目前積極的用于實(shí)驗(yàn)室的清潔手段。包括細(xì)菌分離，超高強(qiáng)度的超聲(> lOOW/cm2)已經(jīng)用于殺死懸浮的細(xì)菌，這有賴于微孔的破裂來破壞細(xì)菌的薄膜。低強(qiáng)度超聲波卻有另外的用途；據(jù)信低強(qiáng)度超聲波能增強(qiáng)骨骼生長率，約80%北美物理理療師擁有超聲發(fā)射器用于物理治療來加速康復(fù)。最近的研究表明只有低強(qiáng)度超聲對(duì)理療是有效的，低強(qiáng)度脈沖超聲設(shè)備(LIPUS)目前已投入市場。其中一種方法由Duarte 于 1982 年注冊(cè)了美國專利(U. S. Pat. No. 4，530，360)。用低強(qiáng)度脈沖超聲幫助組織創(chuàng)傷康復(fù)的方法見于美國專利(U. S. I^t. Application 2006/0106424 Al by Bachem 2005)。此種方法用超聲波來增強(qiáng)人體巨噬細(xì)胞的吞噬行為。但美國專利(U.S. Patent Application No. US 2003/0153077 Al)詳細(xì)描述一種方法用低強(qiáng)度超聲波來刺激生物膜和其他細(xì)胞生長，靠平衡微孔的破裂導(dǎo)致的有益的擾動(dòng)與相應(yīng)的負(fù)面效應(yīng)，低強(qiáng)度超聲可以提高細(xì)胞生長率可高達(dá)50%。實(shí)驗(yàn)人員以此測試了人體和細(xì)菌細(xì)胞，頻率范圍從20kHz到IMHz而強(qiáng)度范圍從1到5000mW/cm2。然而，盡管增加細(xì)胞生長對(duì)發(fā)酵過程是有益的，該研究組的參數(shù)沒有提供發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)表達(dá)的最優(yōu)比率。發(fā)明簡述此發(fā)明提供了一種技術(shù)，利用校正精確的超聲波來刺激原核細(xì)胞，從而促進(jìn)細(xì)胞生長或蛋白質(zhì)表達(dá)或兩者同時(shí)增加。這種增強(qiáng)細(xì)胞生長或蛋白質(zhì)表達(dá)的技術(shù)可以用于具體的應(yīng)用過程中，例如發(fā)酵或其它生物處理方法。另一方面，是通過細(xì)胞暴露給特定頻率和強(qiáng)度的超聲波，此發(fā)明成為了一種在培養(yǎng)基中增強(qiáng)細(xì)胞生長或中蛋白質(zhì)表達(dá)或二者同時(shí)增加的方法。超聲波在通常液體更粘滯的地方，包括緊鄰細(xì)胞壁和其他固體表面附近，產(chǎn)生微觀尺度的擾動(dòng)。超聲頻率范圍在IMHz和IOMHz之間，取決于培養(yǎng)液中細(xì)胞的種類，更可取的范圍是IMHz和2MHz之間。例如，超聲波的刺激頻率可選在1. 4至1. 6MHz之間。再例如，脈沖超聲波將有助于最大限度的減少環(huán)境溫度的增加。另一個(gè)例子中，脈沖的關(guān)開周期約為 4 1，脈沖時(shí)間大約1秒，最為有效。再一個(gè)例子中，超聲波可以被精確調(diào)整，從而在“微孔的破裂”的負(fù)面效應(yīng)與擾動(dòng)提供給細(xì)胞的正面效應(yīng)之間達(dá)到平衡，允許最大限度的增加細(xì)胞的營養(yǎng)攝取和新陳代謝物排出。在另一個(gè)方面，這項(xiàng)技術(shù)包含可以有監(jiān)測到超聲波實(shí)際應(yīng)用強(qiáng)度的方法，猶如靶細(xì)胞可以“感覺”到一樣。然而，這并不是在任何情況下都是必需的，超聲波刺激方法可以在沒有此種探測的情況下進(jìn)行。只要將任何超聲測量儀器連接到超聲發(fā)射器上，測量就可以進(jìn)行。例如，利用傳感器能將收集到的信息通過有線或無線的連接傳回到超聲發(fā)生器。另一方面，此發(fā)明包括了技術(shù)通過利用上述傳感器可以根據(jù)感測到的超聲強(qiáng)度來校正超聲發(fā)射以達(dá)到最大效果。這有助于最大限度的蛋白質(zhì)表達(dá)。
4
靶細(xì)胞可以是真核的或原核的，也可包括真菌和細(xì)菌細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是原始細(xì)胞或生物改造細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞在培養(yǎng)液中的脆弱性，超聲強(qiáng)度可以大于lOmW/cm2至5000mW/cm2。例如，超聲的方向可以被調(diào)整以達(dá)到最低的反射和干涉作用，或者被調(diào)整以達(dá)到超聲發(fā)射的最大效應(yīng)。例如，超聲波發(fā)射器可以放置在發(fā)酵罐里，或發(fā)酵罐外固定的發(fā)射平面，或其他合適的設(shè)置。即使發(fā)酵過程在發(fā)酵槽里沒有發(fā)生，可同樣應(yīng)用此方法，超聲波發(fā)射可以最大覆蓋細(xì)胞以達(dá)到增強(qiáng)的蛋白質(zhì)表達(dá)。比如，在原位細(xì)菌的生物修復(fù)治療中，超聲發(fā)射器可以策略性的放入或周期性的移動(dòng)。
為了更好的理解上述列舉的此項(xiàng)發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，以下給出詳細(xì)的描述。以一個(gè)特定的例子為例，結(jié)果在附錄的圖片中描述。此例子只是此發(fā)明的實(shí)例之一，并不局限于此。在以下的圖片中圖1是一示意圖描述了此發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用實(shí)例，如何在工業(yè)規(guī)模上應(yīng)用此技術(shù)來增產(chǎn)有用的生物材料。用壓電傳感器產(chǎn)生的超聲波作用于傳統(tǒng)發(fā)酵槽中的細(xì)胞培養(yǎng)基。傳感器放在能在生長介質(zhì)中產(chǎn)生最大化超聲效果和能均勻分布的位子。圖2顯示了真菌(T.reesei)的顯微圖像，一組是超聲刺激過的真菌而另一是對(duì)照組。超聲作用后真菌數(shù)量顯著增加。號(hào)碼844是指T.reesei (strain Rut_C30 or 844) (a) 對(duì)照組，經(jīng)過3天，25倍顯微放大；(b)超聲波刺激組，3天后，25倍放大(c)對(duì)照組，3天后 50倍放大；(d)超聲波刺激組，3天后50倍放大。圖3顯示了對(duì)比了 T. reesei (strain 844)在超聲刺激后或無超聲刺激，然后培養(yǎng) 3天后的纖維素酶的活性(844對(duì)照組，or 844 CK為刺激組)。這里844 A2，844 C2和844 E2代表不同的LIPUS的強(qiáng)度10mW/cm2，50mW/cm2，及100mW/cm2。這顯示了 LIPUS的效率與可靠性，及其它超聲特性如強(qiáng)度和頻率。在這里也顯示了如果超聲強(qiáng)度過高會(huì)妨礙生長。圖4顯示了在不同強(qiáng)度超聲處理(mg)后真菌重量的對(duì)比。CK-2是對(duì)照組。Al_3 為 80mW/cm2，D1-3 為 60mW/cm2，E1-3 為 30mW/cm2。圖5顯示了一種發(fā)酵產(chǎn)物(mycophenolic acid)經(jīng)過不同強(qiáng)度(圖4)超聲處理后在培養(yǎng)基中的濃度(yg/ml)。圖6顯示了一個(gè)超聲傳感器排列的實(shí)例，這種超聲傳感器用于大體積的培養(yǎng)基。圖7是一個(gè)示意圖顯示了一個(gè)包含了監(jiān)測系統(tǒng)反饋的超聲儀器。發(fā)明實(shí)例的詳細(xì)描述發(fā)明實(shí)例通過如下描述和圖片來理解。本發(fā)明方法，可以通過許多方式加以應(yīng)用和變更來加以概述。因此，如下的詳細(xì)描述不是用來局限此發(fā)明的范圍。事實(shí)上，此描述“微生物” 一詞包含原核生物和單細(xì)胞的真核生物。微生物包括細(xì)菌、真菌、古真菌、和原生生物以及其他。其中的單細(xì)胞微生物可用于有用的工業(yè)過程，如發(fā)酵、生物治理或生物產(chǎn)品的生產(chǎn)。發(fā)酵”一詞廣泛的用于微生物的大量生長在一些培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基中。如只是“發(fā)酵”一詞，并沒區(qū)分耗氧和厭氧的新陳代謝。厭氧發(fā)酵是營養(yǎng)分子的厭氧新陳代謝分解而產(chǎn)生能量，如葡萄糖，而無凈氧化作用。發(fā)酵一般產(chǎn)生乳酸、醋酸、酒精或一些簡單產(chǎn)品。本發(fā)明是用高頻超聲波來增強(qiáng)微生物的生長或增加蛋白質(zhì)或其他分子或復(fù)合物的產(chǎn)量。微生物可以是在液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基中，或存在不受控的環(huán)境中。利用本發(fā)明方法微生物可生產(chǎn)有用的產(chǎn)品，如油、有機(jī)酸、酒精或蛋白質(zhì)。例如，微生物參與了粉粹或消化物資，比如參與厭氧性消化或生物重建過程。為何本發(fā)明中的超聲波會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞或蛋白質(zhì)生長的機(jī)理還不明確。不受限于任何理論，已經(jīng)顯明本發(fā)明通過允許快速傳輸基本物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞和快速從細(xì)胞中分散新陳代謝副產(chǎn)品，從而加快細(xì)胞生長或蛋白質(zhì)表達(dá)。盡管許多發(fā)酵罐通過用攪拌或搖晃細(xì)胞培養(yǎng)物的方法試圖解決這個(gè)問題，理論上仍有微觀的緩沖區(qū)存在于固定面或細(xì)胞壁附近，從而局限了液體的流動(dòng)。如果浸泡細(xì)胞的液體在緊鄰細(xì)胞的區(qū)域是凝滯的，這無助于傳輸小分子，如氧、氨基酸、二氧化碳等，進(jìn)入或從細(xì)胞中出來。當(dāng)受到超聲波刺激，細(xì)胞培養(yǎng)液周圍的液體包含有小氣泡，能夠壓縮和釋放，導(dǎo)致收縮和擴(kuò)張。這種運(yùn)動(dòng)對(duì)包圍氣泡的液體產(chǎn)生了作用力，當(dāng)氣泡壓縮時(shí)，液體被“推”向小氣泡的周圍，當(dāng)氣泡擴(kuò)張時(shí)，液體被推開。這在微觀尺度上產(chǎn)生了足夠的擾動(dòng)。這種擾動(dòng)甚至是局部的，因?yàn)闅馀輧A向在細(xì)胞壁或固體表面周圍形成，正好是原來凝滯的區(qū)域。如果壓力足夠高(由于高強(qiáng)度的超聲所導(dǎo)致)，氣泡會(huì)完全塌縮。簡單的熱力學(xué)表明在這種情況下溫度會(huì)突然上升，某一研究聲稱溫度高達(dá)5000K，塌縮導(dǎo)致熱的激波或“剪切力”，或直接朝向氣泡中心的力。塌縮引起大范圍的擾動(dòng)，從而營養(yǎng)和廢物的轉(zhuǎn)移更快，但同時(shí)，過強(qiáng)的溫度和力也會(huì)破壞或撕裂細(xì)胞壁。本發(fā)明中的超聲的強(qiáng)度和頻率必須能夠被調(diào)節(jié)以達(dá)到能平衡空穴效應(yīng)帶來的有害和有益的效果。本發(fā)明意在通過增進(jìn)細(xì)胞膜附近的物質(zhì)傳送以期幫助細(xì)胞生長或蛋白質(zhì)表達(dá)。加強(qiáng)的細(xì)胞生長和蛋白質(zhì)表達(dá)通常是相互正相關(guān)的，一方的增強(qiáng)往往導(dǎo)致另一方的增強(qiáng)。T. reesei是真菌的變種，用來產(chǎn)生幾乎所有的生物燃料，包括酒精、丁醇和纖維素乙醇。后者是有效和相對(duì)低廉的生物燃料，從有機(jī)肥料和其他非食用植物原料提煉。特別纖維素乙醇被認(rèn)為是未來化石燃料的替代品，商業(yè)化生產(chǎn)已經(jīng)開始。然而，主要妨礙商業(yè)化的是高額的成本和特別耗時(shí)的生產(chǎn)時(shí)間。優(yōu)化T. reesei發(fā)酵過程將會(huì)使丁醇生產(chǎn)者增加 T. reesei細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的比率，從而增加丁醇的產(chǎn)量。纖維素乙醇來源于非食用農(nóng)作物如稻稈和其他有機(jī)肥料。盡管傾向于用可食用材料自造燃料，但成本高昂并且耗時(shí)過多，本發(fā)明的應(yīng)用可增加纖維素乙醇生產(chǎn)的比率。高頻超聲(高于IMHz)可用于不同情形以增強(qiáng)培養(yǎng)基中細(xì)胞生長或蛋白質(zhì)表達(dá)。 潛在的應(yīng)用包括增加試驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)的蛋白質(zhì)表達(dá)、快速的測試和診斷、快速生產(chǎn)藥物、生長激素、細(xì)胞調(diào)節(jié)因子、蛋白質(zhì)和廣泛的生物醫(yī)療產(chǎn)品。酵母、細(xì)菌、真菌和其他用于化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的微生物的培養(yǎng)基，，包括了其它可能的技術(shù)應(yīng)用，包括以上未提到的應(yīng)用。我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)超聲在高頻時(shí)，超過lMhz，對(duì)微生物培養(yǎng)液中的細(xì)胞生長是有益的。以前手段的超聲刺激頻率范圍在20kHz和IMHz之間。我們驚訝的發(fā)現(xiàn)許多情況下優(yōu)化的頻率是高于1MHz。因此，在一個(gè)實(shí)例中超聲頻率大于IMHz小于2MHz。在1. 5MHz左右，試驗(yàn)
6表明許多細(xì)胞類型，包括干細(xì)胞和其他動(dòng)物細(xì)胞，允許最大“微攪動(dòng)”而只經(jīng)受最小的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損害。因此，在一實(shí)例中，超聲大于約1. 4MHz小于約1. 6MHz。在一可取的實(shí)例中， 1. 4MHz和約1. 6MHz發(fā)現(xiàn)對(duì)T. reesei特別有用。此技術(shù)也可能被應(yīng)用于非培養(yǎng)基的例子，也就是說細(xì)胞不在特別控制的環(huán)境下。 雖然我們描述這項(xiàng)技術(shù)主要運(yùn)用于實(shí)驗(yàn)室條件下的微生物細(xì)胞培養(yǎng)基，但是，本發(fā)明的實(shí)例也可用于不受控的條件下，如生物治理的環(huán)境，或大規(guī)模厭氧消化器。不同細(xì)胞有不同的長處和弱點(diǎn)，不是所有細(xì)胞都要同樣的頻率和強(qiáng)度。比如，不同微生物類別的原核和真核細(xì)胞之間的差別為最大。這里的技術(shù)就提供了一個(gè)窗口對(duì)不同細(xì)胞上使用不同的頻率和強(qiáng)度而達(dá)致最優(yōu)的表現(xiàn)。超聲強(qiáng)度大于約5mW/cm2至約5000mW/cm2。在一實(shí)例中，強(qiáng)度范圍在約40mW/cm2 和約80mW/cm2之間，另一實(shí)例中，最優(yōu)強(qiáng)度約為60mW/cm2。在一實(shí)例中，超聲發(fā)射器放置在足夠靠近目標(biāo)區(qū)域的地方以傳遞特定頻率和強(qiáng)度的超聲波來刺激細(xì)胞。在另一實(shí)例中，超聲作用于細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)數(shù)增長期；不過有益效應(yīng)可在任何增長期實(shí)現(xiàn)。沒有必要用持續(xù)的超聲刺激，每M小時(shí)用低于1小時(shí)的超聲波刺激就能實(shí)現(xiàn)增加的生長率或蛋白質(zhì)表達(dá)的效果。在另一實(shí)例中，每M小時(shí)刺激間隔為10分鐘到 20分鐘之間，就足以得到有益的效果。合適的頻率和強(qiáng)度的優(yōu)化，對(duì)于任何指定微生物和生長條件，可用經(jīng)驗(yàn)方法來確定，如果技巧得當(dāng)可以不必大量試驗(yàn)。一般的，原核細(xì)胞比真核細(xì)胞更耐久因此能承受更高強(qiáng)度的超聲刺激。強(qiáng)度范圍簡略的討論于Pitt等的專利申請(qǐng)，題為“促進(jìn)細(xì)胞生長率的方法”，(Pub. No. US 2003/0153077 Al)。結(jié)論是真核細(xì)胞約為8-50mW/cm2而原核細(xì)胞約為 2-2. 2W/cm2。在所有的Pitt等的專利試驗(yàn)中頻率為70kHz。在一實(shí)例中，因?yàn)殚L時(shí)間的超聲波刺激會(huì)積累熱量并破壞處理的細(xì)胞，最好超聲波為脈沖。脈沖的持續(xù)時(shí)間可以通過有技巧的經(jīng)驗(yàn)方法確定。在一實(shí)例中，1 4的工作周期和1秒的周期時(shí)間被用在測試中(也就是200微秒的作用之后是800微秒的‘安靜期’)。 開/關(guān)比率和周期長度可以根據(jù)需要或要求改變。根據(jù)細(xì)胞種類及細(xì)胞其他的特征，超聲波頻率和強(qiáng)度，其他脈沖周期也許更合適。當(dāng)將本技術(shù)中的幾種機(jī)制聯(lián)合在一起，這項(xiàng)技術(shù)可稱為“LIPUS”，即低頻脈沖超聲。在一實(shí)例中，此發(fā)明除包含了超聲感應(yīng)器，有效地連于超聲發(fā)射器外，還包含有頻率和強(qiáng)度反饋控制機(jī)制。超聲波的強(qiáng)度測量可用任何商用的超聲測量儀器。在一實(shí)例中， 本技術(shù)涵蓋了利用上述傳感器傳遞收集到的信息通過有線或無線連接傳給超聲發(fā)射器的步驟。此反饋傳感器的設(shè)置由圖IB表示。這種環(huán)形反饋被用來保持超聲頻率和強(qiáng)度在預(yù)先設(shè)定的程度或范圍內(nèi)。如上所述，此方法適用于在受控以及許多非受控環(huán)境下的細(xì)胞生長，包括懸浮狀態(tài)下的細(xì)胞生長。在一實(shí)例中，超聲波作用于大容量液體細(xì)胞培養(yǎng)基，超聲波通過一個(gè)傳感器陣列提供更加均勻的超聲能量。如圖6所示，一個(gè)包含許多傳感器的超聲平板安置在細(xì)胞培養(yǎng)液容器中。在一實(shí)例中，此陣列放置在容器底部。通過不斷的擾動(dòng)，在任一個(gè)作用周期，細(xì)胞培養(yǎng)基里都能得到相對(duì)均勻的超聲能量。圖6顯示了一個(gè)5L的燒杯，可以將此設(shè)計(jì)伸延至巨型的發(fā)酵罐，如圖1所示。在設(shè)計(jì)中，由許多的超聲傳感器排列而成的超生盤產(chǎn)生的超聲波輻射透過容器壁對(duì)燒杯里的液體進(jìn)行刺激，這種刺激比在局部的單一超聲傳感器的刺激更為均勻。正如在這里的描述和以后隨之而來的申報(bào)，本發(fā)明可具體實(shí)現(xiàn)于其他特定形式， 而不偏離其結(jié)構(gòu)、方法、或其它基本特性。正如附錄的申報(bào)所指，所有被描述的例子在每一方面都被認(rèn)為是就其所是的具體實(shí)例，因此，而不僅僅是之前的描述。任何在申報(bào)中的含義上的變化和等同的改變將都包含在其范圍內(nèi)。以下的例子僅僅作為示范，而不對(duì)此發(fā)明有任何局限。例子以下例子意在描畫所指的發(fā)明而不以任何形式限制所指的發(fā)明。例一，青霉菌 Penicillium brevicompactum 的生長。一小瓶冷藏的P. brevicompactum孢子用無菌水稀釋成1/20。在含有75毫升的 PDA瓊脂的500毫升燒瓶中，加入1毫升的孢子懸浮液，在室溫下孵化9天。50毫升無菌 0.01% TweenSO加入孢子培養(yǎng)燒瓶，孢子被刮掉懸浮在溶液中。溶液轉(zhuǎn)移到一無菌容器。 200微升的孢子懸浮液被接種于125毫升的燒瓶(內(nèi)含25毫升的接種培養(yǎng)基)。接種的燒瓶在27度，200rpm(2"throw)下孵化48小時(shí)。然后，0. 5毫升的接種培養(yǎng)基被加入包含25 毫升生產(chǎn)培養(yǎng)基的燒瓶并孵化，在27度200rpnK2”throw)下孵化。每天用不同強(qiáng)度的超聲處理每個(gè)燒瓶10分鐘。
權(quán)利要求
1.一個(gè)增加微生物細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基的生長率、有效物資的產(chǎn)量、或蛋白質(zhì)表達(dá)的方法，包括的步驟是將細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)基暴露在頻率范圍在IMHz和IOMHz之間的超聲波之下。
2.權(quán)利要求1的方法，其中的超聲波是脈沖形式。
3.權(quán)利要求2的方法，超聲頻率從約IMHz到2MHz。
4.權(quán)利要求3的方法，其中的頻率在約1.4MHz和約1. 6MHz之間。
5.權(quán)利要求4的方法，其中超聲頻率約為1.5MHz。
6.權(quán)利要求1的方法，其中超聲強(qiáng)度從約lmW/cm2到約5W/cm2。
7.權(quán)利要求6的方法，其中超聲強(qiáng)度從約lOmW/cm2到約150mW/cm2。
8.權(quán)利要求1的方法，其中細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液包含真核細(xì)胞。
9.權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)液包含真菌。
10.權(quán)利要求9的方法，其中真菌包括青霉菌屬(Penicillium)或木霉菌屬 (Trichoderma)0
11.之前任何權(quán)利要求的方法，其中超聲在周期間隔中使用。
12.權(quán)利要求10的方法，其中超聲使用了1個(gè)或多個(gè)間隔，作用時(shí)間在M小時(shí)期間小于60分鐘。
13.權(quán)利要求11的方法，其中超聲在M小時(shí)期間使用了一個(gè)長為10或20分鐘的間隔。
14.與權(quán)利要求1的方法共同使用反饋系統(tǒng)的方法，測量了目標(biāo)點(diǎn)的超聲發(fā)射，調(diào)整發(fā)射強(qiáng)度以確保到達(dá)細(xì)胞的頻率和強(qiáng)度最優(yōu)。
全文摘要
一種加強(qiáng)細(xì)胞增殖率，用于微生物的產(chǎn)品的生產(chǎn)，或蛋白質(zhì)的表達(dá)，包括將微生物暴露給大于1MHz的超聲波頻率。
文檔編號(hào)C12P21/00GK102171336SQ200980138627
公開日2011年8月31日 申請(qǐng)日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者J·邢, J·陳, W·T·昂 申請(qǐng)人:智能納米股份有限公司