專利名稱：新穎的基因sms 44的制作方法
新穎的基因SMS 44本發(fā)明涉及新穎的基因，其編碼L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)和/或 2_酮-L-古洛酸(下文中也稱為2-KGA)合成中涉及的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新 穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片 段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和編碼所述經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的 多核苷酸以及經(jīng)修飾的微生物，其中所述修飾對所述微生物中維生素C和/或2-KGA生產(chǎn) 的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率具有直接或間接的影響。本發(fā)明還包括使用經(jīng)修飾的多核苷酸序 列轉(zhuǎn)化宿主微生物的工藝。本發(fā)明還涉及經(jīng)過遺傳工程改造的微生物及其用于直接生產(chǎn)維 生素C和/或2-KGA的用途。維生素C是對人類來說非常重要且必不可少的營養(yǎng)因子。維生素C還用于動物飼 料，盡管一些畜牧動物可自身合成維生素C。在過去的70年中，已通過公知的Reichstein方法從D-葡萄糖對維生素C進(jìn)行了 工業(yè)生產(chǎn)。該工藝中的所有步驟都是通過化學(xué)方式進(jìn)行的，只除了其中一個步驟(從D-山 梨糖醇到L-山梨糖的轉(zhuǎn)化)，其通過微生物轉(zhuǎn)化來進(jìn)行。從對維生素C的工業(yè)生產(chǎn)的最初 實踐開始，就已使用了多種化學(xué)改良和技術(shù)改良，來提高Reichstein方法的效率。近來對 維生素 C 生產(chǎn)的發(fā)展被概括于 Ullmann，s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition,Vol.A27(1996)，pp. 547ff 中。維生素C生產(chǎn)的不同中間步驟已在微生物或從中分離出的酶的協(xié)助下進(jìn)行。因 此，可通過發(fā)酵工藝，通過屬于例如Ketogulonicigenium屬或Gluconobacter屬的菌株從 L-山梨糖或D-山梨糖醇起始來生產(chǎn)2-KGA (這是可通過堿性重排反應(yīng)化學(xué)轉(zhuǎn)化為維生素C 的中間產(chǎn)物)，或者通過屬于Gluconobacter屬或Pantoea屬的重組菌株，從D-葡萄糖起始 進(jìn)行另一種發(fā)酵工藝來生產(chǎn)2-KGA。目前用于對維生素進(jìn)行化學(xué)生產(chǎn)的方法具有一些人們不想要的特征，例如高能耗 以及要使用大量的有機(jī)及無機(jī)溶劑。因此，在過去數(shù)十年中，人們已在研究更加經(jīng)濟(jì)且環(huán)保 的用微生物轉(zhuǎn)化來制造維生素C的其它方法。從大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)來直接生產(chǎn)維生素 C已在多種微生物中被報道過，所述微生物例如藻類、酵母和乙酸細(xì)菌，其中使用了不同 的培養(yǎng)方法。已知能直接生產(chǎn)維生素C的細(xì)菌的例子包括，例如，來自Gluconobacter、 Gluconacetobacter、Acetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas 或 Escherichia屬的菌株。已知酵母或藻類的例子包括，例如Candida、Saccharomyces、 ZygosaccharomycesλSchizosaccharomyces、Kluyveromyces 或 Chlorella0能吸收D-山梨糖醇用于生長的微生物通常具有能將該化合物氧化為普遍性的同 化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生長的微生物還擁有一種酶——NAD(P) H-依賴性L-山梨糖還原酶，該酶可將該化合物還原為D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被進(jìn)一 步氧化為D-果糖。被D-果糖激酶磷酸化之后，D-果糖成為很多微生物生長的優(yōu)秀底物。例如，在乙酸細(xì)菌(其是專性需氧的革蘭氏陰性微生物，屬于Acetobacter、 Gluconobacter和Gluconacetobacter屬)的情況下，這些微生物能將D-山梨糖醇轉(zhuǎn)運進(jìn)胞質(zhì)溶膠(cytosol)，并通過胞質(zhì)溶膠中的NAD-依賴性D-山梨糖醇脫氫酶將其轉(zhuǎn) 化為D-果糖。一些個體菌株，例如Gluconobacter oxydans IFO 3292和IFO 3293還 能將L-山梨糖轉(zhuǎn)運進(jìn)胞質(zhì)溶膠，并通過胞質(zhì)溶膠中的NAD(P)H-依賴性L-山梨糖還原 酶將其還原為D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被進(jìn)一步氧化為D-果糖。在這些細(xì)菌中， Embden-Meyerhof-Parnas途徑以及三羧酸循環(huán)并不具有完全活性，將糖導(dǎo)向中央代謝的主 要途徑是磷酸戊糖途徑。通過磷酸化反應(yīng)從D-果糖獲得的D-果糖-6-磷酸進(jìn)入磷酸戊糖 途徑，其被進(jìn)一步代謝，產(chǎn)生以NAD (P)H形式存在的還原能量和生長及維持所必需的三羧 基化合物。乙酸細(xì)菌因其能不完全氧化不同底物(例如醇、糖、糖醇和醛)的能力而為人們公 知。這些過程為人們所已知并通常被稱為氧化發(fā)酵或不完全氧化，它們已被長時間應(yīng)用于 食品和化學(xué)工業(yè)中，尤其是對醋和L-山梨糖的生產(chǎn)中。已知能用屬于Gluconobacter屬的 菌株從D-山梨糖醇或L-山梨糖進(jìn)行不完全氧化獲得的有用產(chǎn)物是2-KGA。乙酸細(xì)菌通過位于周質(zhì)空間中、周質(zhì)膜上或胞質(zhì)中的不同脫氫酶來完成這些不完 全氧化反應(yīng)。不同的脫氫酶使用不同的輔助因子，最常見的是用于膜結(jié)合酶或周質(zhì)酶的PQQ 和FAD，以及用于胞質(zhì)酶的NAD/NADP。雖然這些氧化反應(yīng)的所有產(chǎn)物都通過外層膜分散回到外界水環(huán)境，但是它們中的 一些可被主動或被動轉(zhuǎn)運進(jìn)細(xì)胞，并進(jìn)一步用于與生長和能量形成有關(guān)的代謝途徑。細(xì)胞 中，氧化產(chǎn)物可被還原酶多次還原回它們的最初底物，然后被導(dǎo)向進(jìn)入中央代謝。在D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝中具有活性的蛋白質(zhì)，尤其是酶和轉(zhuǎn)運蛋白， 在本文中被稱為涉及山梨糖醇/山梨糖代謝系統(tǒng)(Sorbitol/Sorbose Metabolization System)。此類蛋白質(zhì)在本文中被縮寫為SMS蛋白，其在對D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接 代謝中發(fā)揮作用。D-山梨糖醇或L-山梨糖的代謝包括一方面，將這些化合物吸收進(jìn)胞質(zhì)溶膠，以 及進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為可用于吸收途徑的代謝物，所述吸收途徑例如Embden-Meyerhof-Parnas 途徑、磷酸戊糖途徑、Entner-Doudoroff途徑以及三羧酸循環(huán)，它們都涉及對于活的細(xì)胞的 生長和維持來說必要的全部關(guān)鍵的能量形成和合成代謝反應(yīng)。另一方面，D-山梨糖醇或 L-山梨糖的代謝還包括通過所謂的不完全氧化過程將這些化合物轉(zhuǎn)化為經(jīng)進(jìn)一步氧化的 產(chǎn)物，例如L-山梨糖酮、2-KGA和維生素C。本發(fā)明的一個目的是提高維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力。令人吃驚地，我們發(fā)現(xiàn)，SMS蛋白或此類蛋白的涉及對D-山梨糖醇、L-山梨糖或 L-山梨糖酮的吸收或轉(zhuǎn)化或具有針對此的活性的亞基在對維生素C和/或2-KGA的生物技 術(shù)生產(chǎn)中具有重要作用。在一種實施方式中，本發(fā)明的SMS蛋白選自轉(zhuǎn)移酶[EC 2]例如激酶和磷酸酶，優(yōu) 選地選自轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)[EC 2. 7]，更優(yōu)選地選自以含氮基團(tuán)作為受體的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7. 3]。此外，本發(fā)明的SMS蛋白可選自與膜結(jié)合的PQQ依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、與 膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖酮脫氫酶、與膜結(jié)合的FAD依賴性的D-山 梨糖醇脫氫酶、胞質(zhì)NAD依賴性的D-山梨糖醇脫氫酶、NAD(P)依賴性的D-山梨糖醇脫氫 酶(也被稱為NADPH依賴性的山梨糖還原酶)、NAD依賴性的木糖醇脫氫酶、NAD依賴性的
7醇脫氫酶、與膜結(jié)合的L-山梨糖脫氫酶、NAD (P) H依賴性的L-山梨糖還原酶、胞質(zhì)NADP依 賴性的山梨糖酮脫氫酶、胞質(zhì)NAD (P) H依賴性的L-山梨糖酮還原酶、與膜結(jié)合的醛脫氫酶、 胞質(zhì)醛脫氫酶、3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶以及SMS功能中涉及的其它蛋白 質(zhì)構(gòu)成的組，所述其它蛋白質(zhì)包括任何上述脫氫酶和還原酶的調(diào)節(jié)(例如信號傳導(dǎo))中涉 及的蛋白質(zhì)，例如作為感受傳導(dǎo)蛋白激酶/磷酸酶，其為具有發(fā)送器(transmitter)和接收 器(receiver)模塊、尤其具有規(guī)范組氨酸激酶發(fā)送器和天冬氨酸接收器模塊的多(例如 二)_組分調(diào)節(jié)蛋白系統(tǒng)。特別地，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，具有下述核苷酸序列的多核苷酸編碼的SMS蛋白在對維生素C 和/或2-KGA的生物技術(shù)生產(chǎn)中具有重要作用，該核苷酸序列能在優(yōu)選高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與 SEQ ID NO :1所示的序列雜交。另外發(fā)現(xiàn)，通過修飾所述多肽，可以在帶有這類修飾并且能 夠直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的微生物例如Gluconobacter中大幅提高對維生素C和 /或2-KGA的直接發(fā)酵。隨后，本發(fā)明涉及選自下述組的多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO :2的氨基酸序列的(未經(jīng)修飾的)多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO :1的(未經(jīng)修飾的)核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自微生物的基因 組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例如 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(C)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或 衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守 取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷 酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7] (SMS44)的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7] (SMS 44)多肽的多核苷酸，且其互補鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸 雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7] (SMS 44)多肽的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少60%相同，例如 70%、85%、90%或 95%相同；構(gòu)成，并且其中在SEQ ID NO :1和2中展示的序列被稱為未經(jīng)修飾的序列或野生 型序列。本發(fā)明還涉及選自下組的經(jīng)修飾或突變的多核苷酸或其互補鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 6的氨基酸序列的(經(jīng)修飾的)多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO 5的(經(jīng)修飾的)核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來自微生物的基 因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例 如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(C)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或 衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守 取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7]的活性(SMS 44mut)；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7] (SMS 44mut)多肽的多核苷酸，且其互補鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核 苷酸雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7] (SMS 44mut)多肽的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少60%相同，例 如 70%、85%、90%或 95%相同；構(gòu)成，并且其中SEQ ID NO :5和6展示的序列被稱作經(jīng)修飾或突變的序列，并且其 中所述多核苷酸包含至少一種下述突變，所述突變導(dǎo)致與相應(yīng)的野生型多核苷酸 相比提高的轉(zhuǎn)移酶[EC 2]活性，優(yōu)選地導(dǎo)致提高的轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2.7] (SMS 44mut)活性。上文確定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作為“查詢序列”，以便用來自National Center for Biotechnology[NCBI]的 BLAST 或 Blast2 程序(版本 2)針對數(shù)據(jù)庫 PRO SW-SwissProt (完全發(fā)布版本加上增加的更新)進(jìn)行搜索。根據(jù)這些搜索結(jié)果，將根據(jù)SEQ ID NO :1的SMS 44多核苷酸標(biāo)注為編碼具有組氨酸激酶/磷酸酶發(fā)送器和天冬氨酸接收 器活性的蛋白質(zhì)。SEQ ID NO :2編碼的蛋白質(zhì)發(fā)揮下述各個蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)物/活化物的作 用，所述蛋白質(zhì)包括脫氫酶，尤其是可由根據(jù)SEQ ID NO :7的多核苷酸編碼的例如SEQ ID NO 8中所示的L-山梨糖酮脫氫酶。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可與其它調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)組合發(fā)揮作用， 所述其它調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)例如為可由根據(jù)SEQID NO :9的多核苷酸編碼的如SEQ ID N0:10中所 示的蛋白質(zhì)。術(shù)語“未經(jīng)修飾的SMS蛋白”和“野生型SMS蛋白，，，尤其是“未經(jīng)修飾的SMS 44蛋 白”和“野生型SMS 44蛋白”在本文中可互換使用。未經(jīng)修飾的SMS蛋白或未經(jīng)修飾的蛋 白質(zhì)可包括優(yōu)選地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :1中所示序列(SMS 33基因)雜交的核 苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，對所述蛋白質(zhì)而言提高比活性是期望的，從而提高給定微生物中 維生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)，并且被用作設(shè)計具有提高的本發(fā)明活性的突變體的起點。在 本發(fā)明的上下文中，“野生型”可包括可從天然衍生的序列以及合成序列的變體，只要能夠 通過本發(fā)明的教導(dǎo)使其更有活性即可。具體地，這類蛋白質(zhì)是原核來源的，優(yōu)選地是細(xì)菌來 源，尤其是來自于乙酸細(xì)菌例如Gluconobacter、Acetobacter禾口 Gluconacetobacter。更優(yōu) 選地，未經(jīng)修飾的SMS蛋白選自表1中所示蛋白質(zhì)或其等同物。最優(yōu)選地，未經(jīng)修飾的SMS 蛋白可以從Gluconobacter獲得，尤其是從G. oxydans獲得。術(shù)語“經(jīng)修飾的SMS蛋白”和“突變的SMS蛋白”，尤其是“經(jīng)修飾的SMS 44蛋白” 和“突變的SMS 44蛋白”在本文中可互換使用。這也適用于術(shù)語“經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)”和“突 變體蛋白質(zhì)”。突變體、經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)或經(jīng)修飾的SMS蛋白可包括根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)可從 給定的野生型蛋白質(zhì)/SMS蛋白(根據(jù)上文定義)衍生而來、并且比各自的野生型酶更具活 性(例如可作為從給定底物直接生產(chǎn)的維生素C和/或2-KGA的提高來測量)的任何變體。 對本發(fā)明的范圍而言，與如何獲得突變體無關(guān)；這類突變體可以例如通過定點誘變、飽和誘 變、隨機(jī)誘變/定向進(jìn)化、整個細(xì)胞/生物的化學(xué)或UV誘變、和本領(lǐng)域已知的其它方法來獲 得。這些突變體也可以例如通過設(shè)計合成基因來生產(chǎn)，和/或通過體外(無細(xì)胞)翻譯生
9產(chǎn)。為了測試比活性，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(過)表達(dá)突變體，并測量本文 定義的活性。本發(fā)明的經(jīng)修飾的SMS蛋白可以通過突變相應(yīng)的未經(jīng)修飾的SMS蛋白來獲得。這 可例如通過修飾優(yōu)選地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :1中所示序列(SMS 44基因)雜 交的核苷酸序列來進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)如SEQ ID N0:2所示并在本文中描述的從Gluconobacter oxydans IFO 3293中分離的未經(jīng)修飾的SMS蛋白是一種尤其有用的SMS蛋白，因為似 乎其在微生物中、尤其是細(xì)菌中、例如乙酸細(xì)菌(例如Gluconobacter、Acetobacter和 Gluconacetobacter)中維生素C的直接生產(chǎn)中具有決定性的功能。在一個實施方式中，未 經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)對應(yīng)于SEQ ID NO :2中所示的G. oxydansIFO 3293SMS 44蛋白。該蛋白質(zhì) 可由SEQ ID NO 1中所示核苷酸序列編碼。因此，本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的SMS蛋白，其中所述蛋白質(zhì)的活性被提高，尤其涉及為 了提高其活性而被修飾的SMS 44多肽或其等同物，使得能夠直接由給定底物生產(chǎn)維生素C 的微生物中維生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)被提高。 經(jīng)修飾的SMS蛋白，尤其是經(jīng)修飾的SMS 44蛋白，可含有至少一種導(dǎo)致經(jīng)修飾的 SMS蛋白、尤其是突變的SMS 44蛋白的突變，所述至少一種突變存在于合適的微生物中時 對從底物直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA具有影響。至少一種突變可以是一個或多個取 代、添加和/或缺失，優(yōu)選地是一個或多個氨基酸取代。以SMS 44多肽為例，所述至少一種 突變可以是至少一種氨基酸取代，其中所述取代發(fā)生在對應(yīng)于SEQ ID NO :2中所示氨基酸 300和600之間位置的位置上。優(yōu)選地，所述至少一種取代是對應(yīng)于SEQ ID NO 2中所示第 563位的位置上的至少一種替換，更優(yōu)選地是用另一氨基酸取代T563，最優(yōu)選地是用1563 替換T563。本文定義的經(jīng)修飾的多肽可僅在上文定義的位置上含有一個突變，所述突變存在 于能夠從給定底物直接生產(chǎn)所述產(chǎn)物的微生物中時導(dǎo)致維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)的提 高?；蛘?，其可含有多于一個突變，即至少一個突變，例如2、3、4、5、6、7、8、10個或更多突 變，其中這類經(jīng)修飾的SMS多肽會導(dǎo)致維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)的提高。因此，本發(fā)明的一個目的是提供經(jīng)修飾的SMS 44蛋白，其中(1)與相應(yīng)未經(jīng)修飾 的蛋白質(zhì)相比經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的比活性提高，和(ii)經(jīng)修飾的SMS 44蛋白的氨基酸序列 包含一個或多個突變，包括在對應(yīng)于SEQID NO :2的至少第563位的氨基酸位置上的至少一 個突變。在本發(fā)明的一個尤其有用的實施方式中，未經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)選自如SEQ ID NO 2 中所示的SMS 44蛋白，其可由根據(jù)SEQ ID NO 1的多核苷酸編碼，其中在SEQ ID NO 2的 氨基酸300和600之間，優(yōu)選地在根據(jù)SEQ ID NO 2的氨基酸序列的第563位上引入至少 一個突變，例如僅引入一個突變。優(yōu)選地，所述突變是取代，更優(yōu)選地是用另一氨基酸取代 T563，最優(yōu)選地用1563替換T563。得到的經(jīng)修飾的氨基酸序列展示于SEQ ID N0:6中。該 經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)可以由如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列編碼。發(fā)現(xiàn)所述經(jīng)修飾的SMS蛋 白(其還天然地存在于Gluconobacter oxydans DSM 17078中)是一種尤其有用的SMS蛋 白，因為似乎其在微生物、尤其是細(xì)菌、例如乙酸細(xì)菌(例如Gluconobacter、Acetobacter 和Gluconacetobacter)中的直接維生素C生產(chǎn)中發(fā)揮決定性功能?？墒褂胏DNA、mRNA或基因組DNA作為模板，使用合適的寡核苷酸引物(例如根據(jù)SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 4的核苷酸引物)，按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，通過核酸擴(kuò)增來獲 得根據(jù)本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增出的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序列分析對 其進(jìn)行表征。用于反應(yīng)的模板可以是通過對從已知包含或懷疑包含根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的 菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆和測序，以確保擴(kuò)增出的序 列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。然后可通過多種已知方法，用PCR片段分離全長cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出 的片段，用其篩選噬菌體或粘粒(Cosmid)CDNA文庫?；蛘?，經(jīng)標(biāo)記的片段可用于篩選基因 組文庫。因此，本發(fā)明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用來自 微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4的引物組，通過核 酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其包含編碼本文所述的多核苷酸編碼的多肽的片段 或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保 守取代，并且，所述片段或衍生物具有SMS多肽(優(yōu)選地分別為野生型和經(jīng)修飾的SMS 44 多肽)的活性。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其編碼SMS多肽(優(yōu)選地分別為野生型和經(jīng)修飾的 SMS 44多肽)，其互補鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與本文定義的多核苷酸雜交。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其與本文定義的多核苷酸至少60%相同，并且其編 碼SMS多肽；本發(fā)明還涉及是上文定義的多核苷酸的互補鏈的多核苷酸。本發(fā)明還涉及下述引物、探針和片段，其可用于擴(kuò)增或檢測根據(jù)本發(fā)明的DNA，和 用于鑒定也帶有這類基因的相關(guān)種或科的微生物。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明多核苷酸的載體，和用多核苷酸或所述載體遺傳工程改 造過的微生物。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)下述微生物的方法，所述微生物能夠表達(dá)上文定義的多核 苷酸編碼的多肽和如上文所定義的多核苷酸編碼的多肽，尤其是本文定義的經(jīng)修飾的多 肽。本發(fā)明還涉及下述微生物，其中，SMS多肽(優(yōu)選地，SMS 44多肽)的活性增強(qiáng)和 /或提高，使得從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)的維生素C和/或2-KGA的產(chǎn)率增加。 這可例如通過以本文所述的方式修飾所述SMS多肽、優(yōu)選地所述SMS 44多肽來實現(xiàn)，例如 在帶有SMS 44基因的內(nèi)源等同物的微生物中引入突變，得到SMS 44基因的經(jīng)修飾的等同 物?；蛘呖梢詫⒈疚亩x的經(jīng)突變的SMS基因的等同物直接引入適合從給定底物直接生產(chǎn) 維生素C和/或2-KGA的合適宿主細(xì)胞中。得到的經(jīng)修飾的SMS 44蛋白顯示與相應(yīng)未經(jīng) 修飾的SMS蛋白相比提高的活性。一種尤其有用的經(jīng)修飾的SMS蛋白展示于SEQ ID NO 6 (SMS 44mut)中，其可由 SEQ ID NO 5 編碼。技術(shù)人員將知道如何增強(qiáng)和/或提高SMS蛋白(優(yōu)選地，SMS 44蛋白)的活性，即 產(chǎn)生經(jīng)突變的SMS蛋白，尤其是經(jīng)突變的SMS 44蛋白。這些可以例如通過對宿主生物進(jìn)行 遺傳修飾來完成，所述遺傳修飾以本文所述產(chǎn)生具有較之野生型生物提高的比活性的SMS 蛋白、優(yōu)選地SMS 44蛋白(即經(jīng)突變的SMS 44蛋白)的方式來進(jìn)行。
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為了進(jìn)一步促進(jìn)SMS 44蛋白質(zhì)活性的提高，導(dǎo)致維生素C和/或2-KGA的提高， 可以提高對應(yīng)于本文所述的多核苷酸的基因的拷貝數(shù)。或者可以使用強(qiáng)啟動子指導(dǎo)多核苷 酸的表達(dá)。在另一實施方式中，可以改變基因上游的啟動子、調(diào)節(jié)區(qū)和/或核糖體結(jié)合位點 來提高表達(dá)。也可以通過提高信使RNA的相對半衰期來增強(qiáng)或提高表達(dá)。在另一實施方式 中，可以通過在多肽氨基酸序列中使用一個或多個提高活性的突變，來提高多肽自身的活 性。例如，改變多肽對其相應(yīng)底物的親和力可導(dǎo)致提高的活性。類似地，可以提高多肽的相 對半衰期。在基因表達(dá)被增強(qiáng)或比活性被提高的任一情況下，可以通過改變細(xì)胞培養(yǎng)基的 組成和/或用于培養(yǎng)的方法來實現(xiàn)改進(jìn)。本文中使用“增強(qiáng)的表達(dá)”或“提高的活性”表示 與野生型蛋白質(zhì)、多核苷酸、基因或多核苷酸或多肽被增強(qiáng)和/或提高之前存在的蛋白質(zhì) 的活性和/或濃度相比，至少5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或甚至多于500%的 提高。也可以通過將蛋白質(zhì)與其活性的特異性或一般增強(qiáng)子接觸，來增強(qiáng)SMS 44mut蛋白 的活性。在下述說明書中，將對達(dá)到此目的(S卩，通過增加SMS 44蛋白的活性，例如通過向 編碼所述SMS 44蛋白的DNA中引入至少一個突變，來增加從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接 生產(chǎn)的維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或產(chǎn)量)的方案進(jìn)行詳細(xì)描述。在進(jìn)行必要 修正后，這些方案可應(yīng)用于其它SMS蛋白。為了使生物生產(chǎn)具有提高的比活性的SMS 44基因和/或蛋白質(zhì)(即修飾各自序 列)而進(jìn)行的修飾可包括SMS 44基因(的部分)或其調(diào)節(jié)元件的突變(例如插入、缺失或 點突變)。SMS 44蛋白比活性的增加也可通過本領(lǐng)域已知的方法來完成。此類方法可包括 對SMS 44基因(的部分)的突變(例如，插入、缺失或點突變)。合適的宿主細(xì)胞包括下述微生物細(xì)胞，其能夠生產(chǎn)給定的發(fā)酵產(chǎn)物，例如將給 定的碳源直接轉(zhuǎn)化成維生素C和/或2-KGA，并帶有未經(jīng)修飾的SMS 44基因或其等同 物或同源物(其隨后以本文所述導(dǎo)致維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)提高的方式被突變)， 或者向其中引入經(jīng)修飾的版本的所述SMS 44基因或其等同物。帶有這類未經(jīng)修飾的基 因或其等同物的合適的微生物可選自細(xì)菌，尤其是乙酸細(xì)菌，它們可以是野生型菌株或 通過標(biāo)準(zhǔn)的誘變方法和選擇方法獲得的突變體菌株以及重組菌株。此類細(xì)菌的例子可 以是，例如，Gluconobacterλ AcetobacterΛ GluconacetobacterΛ Ketogulonicigenium、 Methylobacterium 禾口 Magnetospirillum。優(yōu)選的是 Gluconobacter 或 Acetobacter, 例 如，G.oxydans、G.cerinus、G.frateurii、G. industrius、G. thailandicus、 G. rubiginosus、G. melanogenus、A. aceti、A. aceti subsp. xylinum、A. aceti subsp. orleanus、Methylobacteriumsp.4—46、Methylobacterium chloromethanicum CM4、Methylobacteriumextorquens PA1、Methylobacterium populi BJOO1Λ Magnetospirillumgryphiswaldense MSR-I 或Magnetospirillum magneticum AMB-1，更優(yōu) 選地是G.oxyckns。對G.oxyckns DSM 17078而言應(yīng)當(dāng)注意，該菌株已經(jīng)含有經(jīng)修飾的版本 的 SMS 44?？捎糜诒景l(fā)明的微生物可被公眾從不同來源獲得，例如，DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，Inhoffenstr. 7B，D-38124 Braunschweig, Germany、American Type Culture Collection (ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108 USA 或 Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center，
122-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba,292-0818, Japan(以前是 Institue for Fermentation, Osaka(IFO),17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532-8686，Japan)。這類菌株的合適的例子可在例如WO 2006/084719中找到或列于表1中， 包括下述微生物，其帶有編碼L-山梨糖酮脫氫酶的基因，例如編碼與膜結(jié)合的L-山梨糖酮 脫氫酶(SNDHai)或其等同物的基因，如SEQ ID NO 9中所示和W02005/017159中所公開。 特別優(yōu)選的是 Gluconobacter oxydans DSM 17078 (先前已知為 Gluconobacter oxydans N44-1 并描述于 Sugisawa 等，Agric. Biol. Chem. 54 1201-1209，1990 中)，其在 2005 年 1 月 26 日保藏于 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)on 26. January 2005，并且已經(jīng)含有經(jīng)突變版本的SMS 44。帶有未經(jīng)修飾版本的SMS 44的一 種優(yōu)選的菌株是G. oxydans IFO 3293。在關(guān)于本發(fā)明的方面，應(yīng)當(dāng)理解，上述微生物還包括此類菌株的具有同樣生理屬 性的異名(synonym)或基原異名(basonym),其如 International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定義。本文中使用的對微生物的命名是International Committee on Systematics of Prokaryotes andthe Bacteriology and Applied Microbiology Division of the International Unionof Microbiological Societies 官方接受的(在 優(yōu)先權(quán)申請的提交日期時)，并被其官方出版物International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(IJSEM)所公開。具體的參考文獻(xiàn)是 Urbance et al.， IJSEM(2001) vol 51 1059-1070，以及 IJSEM(2001) vol 51 1231-1233 上的修訂通知，其中 描述了對作為Ketogulonicigenium vulgare的G. oxydans DSM 4025的分類學(xué)上的重新歸 類。本發(fā)明涉及經(jīng)修飾的微生物，其中所述修飾導(dǎo)致從底物(例如D-山梨糖醇或 L-山梨糖)直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的提高的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率。這可通過提高 本文所述的SMS 44基因的活性來進(jìn)行。另外，本發(fā)明的微生物可在DNA水平或蛋白質(zhì)水平 上攜帶其它修飾(見上文所述)，只要此類修飾對從底物(例如D-山梨糖醇或L-山梨糖) 直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率具有直接影響即可。此類其它修 飾可以例如影響編碼上文所述的SMS蛋白的其它基因，特別是，編碼與膜結(jié)合的L-山梨糖 酮脫氫酶或與膜結(jié)合的PQQ結(jié)合D-山梨糖醇脫氫酶的基因。進(jìn)行此類修飾的方法是本領(lǐng) 域已知的，一些例子在本文中有進(jìn)一步描述。用于直接生產(chǎn)維生素C的這樣的與膜結(jié)合的 L-山梨糖酮脫氫酶及其核苷酸和氨基酸序列公開于WO 2005/017159中。修飾也可以影響 編碼涉及所述脫氫酶(優(yōu)選L-山梨糖酮脫氫酶)調(diào)節(jié)的其它基因，尤其是WO 2005/017159 中公開的基因。一個特定的例子是下述修飾，其影響例如SEQ ID NO :9所示的編碼根據(jù)SEQ ID NO 10的蛋白質(zhì)的基因或其同源物。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的重組微生物可以帶有例如影響SMS 44基因或其同源物的一 個修飾，或者可帶有例如影響本文所述的多核苷酸的多個修飾(即多于1、2、3個或更多的 修飾)加上脫氫酶(尤其是根據(jù)W02005/017159的L-山梨糖酮脫氫酶)和/或所述脫氫 酶調(diào)節(jié)物(尤其是根據(jù)SEQ ID NO :9的基因或同源物)中的修飾。所述其它基因(例如分 別根據(jù)SEQ ID NO :7和SEQ ID NO :9的基因或等同物)的修飾可以是引入所述序列中的一 個或多個突變，所述突變導(dǎo)致相應(yīng)多肽比活性的提高，或者所述修飾可以通過在給定微生 物中過表達(dá)各個基因，導(dǎo)致更多個拷貝的所述SMS基因來實現(xiàn)。
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如果基因的轉(zhuǎn)錄水平較之野生型基因有所增強(qiáng)，那么認(rèn)為該基因被“過量表達(dá)”。 這可通過例如對mRNA的量加以定量的Northern印跡分析來測量，mRNA的量被用作為對基 因表達(dá)的指示。在本文中，如果產(chǎn)生的mRNA的量較之野生型基因產(chǎn)生的mRNA的量增加至少 1%、2%、5%、10%、25%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過500%，那么基因就是過量 表達(dá)的。本領(lǐng)域中還已知可以通過將各自SMS蛋白與特定增強(qiáng)子相接觸或與能與所述SMS 蛋白發(fā)生特異性相互作用的其它物質(zhì)相接觸，來增強(qiáng)給定蛋白質(zhì)活性的方法。為鑒定出此 類特定增強(qiáng)子，可表達(dá)SMS蛋白，并對存在懷疑能增強(qiáng)給定蛋白活性的化合物時的活性加 以測試。還可通過對編碼這類SMS蛋白的信使RNA進(jìn)行穩(wěn)定化來增加這類SMS蛋白的活 性。此類方法也是本領(lǐng)域已知的,見,例如Sambrook et al. ,1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.禾口 Ausubel etal. (eds. ),1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.)。根據(jù)本發(fā)明的另一目的，提供了本文定義的多核苷酸或者已用此類多核苷酸進(jìn)行 過遺傳工程改造的微生物在生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA中的用途。本發(fā)明還涉及在微生物中表達(dá)(經(jīng)修飾的)基因的工藝，涉及在微生物中生產(chǎn)上 文定義的多肽的工藝，以及生產(chǎn)能產(chǎn)生維生素C和/或2-KGA的微生物的工藝。所有這些工 藝都可包含改變微生物的步驟，其中，本文中使用的“改變”包括下述工藝，該工藝以使得發(fā) 酵產(chǎn)物的產(chǎn)率和/或生產(chǎn)能力較之野生型生物有所提高的方式來進(jìn)行“遺傳改變”或“改變 細(xì)胞培養(yǎng)基的組成和/或改變用于培養(yǎng)的方法”。術(shù)語“改變”還包括本文所述經(jīng)修飾的多 核苷酸和/或多肽的生產(chǎn)，尤其是SMS 44基因/多肽的修飾。本文中使用的“維生素C的 提高的產(chǎn)率”表示較之野生型微生物(即，沒有被遺傳改變的微生物)而言增加至少5%、 10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、200%或者甚至超過 500%。對 2-KGA 生產(chǎn)而言， “2-KGA的提高的產(chǎn)率”表示較之野生型微生物(即，沒有被遺傳改變的微生物)而言增加 至少 1%、2%、5%、10%、20%、30%、40% 或者甚至超過 100%。術(shù)語“遺傳工程改造”或“遺傳改變”表示對活的生物體中遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的科學(xué)改 變。這包括生產(chǎn)和使用重組DNA。更特別地，這用于描述來自天然存在的生物而經(jīng)遺傳工程 改造或修飾的生物。遺傳工程改造可通過本領(lǐng)域已知的多種方法來進(jìn)行，例如，基因替換， 基因擴(kuò)增，基因打斷，使用質(zhì)粒、病毒或其它載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染。經(jīng)遺傳修飾的生物，例 如，經(jīng)遺傳修飾的微生物通常還被稱作重組生物，例如重組微生物。根據(jù)本發(fā)明，提供了經(jīng)遺傳工程改造/重組產(chǎn)生的宿主細(xì)胞(也被稱為重組細(xì)胞 或經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞)，其攜帶有此類經(jīng)修飾的多核苷酸，其中，相連的蛋白的功能較之野生型細(xì) 胞而言被顯著修飾，使得對一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素C)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/ 或效率被提高。宿主細(xì)胞可選自能從給定的碳源直接生產(chǎn)一種或多種發(fā)酵產(chǎn)物(例如維 生素C和/或2-KGA)的微生物，特別是Gluconobacter Oxydans0已經(jīng)帶有這類經(jīng)修飾的 SMS基因，尤其是經(jīng)修飾的SMS 44基因的一種細(xì)胞是G. oxydans DSM17078，其可被進(jìn)一步 修飾，從而進(jìn)一步提高從給定碳源到維生素C和/或2-KGA的直接生產(chǎn)?！敖?jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞”或“重組細(xì)胞”是已通過重組DNA技術(shù)向其(或其祖先細(xì)胞)中引 入了根據(jù)本發(fā)明的核酸的細(xì)胞，或者是其中(內(nèi)源)SMS43蛋白的活性已通過與本文定義的 相同的修飾而被增加和/或增強(qiáng)的細(xì)胞。合適的宿主細(xì)胞包括能生產(chǎn)給定發(fā)酵產(chǎn)物(例如，能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA)的微生物的細(xì)胞?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的 宿主細(xì)胞包括但不限于來自Pseudomonas (例如P. putida、Pantoea)、Escherichia (例如 Ε. coli)和Corynebacterium屬的菌株，所述宿主細(xì)胞天然不帶有這類基因，例如編碼(未 經(jīng)修飾的)SMS 44的基因，而是通過引入本文所述所述經(jīng)突變的基因而被遺傳修飾。本發(fā)明的實施方式既包括遺傳上改變帶有編碼(未經(jīng)修飾的)SMS 44蛋白質(zhì)或其 等同物的內(nèi)源基因的微生物，使得所述(經(jīng)修飾的)基因產(chǎn)物的活性提高，也包括如上文所 述向下述合適的宿主生物中引入所述經(jīng)修飾的多核苷酸或其等同物，所述宿主生物不天然 帶有這樣的基因并且能夠從上文定義的給定的底物生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA，還能夠表達(dá) 所述被引入的(經(jīng)修飾的)基因。通過對從Gluconobacter oxydans IFO 3293獲得的基因組克隆進(jìn)行測序，來測定 包含編碼未經(jīng)修飾的SMS 44蛋白的SEQ ID NO 1的核苷酸序列的基因的序列。本發(fā)明還涉及下述多核苷酸，其至少編碼本文所述的多肽的生物活性片段或其衍 生物，尤其是SEQ ID NO :2所示的SMS 44多肽或SEQ IDNO :6所示的經(jīng)修飾的SMS 44多肽。本文中使用的“生物活性片段或衍生物”表示保留有與SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :6所示的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信 號傳遞活性或抗體反應(yīng)活性。術(shù)語“相同的生物功能”或“功能等同物”在本文中使用時表 示蛋白質(zhì)與SEQ IDNO :2或SEQ ID NO :6所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活 性、信號傳遞活性或者抗體反應(yīng)活性。通常，可通過技術(shù)人員公知的方法來測定SMS蛋白的生物活性、酶活性或其它 活性，所述方法例如在存在其底物、電子受體或供體(包括吩嗪硫酸甲酯(PMS)、二氯苯 酚_吲哚苯酚(DCIP)、NAD、NADH、NADP, NADPH,可通過光度、色度或熒光方法對其消耗進(jìn)行 直接或間接測量)以及其它可能與活性的發(fā)展相關(guān)的無機(jī)組分的情況下，溫育含有SMS蛋 白的膜級分(membrane fraction)。因此，例如，可在下述試驗中測量與膜結(jié)合的D-山梨糖 醇脫氫酶的活性，所述試驗中，在存在PH 6的磷酸鹽緩沖液、D-山梨糖醇和人工電子受體 DCIP和PMS的情況下，溫育含有該酶的膜級分?？稍?00nm處測量DCIP的消耗速率，其與 膜級分中存在的D-山梨糖醇脫氫酶活性直接成正比。SMS蛋白質(zhì)(尤其是野生型和經(jīng)修飾的SMS 44蛋白質(zhì))的生物、酶或其它活性可 以分別通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測量，例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(例如 Northern印跡、轉(zhuǎn)錄融合分析、微陣列分析、目標(biāo)酶活性分析、目標(biāo)酶蛋白質(zhì)水平等等)測 定已知處于野生型/經(jīng)修飾的SMS 44蛋白質(zhì)控制下的基因的表達(dá)。本發(fā)明的多肽和多核苷酸優(yōu)選以經(jīng)分離的形式提供，優(yōu)選地，被純化至均質(zhì)。術(shù)語“經(jīng)分離的”表示物質(zhì)被移出其原來的環(huán)境(例如，如果其天然存在的話，就 是天然環(huán)境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是經(jīng)分離的，但與 天然系統(tǒng)中的一些或全部共存物質(zhì)分開的同樣的多核苷酸或多肽就是經(jīng)分離的。此類多核 苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但仍然是經(jīng) 分離的，因為此類載體或組合物并非其天然環(huán)境的一部分。本文中使用的經(jīng)分離的多核苷酸或核酸可以是這樣的DNA或RNA，它們與從中獲 得該多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因組中緊密相鄰的兩條編碼序列(5’末端一
15條，3’末端一條)并非緊密相鄰。因此，在一種實施方式中，核酸包括與編碼序列緊密相鄰 的5’非編碼(例如，啟動子)序列的一些或全部。術(shù)語“經(jīng)分離的多核苷酸”因此包括，例 如，加入到載體中、加入到自主復(fù)制質(zhì)?；虿《局?，或者加入到原核生物或真核生物的基因 組DNA中的重組DNA，或者作為獨立于其它序列的單獨分子(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切 酶處理產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在的重組DNA。其還包括是雜合體基因的一部 分的重組DNA，所述基因編碼基本不含細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(當(dāng)通過重組DNA技術(shù) 生產(chǎn)時)或化學(xué)前體或其它化學(xué)物質(zhì)(當(dāng)通過化學(xué)方式合成時)的額外多肽。此外，“經(jīng)分 離的核酸片段”是這樣的核酸片段其天然并不作為片段存在，并且將不會在天然狀態(tài)被發(fā) 現(xiàn)。本文中使用的術(shù)語“多核苷酸”、“基因”和“重組基因”指可與染色體DNA分離開 的、包括編碼蛋白質(zhì)(例如，G.oxydans SMS蛋白)的開放讀碼框的核酸分子。多核苷酸可 包括，例如，SEQ ID N0:USEQID NO :5所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或 下游的區(qū)域，所述區(qū)域可包括，例如，對于由其獲得的多肽的適當(dāng)表達(dá)和穩(wěn)定來說重要的啟 動子區(qū)域、調(diào)控子區(qū)域和終止子區(qū)域?；蚩砂ň幋a序列、非編碼序列(例如，位于基因編碼區(qū)域3’末端和5’末端的 非翻譯序列)和調(diào)控序列。此外，基因指本文定義的經(jīng)分離的核酸分子。技術(shù)人員還將理 解，導(dǎo)致SMS蛋白氨基酸序列的變化的DNA序列多態(tài)性可存在于種群(population)中，例 ta, Gluconobacter oxydans種群中。SMS 44基因中的此類遺傳多態(tài)性可由于天然變異存 在于種群的個體間，或者存在于不同種群的細(xì)胞中。典型地，此類天然變異可導(dǎo)致SMS 44 基因核苷酸序列中1-5%的變化度。作為天然變異結(jié)果的、并且不會改變SMS蛋白的功能活 性的SMS 44中的任何以及全部此類核苷酸變異和由此得到的氨基酸多態(tài)性也包括在本發(fā) 明的范圍內(nèi)。本文中使用的術(shù)語“多核苷酸”或“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，cDNA或 基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或RNA的類似物。 核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但優(yōu)選是雙鏈DNA?？墒褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例 如，肌苷或磷硫酰核苷酸)來合成核酸。此類寡核苷酸可用于例如，制備具有改變的堿基 配對能力或增加的對核酸酶的抗性的核酸。本文中提供的序列信息不應(yīng)被狹義理解為需要包括進(jìn)被錯誤鑒定的堿基。本文 公開的特定序列可以很容易地用于從能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA的 重組或非重組微生物(特別是 Gluconobacteroxydans，例如 Gluconobacter oxydans DSM 17078)中分離出完整基因，隨后可容易地對該基因進(jìn)行進(jìn)一步的序列分析，由此鑒定出測 序錯誤。除非特別指明，本文中通過對DNA分子進(jìn)行測序來確定的所有核苷酸序列都是用 自動DNA測序儀(測定的，并且，本文測定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通 過對按照上文所述測定的DNA序列進(jìn)行翻譯來推測的。因此，如本領(lǐng)域所已知的，對由該自 動方法所測定的任何DNA序列而言，本文所測定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯誤。 典型地，通過自動方法測出的核苷酸序列與被測序的DNA分子的實際核苷酸序列至少大約 90 %同源，更典型地，至少大約95 %至至少大約99. 9 %相同。通過其它方法，包括本領(lǐng)域內(nèi) 公知的人工DNA測序方法，可對實際序列進(jìn)行更為精確的測定。也如本領(lǐng)域所已知的，測得的核苷酸序列中較之實際序列的單個插入或缺失將會導(dǎo)致核苷酸序列翻譯中的讀碼框位 移，使得從此類插入或缺失的點開始，測得的核苷酸序列編碼的預(yù)計氨基酸序列完全不同 于被測序的DNA分子實際編碼的氨基酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能鑒定出此類被錯誤鑒定的堿基，并且知道如何改正此類錯誤。根據(jù)本發(fā)明的核酸分子可以僅包含本發(fā)明提供的核酸序列(例如，SEQ ID NO=I 示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作為探針或引物的片段(例如SEQ ID N0:3或 SEQ ID NO 4)或編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的一部分的片段。從對SMS 44基因的克隆測定的 核苷酸序列允許產(chǎn)生被設(shè)計來鑒定和/或克隆SMS 44家族其它成員以及來自其它物種的 SMS44同源體的探針和引物。典型地，該探針/引物包含基本純化的寡核苷酸，其典型地包 含與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大約12或15個、優(yōu)選大約 18或20個、更優(yōu)選大約22或25個、進(jìn)一步更優(yōu)選大約30、35、40、45、50、55、60、65或75個 或更多個連續(xù)核苷酸雜交(優(yōu)選地，在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的核苷酸序列區(qū)域。這同樣 適用于SEQ ID NO 5或突變的SMS 44基因及其同源物。還可通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使用基于本文含有的序列信息設(shè)計的合成寡核 苷酸引物，分離出包含SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 5的核苷酸序列的全部或一部分的核酸 分子。可按照標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增技術(shù)，用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板，使用合適的寡 核苷酸引物，來擴(kuò)增本發(fā)明的核酸。由此擴(kuò)增的核酸可被克隆進(jìn)合適的載體，并通過DNA序 列分析加以表征。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段還可包含不編碼功能多肽的多核苷酸。此類多核苷 酸可作為探針或引物用于PCR反應(yīng)。不管其編碼功能或非功能多肽，根據(jù)本發(fā)明的核酸都可用作為雜交探針或聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物。不編碼具有SMS 44活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用途包括(1) 從cDNA文庫(例如來自除Gluconobacter oxydans外的其它生物)分離編碼本發(fā)明蛋白 的基因或其等位變體，以及(2)用于探測特定細(xì)胞中所述蛋白的mRNA的表達(dá)的Northern 印跡分析，或(3)用于增強(qiáng)和/或提高同源SMS 44基因在所述其它生物中的功能或活性?；诒疚奶峁┑暮塑账嵝蛄械奶结樋捎糜跈z測編碼同樣或同源蛋白(例如，其它 生物中的)的轉(zhuǎn)錄本或基因組序列?？苫谄渑c本文公開的G.xoydans SMS 44核酸的同 源性，使用G. oxydans DNA或其一部分作為雜交探針，按照標(biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)，優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn) 雜交條件下，分離出對應(yīng)于本發(fā)明的G.xoydans SMS 44 DNA的天然變體或非G. oxydans同 源體的核酸分子，它們也包括在本發(fā)明內(nèi)。這適用于如本文所述的野生型以及經(jīng)修飾的SMS 44 DNA0在優(yōu)選的實施方式中，探針還包含與其附著的標(biāo)記基團(tuán)，例如，標(biāo)記基團(tuán)可以是放 射性同位素、熒光化合物、酶或酶的輔助因子。例如，可使用基于本文教導(dǎo)的核苷酸序列設(shè)計的兩套簡并寡核苷酸引物庫，進(jìn)行 PCR來分離同源基因序列。用于反應(yīng)的模板可以是通過對從已知能表達(dá)或懷疑能表達(dá)根據(jù)本發(fā)明的多核苷 酸的菌株制備的mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA。PCR產(chǎn)物可被亞克隆及測序，以確保擴(kuò)增出 的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。
然后可通過多種已知方法，用PCR片段分離全長cDNA克隆。例如，可標(biāo)記擴(kuò)增出 的片段，用其篩選噬菌體或粘粒cDNA文庫?；蛘?，經(jīng)標(biāo)記的片段可用于篩選基因組文庫。PCR技術(shù)還可用于從其它生物分離全長cDNA。例如，可按照標(biāo)準(zhǔn)方案，從合適的細(xì) 胞或組織來源分離RNA?？稍赗NA上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，其中使用與擴(kuò)增片段的5’最末端具 有特異性的寡核苷酸引物，以引導(dǎo)第一鏈合成。然后可使用標(biāo)準(zhǔn)的末端轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)，對得到的RNA/DNA雜交體“加尾”(例如，用鳥 嘌呤)，可用RNaseH消化雜交體，然后可(例如，用poly-C引物)引導(dǎo)第二鏈合成。由此， 可容易地分離擴(kuò)增的片段上游的cDNA序列。關(guān)于有用的克隆策略的綜述，參見，例如上文 所述的Sambrook et al.禾口上文所述的Ausubel et al.。此外，編碼SMS 44家族其它成員、具有與根據(jù)SEQ ID NO=I的核苷酸序列不同的 核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。此外，編碼來自其它物種的SMS 44蛋白、具有與 SEQ ID NO :1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。所有這些 序列可隨后被用于本文定義的修飾。本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其可在嚴(yán)謹(jǐn)條件下(優(yōu)選地，高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下) 與本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQ ID NO :1或SEQ IDNO :5所示的多核苷酸)雜交。有利地， 此類多核苷酸可從能將給定的碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C的微生物(特別是Gluconobacter oxydans，優(yōu)選地，Gluconobacter oxydans IFO 3293)中獲得。能夠與 SEQ ID NO :5 中所 示多核苷酸雜交的多核苷酸序列可從G.oxydans DSM 17078中分離。本文中用到的術(shù)語“雜交”被用來描述雜交和洗滌，在所述雜交和洗滌條件下，典 型地，互相之間同源性為至少約50%、至少約60%、至少約70%、更優(yōu)選為至少約80%、進(jìn) 一步優(yōu)選為至少約85%到90%、最優(yōu)選為至少95%的核苷酸序列保持相互雜交的狀態(tài)。在一種實施方式中，本發(fā)明的核酸與SEQ ID NO =USEQ ID NO 5所示的核酸序列 或其互補序列至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、 92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 同源或更同源。此類嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的一個優(yōu)選的非限制的例子是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC) 中，大約45°C下雜交，隨后在lxSSC、0. 1% SDS中，50°C下進(jìn)行一次或多次洗滌，洗滌優(yōu)選在 55°C下，更優(yōu)選在60°C下，進(jìn)一步優(yōu)選在65°C下進(jìn)行。高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括使用經(jīng)標(biāo)記的DNA探針(例如，用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探 針)在42°C溫育數(shù)天(例如2-4天)，接著在2xSSC和0. 1 % SDS中于室溫下洗一次或多次， 以及在65-68°C，于0. 5xSSC和0. 1%SDS或0. IxSSC和0. 1 % SDS中洗一次或多次。特別地， 高度嚴(yán)謹(jǐn)條件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100 μ g/ml的鮭魚精DNA的DigEasyHyb 溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，或包含50% 甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三 鈉)、0. 02%十二烷基磺酸鈉、0. 1% N-月桂酰肌氨酸和2%封閉試劑(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，使用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探針(例如通過用RocheDiagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Germany的DIG標(biāo)記系統(tǒng)來制備的)在42°C溫育2小時至4天，接著在 2xSSC和0. 1 % SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68 °C，于0. 5xSSC 和0. SDS或0. IxSSC和0. 1% SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。優(yōu)選地，與本發(fā)明的核苷酸序列雜交(優(yōu)選在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交)的本發(fā)明的 經(jīng)分離的核酸對應(yīng)于天然存在的核酸分子。本文中使用的“天然存在的”核酸分子指具有天
18然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，編碼天然蛋白質(zhì))。在一種實施方式中，核 酸編碼天然的G. oxydans SMS 44蛋白。在例如G. oxydans DSM 17078的情況下，內(nèi)源SMS 蛋白對應(yīng)于本文所述的優(yōu)選的經(jīng)修飾的SMS 44蛋白。技術(shù)人員知道何種條件適合用于嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件及高度嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件。本領(lǐng)域中易 于獲得關(guān)于此類條件的其它指導(dǎo)，例如，在Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.；禾口Ausubel et al. (eds. ),1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.)中。當(dāng)然，僅與 poly (A)序列(例如mRNA的3，末端poly (A)區(qū))或僅與T (或U)殘基的互補性延伸區(qū)段 (stretch)雜交的多核苷酸將不會被包括在用于與本發(fā)明核酸的一部分特異性雜交的本發(fā) 明多核苷酸中，因為此類多核苷酸將與任何含有Poly(A)延伸區(qū)段的核酸分子或其互補序 列(例如，實際上是任何雙鏈的cDNA克隆)雜交。采用典型手段，可以對從其它生物，例如能將給定碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/或 2-KGA的微生物(特別是其它Gluconobacter物種)構(gòu)建的DNA文庫進(jìn)行篩選。例如,可以通過Southern禾口 /或Northern印跡分析來對Gluconobacter的菌株 進(jìn)行篩選。在探測到與本發(fā)明多核苷酸同源的轉(zhuǎn)錄本之后，可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，由分離自合適菌株的RNA來構(gòu)建cDNA文庫?；蛘?，可以使用能與本發(fā)明多核 苷酸雜交的探針來對全基因組DNA文庫進(jìn)行篩選。可使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)以及本文提供的序列信息，來分離本發(fā)明的核酸序 列，例如SEQ ID NO=USEQ ID NO :5所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn) 雜交和克隆技術(shù)(例如，Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，Ε· F.，和 Maniatis，Τ· Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor，NY，1989 所述)，使用 SEQ ID NO :1 或 SEQ ID NO: 5所示的核酸分子的全部或一部分作為雜交探針，分離根據(jù)本發(fā)明的核酸分子。此外，可通過標(biāo)準(zhǔn)合成技術(shù)(例如，使用自動DNA合成儀)來制備對應(yīng)于本發(fā)明的 核苷酸序列的寡核苷酸或可與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸。術(shù)語“同源性”或“相同性百分比”在本文中可互換使用。就本發(fā)明的目的而言， 在此定義為確定兩條氨基酸序列或兩條核酸序列的相同性百分比，本著最優(yōu)比較的目的 (例如，可以在第一條氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以與第二條氨基酸序列或核苷 酸序列達(dá)到最佳的比對)，對序列進(jìn)行比對。然后對相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基 酸殘基或核苷酸進(jìn)行比較。如果第一條序列上某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二條序列 上相應(yīng)位置的相同，那么這些分子在此位置就是相同的。兩條序列間的相同性百分比是所 述序列共有的相同位置的數(shù)量的函數(shù)(即，％相同性=相同位置的數(shù)量/位置(即重疊位 置)總數(shù)XlOO)。優(yōu)選地，這兩條序列長度相同。技術(shù)人員會知道有若干計算機(jī)程序可被用于確定兩條序列間的同源性。例如，可 以使用數(shù)學(xué)算法來完成對序列的比對和對兩條序列間相同性百分比的確定。在一種優(yōu)選 的實施方式中，使用 Needleman 和 Wunsch(J. Mol. Biol. (48) :444_453 (1970))算法來確定 兩條氨基酸序列間的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG軟件包(可從http://www. accelrys. com獲得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，缺口權(quán)重 為16、14、12、10、8、6或4，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。技術(shù)人員會意識到上述的所有不同參數(shù)將導(dǎo)致有細(xì)微區(qū)別的結(jié)果，但是使用不同算法時兩條序列的總體％相同性不會有顯 著改變。在又一種實施方式中，使用GCG軟件包(可從httD //www, accelrys. com獲得)的 GAP程序來確定兩條核苷酸序列間的相同性百分比，其中使用NWSgapdna. CMP矩陣，缺口權(quán) 重為40、50、60、70或80，長度權(quán)重為1、2、3、4、5或6。在另一種實施方式中，使用E. Meyers 和W.Miller(CABI0S，4 11-17 (1989))的算法來確定兩條氨基酸序列或核苷酸序列的相同 性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2. 0版)(可從httD://Vega. iRh. cnrs. fr/ bin/aliRn-Ruess. cgi獲得)中，其中使用PAM120權(quán)重殘基表，缺口長度懲罰(penalty)為 12，缺口懲罰為4。本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)序列可以進(jìn)一步地被用作“查詢序列”來進(jìn)行針對公眾數(shù) 據(jù)庫的搜索，例如，去鑒定相關(guān)序列或家族中其它成員?？梢允褂肁ltschuLet al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403-10的BLASTN和BLASTX程序(2. 0版)來進(jìn)行此類搜索。可以用 BLASTN程序，以分?jǐn)?shù)=100，字長(word length) = 12來進(jìn)行BLAST核苷酸搜索，以獲得 與本發(fā)明的核酸分子同源的核苷酸序列?？梢杂肂LASTX程序，以分?jǐn)?shù)=50，字長=3來 進(jìn)行BLAST蛋白質(zhì)搜索，以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。本著比較的目 的，為獲得有缺口的比對，可以利用 Altschul et al. , (1997)Nucleic Acids Res. 25(17) 3389-3402中描述的Gapped BLAST。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各個 程序(例如 BLASTX 和 BLASTN)的缺省參數(shù)。見 http //www, ncbi. nlm. nih. gov。在另一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子包含是本發(fā)明的核苷酸 序列(例如，SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :5所示的序列)的互補序列的核酸分子。與本文公 開的核苷酸序列互補的核酸分子是這樣的序列其與SEQ ID NO :1或SEQ ID N0:5所示的 核苷酸序列足夠互補，從而其可與所述核苷酸序列雜交，由此形成穩(wěn)定的雙鏈體(duplex)。本發(fā)明的另一方面涉及載體，所述載體含有編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸或其功能等 同物或一部分。在本文中使用的術(shù)語“載體”指能運送連接到其上的另一個核酸分子的核 酸分子。一種載體類型是“質(zhì)粒”，“質(zhì)?！敝腑h(huán)狀的雙鏈DNA環(huán)，另外的DNA片斷可以連接 到所述的環(huán)上。另一種載體的類型是病毒載體，其中，另外的DNA片斷可以連接到病毒基因 組中。某些載體能在其被引入的宿主細(xì)胞中進(jìn)行自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌的復(fù)制起點的 細(xì)菌載體)。其它載體在被引入宿主細(xì)胞之后就被整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組中，因此它們與 宿主基因組一同復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)可操作地連接到其上的基因的表達(dá)。此類載體在本文中被 稱為“表達(dá)載體”。一般而言，在重組DNA技術(shù)中用到的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒的形式。在本 文中術(shù)語“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因為質(zhì)粒是最常用到的載體形式。然而，本發(fā)明 也將包括其它形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺 伴隨病毒)，它們能提供等同的功能。本發(fā)明的重組表達(dá)載體包含本發(fā)明的核酸，所述核酸存在的形式適合于該核酸在 宿主細(xì)胞中的表達(dá)，這意味著該重組表達(dá)載體包括一段或多段調(diào)控序列，所述調(diào)控序列是 基于將用于表達(dá)的宿主細(xì)胞來選擇的，其被可操作地連接到將要表達(dá)的核酸序列上。在重 組表達(dá)載體中，“可操作地連接”被用來表示人們感興趣的核苷酸序列被連接到調(diào)控序列 上，所述的連接以允許該核苷酸序列表達(dá)(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中表達(dá)，或者當(dāng)載
20體被引入宿主細(xì)胞中時，在該宿主細(xì)胞中的表達(dá))的方式進(jìn)行。術(shù)語“調(diào)控序列”將包括啟 動子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel ；Gene Expression Technology :Methods inEnzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)中對此類 調(diào)控序列進(jìn)行了描述。調(diào)控序列包括在很多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型或誘導(dǎo) 型表達(dá)的調(diào)控序列，也包括僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列表達(dá)的調(diào)控序列(例如， 組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到，對表達(dá)載體的設(shè)計可能取決于以下因 素例如對將被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇，期望獲得的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。本發(fā)明的表達(dá) 載體可以被引入宿主細(xì)胞，由此生產(chǎn)本文所述的核酸編碼的蛋白質(zhì)或肽，其包括但不限于 本文所述的核酸編碼的突變體蛋白、其片段、其變體或功能等同物以及融合蛋白，例如，SMS 44蛋白、SMS 44蛋白的突變體形式、融合蛋白等，還包括本文提到的其它SMS蛋白。為了在合適的微生物中表達(dá)(經(jīng)修飾的)SMS 44蛋白，可對本發(fā)明的重組表達(dá)載 體加以設(shè)計。例如，根據(jù)本發(fā)明的蛋白可在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，例如，在屬于Gluconobacter、 Gluconacetobacter或Acetobacter屬的菌株中表達(dá)。在本發(fā)明中有用的表達(dá)載體包括源 自染色體、游離體和病毒的載體，例如源自細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體的載體和源自上述物質(zhì)的組合 的載體，例如源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件的載體，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。DNA插入應(yīng)當(dāng)被可操作地連接到合適的啟動子上，啟動子可以是組成型啟動子或 可誘導(dǎo)的啟動子。技術(shù)人員知道如何選擇合適的啟動子。表達(dá)構(gòu)建體可以含有用于轉(zhuǎn)錄起 始、終止的位點，還可在轉(zhuǎn)錄區(qū)域含有核糖體結(jié)合位點，以用于翻譯。由構(gòu)建體表達(dá)的成熟 轉(zhuǎn)錄本的編碼部分可優(yōu)選包括處于起點的起始密碼子，以及恰當(dāng)?shù)囟ㄎ挥诖g的多肽末 尾的終止密碼子?？赏ㄟ^傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入合適的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù) 語“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)橋聯(lián)(transconjugation) ”和“轉(zhuǎn)染”意指本領(lǐng)域內(nèi)已知的、用于將外源核酸 (例如DNA)引入到宿主細(xì)胞中的多種技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo) 的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子脂介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于對宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化和 轉(zhuǎn)染的合適方法可在Sambrook, et al.(上文所述的)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它實驗手冊中找到。為對已將外源DNA整合進(jìn)它們基因組的細(xì)胞進(jìn)行鑒定和選擇，通常，將編碼選擇 標(biāo)記(例如，對抗生素的抗性)的基因與感興趣的基因一起引入宿主細(xì)胞。優(yōu)選的選擇標(biāo) 記包括賦予對藥物(例如卡納霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素和鏈霉素)抗性的那些。編碼選擇 標(biāo)記的核酸優(yōu)選在與編碼根據(jù)本發(fā)明的蛋白的載體相同的載體上引入宿主細(xì)胞，或者其可 在單獨的載體上引入，該載體例如是自殺性載體，其不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制。可通過藥物選 擇鑒定出經(jīng)過引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，已合并有選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞將存活， 而其它細(xì)胞會死亡)。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的多肽，其具有SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列或可通過 在合適的宿主中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸(例如，SEQ IDNO :5所示的多核苷酸序列)獲得的
氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的多肽可僅含對SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列中一 個或多個氨基酸的保守取代，或?qū)Ψ顷P(guān)鍵氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非關(guān)鍵氨基酸 是SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :6所示的氨基酸序列中可被改變、且不會對生物功能造成實質(zhì)性影響的殘基。例如，在本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間保守的氨基酸殘基被預(yù)計為對改變特別不 敏感。此外，在根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)和其它SMS 44蛋白之間保守的氨基酸也對改變不太敏 感。在一個實施方式中，本發(fā)明涉及下述微生物，其含有經(jīng)突變的SMS44多肽，還包含 選自下組的多核苷酸或其互補鏈，所述組由以下組成(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來自微生物的基 因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID N0:17和SEQID NO 18的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例 如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(C)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或 衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守 取代，并且，所述片段或衍生物具有氧化還原酶[EC 1]的活性，優(yōu)選地具有L-山梨糖酮脫 氫酶的活性；(e)編碼氧化還原酶[EC 1]，優(yōu)選地編碼L-山梨糖酮脫氫酶的多核苷酸，且其互 補鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼氧化還原酶[EC 1]，優(yōu)選地編碼L-山梨糖酮脫氫酶的多核苷酸，且其與 (a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、90%或95%相同；構(gòu)成。在另一實施方式中，本發(fā)明涉及下述微生物，其含有經(jīng)突變的SMS44多肽，還包含 選自下組的多核苷酸或其互補鏈，所述組由以下組成(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO 10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO 9的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來自微生物的基 因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID N0:19和SEQID NO :20的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例 如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(C)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或 衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守 取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷 酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7]的多核 苷酸，且其互補鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7]多肽的 多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、 90%或95%相同；構(gòu)成。術(shù)語“保守取代”用于表示下述取代，其中，氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸 殘基所取代。這些家族是本領(lǐng)域已知的，其包括具有堿性側(cè)鏈(例如，賴氨酸、精氨酸和組 氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸、天冬酰
22胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、帶beta支鏈側(cè)鏈(例如，蘇氨酸、纈 氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)的氨基酸。如上所述，本發(fā)明的多核苷酸可用于對合適的宿主細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程改造，使其 在發(fā)酵中更好且更有效，例如，在對維生素C和/或2-KGA的直接發(fā)酵工藝中更好且更有 效。微生物基因組中的改變可例如通過單交叉重組或多交叉重組用含有改變的DNA 序列替換野生型DNA序列來進(jìn)行。為了能方便地選擇出基因組被改變的微生物轉(zhuǎn)化子，該 改變可以例如是編碼抗生素抗性基因的DNA序列，或者編碼補足微生物可能的營養(yǎng)缺陷型 的基因的DNA序列。突變可包括但不限于缺失-插入突變。還可通過下述方法獲得微生物基因組中導(dǎo)致功能更強(qiáng)的多肽的改變使用例如化 學(xué)誘變劑、輻射或轉(zhuǎn)座子對微生物基因組進(jìn)行隨機(jī)誘變，以及選擇或篩選出是一種或多種 發(fā)酵產(chǎn)物的更好的或更有效的生產(chǎn)菌株的突變體。用于篩選和選擇的標(biāo)準(zhǔn)方法是技術(shù)人員 已知的。用于SMS 44蛋白的上述誘變策略可導(dǎo)致想要的化合物(特別是維生素C和/或 2-KGA)的產(chǎn)率增加。這些策略的列出并不意味著限制；對這些誘變策略的變化對于本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員來說將是顯而易見的?？赏ㄟ^這些機(jī)制，用本發(fā)明的核酸和蛋白質(zhì)分子產(chǎn)生 出微生物，例如表達(dá)經(jīng)突變SMS 44核酸和蛋白分子的Gluconobacter oxydans或細(xì)菌的相 關(guān)菌株，使得對想要的化合物(例如維生素C和/或2-KGA)的生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/ 或產(chǎn)量被提高。本文所述的核酸分子、多肽、載體、引物和重組微生物可用于下述方法中的一種或 多種鑒定Gluconobacter oxydans以及相關(guān)的生物；繪制與Gluconobacter oxydans相 關(guān)的生物的基因組圖譜；對感興趣的Gluconobacter oxydans序列進(jìn)行鑒定和定位；進(jìn)化 研究；測定功能所需的SMS 44蛋白區(qū)域；調(diào)節(jié)SMS 44蛋白活性或功能；調(diào)節(jié)RCS途徑的活 性；以及調(diào)節(jié)對想要的化合物(例如，維生素C和/或2-KGA)的細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)。本發(fā)明提供了篩選能調(diào)節(jié)經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的SMS 44蛋白活性的分子的方法， 這種調(diào)節(jié)或者通過與蛋白本身或底物或SMS 44蛋白的結(jié)合伴侶的相互作用或者通過調(diào)節(jié) 本發(fā)明的SMS 44核酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯來實現(xiàn)。在此類方法中，將表達(dá)一種或多種本發(fā)明 的經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的SMS44蛋白的微生物與一種或多種測試化合物接觸，并評估每種測 試化合物對于各個SMS 44蛋白表達(dá)水平或活性的影響。本發(fā)明提供了通過直接發(fā)酵生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的工藝。具體地，本發(fā)明提 供了用于直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的工藝，包括將底物轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA。若干種底物可在本發(fā)明的工藝(即，用于將給定的底物直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/ 或2-KGA的工藝，例如上文提到的)中用作為碳源。特別適用的碳源是可以容易地從D-葡 萄糖或D-山梨糖醇代謝途徑獲得的那些，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山 梨糖酮、2-酮基-L-古洛糖酸鹽/酯、D-葡萄糖酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯，或 2，5-二酮基-葡萄糖酸鹽/酯。優(yōu)選地，底物選自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨 糖或L-山梨糖酮，最優(yōu)選地，選自D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮。在涉及使用微 生物進(jìn)行上述工藝時，術(shù)語“底物”和“生產(chǎn)底物”在本文中可互換使用。
在本文中用于使用微生物進(jìn)行的上述工藝的培養(yǎng)基可以是用于生產(chǎn)維生素C和/ 或2-KGA的任何合適的培養(yǎng)基。典型地，該培養(yǎng)基是包含例如鹽和(多種)底物，并具有一 定PH的水性培養(yǎng)基。其中底物被轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA的培養(yǎng)基也被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基。本文中使用的“發(fā)酵”或“生產(chǎn)”或“發(fā)酵工藝”可以是利用技術(shù)人員已知的培養(yǎng) 基、條件和方案，使用生長中的細(xì)胞或非生長中的所謂靜止細(xì)胞，這在適合于將合適的底物 轉(zhuǎn)化為想要的產(chǎn)物(例如維生素C)的條件下，使用技術(shù)人員已知的培養(yǎng)基、條件和方案對 所述靜止細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)之后進(jìn)行。優(yōu)選地，用靜止細(xì)胞來生產(chǎn)維生素C。用于生產(chǎn)維生素C 的這類方法的一個例子描述于WO 2005/017159中。優(yōu)選地，使用生長中的細(xì)胞，例如分批、 補料分批或連續(xù)模式培養(yǎng)的細(xì)胞來生產(chǎn)2-KGA (參閱例如EP 518136)。術(shù)語“直接發(fā)酵”、“直接生產(chǎn)”、“直接轉(zhuǎn)化”等意指微生物能通過一個或多個生物 轉(zhuǎn)化步驟將某底物轉(zhuǎn)化為特定的產(chǎn)物，而無需任何額外的化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。例如，術(shù)語“將 D-山梨糖醇直接轉(zhuǎn)化為維生素C”意在描述下述過程，其中，微生物生產(chǎn)維生素C，并且，其 中，D-山梨糖醇作為碳源提供，而無需中間產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化步驟。能直接發(fā)酵維生素C的單 種微生物是優(yōu)選的。在允許本文定義的從底物開始的此類轉(zhuǎn)化進(jìn)行的條件下培養(yǎng)所述微生 物。本文中使用的靜止細(xì)胞指下述微生物的細(xì)胞，所述微生物例如是存活但不能活 躍生長的，或者是以低的比生長速率生長的，例如，低于0. 021Γ1的生長速率，優(yōu)選地，低于 0. Oir10顯示出上述生長速率的細(xì)胞被稱為“靜止細(xì)胞模式”。如上所述使用微生物來進(jìn)行的本發(fā)明的工藝可以以不同的步驟或階段來進(jìn)行優(yōu) 選地，在第一個步驟(也被稱為步驟(a)或生長階段)中，于能夠生長的條件下對微生物進(jìn) 行培養(yǎng)。通過改變條件來終止該階段，其中，所述條件改變使得微生物的生長速率降低，導(dǎo) 致靜止細(xì)胞產(chǎn)生，這也被稱為步驟(b)，接著是用(b)的靜止細(xì)胞從底物來生產(chǎn)維生素C，這 也被稱為生產(chǎn)階段。使用微生物的上述工藝中進(jìn)行的生長階段和生產(chǎn)階段可在同樣的容器中進(jìn)行， 即，僅有一種容器，或在兩種或更多的不同容器中進(jìn)行，在兩個階段之間具有可選的分離步 驟。可通過任何合適的手段從細(xì)胞中回收得到產(chǎn)生的維生素C?！盎厥铡敝?，例如，可將維生 素C從生產(chǎn)培養(yǎng)基中分離出來?？蛇x地，可對由此產(chǎn)生的維生素C進(jìn)行進(jìn)一步加工。就關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“生長階段”、“生長步 驟”和“生長時期”在本文中可互換使用。這同樣適用于“生產(chǎn)階段”、“生產(chǎn)步驟”、“生產(chǎn)時 期”。進(jìn)行本發(fā)明的使用微生物的上述工藝的一種途徑可以是下述工藝，其中微生物 生長于第一容器(所謂的生長容器)中，它們作為靜止細(xì)胞的來源，細(xì)胞中的至少一部分被 轉(zhuǎn)移到第二容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。生產(chǎn)容器中的條件可以是使得從生長容器中轉(zhuǎn) 移出的細(xì)胞變?yōu)樯衔亩x的靜止細(xì)胞的條件。維生素C在第二容器中產(chǎn)生，并從其中被回 收。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，在一個方面，生長步驟可在水性培養(yǎng)基 中進(jìn)行，即，補充有用于在需氧條件下生長的合適營養(yǎng)物的生長培養(yǎng)基。培養(yǎng)可以以，例如， 分批、補料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式來進(jìn)行。培養(yǎng)時間可以例如隨所用的宿主、PH、溫度和營養(yǎng)培養(yǎng)基而變化，其可以為例如以分批或補料分批模式進(jìn)行時，大約10小時至大約10天 之間，優(yōu)選為大約1天至大約10天之間，更優(yōu)選地，大約1至大約5天，這取決于所述微生 物。如果細(xì)胞以連續(xù)模式被培養(yǎng)，駐留時間可以例如為大約2至大約100小時，優(yōu)選地，大 約2至大約50小時，這取決于所述微生物。如果微生物選自細(xì)菌，培養(yǎng)可進(jìn)行于大約3. 0至 大約9. 0的pH下，優(yōu)選為大約4. 0至大約9. 0，更優(yōu)選地，大約4. 0至大約8. 0，進(jìn)一步更優(yōu) 選地，大約5. 0至大約8. 0。如果使用了藻類或酵母，培養(yǎng)可進(jìn)行于低于大約7. 0的pH下， 優(yōu)選低于大約6. 0，更優(yōu)選低于大約5. 5，最優(yōu)選地，低于大約5. 0。用于使用細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng) 的合適的溫度范圍可以為，例如，大約13°C至大約40°C，優(yōu)選地，大約18°C至大約37°C，更 優(yōu)選地，大約13°C至大約36°C，最優(yōu)選地，大約18°C至大約33°C。如果使用藻類或酵母，用 于進(jìn)行培養(yǎng)的合適的溫度范圍可以例如為，大約15°C至大約40°C，優(yōu)選地，大約20°C至大 約45°C，更優(yōu)選地，大約25°C至大約40°C，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約25°C至大約38°C，最優(yōu)選 地，大約30°C至大約38°C。用于進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基通?？梢院邢率鰻I養(yǎng)物作為可被吸收 的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、 肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖和乙醇，優(yōu)選地，L-山梨糖、D-葡萄糖、 D-山梨糖醇、D-甘露醇、甘油和乙醇；以及含有可消化的氮源，例如，有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白 胨、酵母提取物和氨基酸。所述培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或面 包酵母。多種無機(jī)物質(zhì)也可被用作為氮源，例如，硝酸鹽和銨鹽。此外，生長培養(yǎng)基通常含 有無機(jī)鹽，例如，硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和碳酸鈣。然后可在與上文所述大致相同的模式、 溫度和PH條件下，存在例如D-山梨糖醇、L-山梨糖或D-葡萄糖等底物時，進(jìn)一步溫育使 用上述方案獲得的細(xì)胞，以使得所述細(xì)胞將底物直接轉(zhuǎn)化為維生素C和/或2-KGA。溫育可 在富含氮的培養(yǎng)基中進(jìn)行，培養(yǎng)基中含有，例如，有機(jī)氮源，例如，蛋白胨、酵母提取物、面包 酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液，或無機(jī)氮源，例如硝酸鹽和銨鹽，這種情況下，細(xì)胞將能 夠在產(chǎn)生維生素C和/或2-KGA的同時進(jìn)一步生長?；蛘撸瑴赜稍诘毞Φ呐囵B(yǎng)基中進(jìn) 行，在這種情況下，細(xì)胞將基本不生長，其將處于靜止細(xì)胞模式，或生物轉(zhuǎn)化模式。在所有情 況下，溫育培養(yǎng)基還可含有無機(jī)鹽，例如硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀和氯化鈣。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，在生長階段中，比生長速率例如為至少 0. 021Γ1。對于以分批、補料分批或半連續(xù)模式生長的細(xì)胞而言，生長速率取決于，例如，生長 培養(yǎng)基的組成、pH、溫度等。通常，生長速率可以例如在大約0.05至大約OJtT1的范圍內(nèi)， 優(yōu)選地，在大約0. 06至大約0. 151Γ1的范圍內(nèi)，最優(yōu)選地，在大約0. 07至大約0. 131Γ1的范 圍內(nèi)。在使用微生物進(jìn)行的上述方法的另一個方面，可通過在瓊脂平板(作為生長容 器)上對個別微生物進(jìn)行培養(yǎng)來提供靜止細(xì)胞，其中使用了基本上相同的條件，例如，如上 所述的培養(yǎng)時間、PH、溫度、營養(yǎng)培養(yǎng)基，并添加有瓊脂。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，如果生長和生產(chǎn)階段進(jìn)行于兩種不同的容器 中，那么來自生長階段的細(xì)胞可被收獲或濃縮，并轉(zhuǎn)移至第二容器(所謂的生產(chǎn)容器)中。 該容器可以含有補充有任何適用的生產(chǎn)底物(可通過細(xì)胞被轉(zhuǎn)化為維生素C)的水性培養(yǎng) 基?？赏ㄟ^任何合適的操作來收獲或濃縮來自生長容器的細(xì)胞，所述操作例如，離心、膜橫 流(membrane crossflow)超濾或微濾、過濾、傾析、絮凝。由此獲得的細(xì)胞還可以以原始培 養(yǎng)液的形式從生長容器轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器中，而不用被收獲、濃縮或洗滌，即，以細(xì)胞懸浮液的形式被轉(zhuǎn)移。在一種優(yōu)選的實施方式中，細(xì)胞以細(xì)胞懸浮液的形式從生長容器被轉(zhuǎn)移至 生產(chǎn)容器，在它們之間沒有任何洗滌或分離步驟。因此，在使用微生物進(jìn)行的上述工藝的一種優(yōu)選的實施方式中，上文所述的本發(fā) 明方法的步驟(a)和(c)不被任何洗滌和/或分離步驟分開。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，如果生長和生產(chǎn)階段進(jìn)行于同樣的容器中， 細(xì)胞可以生長于適當(dāng)?shù)臈l件下，以達(dá)到理想的細(xì)胞密度，接著用含有生產(chǎn)底物的生產(chǎn)培養(yǎng) 基來替換生長培養(yǎng)基。此類替換可以例如是，在從容器中收回或收獲上清液的同時，并以與 之相同的速度，將生產(chǎn)培養(yǎng)基補入到容器中。為將靜止細(xì)胞保留于容器中，可以使用用于細(xì) 胞回收或駐留的操作，例如，細(xì)胞回收步驟。此類回收步驟，例如包括但不限于如下的方法 使用離心機(jī)、過濾器、超濾步驟的膜橫流微濾、膜反應(yīng)器、絮凝或在合適的多孔、非多孔或聚 合物基質(zhì)上的細(xì)胞固定。在轉(zhuǎn)移階段之后，對容器應(yīng)用下述工藝條件在此條件下，細(xì)胞以 如上文定義的靜止細(xì)胞模式存在，并且，生產(chǎn)底物能有效地轉(zhuǎn)化為維生素C。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，用于生產(chǎn)步驟中的生產(chǎn)容器中的水性培養(yǎng)基 在下文中被稱為生產(chǎn)培養(yǎng)基，其可以僅含有將被轉(zhuǎn)化為維生素C的生產(chǎn)底物，或可以含有 額外的無機(jī)鹽，例如，氯化鈉、氯化鈣、硫酸鎂、硫酸錳、磷酸鉀、磷酸鈣和碳酸鈣。生產(chǎn)培養(yǎng) 基還可以含有可消化的氮源，例如有機(jī)物質(zhì)，例如，蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉 米浸出液；以及無機(jī)物質(zhì)，例如，氨、硫酸銨和硝酸鈉，其濃度為使得細(xì)胞被保持為上文定義 的靜止細(xì)胞模式的濃度。培養(yǎng)基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。 生產(chǎn)步驟可以，例如，以分批、補料分批、半連續(xù)或連續(xù)模式進(jìn)行。在補料分批、半連續(xù)或連 續(xù)模式下，來自生長容器和生產(chǎn)培養(yǎng)基的兩種細(xì)胞都可以以合適的補料速率被連續(xù)或間歇 地補入到生產(chǎn)容器中?；蛘?，僅生產(chǎn)培養(yǎng)基可被連續(xù)或間歇補入到生產(chǎn)容器中，而來自生長 容器的細(xì)胞被同時轉(zhuǎn)移至生產(chǎn)容器。來自生長容器的細(xì)胞可在生產(chǎn)容器中用作為細(xì)胞懸浮 液，或者可被用作為例如，在任何固相(例如，多孔或聚合物基質(zhì))上絮凝或固定的細(xì)胞。 生長時期被定義為從底物進(jìn)入到生產(chǎn)容器中開始，到收獲含有維生素C的上清液(即所謂 的收獲流)之間的時期，該時期可根據(jù)，例如，使用的細(xì)胞的濃度和種類、PH、溫度和營養(yǎng)培 養(yǎng)基而變動，其優(yōu)選在大約2至大約100小時之間。pH和溫度可與生長步驟中的pH和溫度 不同，但應(yīng)與生長步驟中的基本上相同。在使用微生物進(jìn)行上述工藝的一種優(yōu)選的實施方式中，生產(chǎn)步驟可以以連續(xù)模式 進(jìn)行，這意味著，含有來自生長容器的細(xì)胞的第一種補料流和含有底物的第二種補料流被 連續(xù)或間歇補入到生產(chǎn)容器中。第一種流可以僅含有從生長培養(yǎng)基中分離/分開的細(xì)胞， 或可以含有直接來自生長步驟的細(xì)胞懸浮液，即，懸浮于生長培養(yǎng)基中的細(xì)胞，而沒有任何 中間的細(xì)胞分離、洗滌和/或分離步驟。在本文中定義的第二種補料流可以包括生產(chǎn)步驟 的操作所需要的所有其它補料流，例如，以一種或多種不同的流的形式存在的包含底物的 生產(chǎn)培養(yǎng)基、用于稀釋的水以及用于控制pH的堿。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，當(dāng)兩種流都連續(xù)補料時，第一種流的補 料速率與第二種流的補料速率之比可在大約0. 01至大約10之間變動，優(yōu)選地，在大約0. 01 至大約5之間變動，最優(yōu)選地，在大約0. 02至大約2之間變動。該比例取決于第一種和第 二種流中各自的細(xì)胞和底物的濃度。進(jìn)行本發(fā)明的使用微生物的上述工藝的另一種途徑可以是在生長容器中使用一
26定細(xì)胞密度的靜止細(xì)胞的工藝。通過技術(shù)人員已知的方法，于600nm處，細(xì)胞密度作為吸收 單位(光學(xué)密度)被測得。在一種優(yōu)選的實施方式中，生產(chǎn)步驟中的細(xì)胞密度為至少大約 10，更優(yōu)選地，大約10至大約200之間，進(jìn)一步更優(yōu)選地，大約15至大約200之間，進(jìn)一步 更優(yōu)選地，大約15至大約120之間，最優(yōu)選地，大約20至大約120之間。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，為在生產(chǎn)階段期間(例如，以連續(xù)或半 連續(xù)模式進(jìn)行的)，以想要的細(xì)胞密度將細(xì)胞保持于生產(chǎn)容器中，本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何手段 都可以使用，例如，通過離心、過濾、微濾的膜橫流超濾、傾析、絮凝進(jìn)行的細(xì)胞再利用，通過 膜設(shè)備進(jìn)行的細(xì)胞駐留，或細(xì)胞固定。此外，在生產(chǎn)步驟以連續(xù)或半連續(xù)模式進(jìn)行的情況 下，從生長容器中連續(xù)或間歇補入細(xì)胞，生產(chǎn)容器中的細(xì)胞密度可被保持于恒定的水平，這 例如，通過從生產(chǎn)容器中收獲一定量的細(xì)胞來進(jìn)行，所述的量對應(yīng)于從生長容器中補入的 細(xì)胞的量。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的方面，從生產(chǎn)容器中回收/收獲在所謂的收獲 流中含有的產(chǎn)生出的維生素C。收獲流可以包括，例如，來自生產(chǎn)容器的不含細(xì)胞的水溶液 或含有細(xì)胞的水溶液，其中含有通過生產(chǎn)容器中的靜止細(xì)胞從生產(chǎn)底物轉(zhuǎn)化得到的維生素 C?？赏ㄟ^本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何操作，將仍處于收獲流中的細(xì)胞與維生素C分開，例如，過 濾、離心、傾析、膜橫流超濾或微濾、切線流超濾或微濾或死端(dead end)過濾。在該細(xì)胞 分離操作之后，收獲流中基本不含細(xì)胞。在關(guān)于使用微生物進(jìn)行上述工藝的一個方面，本發(fā)明的工藝導(dǎo)致維生素C的產(chǎn)率 通常為至少約高于 5. 7g/l，例如，10g/l、20g/l、50g/l、100g/l、200g/l、300g/l、400g/l 或 者超過600g/l。在一種實施方式中，通過本發(fā)明的工藝生產(chǎn)的維生素C的產(chǎn)率在大約高于 5. 7g/l至大約600g/l的范圍內(nèi)。維生素C的產(chǎn)率指直接來自生產(chǎn)容器的收獲流(即包含 維生素C的不含細(xì)胞上清液)中維生素C的濃度。在一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的方法，其中， 將根據(jù)本發(fā)明的核苷酸或上文所述的經(jīng)修飾多核苷酸序列引入如本文所述合適的微生物， 在允許以高生產(chǎn)能力、產(chǎn)率和/或效率生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的條件下培養(yǎng)重組微生 物，從培養(yǎng)基中分離產(chǎn)生的發(fā)酵產(chǎn)物，以及可選地，進(jìn)一步純化。在本發(fā)明的一個方面，提供了能從合適的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山 梨糖)直接生產(chǎn)維生素C的微生物(特別是Gluconobacter、Gluconacetobacter和 Acetobacter屬的)。當(dāng)例如以靜止細(xì)胞方法在20小時的溫育期之后測量時，發(fā)現(xiàn)這些生 物能以分別高至280mg/l和670mg/l的水平從D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生產(chǎn)維生素C。 在本發(fā)明的另一個方面，提供了下述微生物，當(dāng)從D-山梨糖醇起始時，其能以300mg/l或更 多的量直接生產(chǎn)維生素C，或者當(dāng)從L-山梨糖起始時，其能以800mg/l或更多的量直接生產(chǎn) 維生素C，所述的量是例如以靜止細(xì)胞方法在20小時的溫育期之后測量的。這可以通過增 加SMS多肽(優(yōu)選地，SMS 44多肽)的活性來獲得。從D-山梨糖醇產(chǎn)生的維生素C的產(chǎn) 率甚至可以高達(dá)400、600、1000mg/l，或者甚至超過1. 5、2、4、10、20、50g/l。從L-山梨糖產(chǎn) 生的維生素C的產(chǎn)率甚至可以高達(dá)1000mg/l，或者甚至超過1.5、2、4、10、20、50g/l。優(yōu)選 地，維生素C的這些量可以是例如以靜止細(xì)胞方法在20小時的溫育期之后測量獲得的。本文中使用的以“靜止細(xì)胞方法”進(jìn)行的測量包括(i)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的任何方法培養(yǎng)細(xì)胞，(ii)從生長培養(yǎng)基收獲細(xì)胞，以及(iii)在含有將被轉(zhuǎn)化為想要的產(chǎn)物(例如維生素C)的培養(yǎng)基中，于其中細(xì)胞不再生長的條件下，溫育收獲的細(xì)胞(即，在 該所謂的轉(zhuǎn)化步驟期間，生物質(zhì)沒有量上的增加)。靜止細(xì)胞方法的更一般的說明描述于例 如TO 2005/017159和之前的段落中。在本發(fā)明的一個方面中，提供了能夠從合適的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山 梨糖)直接生產(chǎn)2-KGA的微生物(尤其是來自Gluconobacter、Gluconacetobacter和 Acetobacter屬)。例如通過實施例6的方法測量時，發(fā)現(xiàn)這些生物能夠以約至少500mg/ 1，例如約至少700、900、1000、2000mg/l，優(yōu)選地約0. 5到約0. 7g/l的量從D-山梨糖醇或 L-山梨糖直接生產(chǎn)2-KGA。在本發(fā)明的另一方面中，提供了從L-山梨糖開始時能夠以約7、 8、9、10g/l或更多或甚至約50、60、70、80、90、100g/l的量直接生產(chǎn)2-KGA的微生物。這可 通過提高本文所述各個微生物中SMS多肽(優(yōu)選地為SMS 44多肽)的活性來實現(xiàn)。攜帶有例如經(jīng)修飾的SMS 44基因并且能以顯著更高的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和/或效率 生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)物的重組微生物可在上文所述的需氧條件下被培養(yǎng)于補充有合適營養(yǎng)物的水 性培養(yǎng)基中。在另一個方面，本發(fā)明的工藝可組合有將產(chǎn)生的維生素C和/或2-KGA與收獲流 中含有的其它組分分離和/或純化的額外步驟，即，所謂的下游加工步驟。這些步驟可包括 技術(shù)人員已知的任何手段，例如，濃縮、結(jié)晶、沉淀、吸附、離子交換、電滲析、兩極膜電滲析 和/或反滲透。維生素C可作為游離酸形式或其已知的任何鹽的形式被進(jìn)一步純化，這是 通過下述操作手段來進(jìn)行的，例如，用活性炭進(jìn)行處理、離子交換、吸附和洗脫、濃縮、結(jié)晶、 過濾和干燥。特別地，將維生素C與收獲流中其它組分的第一次分離可通過例如下述方法 的任何合適的組合或重復(fù)來進(jìn)行，所述方法例如兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析、兩極膜電滲析、 反滲透或吸附(其進(jìn)行于，例如，離子交換樹脂上或非離子樹脂上)。如果獲得的維生素C 的形式為L-抗壞血酸的鹽，將該鹽形式轉(zhuǎn)化為游離酸形式可通過例如，兩極膜電滲析、離 子交換、模擬移動床色譜技術(shù)等來進(jìn)行。上述步驟的組合也可使用，例如，將電滲析和兩極 膜電滲析組合為一個步驟，以及使用模擬移動床色譜方法的多個離子交換步驟的組合。上 述任何方案單獨或組合就構(gòu)成了用于分離和純化產(chǎn)物(即維生素C)的方便的手段。由此 獲得的產(chǎn)物還可被進(jìn)一步分離(例如，通過濃縮、結(jié)晶、沉淀、對晶體的洗滌和干燥的方式 來進(jìn)行)和/或進(jìn)一步純化(用活性炭處理、離子交換和/或重結(jié)晶)。在一種優(yōu)選的實施方式中，通過一系列上述下游加工步驟來從收獲流中純化維生 素C，而不必在該加工中的任何時刻將其轉(zhuǎn)移到非水性溶液中，S卩，所有步驟都在水性環(huán)境 中進(jìn)行。此類優(yōu)選的下游加工方案可以包括，例如，通過兩區(qū)室或三區(qū)室電滲析對來自生產(chǎn) 容器的收獲流進(jìn)行濃縮，通過兩極膜電滲析和/或離子交換將濃縮溶液中以其鹽的形式存 在的維生素C轉(zhuǎn)化為其酸的形式，通過例如用活性炭、離子交換或非離子樹脂進(jìn)行處理等 方法來進(jìn)行純化，接著進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮步驟和結(jié)晶。這些晶體可被分離、洗滌和干燥。如 果必要的話，晶體還可被重新溶解于水中，用活性炭和/或離子交換樹脂對其進(jìn)行處理，并 重結(jié)晶。然后可對上述晶體進(jìn)行分離、洗滌和干燥。在一個尤其優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的工 藝，其中使用本文所述底物之一在靜止細(xì)胞條件下溫育如本文所述的重組G. oxydans菌株 (尤其是G. oxydans DSM 17078)，尤其是使用2% D-山梨糖醇在30°C和220rpm下溫育20 小時，并且其中關(guān)于下述(1)和(2)對所述菌株進(jìn)行遺傳修飾，所述(1)為優(yōu)選地在高度嚴(yán)
28謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :9(SMS 43基因)所示序列雜交的核苷酸序列編碼的SMS 43多肽， (2)為優(yōu)選地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :7(sndhai基因)所示序列雜交的核苷酸序 列編碼的本文所述的SNDHai多肽，并且其中所述修飾導(dǎo)致各個基因的提高的活性。如果如 本文所述使用除G. oxydans DSM17078之外的其它菌株例如G. oxydans IFO 3293，則所述重 組菌株優(yōu)選地在優(yōu)選地在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與SEQ ID NO :1中所示序列雜交的核苷酸序列編 碼的如本文所述的SMS 44多肽中帶有突變，尤其是位于對應(yīng)于SEQ IDNO :2第563位的氨 基酸位置上的突變，優(yōu)選地是用1563置換T563。從上述描述中可顯而易見根據(jù)本發(fā)明的方法的發(fā)酵產(chǎn)物可不僅限于維生素C。 本文中使用的“想要的化合物”或“發(fā)酵產(chǎn)物”可以是Gluconobacter oxydans的任何天然 產(chǎn)物，其包括生物合成途徑的終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物，例如，L-山梨糖、L-山梨糖酮、D-葡萄糖 酸鹽/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯、5-酮基-D-葡萄糖酸鹽/酯、2，5- 二酮基-葡萄糖 酸鹽/酯和2-酮基-L-古洛糖酸鹽/酯(2-KGA)，特別是對維生素C的生物合成生產(chǎn)。因此，本發(fā)明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、載體、引物和重組微生物在生產(chǎn)維 生素C(即將碳源直接轉(zhuǎn)化為維生素C)中的用途。在一種優(yōu)選的實施方式中，本文所述的 經(jīng)修飾的多核苷酸、多肽、載體和重組微生物用于提高對維生素C生產(chǎn)的產(chǎn)率、生產(chǎn)能力和 /或效率。術(shù)語“產(chǎn)量”或“生產(chǎn)能力”是本領(lǐng)域已知的，其包括給定的時間和給定的發(fā)酵體 積中形成的發(fā)酵產(chǎn)物(例如維生素C)的濃度(例如，每升每小時的kg產(chǎn)物)。術(shù)語“生產(chǎn) 效率”包括獲得的特定水平的生產(chǎn)所需要的時間(例如，細(xì)胞達(dá)到發(fā)酵產(chǎn)物的特定速率輸 出所需時間有多長)。術(shù)語“產(chǎn)率”是本領(lǐng)域已知的，其包括碳源向產(chǎn)物(例如，維生素C) 轉(zhuǎn)化的效率。這通常寫作，例如，kg產(chǎn)物/kg碳源?！霸黾印被衔锏摹爱a(chǎn)率和/或產(chǎn)量和 /或生產(chǎn)能力”表示，給定的時間中給定量的培養(yǎng)物中回收的該化合物分子或回收的該化合 物有用分子的量增加。術(shù)語“生物合成”或“生物合成途徑”是本領(lǐng)域已知的，其包括通過 細(xì)胞，以可能是多步驟且被高度調(diào)控的過程，從中間產(chǎn)物化合物對化合物(優(yōu)選地，有機(jī)化 合物)的合成。措辭“代謝”是本領(lǐng)域已知的，其包括對生物中發(fā)生的生化反應(yīng)的總稱。然 后，特定化合物的代謝(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代謝)包含細(xì)胞中與該化合物相關(guān) 的總的生物合成、修飾和降解途徑。措辭“轉(zhuǎn)運”或“運入”是本領(lǐng)域已知的，其包括一種或 多種分子在協(xié)助下移動經(jīng)過該分子本來不能經(jīng)過或不能高效經(jīng)過的細(xì)胞膜。本文中使用的維生素C可以是水溶液中發(fā)現(xiàn)的L-抗壞血酸的任何化學(xué)形式，例如 未離解的、以其游離酸形式存在的或離解為陰離子的。L-抗壞血酸的溶解的鹽形式的特征 為在通常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵上清液中的任何種類的陽離子(例如，鉀、鈉、銨或鈣)存在時的陰 離子。還包括在內(nèi)的可以有L-抗壞血酸的游離酸形式的經(jīng)過分離的晶體。另一方面，用其 相應(yīng)的鹽的名稱來命名L-抗壞血酸的鹽形式的經(jīng)過分離的晶體，即抗壞血酸鈉、抗壞血酸 鉀、抗壞血酸鈣等。在本文中使用時，2-KGA可以是存在于水性溶液中的2-酮古洛酸的任何化學(xué)形 式，例如未解離的形式、游離酸形式或解離的離子形式。2-酮古洛酸的溶解鹽形式可以被表 征為存在發(fā)酵上清液中通常存在的任何種類陽離子(例如鉀、鈉或鈣)時的陰離子。還可 包括在內(nèi)的是游離酸形式2-酮古洛酸的經(jīng)分離的結(jié)晶。另一方面，鹽形式2-酮古洛酸的 經(jīng)分離的結(jié)晶通過它們相應(yīng)鹽的名稱來命名，即2-酮古洛酸鈉、2-酮古洛酸鉀、2-酮古洛酸鈣等等。本發(fā)明的有利的實施方式通過從屬權(quán)利要求而顯而易見。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本 領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本發(fā)明的上述和其它方面以及上述和其它實施方式。將通過下述實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，所述實施例不應(yīng)被理解為起限制作用。本 文提到的所有參考文獻(xiàn)、專利申請、專利和公開的專利申請(尤其是WO 2005/017159、WO 2006/084719和EP 518136)的內(nèi)容都通過引用并入本文。實施例1制備染餼體SMS 44 DNA以及通過PCR擴(kuò)增DNA片段在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)和3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)構(gòu) 成的液體甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)中，于30°C對Gluconobacter oxydans IFO 3293的細(xì)胞 進(jìn)行一天的培養(yǎng)，通過 Sambrook 等(1989)" Molecular Cloning :A Laboratory Manual/ Second Edition" ， ColdSpring Harbor Laboratory Press fffi^^iTj^, JA^n^f^MMM 備 Gluconobacter oxydans IFO 3293 的染色體 DNA。使用按照上文所述制備的染色體DNA以及一組引物——Pf (SEQ IDNO 3)和 Pr (SEQ ID NO :4)，通過PCR來制備DNA片段。按照廠商說明書，用Expand High Fidelity PCR試劑盒(Roche Diagnostics)和IOng染色體DNA以10 μ 1的總體積來進(jìn)行反應(yīng)，獲得 了含有SMS 44 DNA序列(SEQ ID NO 1)的PCR產(chǎn)物。從反應(yīng)體系中回收PCR產(chǎn)物，并驗證 了其正確序列。實施例2 在其它牛物中鑒定和克降SMS 44基因和等同物可通過簡單的DNA雜交實驗來測定其它生物(而非本文前面公開的那些，例如表 1中提到的生物)中SEQ ID NO :1和/或等同物的存在。在含有5g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l葡萄糖、5g/ 1甘露糖醇、lg/1 MgSO4 · 7H20、5ml/l乙醇和15g/l瓊脂的No. 350培養(yǎng)基上，于27°C，對 菌株 Acetobacter aceti subsp. xylinum IF013693 和 IFO 13773 進(jìn)行 3 天的培養(yǎng)。在 含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)、3g/l細(xì)菌蛋白胨(Difco)和18g/l瓊 脂(Difco)的甘露糖醇培養(yǎng)基(MB)型瓊脂培養(yǎng)基上，于27°C，對所有其它Acetobacter、 Gluconacetobacter菌株禾口所有Gluconobacter菌株進(jìn)行3天的培養(yǎng)。在Luria Broth瓊 脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)E. coli K-12。在廠商推薦的培養(yǎng)基上或者按照本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)其 它菌株。按照例如 Sambrook et al, 1989, ‘‘ Molecular Cloning :A Laboratory Manual/ Second Edition" ,Cold SpringHarbor Laboratory Press 所述，從合適的生物(例如表 1 提到的)提取基因組DNA。用限制性酶EcoRI或HindIII消化基因組DNA制備物，通過瓊脂糖凝膠電泳(1% 瓊脂糖)分離出IygW DNA片段。用0. 25 N HCl對凝膠進(jìn)行15分鐘的處理，接著再用 0.5 N NaOH處理30分鐘，然后按照廠商說明書，用Vacuum Blotter Model 785 (BIO-RAD Laboratories AG, Switzerland)將凝膠印到硝酸纖維素或尼龍膜上。然后用得到的印跡 與含有探針(例如具有SEQ ID NO :1序列的DNA片段，或含有SEQ IDNO :1序列的部分或全 部的DNA片段)的溶液接觸或雜交，以從測試生物中探測陽性DNA片段。按照實施例1，用 PCR-DIG 標(biāo)記試劑盒(RocheDiagnostics)和引物組 SEQ ID NO 3 禾口 SEQ ID NO :4 來制備 DIG標(biāo)記的探針，例如SEQ ID NO :1。此印跡雜交結(jié)果示于表1中。雜交在嚴(yán)謹(jǐn)條件或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。在嚴(yán)謹(jǐn)條件下的雜交是在6x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，大約45°C下進(jìn)行，隨后在lxSSC、0. 1% SDS中，50°C下至少洗滌一次，其 中洗滌溫度可以高達(dá)約55°C，甚至高達(dá)約60°C或65°C。高度嚴(yán)格條件下的雜交在含或不含 100 μ g/ml 的鮭魚精 DNA 的 DigEasyHyb 溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，或包含 50% 甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、0. 02%十二烷基磺酸鈉、0. N-月桂酰 肌氨酸和2%封閉試劑(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，于42°C溫育2小時至4天， 接著在2xSSC和0. SDS中，于室溫下，洗兩次膜，每次5至15分鐘，然后在65-68°C，于 0. 5xSSC和0. 1% SDS或0. IxSSC和0. 1% SDS中洗兩次，每次15-30分鐘。為檢測出與探 針DNA具有較低相同性的DNA片段，最后的洗滌步驟可在較低溫度(例如50-65°C)進(jìn)行較 短的洗滌時間(例如1-15分鐘)。此實驗的結(jié)果如表1 (信號1)所示。可通過本領(lǐng)域公知的PCR方法，對表1所示各生物中陽性信號對應(yīng)的基因加以克 隆，這使用此生物的基因組DNA與合適的引物組(例如，SEQ ID NO :3和SEQ ID NO 4)在 實施例1所述條件下進(jìn)行，或者按照這樣進(jìn)行每個反應(yīng)使用5至IOOng基因組DNA (總體 積 50μ1)。使用 Expand High Fidelity PCR 系統(tǒng)(Roche Diagnostics)，采用下述反應(yīng) 條件94°C 2分鐘；30個循環(huán)的⑴94°C 15秒的變性步驟，(ii)60°C 30秒的退火步驟， (iii)72°C 0.5至5分鐘(取決于目標(biāo)DNA長度，1分鐘/lkb)的合成步驟；72°C延伸7分 鐘。此實驗的結(jié)果如表1 (信號2)所示。或者，用簡并引物來進(jìn)行PCR，對簡并引物的設(shè)計可基于SEQ IDNO 2或基于作為 共有序列的氨基酸序列(通過對由序列搜索程序(例如BLASTP，或當(dāng)核苷酸序列被用作“查 詢序列”時，BLASTX)獲得的若干氨基酸序列進(jìn)行比對選出的)，以找到與SEQ ID NO 2的 蛋白相似的蛋白。對使用簡并引物進(jìn)行的PCR而言，第二個退火步驟的溫度(見上文)被 降低至55°C，或者甚至50-45°C。此實驗的結(jié)果如表1(信號3)所示。通過瓊脂糖凝膠電泳來分離PCR反應(yīng)的樣品，在用例如溴化乙啶染色后，用透照 器(transilluminator)來觀察條帶，從凝膠對條帶進(jìn)行分離，驗證正確的序列。表1 其它生物中SMS 44基因的等同物。
信號1 在使用不同菌株的基因組DNA，用SEQ ID NO 1作為經(jīng)標(biāo)記探針進(jìn)行的印 跡雜交試驗上對DNA的探測。信號2 使用引物對SEQID NO 3和SEQ ID NO 4在PCR反應(yīng) 中對不同菌株DNA的探測。信號3 使用簡并引物進(jìn)行的PCR反應(yīng)中對不同菌株DNA的探 測。更多解釋參見文本。實施例3 構(gòu)律帶有經(jīng)突奪的SMS 44某因或其等同物的菌株使用根據(jù)表1的其它菌株例如G. oxydans IFO 3293時，如下進(jìn)行導(dǎo)致用1563 置換T563的SMS 44多肽的突變通過使用PCR和各自引物組PrSMS44(SEQ ID NO 3)/ PfSMS44 (SEQ ID NO 4)從G. oxydans DSM17078中擴(kuò)增經(jīng)修飾的SMS 44基因來實現(xiàn)菌株的 構(gòu)建，其中野生型SMS44基因被突變的SMS 44基因置換。將擴(kuò)增產(chǎn)物與抗生素盒連接，使 得可以用PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化含有野生型SMS 44基因的菌株(例如G. oxydans IF03293菌株)， 并通過涂布在所述抗生素盒抗性的抗生素的培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇。通過測定序列來測試突變 的驗證。實施例4 構(gòu)津帶有經(jīng)突變的SMS 44基因并目.過表汰SNDHai基因或其等同物的 菌株根據(jù)TO 2006/084719的實施例10，構(gòu)建過表達(dá)編碼SEQ ID NO 7中所示L-山梨 糖酮脫氫酶(SNDHai)的基因的菌株。WO 2005/017159中描述了從G. oxydans DSM 17078 中克隆SNDHai基因和從其它菌株中克隆其等同物。將SNDHai基因與強(qiáng)組成型啟動子融合，然后引入帶有經(jīng)修飾的SMS44基因的各自 的宿主細(xì)胞例如G. oxydans DSM 17078 (其天然地帶有突變版本的SMS 44基因)中。通過 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法測定各自基因的過表達(dá)。重組菌株分別被稱為G. oxydans DSM 17078-SMS 44mut_SNDHaiup 和 G. oxydans DSM 17078-基因 Xmut-SNDHaiup，其中基因 X定義SMS 44基因的等同物。使用特異性抗體(見上文)或如W02005/017159中所公開 地，通過Western印跡分析來測試蛋白質(zhì)的表達(dá)。
實施例5 構(gòu)津過表汰SMS 44基因、SNDHai基因或其等同物并目.帶有突變的SMS根據(jù)WO 2006/084718的實施例2，將實施例4中獲得的菌株進(jìn)一步用于引入質(zhì)粒 構(gòu)建體，所述質(zhì)粒構(gòu)建體含有與強(qiáng)組成型啟動子融合的根據(jù)SEQ ID NO :9的SMS 43基因或 其等同物。已知根據(jù)SEQ ID NO: 10的SMS 43多肽作為與SMS 44組合發(fā)揮作用的SNDHai 基因的其它活化物/調(diào)節(jié)物而發(fā)揮作用。得到的菌株分別被稱為G.oxydans DSM 17078-(SMS 43-SNDHai)up-SMS 44mut和 G. oxydans DSM 17078-(基因X-SNDHai) up-SMS 44mut。使用對所述多肽特異性的抗體，通 過Western印跡測試與野生型狀況相比各個蛋白質(zhì)的過表達(dá)。技術(shù)人員還知道其它方法， 例如測定磷酸轉(zhuǎn)移酶活性(ATP水解)或測定受SMS 43或SMS 44多肽調(diào)節(jié)的目標(biāo)基因的 表達(dá)。如WO 2005/017159中所公開的那樣來測試SNDHai的過表達(dá)。使用特異性抗體(見 上文)或如WO 2005/017159中所公開地，通過Western印跡分析來測試蛋白質(zhì)的表達(dá)。實施例6 在靜Ih細(xì)胞反應(yīng)中牛產(chǎn)維牛素C在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/ 1 MgSO4 · 7H20、10g/LCaC03 和 18g/l 瓊脂(Difco)的 No. 3BD 瓊脂培養(yǎng)基上，于 27 "C 對 G. oxydans DSM 17078、G. oxydansDSM 17078-SMS 44mut、G. oxydans DSM 17078-基 因 Xmut、G. oxydansDSM 17078-SMS 44mut_SNDHaiup、G. oxydans DSM 17078-基因 Xmut-SNDHaiup、G. oxydans DSM 17078-(SMS 43-SNDHai) up-SMS 44mut 和 G. oxydans DSM 17078-(SMS 43-SNDHai) up-基因Xmut的細(xì)胞進(jìn)行3天的培養(yǎng)。從瓊脂平板上刮下細(xì)胞，將其懸浮于蒸餾水中，用于在30°C，220rpm振蕩下 進(jìn)行并如WO 2005/017159所述的靜止細(xì)胞反應(yīng)。用處于反應(yīng)混合物(還含有0. 3 % NaCl和1 % CaCO3)中的2 % D-山梨糖醇來進(jìn)行一系列反應(yīng)(0.5ml反應(yīng)混合物，處 于5ml反應(yīng)試管中)，用終濃度為0D_ = 10的細(xì)胞進(jìn)行溫育。20小時的溫育后， 用具有與 Aminex-HPX-78H(300x7. 8mm)柱(Biorad，Reinach, Switzerland)相連的 LiChrospher-100-RP18 (125x4. 6mm) ft (Merck, Darmstadt, Germany) ^AgilentllOOHPLC 系統(tǒng)(Agilent Technologies, Wilmington, USA)，通過高效液相色譜(HPLC)來對反應(yīng)混 合物樣品進(jìn)行分析。移動相是流速為0.6ml/分鐘的0.004M硫酸。用UV探測器(波長 254nm)組合折射率探測器，記錄下兩個信號。此外，用具有UV探測的氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II, YMC, Inc. ,Kyoto, Japan)在254nm處來進(jìn)行對L-抗壞血酸的鑒定。移動相 為 50mM NH4H2PO4 和乙腈(40 60)。用Agilent Series 1100 HPLC-質(zhì)譜(MS)系統(tǒng)來鑒定L-抗壞血酸。用電噴霧 界面在正離子模式下來操作MS。用0.1%蟻酸和甲醇(96 4)的混合物作為移動相，用 LUNA-C8 (2)柱(100x4. 6mm) (Phenomenex, Torrance,USA)來進(jìn)行分離。L-抗壞血酸以 3. 1 分鐘的駐留時間被洗脫出來。通過駐留時間和該化合物的分子量來確認(rèn)L-抗壞血酸的身 份。用突變體菌株G. oxydans DSM 17078-SMS 44mut的細(xì)胞溫育的反應(yīng)混合物的上清 液含有約1.8g/l的維生素C，相比之下，用G. oxydans DSM17078細(xì)胞為1. 0g/l。使用突 變體菌株 G. oxydans DSM 17078-基因 Xmut、G. oxydans DSM 17078-SMS 44mut_SNDHaiup、 G. oxydans DSM 17078-基因 Xmut-SNDHaiup、G. oxydans DSM 17078-(SMS 43-SNDHai)up-SMS44mut 和 G. oxydans DSM 17078-(SMS 43_SNDHai) up-基因 Xmut 的細(xì)胞時，在反應(yīng)混 合物的上清液中測量到7g/l的維生素C量。在使用G. oxydans DSM 17078菌株的重組細(xì)胞和相應(yīng)野生型菌株、用L-山梨 糖酮作為底物的靜止細(xì)胞反應(yīng)中，重組細(xì)胞能夠生產(chǎn)與野生型菌株相比至少多20%的維生
素Co另外，為了測試SMS 44mut對維生素C生產(chǎn)的影響，構(gòu)建了缺失-突變菌 株 G. oxydans DSM 17078。首先，使用各自的引物對 SMS44mutLra+l (SEQ ID NO 11) /SMS44mutKmLFH-l (SEQ ID NO 12)(在5 ‘ _端含有互補的卡那霉素-抗性盒) 和SMS44mutKmLFH+l (SEQ IDNO 13)(在5 ‘-端含有互補的卡那霉素-抗性盒)/ SMS44mutLFH-l (SEQ IDNO 14)，通過長-側(cè)翼同源性(LFH) PCR擴(kuò)增SMS 44mut基因側(cè)翼的 上游和下游區(qū)域，獲得約550-bp的產(chǎn)物。使用G. oxydans DSM 17078基因組DNA作為模板， 反應(yīng)條件由94V變性30秒、50°C退火30秒、70V延伸1分鐘的35個循環(huán)組成。在兩種情況 下均使用富含GC的PCR試劑盒(Roche Molecular Biochemicals)來最小化PCR-產(chǎn)生的錯 誤。使用 PUC4K 質(zhì)粒 DNA 作為模板，使用引物對 Km+1 (SEQ ID NO 15)/Km-I (SEQ IDNO 16) 擴(kuò)增卡那霉素_抗性盒，產(chǎn)生1.2-kb的片段。反應(yīng)條件如上文所述。凝膠純化三種產(chǎn)物， 將其混合，并與側(cè)翼引物SMS44mutLFH+l/SMS44mutLFH-l —起用于第二輪PCR反應(yīng)中，產(chǎn)生 2. 3-kb的產(chǎn)物。第二輪反應(yīng)的反應(yīng)條件由以下組成94°C 2分鐘，然后10個循環(huán)[94°C， 30 #,63°C，30 #, 680C，6 分鐘]，然后 20 個循環(huán)[94°C，30 秒，63°C，30 秒，68°C，6 分鐘，每 個循環(huán)額外進(jìn)行20秒]，和最終在68°C下延伸10分鐘。通過電穿孔將2μ 1全長PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化進(jìn)G. oxydans DSM 17078感受態(tài)細(xì)胞 中。在含有終濃度50 μ g πιΓ1卡那霉素的MB瓊脂培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。觀察若干推定的轉(zhuǎn) 化體，并使用側(cè)翼引物SMS44mutLra+l/SMS44mutLra-l通過PCR來分析，驗證SMS44mut :Km 突變已通過雙雜交被整合。發(fā)現(xiàn)單個菌株含有SMS44mut: Km突變，并稱為G. oxydansDSM 17078-SMS44-1。如上文所述培養(yǎng)細(xì)胞并分析上清液。G. oxydans DSM 17078_SMS44_1突變體菌株 生產(chǎn)0. 15g/l維生素C，相比之下，野生型菌株G. oxydansDSM 17078菌株(即天然帶有突變 版本的SMS 44基因的菌株)生產(chǎn)0.73g/l，這是約80%的降低。這清楚地證明維生素C生 產(chǎn)對SMS 44基因的功能產(chǎn)物(即G. oxydans DSM 17078中天然存在的突變版本)的需要。實施例7 生產(chǎn)2-KGA根據(jù)實施例6，使用例如帶有突變的SMS 44基因的G. oxydans菌株DSM 17078的 (重組)細(xì)胞和帶有野生型SMS 44的相應(yīng)菌株生產(chǎn)2-KGA。在使用帶有突變的SMS 44基因的G. oxydans DSM 17078菌株和帶有野生型SMS 44基因的相應(yīng)菌株、用L-山梨糖酮作為底物的靜止細(xì)胞反應(yīng)中，重組細(xì)胞能夠生產(chǎn)與 野生型菌株相比至少多20%的2-KGA。使用2% D-山梨糖醇作為底物時獲得相同的結(jié)果。
3權(quán)利要求
選自下組的多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來自微生物的基因組DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO3和SEQ IDNO4的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2.7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]的多核苷酸，且其互補鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC 2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]多肽的多核苷酸，且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少60％相同，例如70％、85％、90％或95％相同；構(gòu)成。
2.選自下組的經(jīng)修飾的多核苷酸或此類多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQID NO 6的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQID NO 5的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來自微生物的基因組 DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例如聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍 生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取 代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸 轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7]的多核苷酸， 且其互補鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7]的多核苷酸， 且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、90%或95% 相同；構(gòu)成，并且其中所述多核苷酸包含至少一種下述突變，所述突變導(dǎo)致與相應(yīng)的野生型 多核苷酸相比提高的轉(zhuǎn)移酶[EC 2]活性，優(yōu)選地導(dǎo)致提高的轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶 [EC 2. 7]活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的多核苷酸，其中所述至少一種突變在被引入微生物后導(dǎo)致與帶有 野生型多核苷酸的相應(yīng)微生物相比提高的維生素C和/或2-KGA的生產(chǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的多核苷酸，所述多核苷酸編碼帶有至少一種下述突變的多肽， 所述至少一種突變位于對應(yīng)于SEQ ID NO 2的氨基酸300和600之間位置的氨基酸位置 上。
5.根據(jù)權(quán)利要求2到4中任一項的多核苷酸，其中所述至少一種突變位于對應(yīng)于SEQ ID NO 2的第563位的氨基酸位置上，優(yōu)選地是用1563置換T563。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項的多核苷酸，其與允許在原核或真核宿主細(xì)胞中表達(dá) 的表達(dá)控制序列可操作地連接。
7.含有根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的多核苷酸的載體。
8.由根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的多核苷酸或權(quán)利要求7的載體編碼的多肽。
9.用根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的多核苷酸或權(quán)利要求7的載體遺傳工程改造的微 生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的微生物，其中與野生型微生物相比維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)的 產(chǎn)率和/或效率提高。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10的微生物，其能以300mg/l或更多的量從D-山梨糖醇直接生 產(chǎn)維生素C，所述的量是在20小時溫育之后以靜止細(xì)胞方法測量的。
12.根據(jù)權(quán)利要求9或10的微生物，其能以800mg/l或更多的量從L-山梨糖直接生產(chǎn) 維生素C。
13.根據(jù)權(quán)利要求9或10的微生物，其能以7g/l或更多的量從D-山梨糖醇生產(chǎn) 2-KGA。
14.根據(jù)權(quán)利要求9到13中任一項的微生物，其生產(chǎn)出根據(jù)權(quán)利要求8的多肽，所述多 肽與野生型微生物相比具有增加的和/或提高的轉(zhuǎn)移酶[EC 2]活性，優(yōu)選地具有增加的和 /或提高的轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7]活性。
15.根據(jù)權(quán)利要求9到14中任一項的微生物，其中根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的多 核苷酸被過表達(dá)。
16.根據(jù)權(quán)利要求9到15中任一項的微生物，其包含選自下組的其它多核苷酸或此類 多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQID NO 8的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQID NO 7的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來自微生物的基因組 DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID N0:17和SEQID NO 18的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例如 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍 生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取 代，并且，所述片段或衍生物具有氧化還原酶[EC 1]的活性，優(yōu)選地具有L-山梨糖酮脫氫 酶的活性；(e)編碼氧化還原酶[EC1]，優(yōu)選地編碼L-山梨糖酮脫氫酶的多核苷酸，且其互補鏈 能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼氧化還原酶[EC1]，優(yōu)選地編碼L-山梨糖酮脫氫酶的多核苷酸，且其與(a) 至⑷中任一項所定義的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、90%或95%相同；組成。
17.根據(jù)權(quán)利要求9到16中任一項的微生物，其包含選自下組的其它多核苷酸或此類 多核苷酸的互補鏈，所述組由(a)編碼包含根據(jù)SEQID NO 10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)包含根據(jù)SEQID NO 9的核苷酸序列的多核苷酸；(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能夠使用來自微生物的基因組 DNA作為模板，并使用根據(jù)SEQ ID NO 19和SEQID NO 20的引物組，通過核酸擴(kuò)增(例如 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))來獲得；(d)多核苷酸，其包含編碼被(a)至(c)中任一項的多核苷酸編碼的多肽的片段或衍 生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一個或多個氨基酸殘基較之所述多肽被保守取 代，并且，所述片段或衍生物具有轉(zhuǎn)移酶[EC 2]的活性，優(yōu)選地具有轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸 轉(zhuǎn)移酶[EC 2. 7]的活性；(e)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2. 7]的多核苷酸， 且其互補鏈能在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸雜交；以及(f)編碼轉(zhuǎn)移酶[EC2]，優(yōu)選地編碼轉(zhuǎn)移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC2.7]多肽的多核 苷酸，且其與(a)至(d)中任一項所定義的多核苷酸至少60%相同，例如70%、85%、90% 或95%相同；構(gòu)成。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17的微生物，其中所述其它多核苷酸被遺傳工程改造，導(dǎo)致與 相應(yīng)未經(jīng)遺傳工程改造的微生物相比提高的維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)的產(chǎn)率和/或效率。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的微生物，其中所述其它多核苷酸被過表達(dá)。
20.根據(jù)權(quán)利要求9到19中任一項的微生物，所述微生物選自由Pseudomonas、 Pantoea、Escherichia、Ketogulonicigenium 禾口乙酸細(xì)菌例如 Gluconobacter、Acetobacter 或 Gluconacetobacter,優(yōu)選 Acetobacter sp.、Acetobacter aceti、Gluconobacter frateurii、Gluconobacter cerinus、Gluconobacter thailandicus、Gluconobacter oxydans 組成的組，優(yōu)選選自 Gluconobacter oxydans,更優(yōu)選選自 Gluconobacter oxydans IFO 3293。
21.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求9到20中任一項的微生 物用于生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的用途。
22.根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的多核苷酸或權(quán)利要求7的載體用于對能夠生產(chǎn)維 生素C和/或2-KGA的微生物進(jìn)行遺傳工程改造的用途。
23.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸用于調(diào)節(jié)氧化還原酶[EC1]、優(yōu)選地調(diào)節(jié)L-山梨 糖酮脫氫酶的用途。
24.用于生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求9到20中任一項的微生物的工藝，所述工藝包括步驟(a)提供能夠生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的合適的微生物，(b)用根據(jù)權(quán)利要求2到6中任一項的多核苷酸或權(quán)利要求7的載體對所述微生物進(jìn) 行遺傳工程改造。
25.在能夠生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的微生物中增強(qiáng)轉(zhuǎn)移酶[EC2]活性、優(yōu)選地轉(zhuǎn) 移含磷基團(tuán)的磷酸轉(zhuǎn)移酶[EC 2.7]活性的工藝，所述工藝包括向所述微生物中引入根據(jù) 權(quán)利要求2到6中任一項的多核苷酸。
26.用于生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的方法，其中在允許從給定碳源直接生產(chǎn)維生素C 和/或2-KGA的條件下，在水性培養(yǎng)基中溫育根據(jù)權(quán)利要求9到20中任一項的微生物。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的工藝，其中所述碳源選自由D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨 糖、L-山梨糖酮、2-酮-L-古洛酸、D-古洛酸、2-酮-D-古洛酸或2，5- 二酮-古洛酸組成 的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求26或27的工藝，其中所述微生物在從約3到約9的pH和從約13°C 到約40°C的溫度下溫育。
29.根據(jù)權(quán)利要求26到27中任一項的工藝，其中所述維生素C的生產(chǎn)在靜止細(xì)胞反應(yīng) 中進(jìn)行。
30.根據(jù)權(quán)利要求26到29中任一項的工藝，其還包括從反應(yīng)混合物中分離和/或純化 所生產(chǎn)的維生素C和/或2-KGA。
全文摘要
本發(fā)明涉及新穎的基因，其編碼L-抗壞血酸(下文中也稱為維生素C)和/或2-酮-L-古洛酸(下文中也稱為2-KGA)合成中涉及的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還涉及包含該新穎基因的全長多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸編碼的新穎的多肽及其片段，以及它們的功能等同物。本發(fā)明還涉及經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)和編碼所述經(jīng)修飾的蛋白質(zhì)的多核苷酸以及經(jīng)修飾的微生物，其中所述修飾對所述微生物中維生素C和/或2-KGA生產(chǎn)的產(chǎn)率、產(chǎn)量和/或效率具有直接或間接的影響。本發(fā)明還包括使用經(jīng)修飾的多核苷酸序列轉(zhuǎn)化宿主微生物的工藝。本發(fā)明還涉及經(jīng)過遺傳工程改造的微生物及其用于直接生產(chǎn)維生素C和/或2-KGA的用途。
文檔編號C12P17/04GK101918575SQ200980102073
公開日2010年12月15日 申請日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月10日
發(fā)明者奈杰爾·約翰·芒希亞, 巴斯坦·切弗勒克斯 申請人:帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司