專利名稱：：干酪乳桿菌Zhang中fbpA的蛋白序列的制作方法干酪乳桿菌Zhang中fbpA的蛋白序列
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種蛋白編碼序列，特別是一種干酪乳桿菌Zhang中FbpA的蛋白序列。
背景技術(shù)：
：人體腸道內(nèi)有大約1000多種共生微生物，其遺傳信息的總和叫"微生物組"，編碼基因有100萬個以上。如果想要保持人體自身的健康狀態(tài)，必須要使腸道菌群與人之間保持相互協(xié)調(diào)、和諧一致。乳桿菌是一類發(fā)酵已糖，產(chǎn)生以乳酸為主要代謝產(chǎn)物的細菌的總稱。它們作為腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群之一，在宿主胃腸道上皮黏附和定植可以有效的抑制病原菌的生長和繁殖，對于維持腸道微生態(tài)平衡起到了非常重要的作用。近些年以來，對于乳桿菌黏附特性的研究中，除采用常規(guī)的生理生化手段定性檢測乳桿菌黏附活性成分及其生物學特性之外，許多研究者還利用生物信息學的分析方法對黏附相關(guān)的蛋白也進行了深入細致的分析。目前，盡管這些基因中一部分成員的功能已經(jīng)得到了驗證，乳桿菌的黏附機制尚不清楚。隨著現(xiàn)代分子生物學研究技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟，相關(guān)功能基因的數(shù)據(jù)庫勢必日臻完善，這也有助于這一機理的識別。fbpA蛋白是二聚體糖蛋白，分子量約為450kD。通常有兩種存在形式一種游離存在于血漿中；一種以纖維狀存在細胞外基質(zhì)。關(guān)于fbpA蛋白的研究已有近60年的歷史，特別是在致病菌中，包括肺炎鏈球菌和化膿性鏈球菌，它被證明在細胞生長、分化和黏附過程中都有著非常重要的作用，因此也被認為是病原菌中主要致病因子之一。在乳桿菌中，研究者對于fbpA蛋白在黏附過程中潛在作用也進行了卓有成效的探索。例如在短乳桿菌中，研究者發(fā)現(xiàn)表層蛋白在N端有同纖連蛋白連接的區(qū)域，由96-245個氨基酸組成；在嗜酸乳桿菌中，基因突變結(jié)果也證明了fbpA在黏附過程中不可或缺的作用，缺少fbpA基因的菌株細胞黏附Caco-2的能力顯著下降。雖然干酪乳桿菌也是時下研究的熱點之一，但迄今為止，很少有學者針對干酪乳桿菌中編碼的fbpA蛋白進行探討。本發(fā)明參考其它菌株fbpA基因序列，克隆測序獲得干酪乳桿菌Zhang(LactobacilluscaseiZhang)中的fbpA基因序列，并對不同物種fbpA基因核酸和氨基酸序列進行相似性比較，為今后開展與干酪乳桿菌中fbpA蛋白與宿主黏附能力相關(guān)研究工作提供基礎(chǔ)資料。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了一種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白FbpA編碼序列，該序列是干酪乳桿菌Zhang應激密切相關(guān)的基因，其核苷酸序列與已公布的干酪乳桿菌BL23的核酸序列FM177140和干酪乳桿菌ATCC334的核酸序列CP000423有99%的相似性。具體地，本發(fā)明提供了一種干酪乳桿菌Zhang中的熱休克蛋白FbpA的編碼序列，該序列的核苷酸序列為SEQIDN0:1，本發(fā)明還提供了一種分離出的干酪乳桿菌Zhang中的FbpA蛋白，該蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO:2。本發(fā)明還提供了SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。本發(fā)明還提供了一種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白FbpA基因的克隆和測序方法。該方法包括步驟(1)PCR引物設(shè)計與合成；(2)干酪乳桿菌DNA的提??；(3)目的片斷的PCR擴增；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測；(5)目的基因片斷回收與鑒定；(6)目的基因片斷的克隆與鑒定；(7)測序，其特征在于PCR引物為SEQIDN0:3(正向)和SEQIDN0:4(反向)，其序列信息如下SEQIDNO:3:5，-GCTTTTTGCTATGCCACCC-3，SEQIDNO:4:5'-TGACAGCGACCGTCTTTTG-3'具體地，各個步驟的詳細內(nèi)容如下(l)PCR引物設(shè)計與合成PCR引物對的正向引物和反向引物信息如下SEQIDNO:3(正向):5，-GCTTTTTGCTATGCCACCC-3，;SEQIDNO:4(反向):5，-TGACAGCGACCGTCTTTTG-3，;(2)干酪乳桿菌DNA的提取總DNA的提取參照QIAGEN的細菌基因組提取試劑盒說明書進行。具體操作步驟如下細菌培養(yǎng)液5ml，10，OOOrpm離心1分鐘，棄上清。加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理30-60分鐘。加入20蛋白酶K(20mg/ml)溶液，混勻。加220iU緩沖溶液GB，振蕩15秒。7(TC放置30分鐘。加入220無水乙醇，充分振蕩15秒。將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒。加500y1去蛋白液GD，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加700ii1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加500y1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液。再次12，OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200ill洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12，OOOrpm離心30秒。離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA。(3)目的片斷的PCR擴增PCR擴增體系0.2iUTaq聚合酶(5U/ii1，TakaraTokyo,J即an)，2.5iiIIOXPCR緩沖液(withoutMg2+)，2ii1d證(2.5mMeach)，2ii1MgCl2(25mM)，0.2ii1正向引物(50pM)，0.2ii1反向引物(50pM)，liil基因組DNA和17.4iilddH20.PCR擴增條件97。C變性5min;95。C30s，54.5°C30s，72。C30s，如此進行35次循環(huán)；72。C延伸10min，4。C10min。(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測取PCR產(chǎn)物5iU，同1iU上樣緩沖液混合均勻，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5iUDL2000Marker，120V/cm電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)GDS-8000System(UVPBiomagingSystems)上留取照片。(5)目的基因片斷回收與鑒定片段的回收按照QIAGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進行。具體操作步驟如下5在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管中。膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化。將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1或CA2中，13，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體。將吸附柱放入同一個收集管中，在吸附柱中加入700ill漂洗液PW，13，OOOrpm，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。在吸附柱中加入500iU漂洗液PW，13，OOOrpm離心30秒，倒掉廢液。將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13，OOOrpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干。將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-70°C水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。13，OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。(6)目的基因片斷的克隆與鑒定(6.1)感受態(tài)細胞的制備挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線。過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中，37t:搖菌培養(yǎng)2-3小時(160轉(zhuǎn)/分鐘)，至0D6。。達到0.4-0.5時將菌液移至滅菌預冷的100ml離心管中，冰浴10-15分鐘。4，000rpm，4t:離心10分鐘，回收細菌沉淀。加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預冷的0.lMCaCl2懸浮細菌沉淀。冰浴10-15分鐘后于4，000rpm，4。C離心IO分鐘，回收細菌沉淀。加入4ml0.1MCaCl2懸浮細菌沉淀。該細胞可直接用于轉(zhuǎn)化實驗。加甘油至終濃度為15%_20%，混勻，每份分裝成lOOiU于1.5mlEP管中，凍存于_70°C冰箱中。(6.2)回收片段同T載體的連接連接用TaKaRapMD18-TVector試劑盒。具體操作過程如下首先在EP管中制備下列連接反應液pMD18-TVector(50ng/ii1)0.5ii1DNA20_40ng溶液1(試劑盒中的溶液)5ill力口dH20至10ii1Total10ii1然后將上述反應液在16t:反應30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。(6.3)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從-7(TC冰箱中取出保存的感受態(tài)細胞，冰浴助溶。將lOOiU感受態(tài)細胞加入10ii1連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加入400ii1液體LB培養(yǎng)基，37。C復活50分鐘后取100yl鋪于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨節(jié)青霉Amp(100mg/ml)X-gal(100iig/ml)和IPTG(lmM)。最后于37。C恒溫培養(yǎng)10-15小時。白色菌斑應含重組質(zhì)粒。(6.4)轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號筆標記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應液(不含模板)的EP管中晃動，進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物同Marker—起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。得到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應的單菌落，放入40ml含0.1%(V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥蘸蜏y序。(7)測序經(jīng)過測序得到SEQIDNO:1所示的編碼熱休克蛋白FbpA的核苷酸序列。本發(fā)明的干酪乳桿菌Zhang中的fbpA基因在乳桿菌黏附過程中有著非常重要的作用。對這個基因進行克隆和測序，這為乳酸菌益生菌株遺傳改造和應用提供了基本研究材料。具體實施方式下面實施例用于對本發(fā)明的進一步說明，但不用來限制本發(fā)明的保護范圍。實施例1干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白FbpA編碼基因的克隆和測序。本發(fā)明測序得到的片斷經(jīng)過相似性比較為熱休克蛋白FbpA編碼基因的全序列。1、實驗方法1.IPCR引物設(shè)計與合成PCR引物根據(jù)GenBank提供的相關(guān)序列(AccessionNo:FM177140;CP000423)采用Primer5.0自行設(shè)計，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對的核苷酸序列分別為SEQIDNO:3(正向)和SEQIDNO:4(反向)，序列信息如下SEQIDNO:3(正向):5，-GCTTTTTGCTATGCCACCC-3，;SEQIDNO:4(反向):5，-TGACAGCGACCGTCTTTTG-3，;1.2干酪乳桿菌DNA的提取?？侱NA的提取參照QIAGEN的細菌基因組提取試劑盒說明書進行。具體操作步驟如下細菌培養(yǎng)液5ml，10，OOOrpm離心1分鐘，棄上清，加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理50分鐘，加入20蛋白酶K溶液(20mg/ml)，混勻。加220ii1緩沖溶液GB，振蕩15秒。7(TC放置30分鐘。加入220y1無水乙醇，充分振蕩15秒。將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒。加500y1去蛋白液GD，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加700ii1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液。加500y1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液。再次12，OOOrpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘。將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加2001洗脫緩沖液TE，室溫置4分鐘，12，OOOrpm離心30秒。離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，OOOrpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA。1.3目的片斷的PCR擴增PCR擴增體系0.2iUTaq聚合酶(5U/ii1，TakaraTokyo,J即an)，2.5iiIIOXPCR緩沖液(withoutMg2+)，2ii1d證(2.5mMeach)，2ii1MgCl2(25mM)，0.2ii1正向引物(SEQIDNO:3)(50pM)，0.2iU反向引物(SEQIDNO:4)(50pM)，1基因組DNA禾口17.4ii1ddH20.PCR擴增條件97。C變性5min;95。C30s，54.5°C30s，72。C30s，如此進行35次循環(huán)；72。C延伸10min，4。C10min。1.4瓊脂糖凝膠電泳檢測取PCR產(chǎn)物5iU，同1上樣緩沖液混合均勻，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5iUDL2000Marker，120V/cm電壓下電泳30min。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)GDS-8000System(UVPBiomagingSystems)上留取照片。1.5目的基因片斷回收與鑒定片段的回收按照QIAGEN瓊脂糖凝膠回收試劑盒的說明進行。在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管中。膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化。將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1中，13，000rpm離心30秒，倒掉收集管中的液體。將吸附柱放入同一個收集管中，在吸附柱中加入700iil漂洗液PW，13，OOOrpm，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。在吸附柱中加入500iil漂洗液PW，13，000rpm離心30秒，倒掉廢液。將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13，OOOrpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干。將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-7(TC水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘。13，OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。1.6目的基因片斷的克隆與鑒定1.6.1感受態(tài)細胞的制備挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線。過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中，37t:搖菌培養(yǎng)3小時(160轉(zhuǎn)/分鐘)，至0D600達到0.4-0.5時將菌液移至滅菌預冷的100ml離心管中，冰浴15分鐘。4，000rpm，4t:離心10分鐘，回收細菌沉淀。加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預冷的0.lMCaCl2懸浮細菌沉淀。冰浴15分鐘后于4，000rpm，4。C離心IO分鐘，回收細菌沉淀。加入4ml0.1MCaCl2懸浮細菌沉淀。該細胞可直接用于轉(zhuǎn)化實驗。加甘油至終濃度為15%_20%，混勻，每份分裝成100iU于1.5mlEP管中，凍存于-7(TC冰箱中。1.6.2回收片段同T載體的連接連接用TaKaRapMD18-TVector試劑盒。操作過程如下首先在EP管中制備下列連接反應液pMD18-TVector(50ng/ii1)0.5ii1DNA20-40ng溶液15ii1力QdH20至10ii1Total10ii1將上述反應液在16t:反應30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞。1.6.3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從-7(TC冰箱中取出保存的感受態(tài)細胞，冰浴助溶。將lOOiU感受態(tài)細胞加入10ii1連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘。加入400ii1液體LB培養(yǎng)基，37。C復活50分鐘后取100yl鋪于LB平板上，平板含0.1(V/V)的氨芐青霉Amp(100mg/ml)X-gal(100iig/ml)和IPTG(lmM)。最后于37。C恒溫培養(yǎng)15小時。白色菌斑應含重組質(zhì)粒。1.6.4轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)8用記號筆標記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應液(不含模板)的EP管中晃動，進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物同Marker—起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段。得到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應的單菌落，放入40ml含0.1%(V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)LB液體培養(yǎng)基中，37°C過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥蘸蜏y序。2、實驗結(jié)果經(jīng)過測序得到SEQIDNO:1所示編碼FbpA基因的核苷酸序列。3、結(jié)論克隆測序得到的FbpA基因的全長核苷酸序列。實施例2:干酪乳桿菌Zhang中FbpA基因的序列信息與生物信息學分析本發(fā)明新的干酪乳桿菌FbpA全長編碼區(qū)序列的長度為1704bp，詳細序列見SEQIDNO:1。根據(jù)全長CDS推導出干酪乳桿菌Zhang中FbpA的氨基酸序列，共365個氨基酸殘基，詳見SEQIDN0:2，在線預測(http:〃麗w.expasy.ch/tools/pi_tool.html)結(jié)果顯示，其分子量為64301道爾頓，等電點(pi)為9.21。將干酪乳桿菌FbpA相關(guān)的全長核苷酸序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在GenBank的非冗余數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸和蛋白質(zhì)相似性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與已公布序列的干酪乳桿菌FbpA在核苷酸水平和氨基酸水平上都具有99X的相似性。與其它乳桿菌如植物乳桿菌WCSF1(LactobacillusplantarumWCSF1)、唾液乳桿菌UCC118(LactobacillussalivariusUCC118)及短乳桿菌ATCC367(LactobacillusbrevisATCC367)等編碼的FbpA基因也都有著較高的相似性(具體的相似度參見表l)。由此可見，F(xiàn)bpA基因在乳桿菌不同物種間有著較高的保守性。通過檢索由歐洲生物信息研究所(EMI)開發(fā)的Interpro數(shù)據(jù)庫，我們發(fā)現(xiàn)它有著FbpA蛋白典型的結(jié)構(gòu)域特征，一個N端ATP功能結(jié)合區(qū)域(ATPbindingdomain)和一個C端肽結(jié)合區(qū)域(Polyp印tide-bindingdomain)。在其它乳桿菌中FbpA已經(jīng)被證明在乳桿菌應激過程中有著非常重要的作用，可以認為FbpA在干酪乳桿菌應激的過程中也具有相似的作用。3、結(jié)論通過上述操作，表明本發(fā)明得到了編碼干酪乳桿菌Zhang中的FbpA蛋白的基因序列及其氨基酸序列。表1:本發(fā)明得到與其它乳桿菌的編碼干酪乳桿菌Zhang中的FbpA基因序列具有很高的相似度<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表〈110〉內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學〈120〉干酪乳桿菌Zhang中fbpA的蛋白序列〈130〉〈160〉4〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1704〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉1atgtcatttgacggaatctttacccatgcc60ggcggccgtgttgctaaaattcaacaacct120gcgggacgaaagaatcatcccctccttctg180atcacgcatattccattcacgaaccctgat240aagtattttaatgcggccaccttaactgcc300cactttgagttctcaacccgtgacgaactc360gaaatgatgggtcgccacagcaatattttc420gatctcattcggcatgtgtcggccgatcaa■ccttacgttgaaccgcctaagcaagacaaa5403tggCC33Cgtcagccaaccgttcccgcaagtgcatc鄉(xiāng)ggcg鄉(xiāng)咖cttgtcagtgaatcgttatcaccgatcctt■gttgtgatctcaatatgccattcaccattcggcttgcg■cgtectgggtcccctgatttcacgatccaactttaagccactattcgagcgggttcaggacgttgcggccgggtgctcgttgatcatctaaaattattgccaggtgccagaccggcgttaccacgcat600cattatcaag660gatgc鄉(xiāng)ct720780caatatccga840cgcgtcttgc900cgc^^^c960cg^ttcggg1020atcgagctgc1080ctgacgccgt1140gttgcccatg1200atcatggccc1260C3gC3gC^g1320gtcgc^^c1380■cttgcaga14401500ttgctcgaag1560ccggtggact1620gtggtttetg1680ttacgcaaccgcttagctaagggatggtttaggccgttttccctcagcacagc卿gtgggcg卿tgttctaatttctatccatcaacaagatcgacgtgctatttacgctgatcaattatgatcaatttaccaggctccggctaagttggatcg卿t■gggc^^cgcctaccaaggtcacgcccagattcggctctttgccgcacacggcaatcg3tgttgg3tgaacctgatcgcagcggaccgacgacttat^tgcagg^cgctagcccgc^gc^^gttatgccagcgaccttgcacccatgttatcggccgcctatgacggtcgct11gccttaagtcactgagcttgctggcgacacccctacctgtgcttattatgcacgtcatcacggccaatcattcgctaaat■tcagg^g■agatttggg3tggC3CC33ccgcteagaatcgatagtcttttcaaaagcgtaaacccagtcacgcctggcgcagcgctcgttacgactccgtgccgaccattgactgg■c^^ggcagaacgtcctcgg^^ggctcg^cgcggccgatattcg■atttgggtatcagcc^gcccgtgacag3tggCgCC33acgtcgagctc^cc^ggccatcacggcatgagca^gcggagcacgatcgatgattaccatgaccagcatccaaccaagcgtaatgcctcttgaaggtgctcgaactgacgcc^^ggggc^g^tctggctgcactgag^^cgtgctaatgtagccaggttttggtCg3C33g1704〈210>2〈211>365〈212>PRT〈213〉人工序列〈400>2MetSerAspGlyThrHisAlaMetAlaAsnAsnAlaThrSerGlyGly151015ArgValAlaLysTyrAsnValValThrArgAlaGlyArgLysAsnHis202530SerAlaAsnTyrAlaArgValThrHisThrAsnAspValAlaThrThr354045MetThrArgLysTyrAsnAlaAlaThrThrAlaValHisValAsnAsp505560ArgValHisSerThrArgAspGlyGlyArgMetMetGlyArgHisSer65707580AsnValSerArgThrGlyLysAspArgHisValSerAlaAspAsnArg859095TyrArgMetGlyAlaTyrValLysAspLysThrAspHisAspAspArg100105110ArgTyrHisAlaArgValThrAlaSerArgAlaAlaHisTyrGlyAla115120125LysAspSerAlaThrAlaArgAsnGlyAspAlaGlyTrpAspGlyAla130135140AlaAlaThrValThrThrAlaGlyLysLysAlaValThrAlaTyrSer145150155160ThrGlySerTyrThrSerThrMetAspAlaTyrTyrLysAlaHisAsp165170175ArgValGlyGlyAsnHisValLysAsnValAspLysAspArgLysLys180185190ArgLysArgThrThrLysAlaAspAspTyrArgArgGlyValThrThr195200205TyrSerValArgGlyMetThrSerAsnTyrAspAspAsnArgLysThr210215220SerAsnThrSerArgAsnAlaLysTyrAlaLysTyrThrLysArgAsn225230235240AlaValAlaHisValHisMetAsnAspTyrGlyMetAlaAspValAla245250255SerLysAspAlaAspArgGlyTyrArgLysLysThrAsnLysLysGly260265AlaLysArgLysValAlaLysAspTyrAlaSerAspGly275280285ValGlyLysAsnAsnAsnAspThrHisThrAlaLysLys290295300HisValLysAspGlySerHisValAspSerHisSerLys305310315LysAlaAlaTyrSerLysAlaArgAspSerAlaAsnVal325330ValLysLysArgLysAsnGlyAlaLysGlyValValTyr340345ValAlaValThrAspValValAspLysArgAsnThrLys355360365〈210〉3〈211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3gctttttgctatgccaccc19〈210〉4<211〉19〈212〉DNA〈213〉人工序列<400〉4tgacagcgaccgtcttttg19270ThrLysTrpThrAspTrpThrAlaAla320ValAspTrp335GlyLysThr350權(quán)利要求一種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白FbpA編碼序列，其特征在于該序列是干酪乳桿菌Zhang應激密切相關(guān)的基因，其核苷酸序列與干酪乳桿菌BL23的核酸序列FM177140和干酪乳桿菌ATCC334的核酸序列CP000423具有99％的相似性。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的序列，其特征在于核苷酸序列為SEQIDN0:1。3.—種分離出的干酪乳桿菌Zhang中的FbpA蛋白，其特征在于該蛋白為SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。4.權(quán)利要求3所述的蛋白，其特征在于該蛋白的氨基酸序列為SEQIDN0:2。5.—種干酪乳桿菌Zhang中熱休克蛋白FbpA基因的克隆和測序方法，該方法包括步驟(l)PCR引物設(shè)計與合成；(2)干酪乳桿菌DNA的提??；(3)目的片斷的PCR擴增；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測；(5)目的基因片斷回收與鑒定；(6)目的基因片斷的克隆與鑒定；(7)測序，其特征在于PCR引物的正向引物為SEQIDNO:3和反向引物為SEQIDN0:4，其序列信息如下SEQIDNO:3:5，-GCTTTTTGCTATGCCACCC-3，SEQIDNO:4:5'-TGACAGCGACCGTCTTTTG-3'。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于干酪乳桿菌DNA的提取步驟如下細菌培養(yǎng)液5ml，10，OOOrpm離心1分鐘，棄上清；加入適量溶菌酶溶液，使其最終濃度為20mg/ml，徹底懸浮，37。C處理30-60分鐘；加入20蛋白酶K溶液，其濃度為20mg/ml，混勻；加220ii1緩沖溶液GB，振蕩15秒；7(TC放置30分鐘；加入220y1無水乙醇，充分振蕩15秒；將溶液加入吸附柱中，12，OOOrpm離心30秒；加500去蛋白液GD，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液；加700ii1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄廢液；加500y1漂洗液GW，12，OOOrpm離心30秒，棄掉廢液；再次12，000rpm離心2分鐘，將吸附柱置于室溫數(shù)分鐘；將吸附柱轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，加50-200ii1洗脫緩沖液TE，室溫置2-5分鐘，12，OOOrpm離心30秒；離心得到的溶液再次加入吸附柱中，室溫放置2分鐘，12，000rpm離心2分鐘，即得到干酪乳桿菌Zhang基因組DNA。7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于目的片斷的PCR擴增的擴增體系為0.2iUTaq聚合酶，2.5ii110XPCR緩沖液，2ii1dNTP，2ii1MgCl2，0.2ii1正向引物，0.2ii1反向引物，lP1基因組DNA和17.4ii1ddH20，擴增條件為97。C變性5min;95°C30s，54.5°C30s，72。C30s，如此進行35次循環(huán)；72。C延伸10min，4。C10min。8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于瓊脂糖凝膠電泳檢測的步驟為取PCR產(chǎn)物5iU，同liU上樣緩沖液混合均勻，點樣于瓊脂糖凝膠孔中，在另一孔中加入5iUDL2000Marker，120V/cm電壓下電泳30min，電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)GDS-8000System上留取照片。9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于目的基因片斷回收與鑒定的操作步驟如下在紫外燈下迅速將含有目的片段條帶的瓊脂糖塊割下，放入1.5ml的離心管中；膠塊中加入3倍體積溶膠液PN，置5(TC水浴放置10分鐘，使瓊脂糖塊完全溶化；將溶化后的瓊脂糖塊移入吸附柱CA1或CA2中，13，OOOrpm離心30秒，倒掉收集管中的液體；將吸附柱放入同一個收集管中，在吸附柱中加入700iil漂洗液PW，13，OOOrpm，離心30秒，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中；在吸附柱中加入500iil漂洗液PW，13，000rpm離心30秒，倒掉廢液；將離心吸附柱CA1或CA2放回收集管中，13，000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液；將吸附柱置于室溫或5(TC溫箱數(shù)分鐘，晾干；將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量65-7(TC水浴預熱的洗脫緩沖液EB，室溫放置2分鐘；13，OOOrpm離心1分鐘收集DNA溶液。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于目的基因片斷的克隆與鑒定的步驟如下感受態(tài)細胞的制備挑取JM109大腸桿菌原種，LB瓊脂板上劃線；過夜培養(yǎng)后挑取新鮮單菌落，接種到100mlLB培養(yǎng)基中，37t:搖菌培養(yǎng)2-3小時，至0D6。。達到0.4_0.5時將菌液移至滅菌預冷的100ml離心管中，冰浴10-15分鐘；4，000rpm，4。C離心10分鐘，回收細菌沉淀；加入20ml經(jīng)過過濾除菌并經(jīng)預冷的0.lMCaCl2懸浮細菌沉淀；冰浴10-15分鐘后于4，000rpm，4t:離心10分鐘，回收細菌沉淀；加入4ml0.1MCaCl2懸浮細菌沉淀；該細胞可直接用于轉(zhuǎn)化實驗；加甘油至終濃度為15%-20%，混勻，每份分裝成100iil于1.5mlEP管中，凍存于-7(TC冰箱中；回收片段同T載體的連接首先在EP管中制備下列連接反應液pMD18-TVector0.5ii1DNA20-40ng溶液15ill加dH20至10illTotal10ill然后將上述反應液在16t:反應30分鐘，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞；質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從-7(TC冰箱中取出保存的感受態(tài)細胞，冰浴助溶；將100ill感受態(tài)細胞加入lOiU連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘后于42t:水浴熱應激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘；加入400y1液體LB培養(yǎng)基，37t:復活50分鐘后取100yl鋪于LB平板上，平板含0.1的氨芐青霉AmpX-gal和IPTG;最后于37t:恒溫培養(yǎng)10-15小時；白色菌斑應含重組質(zhì)粒；轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號筆標記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取白色單菌落；將牙簽頭放入在加有PCR反應液的EP管中晃動，進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物同Marker—起進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；得到目的片段后，用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對應的單菌落，放入40ml含0.1%的青霉素鈉LB液體培養(yǎng)基中，37t:過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥蘸蜏y序。全文摘要本發(fā)明涉及一種干酪乳桿菌Zhang中FbpA的蛋白序列，提供了一種新的干酪乳桿菌熱休克蛋白FbpA的編碼核苷酸序列，該序列是干酪乳桿菌Zhang應激密切相關(guān)的基因，該序列的核苷酸序列與已公布的干酪乳桿菌BL23的核酸序列FM177140和干酪乳桿菌ATCC334的核酸序列CP000423有99％的相似性。本發(fā)明還提供了干酪乳桿菌Zhang中的FbpA基因的核酸序列，該核酸序列為SEQIDNO1，本發(fā)明還提供了一種分離出的干酪乳桿菌Zhang熱休克蛋白FbpA的氨基酸序列，該序列的氨基酸序列為SEQIDNO2。文檔編號C12N15/10GK101705236SQ20091025067公開日2010年5月12日申請日期2009年12月14日優(yōu)先權(quán)日2009年12月14日發(fā)明者孫志宏,孟和,張和平,張文羿申請人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學