專利名稱：一種表達結(jié)核桿菌抗原的重組釀酒酵母及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于結(jié)核疫苗領(lǐng)域和生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可用作結(jié)核病 疫苗的重組酵母及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
(tuberculosis) ^i^^aWM^PfM (Mycobacterium tuberculosis, MT) 引起的一種慢性傳染病。近年來，由于結(jié)核桿菌多重耐藥性菌株的出現(xiàn)以及艾滋病毒(HIV) 與結(jié)核桿菌伴發(fā)感染，結(jié)核病與艾滋病、瘧疾一起成為威脅人類健康的三大傳染病。中國是 世界第二大結(jié)核病發(fā)病國，結(jié)核病防治形勢嚴峻。疫苗是防治傳染病的有效手段，而卡介苗 (BCG)是目前唯一獲得批準(zhǔn)的預(yù)防結(jié)核病疫苗，迄今已使用80多年，但BCG的免疫保護作用 不穩(wěn)定，有效率介于0% -80%之間，因個體、區(qū)域不同差異很大，而且由于結(jié)核桿菌耐藥菌 株的擴散，導(dǎo)致結(jié)核病藥物治療效果不佳(王洪海，結(jié)核病防治基礎(chǔ)研究進展，微生物與感 染，2007，2C3) :164-169 ；吳芳等，結(jié)核病疫苗研究進展，國外醫(yī)學(xué)(預(yù)防診斷治療用生物制 品分冊)，2005，28 (3) :110-113)。因此，發(fā)展新型結(jié)核病疫苗成為結(jié)核病防治的當(dāng)務(wù)之急。目前正在研制的結(jié)核病疫苗主要有亞單位疫苗、DNA疫苗、全菌疫苗等。(1)亞單 位疫苗指利用結(jié)核桿菌的抗原蛋白(多肽)所制備的疫苗，通常采用基因工程技術(shù)表達、 純化制備抗原蛋白(多肽)。結(jié)核桿菌具有較強免疫原性的抗原蛋白有早期分泌性抗原 (ESAT-6)、Ag85復(fù)合物(Ag85A、Ag85B、Ag85C)、MPT_64和熱休克蛋白HSP65等，亞單位疫苗 使用安全，但在體內(nèi)滯留時間與免疫應(yīng)答的持續(xù)時間短，必須尋找安全有效的佐劑和傳遞 形式。0)DNA疫苗指將結(jié)核桿菌抗原蛋白編碼基因克隆在相應(yīng)的表達載體(主要為病毒載 體)作為疫苗，直接導(dǎo)入機體細胞。DNA疫苗技術(shù)簡單，能夠在機體內(nèi)持續(xù)表達一段時間，能 夠很好地激發(fā)細胞免疫反應(yīng)，但DNA疫苗表達水平存在一定問題，單獨免疫保護效果有限， 與亞單位疫苗或BCG聯(lián)合免疫才可以達到較好的免疫保護效果，而且安全性存在疑問。(3) 全菌疫苗主要為重組BCG (rBCG)，即對BCG進行基因工程改造，如將BCG中缺乏的重要保護 性抗原重組入BCG，提高其免疫保護作用。rBCG主要優(yōu)勢在于其表達的靶抗原不需經(jīng)過純 化處理復(fù)雜工序，可直接用于免疫。rBCG免疫和保護效果還需進一步提高。由于存在數(shù)量龐大的結(jié)核感染者，發(fā)展預(yù)防和治療效應(yīng)兼具的新型結(jié)核病疫苗尤 顯重要。而基于重組全釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的新型結(jié)核病疫苗具有成為 治療型疫苗的潛能。釀酒酵母作為疫苗載體，其主要特點有(1)安全性好，釀酒酵母是一種 非致病的安全型微生物，在食品、制藥領(lǐng)域長期廣泛使用；( 優(yōu)良的真核細胞表達系統(tǒng)， 遺傳背景清楚，易進行遺傳操作；C3)制備方法簡單，成本低；(4)酵母細胞自身具有很強的 免疫佐劑效應(yīng)，不需添加佐劑；(6)能夠作用并激活樹突狀細胞(Dendritic Cells, DCs), 誘導(dǎo)強效細胞免疫反應(yīng)。針對艾滋病(HIV)和丙型肝炎(HCV)的重組全酵母治療型疫苗已 完成臨床前研究，RAS重組全酵母腫瘤疫苗已獲美國FDA批準(zhǔn)進入治療多種癌癥的臨床研 究(Α·Α· Haller et al· ,Whole recombinant yeast-basedimmunotherapy induces potent T cell response targeting HCV NS3 and Coreproteins，Vaccine(2007)，25 :1452-1463 ;R. P.Galao, et al. , Saccharomyces cerevisiae :a versatile eukaryotic system in virology, Microbial Cell Factories(2007),6 :32)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在構(gòu)建一種表達結(jié)核桿菌抗原的重組釀酒酵母，該重組釀酒酵母可作為 疫苗應(yīng)用于結(jié)核病防治。本發(fā)明的另一個目的是提供上述重組釀酒酵母的構(gòu)建方法。本發(fā)明提供了一種表達結(jié)核桿菌抗原的重組釀酒酵母，該釀酒酵母菌株含有如下 表達載體該表達載體含有酵母2 μ質(zhì)粒完整序列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子、 酵母終止子和結(jié)核桿菌抗原基因。所述的酵母啟動子是酵母菊粉酶基因啟動子、TEFl基因啟動子、ADHl基因啟動 子、ADH2基因啟動子、GAPDH基因啟動子、GALl基因啟動子、GALlO基因啟動子中的任意一 種，或者其中兩種及兩種以上啟動子的融合啟動子。所述的酵母終止子是菊粉酶基因終止子、CYCl基因終止子、TEFl基因終止子、 ADHl基因終止子中的一種或者幾種。所述的酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因是LEU2、ADE2、URA3、TRP1或者HIS3中的一種或者 幾種。所述的結(jié)核桿菌抗原基因是ESAT-6、Ag85A、Ag85B、Ag85C、MPT-64、熱休克蛋白 HSP65，或者其中兩種及兩種以上的融合基因。本發(fā)明的一個實施例中，以ESAT-6和Ag85B的融合基因(EA)作為結(jié)核桿菌抗原 基因。EA即Ag85B和EAST6融合蛋白的連接順序是直接頭尾相連后插入同一載體。Ag85B 基因登錄號BX842578. 1 ；蛋白登錄號CAB10044. 1。ESAT-6基因登錄號BXM8347. 1 ；蛋白 登錄號:CAD96091. 1。結(jié)核桿菌抗原表達鑒定方法如下將構(gòu)建的重組釀酒酵母工程菌接種于選擇性SD-Leu液體培養(yǎng)基，30°C搖床中培 養(yǎng)過夜作為種子液，按照5% (ν/ν)的比例接種于YEPD培養(yǎng)基中，30°C搖床中培養(yǎng)48小時， 離心收獲酵母細胞，玻璃珠法裂解酵母，取裂解液進行SDS-PAGE電泳，Western blot鑒定 重組結(jié)核桿菌抗原蛋白表達水平。上述表達載體及其重組釀酒酵母菌株可以用于制備抗結(jié)核桿菌疫苗。本發(fā)明還提供了上述的重組釀酒酵母菌株的制備方法，該方法包括如下步驟(1)構(gòu)建含有酵母2 μ質(zhì)粒完整序列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子和酵母 終止子的穿梭質(zhì)粒酵母載體部分；(2)構(gòu)建含有酵母啟動子、酵母終止子和結(jié)核桿菌抗原基因的外源基因表達盒；(3)將(1)獲得的穿梭質(zhì)粒酵母載體部分與( 獲得的外源基因表達盒共轉(zhuǎn)化相 應(yīng)營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株，在營養(yǎng)缺陷選擇性培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得表達結(jié)核 桿菌抗原的重組釀酒酵母菌株。表達結(jié)核桿菌抗原的重組釀酒酵母構(gòu)建方法如下 酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Px (見專利申請“一種新型食品級釀酒酵母表達系 統(tǒng)”，發(fā)明人劉建平等)經(jīng)限制性內(nèi)切酶Mil、Mel雙酶切，去除載體中的大腸桿菌復(fù)制子Ori和氨芐青霉素抗性基因Af序列，得到的酵母表達載體片段與結(jié)核桿菌抗原表達盒共轉(zhuǎn) 化釀酒酵母宿主，涂布亮氨酸缺陷選擇性培養(yǎng)基SD-Leu上篩選轉(zhuǎn)化子，在轉(zhuǎn)化的酵母細胞 內(nèi)結(jié)核桿菌抗原基因通過同源重組機制克隆于酵母表達載體上，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，獲得表達 結(jié)核桿菌抗原的重組釀酒酵母工程菌，該重組酵母內(nèi)的抗原表達質(zhì)粒沒有大腸桿菌序列和 抗藥性基因序列。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Notl酶切，電泳分離回收由酵母啟動子、結(jié)核桿菌抗原 基因和酵母終止子序列組成的結(jié)核桿菌抗原釀酒酵母表達盒。上述步驟(1)中的穿梭質(zhì)粒含有大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子、抗生素抗性基因、釀酒酵 母2μ質(zhì)粒完整序列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子和酵母終止子的序列，切除大腸 桿菌質(zhì)粒復(fù)制子和抗生素抗性基因，獲得穿梭質(zhì)粒酵母載體部分?？梢岳每寺≥d體構(gòu)建外源基因表達盒。克隆載體含有酵母啟動子、多克隆位點 區(qū)和酵母終止子。例如，以PAG61質(zhì)粒為基礎(chǔ)，構(gòu)建含有酵母啟動子、多克隆位點區(qū)和酵母 終止子的克隆載體I3x-RiK圖3)。外源基因通過多克隆位點區(qū)克隆于I3X-RH載體，限制性內(nèi) 切酶酶切獲得由酵母啟動子1^、結(jié)核桿菌抗原基因開發(fā)閱讀框和酵母終止子組成的外源基 因表達盒。酵母-大腸桿菌穿梭載體構(gòu)建以完整的酵母2μ質(zhì)粒序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建含有酵母 營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子I3X和酵母終止子元件的穿梭質(zhì)粒pHR-Px(圖4)，酵母啟動 子與終止子元件間為大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子(Ori)和氨芐青霉素抗性基因(Ap1O序列，大 腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因序列通過酶切可與穿梭載體上的酵母基因序列 分離。去除了大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因序列的穿梭載體pHR-Px片段 與外源基因表達盒共轉(zhuǎn)化營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株，在營養(yǎng)缺陷選擇性培養(yǎng)基上篩選獲得 外源基因表達工程菌。工程菌中外源基因表達盒與穿梭載體PHR-Px片段通過同源重組形 成外源基因表達質(zhì)粒，該表達質(zhì)粒沒有非酵母基因序列和抗藥性基因序列(除需表達的外 源基因序列外)。裂解所得的重組釀酒酵母菌株，可以分離純化獲得包含酵母2μ質(zhì)粒完整序列、 酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子、酵母終止子和結(jié)核桿菌抗原基因的釀酒酵母表達載 體。該釀酒酵母表達載體也可以通過以下方法制備分別構(gòu)建酵母2μ質(zhì)粒完整序 列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子、結(jié)核桿菌抗原基因和酵母終止子的DNA片段，然 后將其依次連接。本發(fā)明還提供了一種酵母-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒，該穿梭質(zhì)粒含有酵母終止子、釀 酒酵母2 μ質(zhì)粒完整序列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子、大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子和抗 生素抗性基因的序列，上述各部分依次連接，大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子和抗生素抗性基因兩側(cè) 均有酶切位點。本發(fā)明中，制備釀酒酵母菌株的具體步驟如下1、克隆載體I3X-RH構(gòu)建(l)pAG61質(zhì)粒經(jīng)Notl酶切，電泳回收含有大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子Ori和氨芐青霉素 抗性基因Apr序列的DNA片段；
(2)以兩端含有限制性內(nèi)切酶位點的引物分別PCR擴增酵母啟動子及終止子序 列，限制性內(nèi)切酶分別酶切酵母啟動子、終止子PCR產(chǎn)物；(3)分別合成多克隆位點區(qū)的正反鏈單鏈，變性退火形成多克隆位點雙鏈序列，兩 端分別含有與酵母啟動子&序列3’粘端、酵母終止子序列5’粘端互補的粘端；(4)大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子和氨芐青霉素抗性基因序列與酶切后的酵母啟動子、酵 母終止子以及多克隆位點雙鏈連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，對形成的轉(zhuǎn)化子進行PCR篩選鑒 定，PCR陽性轉(zhuǎn)化子抽取質(zhì)粒，測序鑒定，獲得克隆載體I^x-RH。Px-RH載體具有大腸桿菌質(zhì) 粒復(fù)制子、氨芐青霉素抗性基因篩選標(biāo)記、酵母啟動子、多克隆位點區(qū)和酵母終止子元件。2、外源基因表達盒構(gòu)建(外源基因即結(jié)核抗原基因)需表達的外源基因開發(fā)閱讀框(ORF)經(jīng)PCR特異擴增、限制性內(nèi)切酶酶切，與經(jīng)過 同樣限制性內(nèi)切酶酶切處理的I3X-RH載體連接，外源基因插入I^x-RH載體多克隆位點區(qū)，形 成的質(zhì)粒具有酵母啟動子I3X-外源基因ORF-酵母終止子組成的外源基因表達盒，然后轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5 α，對轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒進行PCR、測序鑒定。重組質(zhì)粒經(jīng)Notl酶切，電泳 回收與大腸桿菌質(zhì)粒復(fù)制子、氨芐青霉素抗性基因序列分離的外源基因表達盒。3、酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-I^x構(gòu)建pHCll載體(劉軼婷等，在雜合啟動子控制下乙肝病毒表面抗原SA-觀融合基因在 酵母中的表達及調(diào)控，復(fù)旦學(xué)報，37 (4) =399-444,1998)酶切，電泳回收包括酵母2 μ質(zhì)粒 完整序列和酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因Leu2的8. 7kb片段、與中間插入了大腸桿菌復(fù)制子Ori 和氨芐青霉素抗性基因Af序列的酵母啟動子和酵母終止子連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α， 對轉(zhuǎn)化子中的重組質(zhì)粒進行PCR、測序鑒定，得到pHR-Px穿梭載體。4、工程菌構(gòu)建酵母-大腸桿菌穿梭載體pHR-Px經(jīng)Mel、Sail雙酶切，電泳，回收去除了大腸桿 菌質(zhì)粒復(fù)制子Ori和氨芐青霉素抗性基因Af序列的載體片段，該載體片段均為酵母基因 序列，與外源基因表達盒一起利用醋酸鋰法共轉(zhuǎn)化LEU2基因突變的釀酒酵母菌株，在缺少 亮氨酸(leucine)的SD選擇性培養(yǎng)基(SD-Leu)上篩選轉(zhuǎn)化子，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子中克隆于 表達質(zhì)粒的外源基因，選擇PCR陽性轉(zhuǎn)化子作為工程菌進行外源基因表達試驗。本發(fā)明的載體均為市售或者根據(jù)文獻報道。如非特別指出，均可采用本領(lǐng)域常規(guī) 的操作方法。例如，按照冷泉港實驗室的《分子克隆》、《抗體》、《細胞》，以及《冷泉港實驗室 實驗方案》等通用的實驗手冊。本發(fā)明提供了一種表達結(jié)核桿菌抗原的重組釀酒酵母，該釀酒酵母菌株含有如下 表達載體該表達載體含有酵母2 μ質(zhì)粒完整序列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子、 酵母終止子和結(jié)核桿菌抗原基因。該表達質(zhì)粒中，除需表達的結(jié)核桿菌抗原基因序列外，沒 有非酵母基因序列，只能夠在釀酒酵母細胞內(nèi)生存，不會轉(zhuǎn)移。本發(fā)明所產(chǎn)生的釀酒酵母表 達質(zhì)粒充分發(fā)揮了釀酒酵母食品級微生物的優(yōu)勢，安全、高效；而且，酵母細胞自身具有很 強的免疫佐劑效應(yīng)，不需添加佐劑；可以作為制備結(jié)核病防治疫苗的優(yōu)良材料。


圖1重組釀酒酵母工程菌中結(jié)核桿菌融合抗原ESAT6_Ag85B表達質(zhì)粒pHR_EA。圖2重組釀酒酵母工程菌表達結(jié)核桿菌融合抗原ESAT6_Ag85B (EA)Western blot鑒定。泳道1，對照樣品(釀酒酵母Y16菌株發(fā)酵菌體裂解液)。泳道2-4，分別為3株Y16/pHR-EA工程菌發(fā)酵菌體裂解液樣品，EA即ESAT6_Ag85B 融合抗原。圖3PX_RH 示意圖。圖4pHR_PADH1 示意圖。圖5重組釀酒酵母免疫小鼠血清中與結(jié)核桿菌抗原Ag85B反應(yīng)的抗體IgGELISA 檢測結(jié)果。重組酵母為Y16/pHR-EA工程菌，對照1為宿主釀酒酵母Y16，對照2為PBS溶液。
具體實施例方式
實施例1結(jié)核桿菌融合抗原ESAT6-Ag85B (EA)釀酒酵母表達盒構(gòu)建以質(zhì)粒pMD18-T-ESAT6(ESAT6基因克隆于pMD18_T vector)為模板，引物Pl和 P2PCR擴增ESAT6基因開放閱讀框ORF序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)HindIII、BamHl雙酶切處理。以質(zhì) 粒pMD18-T-Ag85B(Ag85B基因克隆于pMD18-T vector)為模板，引物P3和P4PCR擴增Ag85B 基因開發(fā)閱讀框ORF序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)Bgl II,Sail雙酶切處理。克隆載體Padhi-RH(見專利 申請“一種新型食品級釀酒酵母表達系統(tǒng)”，發(fā)明人劉建平等)經(jīng)HindIH、Sall雙酶切后，與 ESAT6基因Hindlll/BamHl酶切產(chǎn)物、Ag85B基因Bgl ΙΙ/Sall酶切產(chǎn)物進行三片段連接， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci菌株，PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，抽提陽性轉(zhuǎn)化子重組質(zhì)粒，測序鑒定，得到克隆 有融合抗原EA的重組質(zhì)粒Padh1-EA-RH。該重組質(zhì)粒具有由啟動子Padhi、融合抗原EA和終 止子Tcyc序列組成的EA基因表達盒(PADH1-EA-Tcyc)，重組質(zhì)粒經(jīng)Notl酶切，電泳分離、回 收融合抗原EA基因表達盒P-fEA-Tcyc。采用的PCR、酶切、連接、大腸桿菌轉(zhuǎn)化等基因工 程技術(shù)方法均為常規(guī)方法，參照《分子克隆實驗指南》(J.Sambr00k，et al.，第二版，1996)?？寺SAT6基因ORF兩條引物序列是Pl :5’ AGGAAGCTT AGATCTATGACAGAGCAGCAGTGGAATT(SEQ ID NO 1)HindIIIP2 :5， ATGGATCCTGCGAACATCCCAGTGACGTTG(SEQ ID NO 2)BamHl克隆Ag85B基因ORF兩條引物序列是P3 :5， AT AGATCTTTCTCCCGGCCGGGGCTG(SEQ ID NO 3)Bgl IIP4 :5，CA GTCGAC TTATCAGCCGGCGCCTAACGAAC(SEQ ID NO 4)Sail實施例2表達結(jié)核桿菌融合抗原EA的重組釀酒酵母工程菌構(gòu)建酵母-大腸桿菌穿梭載體PHR-PadhJS Mel、Sail雙酶切，電泳分離、去除大腸桿菌 復(fù)制子Ori和氨芐青霉素抗性基因Af片段，回收酵母載體部分，與融合抗原EA基因表達 盒一起采用醋酸鋰法共轉(zhuǎn)化釀酒酵母Y16菌株，在選擇性培養(yǎng)基SD-Leu篩選轉(zhuǎn)化子，對轉(zhuǎn) 化子中的重組表達質(zhì)粒進行PCR鑒定，EA基因PCR陽性的酵母轉(zhuǎn)化子即為表達融合抗原EA 的重組釀酒酵母工程菌Y16/pHR-EA。酵母細胞醋酸鋰轉(zhuǎn)化方法參照《酵母遺傳學(xué)方法實驗 指南》(A. Adams, et al.，2000)。 實施例3融合抗原EA表達鑒定 ①將重組釀酒酵母工程菌Y16/pHR-EA接入3ml選擇性SD-Leu液體培養(yǎng)基中， 在30°C，250rpm轉(zhuǎn)速搖床中培養(yǎng)過夜后作為種子液。選擇性SD-Leu液體培養(yǎng)基成分為0. 67% YNB，2%葡萄糖，0. 002%尿嘧啶，0. 002%組氨酸和0. 002%色氨酸。將種子液以 1 20的比例接入裝有20ml YEPD的IOOml三角瓶中，在30°C，250rpm轉(zhuǎn)速搖床中培養(yǎng)48 小時。YEPD培養(yǎng)基成分為酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖。②取Iml發(fā)酵液高速離心，去除上清液，收獲沉淀菌體，加入200 μ 1 PBS,再加入 等量玻璃微珠，劇烈振蕩破菌(振蕩1分鐘后置冰上1分鐘，如此重復(fù)5次)，取20 μ 1破菌 液經(jīng)SDS-PAGE電泳后，Western blot鑒定EA表達。Western blot方法參照《分子克隆實驗指南》(J. Sambrook, et al.，第二版， 1996)。結(jié)果顯示，上述獲得的重組釀酒酵母工程菌能夠表達融合抗原EA。具體詳見圖2。實施例4重組釀酒酵母工程菌Y16/pHR_EA免疫小鼠效果檢測①將重組釀酒酵母工程菌Y16/pHR_EA接入3ml選擇性SD-Leu液體培養(yǎng)基中， 在30°C，250rpm轉(zhuǎn)速搖床中培養(yǎng)過夜后作為種子液。選擇性SD-Leu液體培養(yǎng)基成分為 0. 67 % YNB，2 %葡萄糖，0. 002 %尿嘧啶，0. 002 %組氨酸和0. 002 %色氨酸。將種子液以 1 20的比例接入裝有20ml YEPD的IOOml三角瓶中，在30°C，250rpm轉(zhuǎn)速搖床中培養(yǎng)48 小時。YEPD培養(yǎng)基成分為酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖。②離心收獲工程菌，磷酸鈉緩沖液(PBS，pH7. 4)洗滌3次，置于60°C水浴1小時， 失活酵母細胞，制備成為5 X 108/ml細胞懸液，按照每次劑量0. Iml細胞懸液(即5 X IO7細 胞數(shù))，皮下注射法免疫年齡7-9周雌性C57BL/6小鼠，共3次，每次間隔1周，分別于免疫 后的9天、16天采血，分離血清。以宿主釀酒酵母Y16和PBS溶液免疫小鼠作為對照1、對 照2。每組小鼠數(shù)量4只。③免疫小鼠血清中結(jié)核桿菌抗原特異性抗體IgG檢測。采用ELISA檢測免疫小鼠 血清中結(jié)核桿菌抗原Ag85B特異抗體IgG水平。ELISA方法按照常規(guī)程序操作。96孔酶標(biāo) 板每孔包被抗原蛋白Ag85B 0. 5微克，血清樣本稀釋倍數(shù)為500倍，ELISA反應(yīng)底物為TMB， 檢測波長450nm。結(jié)果顯示，表達結(jié)核桿菌ESAT6-Ag85B融合抗原(EA)的重組酵母Y16/pHR_EA免 疫小鼠后能夠有效激起小鼠產(chǎn)生抗Ag85B的抗體IgG，而作為對照的宿主釀酒酵母Y16免疫 后不能產(chǎn)生Ag85B特異抗體。序列表<210>1<211>37<212>DNA<213>Artificial<400>1aggaagctta gatctatgac agagcagcag tggaatt37<210>2<211>30<212>DNA<213>Artificial<400>2
atggatcctg cgaacatccc agtgacgttg30<210>3<211>26<212>DNA<213>Artificial<400>3atagatcttt ctcccggccg gggctg26<210>4<211>31<212>DNA<213>Artificial<400>4cagtcgactt atcagccggc gcctaacgaa c3權(quán)利要求
1.一種結(jié)核桿菌抗原表達載體，其特征在于，該表達載體含有酵母2 μ質(zhì)粒完整序列、 酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子、酵母終止子和結(jié)核桿菌抗原基因。
2.如權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述的酵母啟動子是酵母菊粉酶基因 啟動子、TEFl基因啟動子、ADHl基因啟動子、ADH2基因啟動子、GAPDH基因啟動子、GALl基 因啟動子、GALlO基因啟動子中的任意一種，或者其中兩種及兩種以上啟動子的融合啟動 子。
3.如權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述的酵母終止子是菊粉酶基因終止 子、CYCl基因終止子、TEFl基因終止子、ADHl基因終止子中的一種。
4.如權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述的酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因是LEU2、 ADE2、URA3、TRP1或者HI S3中的一種或者幾種。
5.如權(quán)利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述的結(jié)核桿菌抗原基因是ESAT-6、 Ag85A、Ag85B、Ag85C、MPT-64、熱休克蛋白HSP65或者其中兩種及兩種以上的融合基因。
6.一種含有權(quán)利要求1所述的表達載體的重組釀酒酵母菌株。
7.權(quán)利要求6所述的重組釀酒酵母菌株的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)構(gòu)建含有酵母2μ質(zhì)粒完整序列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子和酵母終止 子的穿梭質(zhì)粒酵母載體部分；(2)構(gòu)建含有酵母啟動子、酵母終止子和結(jié)核桿菌抗原基因的外源基因表達盒；(3)將(1)獲得的穿梭質(zhì)粒酵母載體部分與( 獲得的外源基因表達盒共轉(zhuǎn)化相應(yīng)營 養(yǎng)缺陷型釀酒酵母菌株，在營養(yǎng)缺陷選擇性培養(yǎng)基上篩選培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子，獲得表達結(jié)核桿菌 抗原的重組釀酒酵母菌株。
8.權(quán)利要求1所述的表達載體的制備方法，其特征在于，裂解權(quán)利要求7所得的重組釀 酒酵母菌株，分離純化獲得包含酵母2 μ質(zhì)粒完整序列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動 子、酵母終止子和目標(biāo)外源基因的釀酒酵母重組質(zhì)粒。
9.權(quán)利要求1所述的表達載體的應(yīng)用，其特征在于，將所述的表達載體用于制備抗結(jié) 核桿菌疫苗。
10.權(quán)利要求6所述的重組釀酒酵母菌株的應(yīng)用，其特征在于，將所述的重組釀酒酵母 用于制備抗結(jié)核桿菌疫苗。
全文摘要
本發(fā)明屬于結(jié)核疫苗領(lǐng)域和基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種表達結(jié)核桿菌抗原的重組釀酒酵母，該釀酒酵母菌株含有如下表達載體該表達載體含有酵母2μ質(zhì)粒完整序列、酵母營養(yǎng)缺陷篩選基因、酵母啟動子、酵母終止子和結(jié)核桿菌抗原基因。該表達質(zhì)粒中，除需表達的結(jié)核桿菌抗原基因序列外，沒有非酵母基因序列，只能夠在釀酒酵母細胞內(nèi)生存，不會轉(zhuǎn)移。本發(fā)明所產(chǎn)生的釀酒酵母表達質(zhì)粒充分發(fā)揮了釀酒酵母食品級微生物的優(yōu)勢，安全、高效；而且，酵母細胞自身具有很強的免疫佐劑效應(yīng)，不需添加佐劑；可以作為制備結(jié)核病防治疫苗的優(yōu)良材料。
文檔編號C12N1/19GK102108368SQ20091024731
公開日2011年6月29日 申請日期2009年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月28日
發(fā)明者俞靜, 劉建平, 李育陽, 江佳稀 申請人:復(fù)旦大學(xué)