重組副豬嗜血桿菌免疫保護(hù)性抗原PotD的用途及其制備的亞單位疫苗的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重組PotD蛋白在制備預(yù)防副豬嗜血桿菌病的藥物中的用途，以及由氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的重組PotD蛋白和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成的亞單位疫苗及其用途。本發(fā)明重組PotD蛋白良好的免疫原性和保護(hù)原性，免疫后產(chǎn)生的PotD特異性抗體水平高，制備的亞單位疫苗保護(hù)率高，臨床應(yīng)用前景良好。
【專(zhuān)利說(shuō)明】重組副豬嗜血桿菌免疫保護(hù)性抗原PotD的用途及其制備 的亞單位疫苗

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種重組副豬嗜血桿菌免疫保護(hù)性抗原PotD 及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（Haemophilus Parasuis，HPS)引起家豬及藏 豬的一種泛嗜性細(xì)菌性傳染病，又稱(chēng)"革拉瑟氏病" (Glasser' s Disease)。隨著規(guī)?；?、集 約化豬場(chǎng)的發(fā)展，副豬嗜血桿菌引起的以豬多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、呼吸困難、高熱及高死 亡率為特征的傳染性疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，副豬嗜血桿菌引起的疾病已逐 漸成為世界范圍的重要疾病。
[0003] 我國(guó)近年來(lái)才開(kāi)始逐漸重視對(duì)副豬嗜血桿菌病的研究。副豬嗜血桿菌的血清型眾 多，目前已鑒別十五種血清型，還有15% -41%的未鑒定血清型，其中1，5,10,12,13和14 為強(qiáng)毒株，而我國(guó)流行的血清型為4型和5。不同血清型的副豬嗜血桿菌毒力差異很大，我 們對(duì)其毒力因子及致病機(jī)理知之甚少，至今尚無(wú)有效的通用商品苗和敏感的診斷方法，該 病尚未得到有效控制，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 我國(guó)至今沒(méi)有像豬瘟兔化弱毒疫苗、偽狂犬基因缺失疫苗那樣的成熟疫苗來(lái)針對(duì) 副豬嗜血桿菌病，目前大多都是傳統(tǒng)型滅活苗和弱毒苗，缺乏良好的保護(hù)力，導(dǎo)致臨床病例 多見(jiàn)。而滅活疫苗只能對(duì)同種血清型的菌株具有保護(hù)作用，缺乏交叉保護(hù)力。副豬嗜血桿 菌血清型的多樣性以及占很大比例的不能分型菌株影響了對(duì)具有高效交叉保護(hù)力疫苗的 研制。亞單位疫苗同時(shí)具有活疫苗免疫效力高、交叉保護(hù)力強(qiáng)以及滅活苗的安全性好等優(yōu) 點(diǎn)，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。大部分不能分型菌株副豬嗜血桿菌及其血清型的多樣性影 響了人們對(duì)于具有高效交叉保護(hù)力疫苗的研制。
[0005] PotD (Polyamine transport protein聚胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白）參與大腸埃希氏菌生物膜的 形成，屬于A(yíng)TP-結(jié)合匣（ATP-binding cassette)中的聚胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的一員，該系統(tǒng)包含 PotA，B，C和D，他們同屬于亞精胺偏愛(ài)性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；而PotF，G，H和I則屬于鹽酸丁二胺 偏愛(ài)性的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。聚胺和鹽酸丁二胺則是構(gòu)成體內(nèi)多價(jià)陰離子化合物的重要組成，普遍 存在于包括原核生物在內(nèi)的生物體內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)聚胺過(guò)多或者過(guò)少都將造成細(xì)胞損害。同時(shí) 發(fā)現(xiàn)，PotABCD中的任何一員缺失，都將導(dǎo)致整個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)無(wú)法轉(zhuǎn)運(yùn)聚胺，特別是亞精胺 [8]。 因此作為聚胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)中的重要一員，PotD對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)至關(guān)重要。
[0006] 目前未見(jiàn)重組表達(dá)PotD基因，并用其制備亞單位疫苗的報(bào)道的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種亞單位疫苗。
[0008] 本發(fā)明首先提供了氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重組PotD蛋白在制備預(yù)防 副豬嗜血桿菌病的藥物中的用途。
[0009] 優(yōu)選地,所述藥物包含致免疫有效量的重組PotD蛋白。
[0010] 本發(fā)明亞單位疫苗,它是由氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重組PotD蛋白和藥 學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。
[0011] 優(yōu)選地,所述疫苗包含致免疫有效量的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重組 PotD蛋白以及藥學(xué)上可接受的輔料或者載體。
[0012] 優(yōu)選地，所述的致免疫有效量為不低于0. lug/ml。
[0013] 優(yōu)選地，所述的輔料或者載體為免疫佐劑和/或防腐劑。
[0014] 所述佐劑為完全弗氏佐劑或不完全弗氏佐劑。
[0015] 所述防腐劑為硫柳汞。
[0016] 本發(fā)明還提供了前述的疫苗在制備預(yù)防副豬嗜血桿菌病的藥物中的用途。其中， 所述的預(yù)防副豬嗜血桿菌病的藥物是通過(guò)注射的方式給藥。
[0017] 本發(fā)明采用基因工程的方式重組表達(dá)得到的重組蛋白PotD具有良好的免疫原性 和保護(hù)原性，免疫后產(chǎn)生的PotD特異性抗體水平高，制成疫苗后，可以顯著保護(hù)小鼠抵抗 副豬嗜血桿菌血清5型強(qiáng)毒菌株的攻擊，保護(hù)率高達(dá)80%，可以有效預(yù)防副豬嗜血桿菌病， 臨床應(yīng)用前景良好。
[0018] 以下通過(guò)實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō) 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi) 容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1重組蛋白表達(dá)誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化。其中M為高分子量蛋白預(yù)染marker(購(gòu)自 Tiangen公司），1是未誘導(dǎo)的PET28a-potD-BL21在Oh下的蛋白表達(dá)情況，2-9分別為IPTG 誘導(dǎo)〇h_7h下蛋白的表達(dá)情況；
[0020] 圖2重組蛋白表達(dá)IPTG濃度的優(yōu)化。其中M為高分子量蛋白marker (購(gòu)自Tiangen 公司），其中1是未誘導(dǎo)的PET28a-potD-BL21在培養(yǎng)5h后的蛋白表達(dá)情況，2-9分別為不 同IPTG濃度誘導(dǎo)5h后蛋白的表達(dá)情況；
[0021] 圖3重組蛋白表達(dá)誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化。其中M為高分子量蛋白marker，1、2分別25°C 下未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)情況，3、4分別30°C下未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)情況，5、6 分別37°C下未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)情況，7、8分別42°C下未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá) 情況；
[0022] 圖4表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測(cè)。其中M為高分子量蛋白marker，1為未誘導(dǎo)的 PET28a-BL21，2 為誘導(dǎo)后的 PET28a-BL21 ;3、4、5 為 PET28a-PotD-BL21 經(jīng)過(guò) IPTG 誘導(dǎo)之后 表達(dá)的蛋白，其中3為超聲破碎前的全菌蛋白，4為破碎后的上清蛋白，5為純化后的PotD 蛋白；
[0023] 圖5純化后的PotD蛋白Western-blot檢測(cè)結(jié)果；
[0024] 圖6攻毒后各組保護(hù)率情況統(tǒng)計(jì)。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 1、質(zhì)粒與菌株
[0026] PET_28a(+)質(zhì)粒、感受態(tài)大腸桿菌DH5a和BL21，商購(gòu)。
[0027] 副豬嗜血桿菌CVCC3361，來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心，菌種編號(hào)： CVCC3361。
[0028] 2、主要試劑及緩沖液
[0029] 氯化鈉、碳酸鈉、無(wú)水乙醇、乙酸、醋酸鈉（均購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠(chǎng)）， Tris (三羥甲基氨基甲烷，購(gòu)自北京Biotopped公司），小牛血清（購(gòu)自上海GIBCO公司）， TSB培養(yǎng)基、TSA培養(yǎng)基（均由上海碧迪醫(yī)療器械有限公司代購(gòu)），酵母提取物、胰大豆蛋 白胨（均購(gòu)自英國(guó)OXOID公司），弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑（購(gòu)自SIGM公司）， 羊抗鼠二抗、誘導(dǎo)劑IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，購(gòu)自BI0SHARP)，2XTaq PCR Master Mix(均購(gòu)自 Tiangen) ,DL10000DNA marker、DL2000DNA marker、Premixed Protein Marker(High)、T_Vevor pMD19、限制性?xún)?nèi)切酶 BamH I 和 Xho I (均購(gòu)自 Takara)，小量質(zhì)粒 抽提試劑盒（Plasmid Mini Kit I )、膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit)(均購(gòu)自美國(guó) OMEGA公司），SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、Albumin Bovine V(牛血清白蛋白）（均購(gòu)自北京 Solarbio 公司），T4 連接酶（購(gòu)自 NEW ENGLAND BIOLABS)，GoldView (購(gòu)自賽百盛），瓊脂 糖（購(gòu)自法國(guó) Biowest 公司），kanamycin Sulfate(Kan 卡那霉素 ）、Ampicillin Na(氨節(jié) 青霉素鈉）、槍頭、移液槍、EP管等耗材（均由雅安萬(wàn)科公司代購(gòu)）。
[0030] LB培養(yǎng)基的配方如下：胰蛋白胨（Tryptone) 10g/L、酵母提取物（Yeast extract) 5g/L、氯化鈉（NaCl) 10g/L，用NaOH調(diào)節(jié)該培養(yǎng)基的pH，使其達(dá)到7. 2-7. 4,高壓蒸 汽滅菌30min。
[0031] 包涵體洗滌液（50臟〇1/11^8 - !1(：1口!18.0,0.5111〇1/1恥(：1，2111〇1/1尿素，2% Triton)
[0032] 包涵體溶解液（50mmol/L Tris - HCl ρΗ8· 0,0· 5mol/L NaCl，8mol/L 尿素， 0. 2mmol/L DTT 或 lOOmmol/L β -疏基乙醇，2% Triton)
[0033] 3、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
[0034] SPF昆明小鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。
[0035] 實(shí)施例1本發(fā)明副豬嗜血桿菌免疫保護(hù)性抗原PotD的制備
[0036] 1、重組表達(dá)
[0037] I. IPotD基因的克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建
[0038] 1. 1. 1引物設(shè)計(jì)及合成
[0039] 按照GenBank上已發(fā)表的副豬嗜血桿菌PotD基因序列，利用Primer5. 0軟件，設(shè) 計(jì)了一對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：
[0040] 上游引物（5' 一3'）：GGATCCCATCTTTATACTTGGACAGA(劃線(xiàn)為 BamH I 酶切位點(diǎn)）
[0041] 下游引物（5' 一3'）：CTCGAGTTACTTCGCAGCTTTTAACT(劃線(xiàn)為 Xho I 酶切位點(diǎn)）
[0042] 設(shè)計(jì)的引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成
[0043] I. I. 2PotD 基因的 PCR 擴(kuò)增
[0044] 利用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取副豬嗜血桿菌CVCC3361的基因組。以 副豬嗜血桿菌CVCC3361基因組DNA為模板，按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：
[0045]

【權(quán)利要求】
1. 氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重組PotD蛋白在制備預(yù)防副豬嗜血桿菌病的藥 物中的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于：所述藥物包含致免疫有效量的重組PotD 蛋白。
3. -種亞單位疫苗，其特征在于：它是由氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示的重組PotD 蛋白和藥學(xué)上可接受的輔料或者載體制備而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗包含致免疫有效量的氨基酸序 列如SEQ ID NO :2所示的重組PotD蛋白以及藥學(xué)上可接受的輔料或者載體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的致免疫有效量為不低于0. lug/ml。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的疫苗，其特征在于：所述的輔料或者載體為免疫佐劑和/或 防腐劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述佐劑為完全弗氏佐劑或不完全弗氏 佐劑。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的疫苗，其特征在于：所述防腐劑為硫柳汞。
9. 權(quán)利要求3-8任意一項(xiàng)所述的疫苗在制備預(yù)防副豬嗜血桿菌病的藥物中的用途。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于：所述的預(yù)防副豬嗜血桿菌病的藥物是通 過(guò)注射的方式給藥。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104324371SQ201410637926
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月12日
【發(fā)明者】文心田, 文翼平, 代科, 曹三杰, 黃小波, 伍銳, 張祿滑, 周鵬, 李英, 何綠琴, 丁玲強(qiáng) 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)