專利名稱：β-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)方案屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用堿溶液控制發(fā)酵pH，調(diào) 節(jié)罐壓、通風(fēng)量及攪拌速率控制溶解氧濃度的發(fā)酵新工藝。
背景技術(shù)：
1969年，研究圓弧青霉菌(Pencillium cyclopium)的微生物學(xué)家Shimada和 Matsushima等首次在該菌的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)了聚蘋果酸。1979年，Vert等首次合成了水溶性 脂肪族聚酯——聚蘋果酸，它以聚蘋果酸為唯一單體。1989年，F(xiàn)isher等從黏菌(Physarum Polyc印halum)細(xì)胞中分離出聚蘋果酸，并發(fā)現(xiàn)它是DNA聚合酶a的抑制劑。迄今為止，以 Vert、Cammas、Kajiyama等為代表的國外學(xué)者已對聚蘋果酸性能和應(yīng)用做了較深入的研究。
聚蘋果酸是一種特殊的脂肪族聚酯，以蘋果酸為唯一單體、相互通過酯鍵聯(lián)接而 成。它是天然多聚物中新近開發(fā)的一種生物多聚物。與許多其它天然多聚物不同，聚蘋果 酸分子中有許多自由羧基和非對稱碳原子，這些自由羧基賦予了它許多特別的性質(zhì)，它除 了具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性之外，還具有兩個(gè)顯著的 優(yōu)點(diǎn)(l)易代謝性。由于L-蘋果酸是生物體內(nèi)克雷伯氏三羧酸循環(huán)的中間體，|3-聚蘋 果酸容易在生物體內(nèi)通過正常的三羧酸循環(huán)代謝途徑除去；(2)易修飾性。聚蘋果酸具有 懸掛羧基，容易與其它官能團(tuán)反應(yīng)而制得聚蘋果酸衍生物，或引入功能基團(tuán)或小分子藥物， 從而制得許多具有特殊功能的產(chǎn)物。因此，聚蘋果酸及其衍生物可作為手術(shù)縫合線、組織工 程支架材料、藥物載體或原生藥物、藥物控制釋放體系、食品包裝材料、化妝品等，在生物醫(yī) 藥、食品、化妝品等領(lǐng)域獲得重要的應(yīng)用。 目前國內(nèi)外有關(guān)利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋果酸的專利及文獻(xiàn)非常少，已有的發(fā) 酵生產(chǎn)或人工合成聚蘋果酸(蘋果酸聚合物)的專利有1995年公開的日本專利"生產(chǎn) 蘋果酸聚合微生物的培養(yǎng)方法(JP7308188A2) "、1991年公開的日本專利"酶法生產(chǎn)L-蘋 果酸聚合物(JP4341189A2)"和1992年公開的日本專利"微生物合成L-蘋果酸聚合物 (JP4211385A2)"，這些專利著重描述了產(chǎn)聚蘋果酸菌株的培養(yǎng)方法，及醇析獲得聚蘋果酸 的方法；美國專利US4320753，主要是合成聚蘋果酸和相應(yīng)P_內(nèi)酯的衍生物；中國專利 CN101100687，公開了采用不同乙醇濃度醇析，同時(shí)獲得普魯蘭和聚蘋果酸的方法；中國專 利CN101487034，公開了采用膜技術(shù)制備聚蘋果酸及其鹽的方法。而關(guān)于聚蘋果酸應(yīng)用的 專利較多，如US05811032、US05324519、US5702716等多達(dá)90余項(xiàng)。已有的發(fā)酵生產(chǎn)聚蘋 果酸(蘋果酸聚合物)的文獻(xiàn)有Nagata(1993)用菌株Aureobasidium sp.A-91搖瓶發(fā) 酵，丁二酸銨做氮源，CaC03調(diào)節(jié)p朋.8發(fā)酵7d，獲得聚蘋果酸鈣61g/L ;Nakajima-k (1996) 用非生長型細(xì)胞菌株Aureobasidium sp. A_91，磷酸緩沖液控制pH7. 0， 30°C ，搖瓶發(fā)酵5d， 獲得聚蘋果酸80g/L ;劉雙江(1997)用菌株Aureobasidiumpullulans 591.75， NaOH調(diào)節(jié) pH4. 0， NaN03做氮源，用發(fā)酵反應(yīng)器發(fā)酵9天獲得聚蘋果酸9. 8g/L ;Holler (1999)用菌株 Physarum polyc印halum搖瓶發(fā)酵，1 %蛋白胨做氮源，CaC03調(diào)節(jié)pH5. 5，搖瓶發(fā)酵6d，獲得 聚蘋果酸鈣2. 7g/L。專利及文獻(xiàn)聚蘋果酸發(fā)酵工藝中關(guān)于溶解氧控制未有報(bào)道，pH調(diào)節(jié)存在較大差異，搖瓶發(fā)酵雖然產(chǎn)量較高，但不適宜規(guī)?；a(chǎn)。 到目前為止，發(fā)酵法生產(chǎn)P-聚蘋果酸沒有大規(guī)模的應(yīng)用，其主要原因是沒有適 宜大規(guī)模生產(chǎn)13 -聚蘋果酸的發(fā)酵工藝，發(fā)酵周期過長，產(chǎn)率低，生產(chǎn)成本過高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是流加堿溶液精確控制發(fā)酵液pH，解決因碳酸鈣調(diào)節(jié)
pH造成的pH波動(dòng)、溶氧傳質(zhì)困難及Ca離子易與其它培養(yǎng)基成份起反應(yīng)造成沉淀的問題；
采用有機(jī)氮源與無機(jī)氮源復(fù)配使用，解決菌體生長緩慢及發(fā)酵周期過長的問題；調(diào)節(jié)罐壓、
通氣量及攪拌速率控制發(fā)酵過程溶解氧濃度。 本發(fā)明解決該技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是 1. |3 -聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于 將出芽短梗霉ipe-l經(jīng)活化和種子培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在控制pH及溶解 氧條件下，在含碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出芽短梗霉ipe-l ;采用堿 溶液控制發(fā)酵pH ;調(diào)節(jié)通風(fēng)量、罐壓及攪拌速率控制溶解氧濃度。
說明 (1)第1步所采用的活化培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，12rC滅菌15min ;
(2)第1步所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v) :8-15% glucose,0.2% NaN03，0.01% KH2P04，0. 02% MgS04 *71120，0. 05% KCl，O. l-2^有機(jī)氮源，pH 4. 0 7. 0， 121。C滅菌15min ;
(3)第1步菌種活化方法 將出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans ipe-1)采用活化培養(yǎng)基在
20-28 。C進(jìn)行活化培養(yǎng)48-96小時(shí)； (4)第1步采用的種子培養(yǎng)方法 將斜面上活化的種子培養(yǎng)物接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在20-28t:，200r/min條件下 振蕩培養(yǎng)48-96h小時(shí)。 2.根據(jù)步驟l所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于發(fā)酵前16h控制溶 解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在10-80%。 3.根據(jù)步驟1所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于發(fā)酵過程使用有機(jī) 氮源與無機(jī)氮源復(fù)配使用，提供微生物生長所需氮源。 4.根據(jù)步驟1所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于發(fā)酵過程采用堿溶 液控制發(fā)酵pH5. 5-7.0。 5.根據(jù)步驟2所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于發(fā)酵罐罐壓在 0. 01-0. 1Mpa，通風(fēng)量在0. 25-2. 5vvm，攪拌速率根據(jù)所控制的溶解氧值進(jìn)行調(diào)節(jié)。
6.根據(jù)步驟3所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于所采用的有機(jī)氮源 為蛋白胨、酵母粉等，無機(jī)氮源為硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等。 7.根據(jù)步驟4所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于所采用的堿溶液為 氫氧化鈉、碳酸鈉、氨水、液氨或其復(fù)配溶液。 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是第一，采用流加堿溶液精確控制發(fā)酵液pH 值，避免用碳酸鈣調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH的波動(dòng)及溶氧傳質(zhì)困難的問題；第二，添加適量的有機(jī)氮 源促進(jìn)菌體生產(chǎn)，解決菌體生長緩慢，發(fā)酵周期過長的問題；第三，調(diào)節(jié)罐壓、通氣量及攪拌速率控制溶解氧濃度，使菌體處于大量分泌P -聚蘋果酸階段。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，本發(fā)明所涉及的主題保護(hù)范圍并非僅限
于這些實(shí)施例。 實(shí)施例1 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸
第一步，培養(yǎng)基配制 ①活化培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基，12rC滅菌15min ; ②種子培養(yǎng)基的配制(w/v) :8 % glucose，O. 2 % NaN03，0. 01 % KH2P04，0. 02 %
MgS04 7H20，0. 05% KCl， lg/1蛋白胨，pH 4. 0 4. 5， 121。C滅菌15min。 ③發(fā)酵培養(yǎng)基的配制(w/v) :8-15% glucose, 0. 2% NaN03，0. 01% KH2P04，0. 02%
MgS04 7H20，0. 05% KC1， 121。C滅菌15min。 第二步，菌種活化 將4。C保存的出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans ipe_l)，轉(zhuǎn)接于活化培 養(yǎng)基斜面上，在25t:進(jìn)行活化培養(yǎng)72小時(shí)。
第三步，種子培養(yǎng) 將斜面上活化的種子培養(yǎng)物接種于裝100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在 25°C ， 200r/min條件下振蕩培養(yǎng)48小時(shí)。
第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， pH5. 5，溫度25t:，轉(zhuǎn)速600r/min，0. 75vvm，溶解氧自然，培養(yǎng)7天。最后得發(fā)酵液中P-聚 蘋果酸含量為3. 55g/L，菌體干重6. 17g/l 。
實(shí)施例2 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸 第一步，培養(yǎng)基配制 同實(shí)施例1 第二步，菌種活化 同實(shí)施例1 第三步，種子培養(yǎng) 同實(shí)施例1 第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， p朋.0，溫度25t:，轉(zhuǎn)速600r/min，0. 75vvm，溶解氧自然，培養(yǎng)7天。最后得發(fā)酵液中P-聚 蘋果酸含量為7. 50g/L，菌體干重8. 38g/l 。
實(shí)施例3 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸
第一步，培養(yǎng)基配制
同實(shí)施例1
5
第二步，菌種活化
同實(shí)施例1
第三步，種子培養(yǎng)
同實(shí)施例1
第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， pH7.0，溫度25t:，轉(zhuǎn)速600r/min，0. 75vvm，培養(yǎng)7天。最后得發(fā)酵液中P _聚蘋果酸含量 為2. 64g/L，菌體干重7. 08g/l 。
實(shí)施例4 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸
第一步，培養(yǎng)基配制 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加lg/1蛋白胨，其他同實(shí)施例1 第二步，菌種活化 同實(shí)施例1 第三步，種子培養(yǎng) 同實(shí)施例1 第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， p朋.0，溫度25°C ，轉(zhuǎn)速300-700r/min， 0. 25-2. 5vvm，罐壓在0. 01-0. 1Mpa，發(fā)酵前16h控制 溶解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在30%，培養(yǎng)7天。最后得發(fā)酵液中13-聚蘋 果酸含量為8. 81g/L，菌體干重17. 01g/l。
實(shí)施例5 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸
第一步，培養(yǎng)基配制 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加15g/l蛋白胨，葡萄糖為150g/l，其他同實(shí)施例1 同實(shí)施例1 第二步，菌種活化 同實(shí)施例1 第三步，種子培養(yǎng) 同實(shí)施例1 第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， p朋.O，蛋白胨15g/l，溫度25。C，轉(zhuǎn)速300-800r/min，0. 25-2. 5vvm，罐壓在0. 01-0. 1Mpa，發(fā) 酵前16h控制溶解氧濃度大于70 % ，之后控制溶解氧濃度在30% ，培養(yǎng)4天。最后得發(fā)酵 液中P _聚蘋果酸含量為24. 19g/L，菌體干重39. 57g/l 。
實(shí)施例6 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸
第一步，培養(yǎng)基配制 發(fā)酵培養(yǎng)基中添加20g/l蛋白胨，葡萄糖為150g/l，其他同實(shí)施例1
6
第二步，菌種活化
同實(shí)施例1
第三步，種子培養(yǎng)
同實(shí)施例1
第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， p朋.O，蛋白胨20g/l，溫度25。C，轉(zhuǎn)速300-1000r/min，0. 25-2. 5vvm，罐壓在0. 01-0. 1Mpa， 發(fā)酵前16h控制溶解氧濃度大于70 % ，之后控制溶解氧濃度在30 % ，培養(yǎng)4天。最后得發(fā) 酵液中P -聚蘋果酸含量為24. 42g/L，菌體干重55. 05g/l 。
實(shí)施例7 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸 第一步，培養(yǎng)基配制 同實(shí)施例6 第二步，菌種活化 同實(shí)施例1 第三步，種子培養(yǎng) 同實(shí)施例1 第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， p朋.O，蛋白胨15g/l，溫度25。C，轉(zhuǎn)速300-800r/min，0. 25-2. 5vvm，罐壓在0. 01-0. 1Mpa，發(fā) 酵前16h控制溶解氧濃度大于70 % ，之后控制溶解氧濃度在10 % ，培養(yǎng)4天。最后得發(fā)酵 液中P _聚蘋果酸含量為24. 71g/L，菌體干重41. 6g/1。
實(shí)施例8 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸 第一步，培養(yǎng)基配制 同實(shí)施例6 第二步，菌種活化 同實(shí)施例1 第三步，種子培養(yǎng) 同實(shí)施例1 第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， p朋.O，蛋白胨15g/l，溫度25。C，轉(zhuǎn)速300-1200r/min，0. 25-2. 5vvm，罐壓在0. 01-0. 1Mpa， 發(fā)酵前16h控制溶解氧濃度大于70 % ，之后控制溶解氧濃度在40 % ，培養(yǎng)4天。最后得發(fā) 酵液中P -聚蘋果酸含量為22. 78g/L，菌體干重44. 24g/l 。
實(shí)施例9 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸
第一步，培養(yǎng)基配制
同實(shí)施例6
第二步，菌種活化
同實(shí)施例l
第三步，種子培養(yǎng)
同實(shí)施例l
第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝禮發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， p朋.O，蛋白胨15g/l，溫度25。C，轉(zhuǎn)速300-1200r/min，0. 25-2. 5vvm，罐壓在0. 01-0. 1Mpa， 發(fā)酵前16h控制溶解氧濃度大于70 % ，之后控制溶解氧濃度在70 % ，培養(yǎng)4天。最后得發(fā) 酵液中P -聚蘋果酸含量為35. 17g/L，菌體干重54. 96g/l 。
實(shí)施例10 按如下步驟發(fā)酵生產(chǎn)13 -聚蘋果酸 第一步，培養(yǎng)基配制 同實(shí)施例6 第二步，菌種活化 同實(shí)施例1 第三步，種子培養(yǎng) 同實(shí)施例1 第四步，接種發(fā)酵 將第三步制得的培養(yǎng)物以10%的接種量接種于裝4L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L發(fā)酵罐中， p朋.O，蛋白胨15g/l，溫度25。C，轉(zhuǎn)速300-1200r/min，0. 25-2. 5vvm，罐壓在0. 01-0. 1Mpa， 發(fā)酵前16h控制溶解氧濃度大于70 % ，之后控制溶解氧濃度在80 % ，培養(yǎng)4天。最后得發(fā) 酵液中P -聚蘋果酸含量為32. 27g/L，菌體干重60. 21g/l。
權(quán)利要求
β-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于將出芽短梗霉ipe-1經(jīng)活化和種子培養(yǎng)后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在控制pH及溶解氧條件下，在含碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出芽短梗霉ipe-1；采用堿溶液控制發(fā)酵pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量、罐壓及攪拌速率控制溶解氧濃度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于發(fā)酵前16h控制溶 解氧濃度大于70%，之后控制溶解氧濃度在10-80%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于發(fā)酵過程使用有機(jī) 氮源與無機(jī)氮源復(fù)配使用，提供微生物生長所需氮源。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于發(fā)酵過程采用堿溶液控制發(fā)酵pH5. 5-7.0。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于發(fā)酵罐罐壓在 0. 01-0. 1Mpa，通風(fēng)量在0. 25-2. 5vvm，攪拌速率根據(jù)所控制的溶解氧值進(jìn)行調(diào)節(jié)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的e-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于所采用的有機(jī)氮源 為蛋白胨、酵母粉等，無機(jī)氮源為硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨等。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的P-聚蘋果酸發(fā)酵新工藝，其特征在于所采用的堿溶液為 氫氧化鈉、碳酸鈉、氨水、液氨或其復(fù)配溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物發(fā)酵法生產(chǎn)β-聚蘋果酸的新工藝。通過下述方案予以實(shí)現(xiàn)在控制pH及溶解氧條件下，在含碳源、氮源、無機(jī)鹽及微量元素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)出芽短梗霉ipe-1；采用堿溶液控制發(fā)酵pH；調(diào)節(jié)通風(fēng)量、罐壓及攪拌速率控制溶解氧濃度。pH5.5-7.0，有機(jī)氮源與無機(jī)氮源復(fù)配使用，發(fā)酵前16h控制溶解氧濃度大于70％，之后控制溶解氧濃度10-80％適于大量積累β-聚蘋果酸。
文檔編號C12R1/645GK101696434SQ20091023664
公開日2010年4月21日 申請日期2009年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者萬印華, 伊守亮, 曹偉鋒, 沈飛, 蘇儀, 趙方, 陳向榮 申請人:中國科學(xué)院過程工程研究所;