專利名稱：一種耐熱耐堿木聚糖酶重組工程菌bl21-xa及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域，更具體涉及一種耐熱耐堿木聚糖酶重組工 程菌BL21-XA及其應用。
背景技術(shù)：
木聚糖酶是一類可以催化分解半纖維、木聚糖、支鏈木寡糖的水解酶類。它們不同 于一般的酶類，它是一種內(nèi)切酶系，對底物具有很好的轉(zhuǎn)糖基和降解作用。近年來隨著人們 對于該酶應用范圍認識的增強，此類酶得到了一定的研究。然而由于生產(chǎn)中使用木聚糖酶 常需要有一定的高溫條件和較高的耐堿性，因此耐熱嗜堿木聚糖酶的選育具有極大潛能的 應用價值；但是現(xiàn)有技術(shù)中理想的制備耐熱耐堿木聚糖酶用的重組工程菌比較缺乏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中對于制備耐熱耐堿木聚糖酶用的重組工程菌比 較缺乏的問題，提供一種耐熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA及其應用，由該工程菌 BL21-XA制備的熱穩(wěn)定木聚糖酶具有很好的活性、耐受性好、pH值適應性寬，耐熱耐堿性等 性能。本發(fā)明的含有土芽孢桿菌屬(Gebacillus sp.)嗜熱菌TC-W7的高溫木聚糖酶基 因的重組質(zhì)粒PXA 所述重組質(zhì)粒的核苷酸序列的堿基序列為如SEQ NO. 1中所述。本發(fā)明的耐熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA 所述重組工程菌BL21-XA中含 有上述的高溫木聚糖酶基因的重組質(zhì)粒PXA。本發(fā)明的耐熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA，用大腸桿菌為宿主細胞得到大 腸埃希氏重組工程菌[Escherichia coli BL21-XA]，該菌株已于2009年7月22日由中國 典型培養(yǎng)物保藏中心收到登記入冊，并于2009年7月25日由該保藏中心檢測完畢為存活， 其保藏號為CCTCC :M209164。本發(fā)明的耐熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA構(gòu)建為溫泉樣品經(jīng)木聚糖平板 分離、純化，得到酶活較大的菌株TC-W7。經(jīng)16SrDNA鑒定為Gebacillus sp. TC-W7。從土芽 孢桿菌屬(Gebacillus sp.)嗜熱菌TC-W7中采用常規(guī)或采用基因組提取試劑盒提取其總 DNA ；以所提取的嗜熱菌Gebacillus sp. TC-W7總DNA為模板，采用木聚糖酶酶基因簡并引 物進行PCR擴增，獲得1200bp的DNA片段，測序驗證。采用基因工程工具酶，將擴增的DNA片 段連接到質(zhì)粒載體pGEX中；然后用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3) 感受態(tài)細胞，均勻涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100 u g/ml ；挑取陽性重組工程菌 菌落，提取質(zhì)粒；隨后采用雙酶切和測序的方法鑒定該木聚糖酶的DNA片段已正確融入了 表達載體本發(fā)明的熱穩(wěn)定木聚糖酶含有如SEQ NO. 1中所述的DNA的堿基序列。本發(fā)明的熱穩(wěn)定木聚糖酶為具有SEQ NO. 2氨基酸序列的蛋白質(zhì)，或者熱穩(wěn)定木聚 糖酶也可以是將序列SEQ N0. 2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸取代、缺失或添加，并
3且具有序列SEQ NO. 2的相同活性的由序列SEQ NO. 2衍塵的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的熱穩(wěn)定木聚糖酶的制備步驟包括1、土芽孢桿菌屬(Gebacillus sp.)嗜熱菌TC-W7的分離鑒定將所采集的樣品涂 布木聚糖平板后，挑取單菌落進行劃線純化，將純化后的菌株點種透明圈觀察平板上，選取 有透明圈產(chǎn)生的菌株進行復篩，從而得到酶活較大的菌株TC-W7。對該菌株進行菌落形態(tài)， 菌株形態(tài)的觀察，革蘭氏屬性以及16SrDNA的鑒定，命名為Gebacillus sp. TC-W7。2、熱穩(wěn)定木聚糖酶酶基因的克隆從土芽孢桿菌屬(Gebacillus sp.)嗜熱菌 TC-W7中采用常規(guī)或采用基因組提取試劑盒提取其總DNA ；以所提取的嗜熱菌Gebacillus sp. TC-W7總DNA為模板，采用木聚糖酶酶基因簡并引物進行PCR擴增，獲得1200bp的DNA 片段，測序驗證。3、熱穩(wěn)定木聚糖酶重組工程菌的構(gòu)建采用基因工程工具酶，將擴增的DNA片段 連接到質(zhì)粒載體PGEX中；然后用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)感 受態(tài)細胞，均勻涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100 u g/ml ；挑取陽性重組工程菌菌 落，提取質(zhì)粒；隨后采用雙酶切和測序的方法鑒定該木聚糖酶的DNA片段已正確融入了表 達載體；4、重組工程菌按微生物發(fā)酵和酶工程技術(shù)制備熱穩(wěn)定木聚糖酶。本發(fā)明的熱穩(wěn)定木聚糖酶可以用于生物質(zhì)能源、食品、造紙或醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域，對 木聚糖具有降解、糖基轉(zhuǎn)化的作用。本發(fā)明的顯著優(yōu)點是本發(fā)明提供的木聚糖酶重組工程菌BL21-XA生產(chǎn)的木聚 糖酶具有很好的性能1、該木聚糖酶的最適作用溫度為75°C，但在95°C時仍有一定的酶 活，表現(xiàn)了很好的耐熱性，同時也具有很強的熱穩(wěn)定性，70°C耐受150min后仍保持著70% 的活性，該酶對熱也具有較廣的耐受范圍(35-95度)；2、該酶對pH值有較寬的適應性 (3. 2-10. 2)，其最適最適作用pH為pH8. 2，在偏堿性條件下比較穩(wěn)定，pH7. 2與8. 2耐受 90min后酶活仍高于80%的酶活，在pH10. 2耐受90min后仍具有50%的酶活，表現(xiàn)了很好 的耐堿性能。3、該酶對去污劑和抑制劑有較強的抗逆性，2-Me、Tween20、Triton X_100、DDT 在不同程度上均對該酶有激活作用。4、金屬離子Na+，K+，Li+對該酶有較好的促進作用。5、 由于在造紙工業(yè)中紙漿漂白所需的木聚糖酶應具有在高溫強堿條件下熱穩(wěn)定性強、堿穩(wěn)定 強以及抗化學物質(zhì)與金屬離子的特點，本發(fā)明得到的木聚糖酶顯然具有這些方面的優(yōu)勢， 非常適合在紙漿工業(yè)塵產(chǎn)中應用。

圖1是本發(fā)明的木聚糖酶基因的克隆，其中A 木聚糖酶基因的PCR擴增；B 重組 質(zhì)粒的雙酶切驗證(BamH I和Xho I)。圖2是本發(fā)明的木聚糖酶在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的表達，其中泳道1，只含空載 的菌，未誘導；2，只含空載的菌，誘導；3，含重組質(zhì)粒的菌，未誘導；4，含重組質(zhì)粒的菌，誘 導；5，GST純化蛋白GST-XA ；6，純化蛋白經(jīng)凝血酶酶切。圖3重組酶的最適反應溫度測定曲線圖，酶與底物在不同溫度下反應30分，然后 進行酶活測定。圖4是重組酶的溫度耐受測定曲線圖，酶先在不同溫度下溫育不同時間，然后加 底物反應30分，再進行殘余酶活的測定。圖5重組酶的最適反應pH測定曲線圖，酶與底物在不同pH下反應30分，進行酶活測定。圖6是重組酶的pH耐受測定曲線圖，酶分別在不同pH下溫育不同時間，然后加底 物，反應30分后，再進行酶活測定。圖7是酶抑制劑和去污劑對重組木聚糖酶活的影響圖，重組酶在抑制劑(ImM)及 去污劑(0.1%)作用下酶活測定。圖8是金屬離子對重組木聚糖酶酶活的影響圖，在10mM不同濃度的金屬離子作用 下，進行酶活的測定。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)條件如 Sambrook等所著的《分子克隆實驗室手冊》(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中所述的實驗條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1.嗜熱菌TC-W7的分離與鑒定將從福建永泰溫泉采集的樣品，均勻涂布在以木聚糖為碳源的篩選平板上，挑取 單菌落進行劃線純化，然后將純化后的菌株點種于透明圈觀察平板上，60°C培養(yǎng)兩天后，用 0. 剛果紅染色30min，再用lmol/L NaCl溶液脫色。挑選周圍有透明圈產(chǎn)生的菌落進行 搖瓶發(fā)酵復篩，選取酶活較大的菌株TC-W7。該菌株平板上菌落白色，扁平狀，粘性，半透明，邊緣不規(guī)則，帶有小“V”形缺刻。革 蘭氏染色結(jié)果為陽性，顯微鏡下的形態(tài)為長桿狀。16S rDNA鑒定采用天根細菌基因組提 取試劑盒說明書提取DNA，用細菌通用引物27F、1500R進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后 與PMD-18T載體相連，轉(zhuǎn)化E. coli DH5 a，雙酶切驗證后由北京天根有限公司測序。測序結(jié) 果與GeneBank數(shù)據(jù)庫序列進行相似性比較，初步確定該菌株屬于Gebacillus sp.，命名為 Gebacillus sp. TC-W7。實施例2.嗜熱菌Gebacillus sp. TC-W7木聚糖酶基因的克隆以所提取的嗜熱菌Gebaci 1 lus sp. TC-W7總DNA為模板，采用下列簡并引物 sense primerXA:[5' -CAT (C)ACA (G)C (T)TGGTTTGGCA-3' ], antisense primer XA [5’ -A(T)CCCCAG(A)AAC(T)GTG(A)AC-3']或者來源于簡并引物的一對特異引物。PCR反 應體系如下95°C，4分鐘，一個循環(huán)；95°C，1分鐘，55°C，1分鐘，72°C，1分鐘，30個循環(huán)； 72°C，10分鐘一個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖電泳驗證得到一個約1200bp的DNA片段，測序 驗證。實施例3.木聚糖酶重組工程菌構(gòu)建，木聚糖重組酶的表達及純化采用基因工程工具酶，將擴增的DNA片段連接到質(zhì)粒載體pGEX中。然后用連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞，均勻涂布在LB平板(含 Ampl00ug/ml)上。挑取陽性重組工程菌菌落，提取質(zhì)粒。隨后采用雙酶切和測序的方法鑒 定該木聚糖酶的DNA片段已正確融入了表達載體。挑取含有重組質(zhì)粒的單菌落于3ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100 u g/ml)，37°C搖培 過夜。吸取1ml菌液于新的100ml LB液體培養(yǎng)基(含Amp 100 u g/ml)，30°C搖培至0D6(1(1 為0.6左右，加入IPTG至終濃度0.4mM，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)4h。收集菌液離心，去上清。將細胞
5用適量PBS(pH 7.2)重懸，超聲裂解菌體，離心去沉淀，上清中的重組蛋白木聚糖酶用GST 柱進行親和純化。性能測定實施例4.木聚糖酶活性測定按照Bailey et al [8]等建立的酶活測定方法(DNS)。適量酶液與底物混合后， 75°C溫育30分鐘，通過測定540nm波長下的吸光值判定酶活。酶的定義為，單位時間內(nèi)水 解釋放出1 y mol還原糖木糖所需的酶量Miller [9]。實施例5.木聚糖酶的性質(zhì)鑒定(1)酶最適反應溫度與耐受性的測定以的oat spelt xylan為底物，在pH為7. 2緩沖液的中，于不同溫度下反應 30min，分別測定重組木聚糖酶的活性(重復三次)，以不加酶液的反應體系為對照。結(jié)果顯 示，重組木聚糖反應的最適溫度是75°C，其反應溫度范圍在50°C 90°C，當溫度高于或低 于最適反應酶活時，酶活逐漸降低(圖3)。將重組的木聚糖酶加入緩沖液中，于不同溫度條件下溫浴不同時間，迅速加入含 有底物的反應體積，測定木聚糖酶的殘余酶活。結(jié)果顯示，重組酶在65°C和70°C條件下的 熱穩(wěn)定性較強，耐受2. 3h后仍有70%的酶活(圖4)。75°C時，重組酶的半衰期為70min，溫 度高于80°C，酶的熱穩(wěn)定性下降比較快。(2)重組酶的最適pH與pH耐受性測定以的oat spelt xylan為底物，于最適溫度條件下，在不同pH(pH3. 2-10. 2)的 緩沖液中反應30min，以不加酶液的反應體系為對照，測定木聚糖酶的酶活(重復三次)。結(jié) 果顯示，重組木聚糖酶的反應最適pH為8. 2 (圖5)，當pH超過10. 2或低于5. 2時，木聚糖 酶的活性逐漸降低。將重組的木聚糖酶加入不同pH緩沖液中，于不同pH溫浴不同時間后取出，迅速加 入含有底物的反應體積，測定木聚糖酶的殘余酶活。結(jié)果顯示重組酶在PH7. 2-9. 2這個范 圍內(nèi)比較穩(wěn)定，耐受60min后酶活仍高于75 %的酶活，在pH10. 2耐受60min后仍具有70 % 的酶活，然后這個條件下酶活下降的比較迅速(圖6)。(3)去污劑和抑制劑對酶活的影響在底物溶液中加入10mM或1 %的酶抑制劑(EDTA，2_Me，SDS，PMSF和DDT)和去污 劑(Tween20，Triton X-100)，在75°C，pH8. 2的條件下，以不加酶抑制劑和去污劑的底物溶 液為對照，測定重組木聚糖酶的活性(重復三次)。結(jié)果顯示(圖7)，EDTA和PMSF能夠抑 制其大約80%的活性，SDS對該酶幾乎沒有什么影響，2-Me、Tween20、Triton X-100,DDT在 一定程度上對該重組酶有促進作用。(4)金屬離子對酶活的影響在底物緩沖液液中加入終濃度為10mM的金屬離子，以不加金屬離子的反應體系 為對照，在72°C，pH8.2條件下測定重組木聚糖酶的活性(重復三次)。結(jié)果如圖8所示，一 價的金屬離子(如Li+、Na+、K+)對重組木聚糖酶有促進作用；二價的金屬離子Mg2+，Ca2+, Ba2+和Mn2+對該重組酶也有促進作用。關(guān)于本發(fā)明的遺傳資源的直接來源和原始來源的說明如下遺傳資源名稱高溫木聚糖酶基因XA ；
遺傳資源取自微生物；獲取方式自行采集；直接來源獲取時間2008年8月；采集方式采集地(國家、省(市))中國福建福州采集者名稱(姓名)劉斌；張寧寧采集者聯(lián)系方式0591-83794548 ； 13055783073原始來源采集者名稱(姓名)劉斌；張寧寧采集者聯(lián)系方式0591-83794548 ； 13055783073獲取時間2006年10月獲取地點(國家、省(市))中國福州市永泰縣序列表SEQ NO. 1<110>福建農(nóng)林大學<120> 一種嗜熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA及其應用<160>2<210>1<211>1224<212>DNA<213> 土芽孢桿菌屬(Gebacillus sp)嗜熱菌<220><223><400>1atgttgaaaattagggatgaagcgcattgcgctgttgaacaacagcattgttcaattttgcgtttccacaggccaaccaattaaaacggatattgggacgtatcaaatcgggcaacaagagctctttatacatcagtcccatgtttgccg
7
gatcgcgaaaagcgataatagttggattctcatttatgctgttgctccct60cgaatgcattggcaaaaactgaacaatcatactctaaaaagcctcaaatc120atgccccacaattggaccagcgctacaaagattcattcactattggtgcg180cttatcagctactaaacgagaaagacgcacaaatgctaaaacgccatttt240tcgctgagaacgttatgaagccgattaatattcaaccggaagaaggaaaa300ctgaggcggatcaaatcgttcggtttgcta3.3.3.3.3.C3.CC3.tatggatatc360cgctcgtttggcatagccaagtacctcaatggttctttcttgacaaggaa420tggtcaatgaaacggaccctgtgaaacgcg3.3. C 3.3.3.3.13.3.acagctgtta480tcgaaacccatattaaaacgattgtcgagcggtataaagatgacatcaaa540ttgtaaatgaggtagtcggggatgatggagaattgcgcgattccccatgg600ctggcatcgattatattaaggtagcgttccaaacagcaagaaaatatggc660ttaaactttacattaatgattacaatacggaagttgaaccaaagcgaagc720acttggtgaaacaattaaaagaagagggcattcccattgatggtattggc780acatccaaattgactggccttctgaagaggaaatcgaaaaaacgattatc840atctagggttagacaaccaaattactgagctggatgtgagcatgtacggc9000089]tggccgccgc gggcctaccc gtcgtatgacgccattccgg agcaaaagtttttggaccaa0090]gcgaatcgct atgatcgattgtttaagctgtatgaaaaac acagcgataa aatcagtaac0091]gtcaccttct ggggcatcgccgacaaccatacgtggctcg acagtcgagcggatgtttac0092]tatgatgctg atgggaatgtgattgtagacccgaaagccc catacacgag agtggaaaaa0093]gggaatggaa aagatgcgccatttgtgttcgaccccgaat acaacgtaaa acctgcgtat0094]tgggctatta tcgatcataa gtga0095]SEQ NO. 20096]<210>20097]<211>12240098]<212>DNA0099]<213> 土芽孢桿菌屬(Gebacillus sp)嗜熱菌0100]<220>0101]<223>0102]<400>20103]atgttgagategcgaaaa gcgataatagtt gga ttctea ttt 450104]METLeuLysArgSerArgLys AlalielieVal Gly PheSer Phe0105]1510150106]atgctgttgctccct600107]METLeuLeuLeuPro0108]200109]ttagggatgacgaatgcattg gcaactgaa caa teatac tct 1050110]LeuGlyMETThrAsnAlaLeu AlaLysThrGlu Gin SerTyr Ser0111]2530350112]clclclaagcctcaaate1200113]LysLysProGinlie0114]400115]agegcattgcatgccccacaa ttggaccagcgc tac aaagat tea 1650116]SerAlaLeuHisAlaProGin LeuAspGinArg Tyr LysAsp Ser0117]4550550118]ttcactattggtgcg1800119]PheThrlieGlyAla0120]600121]getgttgaaccttatcageta etaaacgagaaa gac gcacaa atg 2250122]AlaValGluProTyrGinLeu LeuAsnGluLys Asp AlaGin MET0123]6570750124]etacgccatttt2400125]LeuLysArgHisPhe0126]800127]aacageattgtcgetgagaac gttatgaagccg att aatatt caa 285
960 1020 1080 1140 1200 1224
ASh Set Ile Val Ala Glu ASh Val ME／Lys Pro Ile ASh Ile Gln
859095
Pro Glu Glu Gly Lys
100
ttC aat ttt gct gag gcg gat Caa atC gtt cgg ttt gct aaa aaa345
Phe ASh Phe Ala Glu Ala Asp Gln Ile Val Arg Phe Ala Lys Lys
105110115
CaC Cat atg gat atC 360
HiS HiS ME／Asp Ile
120
cgt ttC CaC acg CtC gtt tgg Cat agc Caa gta CCt Caa tgg ttC405
Arg Phe HiS／hr Leu Val／rio HiS Set Gln Val Pro Gln／rio Phe
125130135
ttt Ctt gac aag gaa 420
Phe Leu Asp Lys Glu
140
ggc Caa CCa atg gtc aat gaa acg gac CCt gtg aaa cgc gaa Caa465
Gly Gln Pro ME／Val ASh Glu／hr Asp Pro Val Lys Arg Glu Gln
145150155
aat aaa cag ctg tta 480
ASh Lys Gln Leu Leu
160
tta aaa cgg atC gaa aCC Cat att aaa acg att gtc gag cgg tat525
Leu Lys Arg Ile Glu／hr HiS Ile Lys／hr Ile Val Glu Arg／yr
165170175
aaa gat gac atC aaa 540
Lys Asp Asp Ile Lys
180
tat tgg gac gtt gta aat gag gta gtc ggg gat gat gga gaa ttg 585
／yr／rio Asp Val Val ASh Glu Val Val Gly Asp Asp Gly Glu Leu
185190195
Arg Asp Set Pro／rio
200
tat Caa atC gct ggc atC gat tat att aag gta gcg ttC Caa aCa645
／yr Gln Ile Ala Gly Ile Asp／yr Ile Lys Val Ala Phe Gln／hr
205210215
gca aga aaa tat ggc 660
Ala Arg Lys／yr Gly
220
ggc aaC aag att aaa Ctt taC att aat gat taC aat acg gaa gtt605
225230235
gaa CCa aag cga agc 720
Glu Pro Lys Arg Set
240
gct Ctt tat aaC ttg gtg aaa Caa tta aaa gaa gag ggc att CCC765
Ala Leu／yr ASh Leu Val Lys Gln Leu Lys Glu Glu Gly Ile Pro
245250255
att gat ggt att ggc 780
Ile Asp Gly Ile Gly
260
Cat cag tCC CaC atC Caa att gac tgg CCt tCt gaa gag gaa atC825
HiS Gln Set HiS Ile Gln Ile Asp／rio Pro Set Glu Glu Glu Ile
265270275
gaa aaa acg att atC 840
Glu Lys／hr Ile Ile
280
atg ttt gcc gat Cta ggg tta gac aaC Caa att aCt gag ctg gat885
ME／Phe Ala Asp Leu Gly Leu Asp ASh Gln Ile／hr Glu Leu Asp
285290295
Val Set ME／／yr Gly
300
tgg ccg ccg cgg gcc taC ccg tcg tat gac gcc att ccg gag Caa 945
／rio Pro Pro Arg Ala／yr Pro Set／yr Asp Ala Ile Pro Glu Gln
305310315
aag ttt ttg gac Caa 960
Lys Phe Leu Asp Gln
320
gcg aat cgc tat gat cga ttg ttt aag ctg tat gaa aaa CaC agc1005
325330335
gat aaa atC agt aaC 1020
Asp Lys Ile Set ASh
340
gtc aCC ttC tgg ggc atC gcc gac aaC Cat acg tgg CtC gac agt1065
Val Thr Phe Trp Gly lie Ala Asp Asn His Thr Trp Leu Asp Ser345350355cga gcg gat gtt tac 1080Arg Ala Asp Val Tyr360tat gat get gat ggg aat gtg att gta gac ccg aaa gcc cca tac 1125Tyr Asp Ala Asp Gly Asn Val lie Val Asp Pro Lys Ala Pro Tyr365370375acg aga gtg gaa aaa 1140Thr Arg Val Glu Lys380ggg aat gga aaa gat gcg cca ttt gtg ttc gac ccc gaa tac aac 1185Gly Asn Gly Lys Asp Ala Pro Phe Val Phe Asp Pro Glu Tyr Asn385390395gta aaa cct gcg tat 1200Val Lys Pro Ala Tyr400tgg get att ate gat catTrp Ala lie lie Asp His405
aag tga 1224
T ~k ~k ~k Lys
1權(quán)利要求
一種含有土芽孢桿菌屬(Gebacillus sp.)嗜熱菌TC-W7的高溫木聚糖酶基因的重組質(zhì)粒pXA，其特征在于所述重組質(zhì)粒的核苷酸的堿基序列如SEQ NO.1中所述。
2.一種耐熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA，其特征在于所述重組工程菌BL21-XA 中含有權(quán)利要求1所述的重組質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA，其特征在于所述 耐熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA屬于大腸桿菌Escherichia coli，其保藏號為 CCTCC :M209164o
4.一種熱穩(wěn)定木聚糖酶，其特征在于所述熱穩(wěn)定木聚糖酶含有如權(quán)利要求1所述的 DNA的堿基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熱穩(wěn)定木聚糖酶，其特征在于所述熱穩(wěn)定木聚糖酶為具有 SEQ NO. 2氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的熱穩(wěn)定木聚糖酶，其特征在于所述熱穩(wěn)定木聚糖酶為采用 權(quán)利要求2所述的耐熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA制備。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的熱穩(wěn)定木聚糖酶，其特征在于所述熱穩(wěn)定木聚糖酶的制備 步驟包括(1)土芽孢桿菌屬(Gebacillus sp.)嗜熱菌TC-W7的分離鑒定溫泉樣品經(jīng)木聚糖平 板分離、純化，得到酶活較大的菌株TC-W7 ；對該菌株進行菌落形態(tài)，菌株形態(tài)的觀察，革蘭 氏屬性以及16SrDNA的鑒定，命名為Gebacillus sp. TC-W7 ；(2)高溫嗜熱木聚糖酶酶基因的克隆從土芽孢桿菌屬(Gebacillussp.)嗜熱菌 TC-W7中采用常規(guī)或采用基因組提取試劑盒提取其總DNA ；以所提取的嗜熱菌Gebacillus sp. TC-W7總DNA為模板，采用木聚糖酶酶基因簡并引物進行PCR擴增，獲得1200bp的DNA 片段，測序驗證；(3)高溫嗜熱木聚糖酶重組工程菌的構(gòu)建采用基因工程工具酶，將擴增的DNA片段連 接到質(zhì)粒載體PGEX中；然后用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Escherichia coli BL21(DE3)感受 態(tài)細胞，均勻涂布在LB平板上，所述LB平板含Amp 100 u g/ml ；挑取陽性重組工程菌菌落， 提取質(zhì)粒；隨后采用雙酶切和測序的方法鑒定該木聚糖酶的DNA片段已正確融入了表達載 體；(4)重組工程菌按微生物發(fā)酵和酶工程技術(shù)制備高溫木聚糖酶。
8.—種如權(quán)利要求4、5、6或7所述的熱穩(wěn)定木聚糖酶的用途，其特征在于所述熱穩(wěn) 定木聚糖酶用于生物質(zhì)能源、食品、造紙或醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域，對木聚糖具有降解、糖基轉(zhuǎn)化的 作用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種嗜熱耐堿木聚糖酶重組工程菌BL21-XA及其應用，本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域，解決現(xiàn)有技術(shù)中對于制備木聚糖酶用的嗜熱耐堿木聚糖酶重組工程菌比較缺乏或者活性、嗜熱耐堿性不理想等問題。本發(fā)明包括含有土芽孢桿菌屬(Gebacillus sp.)嗜熱菌TC-W7的高溫木聚糖酶基因的重組質(zhì)粒pXA的核苷酸序列如SEQ NO.1中所述，含有重組質(zhì)粒pXA的重組工程菌BL21-XA，以及利用該工程菌制備的熱穩(wěn)定木聚糖酶、制備方法及木聚糖酶的應用。本發(fā)明工程菌BL21-XA耐熱性好、pH值適應性寬，耐受性好，其制備的熱穩(wěn)定木聚糖酶具有很好的活性、耐熱耐堿等性能。
文檔編號C12P19/14GK101845450SQ20091022118
公開日2010年9月29日 申請日期2009年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月31日
發(fā)明者劉斌, 吳祖建, 張寧寧, 謝聯(lián)輝 申請人:福建農(nóng)林大學