專利名稱：：Mmp3基因中一個(gè)用于豬肉產(chǎn)品dna溯源的新snp分子標(biāo)記的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬食品安全領(lǐng)域，具體涉及匪P3基因中一個(gè)用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的新SNP分子標(biāo)記。
背景技術(shù)：
：鮮肉及肉制品是人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚氖称?，受我國飲食?xí)慣的影響，豬肉是人們?nèi)粘Ｉ钪凶钪饕娜猱a(chǎn)品，因此豬肉產(chǎn)品的安全成為肉產(chǎn)品安全的重點(diǎn)。肉產(chǎn)品追溯系統(tǒng)作為一種食品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)控制管理手段，在越來越多的國家中得到應(yīng)用，甚至一些國家以法規(guī)的形式明確規(guī)定不具備可追溯條件的肉產(chǎn)品禁止進(jìn)入市場。通過肉制品的溯源管理，能夠?yàn)橄M(fèi)者提供準(zhǔn)確而詳細(xì)的有關(guān)產(chǎn)品的信息，有利于生產(chǎn)經(jīng)營者及時(shí)發(fā)現(xiàn)各環(huán)節(jié)中存在的不安全隱患，為消費(fèi)者提供一個(gè)獲取有效可靠信息的途徑，更為重要的是，大大加強(qiáng)了政府部門對肉質(zhì)品質(zhì)量安全的監(jiān)管，為國家迅速建立食品安全風(fēng)險(xiǎn)的應(yīng)對機(jī)制提供有效信息，有助于社會的安定。在我國的肉產(chǎn)品追溯體系中，主要使用的是標(biāo)簽溯源技術(shù)(物理方法)。如2004年，上海在規(guī)?；B(yǎng)豬廠建立了"電子檔案"；2005年福建省開通了肉產(chǎn)品質(zhì)量查詢系統(tǒng)；2008年，杭州建立了"放心肉"的質(zhì)量安全信息可追溯體系，同年北京市建立了畜禽產(chǎn)品追溯系統(tǒng)，納入14家生豬屠宰企業(yè)和所有牛羊肉家禽生產(chǎn)加工企業(yè)，使用的是IC卡和電子標(biāo)簽(RFID)技術(shù)。國外肉產(chǎn)品追溯系統(tǒng)采用的是DNA溯源技術(shù)(生物學(xué)方法)。DNA溯源技術(shù)的產(chǎn)生源于DNA的遺傳與變異，每個(gè)個(gè)體的DNA指紋圖譜是唯一而且不能改變的，于是可以把DNA作為像指紋那樣的獨(dú)特特征來識別不同的個(gè)體。相比之下，我國采用的標(biāo)簽溯源技術(shù)存在標(biāo)簽丟失、記錄出差、標(biāo)記圖案模糊不清以及標(biāo)簽容易人為改換等缺點(diǎn)，而DNA溯源技術(shù)不受人為因素影響，結(jié)果準(zhǔn)確，并且檢測手段簡單快捷等成為目前國際上被公認(rèn)為最具發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用價(jià)值的快速溯源技術(shù)。用于構(gòu)建個(gè)體DNA指紋圖譜的分子標(biāo)記有AFLP標(biāo)記(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性)、SSR分子標(biāo)記(微衛(wèi)星標(biāo)記)和SNP分子標(biāo)記(單核苷酸多態(tài)性)。其中SNP是最簡單的多態(tài)形式，是由DNA序列中某個(gè)特定位點(diǎn)上的單個(gè)核苷酸發(fā)生變異而引起的序列多態(tài)性。它具有以下特點(diǎn)(l)二等位基因；(2)分布廣，密度大；(3)高遺傳穩(wěn)定性。目前，國外采用的溯源標(biāo)記包括以上三種，有的是采取其中二者的組合，但SNP分子標(biāo)記逐步取代AFLP分子標(biāo)記和SSR分子標(biāo)記已經(jīng)成為一種必然的趨勢。因?yàn)橄啾萐NP分子標(biāo)記，AFLP分子標(biāo)記技術(shù)技術(shù)費(fèi)用昂貴，對DNA的純度和質(zhì)量要求很高；SSR分子標(biāo)記等位基因數(shù)目多，帶型復(fù)雜，給DNA指紋識別自動(dòng)化和規(guī)?；瘞砝щy；因而SNP分子標(biāo)記順理成章成為DNA溯源技術(shù)的最佳分子標(biāo)記。但并非所有的SNP分子標(biāo)記都可以用作溯源?？梢杂糜谒菰吹腟NP分子標(biāo)記至少具有以下特點(diǎn)(l)變異度高，等位基因頻率接近；(2)品種間等位基因分布差異小。匪P基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrixmetalloproteinases，匪P)是一類重要的蛋白水解酶，依據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)的相似性以及降解底物不同可分為5個(gè)亞類。匪P家族擁有26位成員，基質(zhì)溶解素匪P3便是其一。人的匪P3基因定位在染色體11q22.3位置，長度約7.8kb，包括10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種匪P3基因中一個(gè)用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的新SNP分子標(biāo)記，用于豬肉產(chǎn)品的安全性溯源。本發(fā)明對豬匪P3基因進(jìn)行分離，并進(jìn)行SNP的尋找，進(jìn)一步進(jìn)行了變異度的篩選，以期獲得可用于肉產(chǎn)品安全性溯源的分子標(biāo)記。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)—種匪P3基因中一個(gè)用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的新SNP分子標(biāo)記，它是通過在6個(gè)豬品種或品系的試驗(yàn)群體(共計(jì)190個(gè)體)中，分析其匪P3基因的SNP位點(diǎn)等位基因的分布情況，通過克隆測序、序列分析比較而獲得。具體步驟如下(1)在NCBI數(shù)據(jù)庫中，以豬匪P3基因的mRNA序列(NMJ)01166308)為模板設(shè)計(jì)引物分離豬匪P3基因的DNA片段，測序并分析。所得匪P3基因序列長573bp，其中包含完整的內(nèi)含子2、內(nèi)含子3和完整外顯子2的序列，部分外顯子1和部分外顯子3的序列。該匪P3基因的序列如SEQIDNOl所示。在其第182位堿基處有一個(gè)堿基突變182C-182T，檢測該堿基突變182C-182T的正、反向引物的DNA序列如SEQIDNO2和SEQIDNO3所示。(2)采集6個(gè)品種和品系的耳組織樣，190個(gè)個(gè)體。(3)檢測SNP分子標(biāo)記在試驗(yàn)群體的分布，篩選適用于豬肉產(chǎn)品溯源的SNP分子標(biāo)記，并采用PCR-HpyF3I-RFLP方法對其進(jìn)行檢測。本發(fā)明采用克隆子測序比較的方法檢測到豬匪P3基因組片段中存在的SNP位點(diǎn)，并通過在試驗(yàn)豬群中進(jìn)行SNP分子標(biāo)記變異度的分析，獲得一個(gè)新的可以用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的SNP分子標(biāo)記。本發(fā)明的新SNP分子標(biāo)記可應(yīng)用于豬肉產(chǎn)品的安全性溯源。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1分子標(biāo)記的查找(1)引物設(shè)計(jì)在NCB數(shù)據(jù)庫中，以豬匪P3基因的mRNA序列(NM_001166308)為模板，使用Primer5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，用于查找新SNP位點(diǎn)。正向引物5—-GCAGAAGTTCCTTGGGTTGG-3—反向引物5—-AAACTTTTCCAGGTCCGTCAA-3—PCR反應(yīng)總體積為20iil，其中豬基因組DNA約100ng，含1Xbuffer(Promega)，1.5mmol/LMgCl2，dNTP終濃度為150iimol/L，引物終濃度為0.2iimol/L，2UTaqDNA聚合酶(Promega)。PCR擴(kuò)增程序是94。C4min，然后循環(huán)35次(94°C30s，退火56°C30s，72。C延伸20s)，最后72t:延伸10min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.0wt^瓊脂糖凝膠電泳檢測。(2)克隆測序分析將得到的匪P3基因PCR產(chǎn)物按照以下方法進(jìn)行克隆PCR產(chǎn)物的純化在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上切下含目的片段的凝膠，放入1.5mlEpendorff管中，用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(華舜)純化。連接反應(yīng)將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，連接反應(yīng)總體積是10iU，其中包括5iUsolutionI，O.5iU的T載體，2.5iU的純化PCR產(chǎn)物，最后加入2iU滅菌水置4t:水浴過夜。感受態(tài)細(xì)胞(Competentcells)購自天根生化科技有限公司。轉(zhuǎn)化無菌狀態(tài)下取100120iU感受態(tài)細(xì)胞于1.5mlEpendorff管中，將5的連接產(chǎn)物加入混勻，在冰上放置30min，42t:熱激90s，其間不要搖動(dòng)Ependorff管，取出后冰浴34min，加入400y1無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37。C平放lh后倒置培養(yǎng)。菌落PCR鑒定經(jīng)菌落PCR鑒定后的菌株在LB培養(yǎng)基37。C培養(yǎng)過夜，隨機(jī)挑取多個(gè)克隆子送到上海生工生物有限公司測序。測序分析發(fā)現(xiàn)引物擴(kuò)增的DNA序列長573bp，該序列的182堿基處存在一個(gè)堿基突變(182C-182T)，通過分子生物學(xué)軟件分析，發(fā)現(xiàn)182堿基處的堿基突變導(dǎo)致HpyF3I-RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)多態(tài)性。(3)RFLP檢測條件酶切反應(yīng)體積是10iil，其中IXbuffer10ii1，PCR產(chǎn)物35iU，限制性內(nèi)切酶HpyF31為0.5ill(5U)，用H20補(bǔ)足10yl，37。C水浴4h，用2wt^瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。C等位基因只有581bp—個(gè)片段，T等位基因有391bp和182bp兩個(gè)片段，這兩個(gè)等位基因可組成三種基因型CC，CT，TT。實(shí)施例2等位基因的分布情況(1)試驗(yàn)群體的設(shè)計(jì)試驗(yàn)組采集梅山豬(33頭)、寧鄉(xiāng)豬(24頭)、浦東白豬(24頭)、杜洛克(10頭)、美系大白(34頭)和法系大白(65頭)個(gè)體的耳組織，提取DNA，共計(jì)190個(gè)DNA樣本。試驗(yàn)群體目的在于檢測SNP分子標(biāo)記在不同品種中的分布情況。(2)基因型檢測利用正向引物和反向引物擴(kuò)增并HpyF3I-RFLP檢測試驗(yàn)群體所有的個(gè)體基因型。(3)統(tǒng)計(jì)分析記錄所有個(gè)體的基因型，并計(jì)算等位基因頻率，結(jié)果參見表1。表1PCR-RFLP-HpyF31多態(tài)性在6豬品種或品系中的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>分析該SNP位點(diǎn)等位基因的分布情況，發(fā)現(xiàn)該分子標(biāo)記在不同的品種和品系中的等位基因頻率接近，多態(tài)性豐富；品種或品系間，等位基因頻率C和T的分布差異小，初步認(rèn)為該SNP分裝置標(biāo)記可以用于豬肉產(chǎn)品安全性溯源。最后應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。附本發(fā)明中所涉及到的核苷酸/氨基酸序列〈110〉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院〈120>MMP3基因中一個(gè)用于豬肉產(chǎn)品溯源的新SNP分子標(biāo)記〈160>3〈210>1〈211>573〈212>DNA〈213〉豬(Susscrofa)〈220〉〈221>gene〈222〉(1).(573)〈223〉〈220〉〈221>mutation〈222〉(182)〈223>n=c或t〈220〉〈221>exon〈222〉(1).(150)〈223〉〈220〉〈221〉intron〈222〉(151)..(241)〈223〉〈220〉〈221>exon〈222>(242)...(390)〈223〉〈220〉〈221〉intron〈222〉(391)..(531)〈223〉〈220〉〈221>exon<222>(532)...(573)〈223〉〈400〉1gcagaagttccttgggttggaggtgacggggaagagggattctaacact49GinLysPheLeuGlyLeuGluValThrGlyLysArgAspSerAsnThr151015ctggaggtgatgcataaacccagatgtggagttcctgatgttggttac97LeuGluValMetHisLysProArgCysGlyValProAspValGlyTyr202530ttcageacctttcctggcctgcccaagtggagaaaaaatgacetcact145PheSerThrPheProGlyLeuProLysTrpArgLysAsnAspLeuThr354045tacag150TyrArg50gteatgggtccaaagagatgttgatetaatantgagattttetteattactetcacagga210gaaatettetctccaattttttttcatecag241gattgtcaattatacactggatttgccaagaagtgttattgattctacc290ValAsnTyrThrLeuAspLeuProArgSerVallieAspSerThrlie556065attgaga朋getctgaaaatetgggaggaagtgactccgcttacattc338GluLysAlaLeuLyslieTrpGluGluValThrProLeuThrliePhe707580tecaagatttctgaaggagaggetgacateatgateacttttgcagtt386SerLyslieSerGluGlyGluAlaAsplieMetlieThrPheAlaVal859095:0100]cgag390:0101]Arg:0102]gte朋幼aaa朋3朋朋朋3a朋tegaaac灘gc旭gaga朋aaaa犯acccaaatttte450:0103]tctggtgtcatttggttggaaaagtttccagaaagatcctaactactgatctttccaata510:0104]atttttttttttctttgttag531:0105]cacggagacttcageccttttgacggacctggaaaagttt573:0106]AsnThrGluThrSerAlaLeuLeuThrAspLeuGluLysPhe:0107]100105110:0108]〈210>2:0109]〈211>20:0110]〈212〉DNA:O川]〈213〉豬(Susscrofa):0112]<220>:0113]〈221>primer—bind:0114]〈222〉(1).(20):0115]<223>:0116]〈400>2:0117]gcagaagttccttgggttgg20:0118]〈210〉3:0119]<211>20:0120]〈212>DNA:0121]〈213〉豬(Susscrofa)〈220>〈221>primer_bind<222>(1)..(22)〈223〉〈400>3aaacttttccaggtcegtcaa2權(quán)利要求MMP3基因中一個(gè)用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的新SNP分子標(biāo)記，其特征在于，它是通過在6個(gè)豬品種或品系的試驗(yàn)群體中，分析其MMP3基因的SNP位點(diǎn)等位基因的分布情況，通過克隆測序、序列分析比較而獲得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新SNP分子標(biāo)記，其特征在于，所述匪P3基因序列長573bp，其中包含完整的內(nèi)含子2、內(nèi)含子3和完整外顯子2的序列，部分外顯子1和部分外顯子3的序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的新SNP分子標(biāo)記，其特征在于，所述匪P3基因的序列如SEQIDNO1所示。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的新SNP分子標(biāo)記，其特征在于，所述匪P3基因的第182位堿基處有一個(gè)堿基突變182C-182T。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的新SNP分子標(biāo)記，其特征在于，檢測所述堿基突變182C-182T的正、反向引物的DNA序列如SEQIDNO2和SEQIDN03所示。6.權(quán)利要求1所述的新SNP分子標(biāo)記采用PCR-HpyF3I-RFLP方法對其進(jìn)行檢測。全文摘要本發(fā)明公開了MMP3基因中一個(gè)用于豬肉產(chǎn)品DNA溯源的新SNP分子標(biāo)記，它是通過在6個(gè)豬品種或品系的試驗(yàn)群體(共計(jì)190個(gè)體)中，分析其MMP3基因的SNP位點(diǎn)等位基因的分布情況，通過克隆測序、序列分析比較而獲得。所述MMP3基因序列長573bp，其中包含完整的內(nèi)含子2、內(nèi)含子3和完整外顯子2的序列，部分外顯子1和部分外顯子3的序列；其序列如SEQIDNO1所示，在其第182位堿基處有一個(gè)堿基突變182C-182T。通過在試驗(yàn)群體中等位基因的變異度分析，初步判定本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記可用于豬肉產(chǎn)品溯源。文檔編號C12Q1/68GK101717821SQ20091020068公開日2010年6月2日申請日期2009年12月24日優(yōu)先權(quán)日2009年12月24日發(fā)明者吳瀟,唐雪明,朱宏,王金斌,蔣玲曦,譚芙蓉,趙凱,陶世如申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院