專利名稱:一種誘導(dǎo)全能干細(xì)胞成為間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)全能干細(xì)胞成為間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
(二)
背景技術(shù):
人體各種組織的損傷極為普遍,特別像骨、軟骨缺損以及肌腱、韌帶等結(jié)締組織損 傷越來越多(占運(yùn)動(dòng)損傷的50%),而皮膚損傷更是不計(jì)其數(shù)。有數(shù)據(jù)表明,在2001年,歐 洲的骨移植手術(shù)有408000例,而單美國(guó)就有605000例。目前,全球65歲以上的人口每年以 2 3%的速度增長(zhǎng)。以及由于人們物質(zhì)生活水平的提高、生活方式的改變以及醫(yī)學(xué)水平的 提高這些都導(dǎo)致了對(duì)額肌腱、韌帶、軟骨、骨移植、骨修復(fù)手術(shù)的更多需求和更廣泛的應(yīng)用。
在我國(guó),據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全國(guó)每年因各類交通事故、骨科疾病等因素,造成骨缺損 或骨損傷的患者有300萬人,骨骼不健全的人數(shù)有上千萬,據(jù)估計(jì)全國(guó)每年個(gè)體匹配骨骼 的市場(chǎng)總額至少在五千萬元以上。肌腱損傷是最常見的運(yùn)動(dòng)性損傷之一,約占其50%以上。 肌腱斷裂后,相應(yīng)的關(guān)節(jié)失去活動(dòng)功能。統(tǒng)計(jì)表明,每2億人口中一年至少有上千萬的肌腱 損傷病例。另外由于生活方式的改變,長(zhǎng)期使用電腦鍵盤以及輸送手機(jī)短訊等導(dǎo)致的手部 肌腱損傷病例也以每年5%的速度增加。 目前臨床運(yùn)動(dòng)器官的損傷以及皮膚等組織缺損主要靠自體/異體組織來修復(fù)加 強(qiáng),或者靠不可降解的生物材料來修復(fù)。但是這些治療方法都有其固有的缺陷。如移植自 體組織需要犧牲供區(qū)的功能,且供應(yīng)十分有限;異體組織來源困難且可能存在免疫和病理 上的問題。 目前組織工程的方法被認(rèn)為是再生運(yùn)動(dòng)器官損傷以及皮膚等組織缺損的最有應(yīng) 用前景的方法,目前已有許多研究探索組織工程方法再生缺損組織的應(yīng)用。據(jù)權(quán)威雜志柳 葉刀報(bào)道,最近組織工程氣管已成功的應(yīng)用于氣管缺損的病人,為組織工程應(yīng)用于組織再 生提供了依據(jù)。組織工程是復(fù)合種子細(xì)胞、材料及生長(zhǎng)因子在體內(nèi)或體外構(gòu)建功能性組織 用于修復(fù)或再生缺損組織的方法。種子細(xì)胞是組織工程中重要的基本元素,是構(gòu)建的組織 具有功能和體內(nèi)再生缺損組織的基礎(chǔ)。 目前應(yīng)用于結(jié)締組織再生的細(xì)胞主要有各種組織來源的成體間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚 成纖維細(xì)胞等分化成熟的體細(xì)胞和全能干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞以及從體細(xì)胞來源的誘導(dǎo)全 能干細(xì)胞(iPS))。但是這些細(xì)胞來源都有其固有的缺陷1)分化成熟的體細(xì)胞只具有有限 的分化及擴(kuò)增能力。2)間充質(zhì)干細(xì)胞具有較強(qiáng)的分化及擴(kuò)增能力,然而仍未能達(dá)到類似胚 胎組織的完全再生的能力。3)胚胎干細(xì)胞是最早的胚胎細(xì)胞,具有全能分化能力,被認(rèn)為最 具有再生潛能的細(xì)胞,然而由于其具有很強(qiáng)的致瘤性,未分化的胚胎干細(xì)胞無法應(yīng)用于修 復(fù)。4)iPS類似胚胎干細(xì)胞,未分化的iPS無法應(yīng)用于修復(fù)。但可由自體細(xì)胞而來,故有更 廣泛的應(yīng)用前景。但鑒于胚胎干細(xì)胞及iPS的組織再生潛能,如將胚胎干細(xì)胞或iPS定向 誘導(dǎo)分化成結(jié)締組織干細(xì)胞或前體細(xì)胞(間充質(zhì)干細(xì)胞及骨、軟骨、肌腱等祖細(xì)胞),去除 其致瘤性,就能使全能干細(xì)胞應(yīng)用于組織工程修復(fù)。目前將全能干細(xì)胞誘導(dǎo)成間充質(zhì)干細(xì) 胞方法較為繁瑣且成本較高,需要使用流式等方法純化細(xì)胞。因此,尋找一種簡(jiǎn)便低成本且不另加試劑的方法誘導(dǎo)全能干細(xì)胞成為間充質(zhì)干細(xì)胞,是全能干細(xì)胞應(yīng)用于結(jié)締組織工程提供前提。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種簡(jiǎn)單、高效的誘導(dǎo)全能干細(xì)胞成為間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 —種誘導(dǎo)全能干細(xì)胞成為間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,所述方法包括
(1)將全能干細(xì)胞培養(yǎng)于絲裂霉素處理過的小鼠MEF飼養(yǎng)層(處理方法參見《小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)——飼養(yǎng)層的制備》,細(xì)胞生物學(xué)雜志Chinese Journal of CellBiology 2009,31 (2) :291-292)上,用細(xì)胞培養(yǎng)基I培養(yǎng)3 5天,全能干細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶-EDTA(即胰酶/EDTA消化液,胰酶濃度0. 01 0. 05X,EDTA濃度0. 01 0. 05%,w/v)消化成單細(xì)胞懸液;所述細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如下5 20% (w/v,質(zhì)量體積百分比濃度,某組分濃度1 %表示lOOmL培養(yǎng)液中含有該組分lg) K0血清替代物,1 5mM L-谷氨酰胺,O. 5 5. 0% (w/v)非必需氨基酸,5 20ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子2, 50 200U/ml青霉素,50 200U/ml鏈霉素,溶劑為K0-DMEM ; (2)步驟(1)單細(xì)胞懸液以100 1000cell/ci^密度種植于培養(yǎng)皿上,于細(xì)胞培養(yǎng)基II中進(jìn)行傳代培養(yǎng);所述細(xì)胞培養(yǎng)基II終濃度組成如下10 30% (w/v)胎牛血清,50 200U/ml青霉素,50 200U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM ; (3)步驟(2)培養(yǎng)獲得的第三代細(xì)胞再以2 10cell/cm2密度種植于培養(yǎng)皿上,于細(xì)胞培養(yǎng)基III中培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞長(zhǎng)出,即得所述間充質(zhì)干細(xì)胞;所述細(xì)胞培養(yǎng)基III終濃度組成如下:5 20% (w/v)胎牛血清,50 200U/ml青霉素,50 200U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM。 所述的細(xì)胞為由全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來,經(jīng)特定培養(yǎng)基下經(jīng)低密度種植而成的成纖維樣細(xì)胞,具骨、軟骨、肌腱及脂肪分化能力,與成體細(xì)胞相比還具有良好的擴(kuò)增能力,可傳代至15代以上而保持原來特性。 所述胚胎干細(xì)胞可采用市購商品,如WiCell Inc公司的Hl、H9細(xì)胞系,也可從廢棄胚胎中獲得。由胚胎中獲得胚胎干細(xì)胞的具體方法如下1.收集IVF/ICSI治療周期第三天的低質(zhì)量胚胎,體外培養(yǎng)至5到6天時(shí),可分出內(nèi)細(xì)胞團(tuán)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上培養(yǎng),9 15天后將長(zhǎng)出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)吹散或者胰酶消化,繼續(xù)在小鼠成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)。2.挑選出具有均一的未分化形態(tài)的單細(xì)胞克隆團(tuán),吹散成50 100細(xì)胞小團(tuán)后現(xiàn)培養(yǎng)。3.如此重復(fù),直至成系。 間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定1)細(xì)胞形態(tài)觀察。細(xì)胞貼壁為分化第一天,每天觀察貼壁細(xì)胞形態(tài),單克隆細(xì)胞篩選后成纖維樣細(xì)胞比例>95%。 2)細(xì)胞表型鑒定,間質(zhì)細(xì)胞表型陽性(CD44,CD90,CD105,CD106),造血系表形陰性(CD34),間質(zhì)細(xì)胞占到95%以上。3)增殖、分化及組織分化能力細(xì)胞具有骨、軟骨及脂肪三系分化能力。 優(yōu)選的,所述步驟(1)中細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如下10% K0血清替代物,2mML-谷氨酰胺,1 %非必需氨基酸,10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子2, 100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為KO-DMEM。 優(yōu)選的,所述步驟(2)中細(xì)胞培養(yǎng)基II終濃度組成如下20%胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM。 優(yōu)選的,所述步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)基III終濃度組成如下10X胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM。 本發(fā)明是在以前研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高,利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法,使用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基及單克隆分選方法,純化出間充質(zhì)干細(xì)胞,使間充質(zhì)干細(xì)胞含量在95%以上,可獲得109以上間充質(zhì)干細(xì)胞,從而獲得足夠的結(jié)締組織種子細(xì)胞。此技術(shù)將促進(jìn)全能干細(xì)胞應(yīng)用于肌腱、骨、軟骨及皮膚組織工程。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在 (1)本發(fā)明所獲得細(xì)胞具有良好的擴(kuò)境能力,可傳至15代而保持特性,并具有形成骨,軟骨及肌腱的能力; (2)本發(fā)明所獲得細(xì)胞獲得方法簡(jiǎn)單,效率高,無需流式,磁珠等分離純化方法,大大降低了從全能干細(xì)胞獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的成本; (3)本發(fā)明細(xì)胞適合于骨、肌腱、軟骨、皮膚等組織的缺損修復(fù)和作為組織工程的種子細(xì)胞。
(四)
圖1為全能干細(xì)胞貼壁分化原代細(xì)胞; 圖2為全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞形態(tài),誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)具有高度的均一性;
圖3為全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞具有間充質(zhì)干細(xì)胞表型; 圖4為全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞具有類似于間充質(zhì)干細(xì)胞的三系分化能力A :骨分化能力,B :軟骨分化能力,C :脂肪分化能力,D :肌腱分化能力; 圖5為全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞修復(fù)肌腱;A :種子細(xì)胞種植于fibrin膠;B :全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞修復(fù)髕腱缺損; 圖6為全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞修復(fù)后肌腱;A :缺損部位出現(xiàn)類似肌腱的結(jié)構(gòu);B :缺損部位出現(xiàn)連續(xù)成熟的膠原纖維;T-正常肌腱,J_修復(fù)連接處,N_修復(fù)部位;
圖7為全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞修復(fù)軟骨;A :全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞修復(fù)后軟骨缺損;B :全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞修復(fù)后軟骨缺損組織學(xué)。 圖8為全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞修復(fù)大塊骨缺損;A :全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞種植于脫鈣骨構(gòu)建組織工程骨;B :組織工程骨修復(fù)大塊骨缺損。 圖9為全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞作為人胚胎干細(xì)胞的飼養(yǎng)層細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞可在全能干細(xì)胞來源的種子細(xì)胞上正常生長(zhǎng)。
(五)
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述,但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此 實(shí)施例1 (本實(shí)例試劑除特殊說明均購自Invitrogen公司)
1)培養(yǎng)孔用0. 1 % (w/w)明膠包被,把全能干細(xì)胞(人胚胎干細(xì)胞,由廢棄胚胎中獲得,方法見發(fā)明內(nèi)容部分。廢棄胚胎為經(jīng)胚胎提供者本人及家屬同意后捐贈(zèng))接種在絲裂霉素處理過的小鼠MEF飼養(yǎng)層上,用細(xì)胞培養(yǎng)基I于37°C,5% C02(剩余95%為空氣)條件下培養(yǎng)3 5天,當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿后使用0. 025 %胰酶-0. 05% EDTA (Invitrogen)消化,吹
散,獲得單細(xì)胞懸液。 MEF飼養(yǎng)層處理 1.取新的培養(yǎng)瓶,加0. 1 % Gelatin (SigmaG2500)溶液覆蓋預(yù)處理30min,用前吸掉Gelatin溶液。 2.取需要處理的MEF細(xì)胞,Mitomycin C(Sigma M0503)以10mg/ml工作濃度加在
MEF培養(yǎng)液里,混勻。 3.置培養(yǎng)箱中作用3h。 4.吸棄廢液。 5.用PBS洗5遍。 6.加0.025% Trypsin-EDTA消化。在顯微鏡下觀察,當(dāng)少量細(xì)胞漂浮,貼壁的細(xì)胞層出現(xiàn)裂隙時(shí),用移液管吹打沖洗瓶底5 6次。
7.即刻加適量MEF完全培養(yǎng)液終止消化。8.細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中,離心1000r/min,5min。吸棄上清液。 9.處理過的MEF細(xì)胞加適量培養(yǎng)液重懸計(jì)數(shù),以3. 0 X 104個(gè)/cm2 (MEF)密度均勻
地鋪在明膠(gelatin)處理過的培養(yǎng)瓶上。 10.置培養(yǎng)箱中靜置過夜,使其貼壁。 細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如下10 % (w/v) KO血清替代物(Invitrogen),2mM卜谷氨酰胺,1% (w/v)非必需氨基酸(Invitrogen) , 10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子2 (FGF2) , 100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為KO-DMEM。 MEF完全培養(yǎng)液10% (w/v)胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為高糖DMEM。 2)單細(xì)胞懸液以500 600cell/cm2密度種植于培養(yǎng)皿上,于細(xì)胞培養(yǎng)基II中進(jìn)行傳代培養(yǎng);所述細(xì)胞培養(yǎng)基II終濃度組成如下20% (w/v)胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM ; 3)步驟2)培養(yǎng)獲得的第三代細(xì)胞(細(xì)胞成較均一的成纖維樣細(xì)胞)再以6 10cell/cm2密度種植于培養(yǎng)皿上,于細(xì)胞培養(yǎng)基III中培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞長(zhǎng)出,即得所述間充質(zhì)干細(xì)胞;所述細(xì)胞培養(yǎng)基III終濃度組成如下20% (w/v)胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM。見細(xì)胞呈均一的成纖維樣細(xì)胞,并具有間充質(zhì)表型(圖1 圖3)。
實(shí)施例2: 將實(shí)施例1所得的細(xì)胞培養(yǎng)至長(zhǎng)滿后,種植2. 5X 107細(xì)胞(50ul,5X 107ml)于殼聚糖凝膠,構(gòu)建組織工程軟骨(見圖4B)。
實(shí)施例3 : 將實(shí)施例1所得的細(xì)胞培養(yǎng)至長(zhǎng)滿后,加50ug/ml維生素C培養(yǎng)14天后形成細(xì)胞片,將細(xì)胞片在靜態(tài)張力剌激下(拉伸10% )培養(yǎng)2周,組織學(xué)及電鏡觀察,見細(xì)胞在力學(xué)方向上有規(guī)律排列,構(gòu)成體外組織工程肌腱(見圖4D)。
實(shí)施例4 : 將實(shí)施例1所得的細(xì)胞植入大鼠體內(nèi)用于修復(fù)髕韌帶缺損,種植5X1QS細(xì)胞(20ul,2.5X107ml)于Fibrin凝膠,種植于大鼠髕韌帶內(nèi)。4周后可發(fā)現(xiàn)組織長(zhǎng)入缺損部位,形成了功能性肌腱組織(見圖5,6)。
實(shí)施例5 : 將實(shí)施例1所得的細(xì)胞植入大鼠用于修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損,5乂105細(xì)胞(20ul,2.5X107ml)于膠原凝膠,4周后組織長(zhǎng)入良好,可形成功能性軟骨組織,沒有明顯的炎性反應(yīng)(見圖7)。
實(shí)施例6 : 將實(shí)施例3所得的細(xì)胞片與脫鈣骨復(fù)合構(gòu)建組織工程骨(見圖8A),用于修復(fù)橈骨缺損(見圖8B),可促進(jìn)新生骨組織長(zhǎng)入。
實(shí)施例7: 將實(shí)施例1所得的細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素c處理后作為人胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)層細(xì)胞(見圖9):人胚胎干細(xì)胞可正常生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
一種誘導(dǎo)全能干細(xì)胞成為間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,所述方法包括(1)將全能干細(xì)胞培養(yǎng)于絲裂霉素處理過的小鼠MEF飼養(yǎng)層上,用細(xì)胞培養(yǎng)基I培養(yǎng)3~5天,全能干細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶-EDTA消化成單細(xì)胞懸液;所述細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如下5~20%KO血清替代物,1~5mM L-谷氨酰胺,0.5~5.0%非必需氨基酸,5~20ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子2,50~200U/m1青霉素,50~200U/ml鏈霉素,溶劑為KO-DMEM;(2)步驟(1)單細(xì)胞懸液以100~1000cell/cm2密度種植于培養(yǎng)皿上,于細(xì)胞培養(yǎng)基II中進(jìn)行傳代培養(yǎng);所述細(xì)胞培養(yǎng)基II終濃度組成如下10~30%胎牛血清,50~200U/ml青霉素,50~200U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM;(3)步驟(2)培養(yǎng)獲得的第三代細(xì)胞再以2~10cell/cm2密度種植于培養(yǎng)皿上,于細(xì)胞培養(yǎng)基III中培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞長(zhǎng)出,即得所述間充質(zhì)干細(xì)胞;所述細(xì)胞培養(yǎng)基III終濃度組成如下5~20%胎牛血清,50~200U/ml青霉素,50~200U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于所述步驟(1)中細(xì)胞培養(yǎng)基I終濃度組成如 下10XK0血清替代物,2mM L-谷氨酰胺,1 %非必需氨基酸,10ng/ml堿性成纖維生長(zhǎng)因子 2, 100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為KO-DMEM。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于所述步驟(2)中細(xì)胞培養(yǎng)基II終濃度組成如 下20%胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法,其特征在于所述步驟(3)中細(xì)胞培養(yǎng)基III終濃度組成 如下10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml鏈霉素,溶劑為低糖DMEM。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)全能干細(xì)胞成為間充質(zhì)干細(xì)胞的方法,本發(fā)明利用簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方法,使用成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基及單克隆分選方法,純化出間充質(zhì)干細(xì)胞,使間充質(zhì)干細(xì)胞含量在95%以上,可獲得109以上間充質(zhì)干細(xì)胞;本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)本發(fā)明所獲得細(xì)胞具有良好的擴(kuò)境能力,可傳至15代而保持特性,并具有形成骨,軟骨及肌腱的能力;(2)本發(fā)明所獲得細(xì)胞獲得方法簡(jiǎn)單,效率高,無需流式,磁珠等分離純化方法,大大降低了從全能干細(xì)胞獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的成本;(3)本發(fā)明細(xì)胞適合于骨、肌腱、軟骨、皮膚等組織的缺損修復(fù)和作為組織工程的種子細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/074GK101709289SQ20091015548
公開日2010年5月19日 申請(qǐng)日期2009年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月15日
發(fā)明者宋興輝, 歐陽宏偉, 茵梓, 陳曉 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)