專利名稱：攜帶分子標(biāo)記的豬瘟病毒感染性cDNA載體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及豬瘟病毒兔化弱毒疫苗C株感染性cDNA載體的構(gòu) 建及病毒的拯救。通過該技術(shù)體系的建立，可在分子水平對疫苗C株基因組進行改造，以便 于對病毒復(fù)制、致病機理以及新型標(biāo)記疫苗開發(fā)等方面進行深入研究。
背景技術(shù)：
WM-'MM (classical swine fever virus,CSFV)禾4· (Flaviviridae) ^ 病毒屬(Pestivirus)成員之一。CSFV的基因組為單股正鏈RNA，長約12. 3kb，含有一個大 的開放閱讀框(ORF)，ORF兩側(cè)各有一個非編碼區(qū)(UTR)，且5'-端無帽子結(jié)構(gòu)，3'-端無 polyA尾。CSFV的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由這個大的ORF編碼，翻譯成一個含3898 個氨基酸的多聚前體蛋白，這一大前體蛋白在細(xì)胞蛋白酶和病毒特異的蛋白酶作用下加工 成12種成熟病毒蛋白。其中4個為結(jié)構(gòu)蛋白，8個為非結(jié)構(gòu)蛋白。近年來，動物致病性RNA病毒，如豬瘟病毒、流感病毒和口蹄疫病毒等引起的傳染 病在世界各地暴發(fā)，給畜牧業(yè)的發(fā)展造成巨大損失。而新的病毒性傳染病(如SARS等)不 斷出現(xiàn)，威脅著人類健康。在此背景下，在分子病毒學(xué)研究領(lǐng)域興起了一門新技術(shù)，即RNA 病毒的感染性cDNA技術(shù)。該技術(shù)可在DNA水平進行操作，以此來研究RNA病毒的復(fù)制與表 達調(diào)控、病毒與宿主間的相互作用、抗病毒策略、基因治療研究、改造傳統(tǒng)疫苗以及構(gòu)建新 型病毒載體來表達外源基因等。建立RNA病毒感染性cDNA技術(shù)體系主要包括基因組全長cDNA的構(gòu)建，感染性RNA 的產(chǎn)生，子代病毒的鑒定與應(yīng)用等內(nèi)容。在CSFV感染性cDNA的研究中，Moormarm等在1996 年第一次用豬瘟疫苗C株的全長cDNA為模板，將體外轉(zhuǎn)錄的基因組RNA轉(zhuǎn)染豬腎細(xì)胞后， 拯救了具有感染性的子代病毒。同年，Ruggli等和Meyers等分別用CSFV Alfort-187和 Alfort的全長cDNA為模板，獲得了子代病毒。隨后，又有不同強弱毒株的感染性cDNA被成 功構(gòu)建。我國CSFV感染性cDNA技術(shù)起步較晚，目前雖然對構(gòu)建弱毒C株和強毒石門株的 感染性cDNA已有報道，但是可能由于全長cDNA的不穩(wěn)定性，對這些感染性cDNA的深入研 究很少見到報道。本研究旨在構(gòu)建兔化弱毒疫苗C株的感染性cDNA，獲得能夠穩(wěn)定攜帶分 子標(biāo)記的感染性子代病毒。為改造傳統(tǒng)疫苗，開發(fā)新型標(biāo)記疫苗奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要內(nèi)容包括提供一種攜帶分子標(biāo)記的豬瘟病毒感染性cDNA載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)用生理鹽水稀釋豬瘟活疫苗至1頭份/ml作為實驗材料，抽提總RNA后，根據(jù) 設(shè)計的6對引物(見下表)，RT-PCR分段擴增相應(yīng)的6個cDNA片段(圖2)。 (2) cDNA片段Fl和F5中相應(yīng)分子標(biāo)記的引入 用弓I物 Fl-Xho-MU :GAAGCCCACCTCGAIATGCTACGTGGACG 禾口 Fl-Xho-ML CGTCCACGTAGCATATCGAGGTGGGCTTC對Fl片段221位進行定點突變，這一突變敲除基因組中 原有的XhoI限制性酶切位點；而F5片段中NcoI分子標(biāo)記用F5-upper引物通過PCR直接 引入。(3)全長cDNA克隆所需質(zhì)粒的改造以質(zhì)粒pBR322為模板進行改造，獲得用于克隆CSFV基因組3 ‘-半長的質(zhì)粒 pB-CN,具體步驟如下應(yīng)用引物 pGEM-U :GGGAAGCTTGGATCCTATAGGGCGAATTGG 和 pGEM-L CCGCCCGGGCAAGCTATTTAGGTGACAC擴增含有質(zhì)粒pGEM_5ZF(+)多克隆位點的171bp片段，并 在該片段的前后分別引入酶切位點HindIII和Aval ；由于pBR322質(zhì)粒中編碼卡那抗性片 段的前后也含有相應(yīng)的這兩個酶，所以應(yīng)用這兩個酶可將該片段切下，并將171bp的片段 克隆于相應(yīng)位置，獲得中拷貝質(zhì)粒PB-CN ；以低拷貝質(zhì)粒pACYC-177為模板進行改造，獲得用于克隆CSFV基因組5'-半 長和基因組全長的質(zhì)粒pA-CN，具體步驟如下應(yīng)用引物pA-U GCGGACTAGTACGCGTTCTAGA GCGCGGAACCCCTATTTG 和 ρΑ-L TGGATCCGCGGCCGCGTCGACCCCCTTGTATTACTGTTTATGT,在刪除 pACYC-177多余卡那抗性基因的同時，引入6個酶切位點用于半長和全長的克隆，獲得低拷 貝質(zhì)粒pA-CN (圖3)。(4)全長cDNA載體的構(gòu)建CSFV 5'-半長的組裝首先分別用限制性內(nèi)切酶Xbal/Spel、Spel/PstI和 Notl/Sall將Fl、F2和F3片段克隆于質(zhì)粒pA或pGEM_5ZF (+)中，獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒Fl_pA、 F2-pGEM和F3-pGEM;在Fl片段基因組5'-非編碼區(qū)的上游引入T7 RNA聚合酶的啟動子 用于全長cDNA的體外轉(zhuǎn)錄，然后用PstI和SalI將F3從F3_pGEM中切下，克隆與用相同酶 作用的F2-pGEM，獲得重組質(zhì)粒F23-pGEM ；再用SpeI和BamHI將F23從F23_pGEM中切下， 克隆與用相同酶作用的Fl-pA，獲得含有CSFV 5'-半長的重組質(zhì)粒F123-pA;CSFV 3'-半長的組裝首先分別用限制性內(nèi)切酶BamHI/Ncol和NcoI/NotI 將F4、F5片段克隆于質(zhì)粒pB中，獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒F4-pB和F5_pB ；而F6片段則克隆于 pSIMPLE-19EcoR V/BAP Vector 載體中，獲得重組質(zhì)粒 F6_pUC ；然后用 NcoI/NotI 將 F5 從 F5-pB中切下，克隆與用相同酶作用的F4-pB中，獲得重組質(zhì)粒F45_pB ；再用BstBI和SalI 將F6從F6-pUC中切下，克隆與用相同酶作用的F45-pB，獲得含有CSFV 3'-半長的重組 質(zhì)粒 F456-pB ；CSFV全長cDNA的組裝用BamHI和SalI將含有CSFV 3'-半長的F456片段從 重組質(zhì)粒F456-pB中切下，克隆與用相同酶作用的F123-pA中，獲得含有CSFV全長cDNA的 重組質(zhì)粒PA-FL22。將獲得的全長cDNA載體用限制性內(nèi)切酶XhoI進行線性化，在體外通過T7RNA聚 合酶轉(zhuǎn)錄獲得病毒基因組RNA(圖4)。純化后的RNA電轉(zhuǎn)ST或PK-15細(xì)胞后，通過反復(fù)傳 代可檢測到病毒蛋白的表達、RNA的復(fù)制以及子代病毒的產(chǎn)生。獲得的子代病毒感染家兔 后，證實有致病性。本發(fā)明的有益效果在于通過本發(fā)明的構(gòu)建方法，可獲得攜帶分子標(biāo)記的豬瘟病毒兔化弱毒疫苗C株的感染性cDNA載體pA-FL22。由該載體獲得的RNA電轉(zhuǎn)豬瘟病毒的易感細(xì)胞，拯救具有感染性的子代病毒，且該子代病毒能穩(wěn)定遺傳上述構(gòu)建中引入的分子標(biāo)記。通過保留的分子標(biāo)記 可用于區(qū)分其它豬瘟病毒。利用該感染性cDNA載體及子代病毒的拯救技術(shù)體系，可為深入 研究該病毒的復(fù)制機制、致病機理以及新型標(biāo)記疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。由本發(fā)明獲得的攜帶分子標(biāo)記的C株病毒可用于制備豬瘟病毒疫苗。通過對分子 標(biāo)記的鑒定，可在分子水平區(qū)分該疫苗株與其它豬瘟病毒(圖5)，為生產(chǎn)實踐中豬瘟病毒 的鑒別診斷提供新的方法。


圖1為攜帶分子標(biāo)記的豬瘟病毒疫苗C株全長cDNA載體pA-FL22構(gòu)建示意圖，圖 中基因組中標(biāo)記的星號為引入的分子標(biāo)記；圖2為覆蓋全長基因組的6個cDNA片段的RT-PCR擴增示意圖，圖中M為 WideRange DNA Marker 500-15, 000, RT-PCR 分段擴增得到 Fl 片段；依次類推，RT-PCR 分 段擴增得到的F6片段；圖3為構(gòu)建全長cDNA載體pA_FL22所需質(zhì)粒的改造示意圖；圖4為體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA電泳圖，圖中M為1Kb DNA Ladder Marker, 1為PRRSV 體外轉(zhuǎn)錄的15Kb的基因組RNA對照，2為本發(fā)明中CSFV體外轉(zhuǎn)錄的12. 3Kb的基因組RNA 樣品；圖5為子代病毒分子標(biāo)記NcoI鑒定示意圖，圖中M為2000bp DNA Ladder Marker, 1為父代疫苗C株，2為從pA-FL22拯救獲得的子代病毒FL22。
具體實施例方式實施例1覆蓋豬瘟病毒疫苗C株全長基因組cDNA片段的擴增表1為擴增C株基因組的6個cDNA片段所需引物 根據(jù)豬瘟病毒基因組序列，在保守區(qū)域設(shè)計帶有特異性酶切位點的引物。引物序列如表1所示。各片段的擴增均運用套式PCR的方法。其中引物名稱中up表示上游引物， low表示下游引物，new表示用于第一輪擴增的引物。引物中標(biāo)有下劃線的序列為用于該 片段克隆的酶切位點。Fl-upper引物中粗體的序列為引入的T7RNA聚合酶識別的啟動子， F5-upper引物中粗體的序列為引入的NcoI分子標(biāo)記。F6_l0Wer引物中粗體的序列為引入 的XhoI限制性酶切位點。豬瘟活疫苗(細(xì)胞源)購于中牧實業(yè)股份有限公司江西生物藥廠，用生理鹽水稀 釋至1頭份/ml作為實驗材料。用總RNA抽提試劑盒(上海生物工程有限公司)抽提疫苗 中的總RNA。根據(jù)上述設(shè)計的6對引物，RT-PCR分段擴增相應(yīng)的6個cDNA片段(圖2)。6 個獨立的cDNA片段克隆于Takara公司的pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector，進行序列測定。實施例2cDNA片段Fl和F5中相應(yīng)分子標(biāo)記的引入應(yīng)用Stratagene公司的定點突變試劑盒，用引物F1-Xh0-MU GAAGCCCACCTCGATATGCTACGTGGACG 和 Fl-Xho-ML CGTCCACGTAGCATATCGAGGTGGGCTTC 對 Fl 片段221位進行定點突變(G — T)，這一突變敲除基因組中原有的XhoI限制性酶切位點。 而F5片段中NcoI分子標(biāo)記用F5-upper引物通過PCR直接引入。實施例3全長cDNA克隆所需質(zhì)粒的改造以pBR322為模板進行改造，獲得用于克隆CSFV基因組3 ‘-半長的質(zhì)粒 pB-CN。具體步驟如下應(yīng)用引物 pGEM-U GGGAAGCTTGGATCCTATAGGGCGAATTGG 和 pGEM-L CCGCCCGGGCAAGCTATTTAGGTGACAC擴增含有質(zhì)粒pGEM_5ZF(+)多克隆位點的171bp片段，并 在該片段的前后分別引入酶切位點HindIII和Aval。由于pBR322質(zhì)粒中編碼卡那抗性片段 的前后也含有相應(yīng)的這兩個酶，所以應(yīng)用這兩個酶可將該片段切下，并將171bp的片段克 隆于相應(yīng)位置，獲得中拷貝質(zhì)粒ρΒ-CN。以低拷貝質(zhì)粒pACYC-177為模板進行改造，獲得用 于克隆CSFV基因組5'-半長和基因組全長的質(zhì)粒pA-CN。具體步驟如下應(yīng)用引物pA-U GCGGACTAGTACGCGTTCTAGAGCGCGGAACCCCTATTTG 和 ρΑ-L· TGGATCCGCGGCCGCGTCGACCCCCTTGT ATTACTGTTTATGT在刪除pACYC-177多余卡那抗性基因的同時，引入6個酶切位點用于半長 和全長的克隆，獲得低拷貝質(zhì)粒pA_CN(圖3)。實施例4全長cDNA載體的構(gòu)建CSFV 5'-半長的組裝如圖1所示，首先分別用限制性內(nèi)切酶XbaI/SpeI，SpeI/ PstI和Notl/Sall將F1，F(xiàn)2和F3片段克隆于質(zhì)粒pA或pGEM_5ZF(+)中，獲得相應(yīng)重組質(zhì) 粒Fl-pA，F(xiàn)2-pGEM和F3-pGEM。在Fl片段基因組5'-非編碼區(qū)的上游引入T7RNA聚合酶 的啟動子用于全長cDNA的體外轉(zhuǎn)錄。然后用PstI和SalI將F3從F3_pGEM中切下，克隆與 用相同酶作用的F2-pGEM，獲得重組質(zhì)粒F23-pGEM。再用SpeI和BamHI將F23從F23_pGEM 中切下，克隆與用相同酶作用的Fl-pA，獲得含有CSFV 5'-半長的重組質(zhì)粒F123-pA。CSFV 3'-半長的組裝首先分別用限制性內(nèi)切酶BamHI/Ncol和NcoI/NotI將 F4，F(xiàn)5片段克隆于質(zhì)粒pB中，獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒F4-pB和F5_pB。而F6片段則克隆于 pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector 載體中，獲得重組質(zhì)粒 F6_pUC。然后用 NcoI/NotI 將 F5 從F5-pB中切下，克隆與用相同酶作用的F4-pB中，獲得重組質(zhì)粒F45_pB。再用BstBI和 SalI將F6從F6-pUC中切下，克隆與用相同酶作用的F45-pB，獲得含有CSFV 3'-半長的 重組質(zhì)粒F456-pB。
CSFV全長cDNA的組裝用BamHI和SalI將含有CSFV 3'-半長的F456片段從 重組質(zhì)粒F456-pB中切下，克隆與用相同酶作用的F123-pA中，獲得含有CSFV全長cDNA的 重組質(zhì)粒PA-FL22。含有基因組全長重組質(zhì)粒pA-FL22的大腸桿菌在含Amp抗性的LB培養(yǎng)基中傳 代十次。第十代的細(xì)菌抽提質(zhì)粒后，全基因組測序確定該重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性。結(jié)果表明 PA-FL22在大腸桿菌中相當(dāng)穩(wěn)定，無任何突變、插入和缺失引入。實施例5基于體外轉(zhuǎn)錄和電轉(zhuǎn)方法的豬瘟病毒拯救
200ml LB培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)過夜的菌液500 μ 1，同時加入濃度為100mg/ml的 Amp200l·! 1，37°C擴大培養(yǎng)12h。收集菌液后用Promega公司中量質(zhì)粒純化試劑盒抽提 質(zhì)粒。經(jīng)濃度測定的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XhoI進行線性化。線性化的質(zhì)粒經(jīng)純化后用 MEGAscript體外RNA合成試劑盒(Ambion公司)。體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA經(jīng)電泳檢測完整性 和正確性。如圖4所示，體外轉(zhuǎn)錄的RNA非常均一，無脫尾，降解現(xiàn)象。經(jīng)濃度測定后存放 于-80°C備用。電轉(zhuǎn)前一天，將ST或PK-15細(xì)胞分瓶。電轉(zhuǎn)時，將前一天分瓶的細(xì)胞消化后，用PBS 洗滌細(xì)胞2次。將1 1. 5 μ g上述RNA加入細(xì)胞中，混勻后加入0. 2cm的電轉(zhuǎn)杯(Bio-Rad 公司)中用電轉(zhuǎn)儀Gene Pulser Xcell (Bio-Rad公司)進行電轉(zhuǎn)，電轉(zhuǎn)參數(shù)為150V，500 μ F， 電阻無窮。電轉(zhuǎn)后將電轉(zhuǎn)杯中的細(xì)胞迅速移入完全培養(yǎng)基中重懸并加入培養(yǎng)瓶中，37°C， 5%C02培養(yǎng)。電轉(zhuǎn)后96h的細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后以1 4的比例繼續(xù)連續(xù)傳代培養(yǎng)。同時將 上清和剩余的細(xì)胞于_76°C保存?zhèn)溆谩Ｒ酝瑯拥姆椒ㄟB續(xù)傳代，每代都用兔抗C株全病毒抗 體進行間接免疫熒光(IFA)檢測。在檢測是否產(chǎn)生感染性子代病毒時，將細(xì)胞-76°C/37°C 反復(fù)凍融三次，離心去除細(xì)胞碎片后取上清接種新的ST或PK-15細(xì)胞，37°C培養(yǎng)96h后IFA 檢測。結(jié)果表明由全長cDNA載體pA-FL22轉(zhuǎn)錄的RNA在細(xì)胞內(nèi)能夠復(fù)制并合成病毒蛋白， 最終產(chǎn)生具有感染性的子代病毒。將傳至第10代的病毒超離濃縮后，以100個TCID5tl的子代病毒耳緣靜脈注射于家 兔體內(nèi)，陽性對照組為豬瘟病毒C株細(xì)胞苗，每天測量體溫3次。感染后的24-72h可觀察 到兔子體溫升高，且在感染后的第5天剖殺各組家兔脾臟可見明顯腫大。而注射MEM培養(yǎng) 液作為陰性對照組的家兔體溫未見升高，且脾臟無腫大。這一結(jié)果表明子代病毒FL22能夠 在兔體內(nèi)復(fù)制。實施例6子代病毒分子標(biāo)記鑒定對獲得的子代病毒進行NcoI分子標(biāo)記的鑒定。首先在引入的分子標(biāo)記 上、下游分別設(shè)計兩對引物(7673-7693 TGGGGGTGAATCAATAGCAGA 和 8411-8432 ATTACTTGATAGCTGGCGGACC 以及 7843-7872 :GGAATTACAATAACCTGTCCAAGATAGTTG 禾P 8372-8391 :CCCAGCAGTTCCACAGCCTC)。進行套式PCR的檢測，再用限制性內(nèi)切酶NcoI酶切確 定拯救的子代病毒與父代疫苗C株在分子標(biāo)記上的差異。如圖5所示，從FL22基因組中擴 增的片段能被NcoI切成2個片段(lane 2)，而父代C株則仍然為完整的548bp片段(lane 1)。該結(jié)果表明子代病毒FL22能夠在體內(nèi)、外穩(wěn)定遺傳引入的分子標(biāo)記。序列表SEQ ID NO 1gtatacgagg ttagttcatt ctcg 24
SEQ ID NO 2gccttgtgcc ccagttact 19SEQ ID NO 3aaatctagat aatacgactc actatagtat acgaggttag ttcattctc 49SEQ ID NO 4aaaactagta acagccatac cacac 25SEQ ID NO -.5gcttgataaa agtattaaga ggacag 26SEQ ID NO 6aactcgtaag tgggcagtat ga 22SEQ ID NO -Jacggactagt aactggggca caaggc 26SEQ ID NO 8gggctgcagt ggaaataagg tacacgagaa 30SEQ ID NO 9ttaataaggg tgctgaaggg aataggtgag 30SEQ ID NO: 10ccacatccaa gtccgggaga gtaa 24SEQ ID NO: 11aaagcggccg cctgcagtgg taacaagat 29SEQ ID NO: 12gcagtcgacg gatcctcacc actataata 29SEQ ID NO: 13gattaaagat accagtagag gagatgaaga 30SEQ ID NO: 14cacggatact ggattttgtg acat 24SEQ ID NO: 15cgtgacgtcg gatccatcta acctgagggt ggtaacatcg 40SEQ ID NO: 16taccatggcc gcactaaccc ccgtgcctag caaaccatcg ctt 43SEQ ID NO: 17aatcaggcgc ggaaaaag 18 SEQ ID NO: 18cctcttctca ttctttggga tc 22SEQ ID NO: 19accccatgga gatcatgtca caaaatc 27SEQ ID NO 20caggcggccg cttcgaaaaa accagcagca c 31SEQ ID NO 21
attgaaacga cccgagttag ag 22SEQ ID NO 22gggccgttag aaattacctt ag 22SEQ ID NO 23
gggttcgaac gcaaaaatat aggggaaata t 31SEQ ID NO 24aaagtcgacc tcgagggccg ttagaaatta ccttag 36SEQ ID NO 25gaagcccacc tcgatatgct acgtggacg 29SEQ ID NO 26cgtccacgta gcatatcgag gtgggcttc 29SEQ ID NO 27gggaagcttg gatcctatag ggcgaattgg 30SEQ ID NO 28ccgcccgggc aagctattta ggtgacac 28SEQ ID NO 29gcggactagt acgcgttcta gagcgcggaa cccctatttg 40SEQ ID NO 30tggatccgcg gccgcgtcga cccccttgta ttactgttta tgt 4權(quán)利要求
一種攜帶分子標(biāo)記的豬瘟病毒感染性cDNA載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟(1)用生理鹽水稀釋豬瘟活疫苗至1頭份/ml作為實驗材料，抽提總RNA后，根據(jù)設(shè)計的6對引物，RT-PCR分段擴增相應(yīng)的6個cDNA片段；所述6對引物的序列如下表所示(2)cDNA片段F1和F5中相應(yīng)分子標(biāo)記的引入用引物F1-Xho-MUGAAGCCCACCTCGATATGCTACGTGGACG和F1-Xho-MLCGTCCACGTAGCATATCGAGGTGGGCTTC對F1片段221位進行定點突變，這一突變敲除基因組中原有的XhoI限制性酶切位點；而F5片段中NcoI分子標(biāo)記用F5-upper引物通過PCR直接引入；(3)全長cDNA克隆所需質(zhì)粒的改造以pBR322為模板進行改造，獲得用于克隆CSFV基因組3′-半長的質(zhì)粒pB-CN，具體步驟如下應(yīng)用引物pGEM-UGGGAAGCTTGGATCCTATAGGGCGAATTGG和pGEM-LCCGCCCGGGCAAGCTATTTAGGTGACAC擴增含有質(zhì)粒pGEM-5ZF(+)多克隆位點的171bp片段，并在該片段的前后分別引入酶切位點HindIII和AvaI；由于pBR322質(zhì)粒中編碼卡那抗性片段的前后也含有相應(yīng)的這兩個酶，所以應(yīng)用這兩個酶可將該片段切下，并將171bp的片段克隆于相應(yīng)位置，獲得中拷貝質(zhì)粒pB-CN；以低拷貝質(zhì)粒pACYC-177為模板進行改造，獲得用于克隆CSFV基因組5′-半長和基因組全長的質(zhì)粒pA-CN，具體步驟如下應(yīng)用引物pA-UGCGGACTAGTACGCGTTCTAGAGCGCGGAACCCCTATTTG和pA-LTGGATCCGCGGCCGCGTCGACCCCCTTGTATTACTGTTTATGT，在刪除pACYC-177多余卡那抗性基因的同時，引入6個酶切位點用于半長和全長的克隆，獲得低拷貝質(zhì)粒pA-CN；(4)全長cDNA載體的構(gòu)建CSFV 5′-半長的組裝首先分別用限制性內(nèi)切酶XbaI/SpeI、SpeI/PstI和NotI/SalI將F1、F2和F3片段克隆于質(zhì)粒pA或pGEM-5ZF(+)中，獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒F1-pA、F2-pGEM和F3-pGEM；在F1片段基因組5′-非編碼區(qū)的上游引入T7RNA聚合酶的啟動子用于全長cDNA的體外轉(zhuǎn)錄，然后用PstI和SalI將F3從F3-pGEM中切下，克隆與用相同酶作用的F2-pGEM，獲得重組質(zhì)粒F23-pGEM；再用SpeI和BamHI將F23從F23-pGEM中切下，克隆與用相同酶作用的F1-pA，獲得含有CSFV 5′-半長的重組質(zhì)粒F123-pA；CSFV 3′-半長的組裝首先分別用限制性內(nèi)切酶BamHI/NcoI和NcoI/NotI將F4、F5片段克隆于質(zhì)粒pB中，獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒F4-pB和F5-pB；而F6片段則克隆于pSIMPLE-19EcoR V/BAP Vector載體中，獲得重組質(zhì)粒F6-pUC；然后用NcoI/NotI將F5從F5-pB中切下，克隆與用相同酶作用的F4-pB中，獲得重組質(zhì)粒F45-pB；再用BstBI和SalI將F6從F6-pUC中切下，克隆與用相同酶作用的F45-pB，獲得含有CSFV 3′-半長的重組質(zhì)粒F456-pB；CSFV全長cDNA的組裝用BamHI和SalI將含有CSFV 3′-半長的F456片段從重組質(zhì)粒F456-pB中切下，克隆與用相同酶作用的F123-pA中，獲得含有CSFV全長cDNA的重組質(zhì)粒pA-FL22。
全文摘要
本發(fā)明涉及病毒抗體研究，旨在提供一種攜帶分子標(biāo)記的豬瘟病毒感染性cDNA載體的構(gòu)建方法。包括(1)用生理鹽水稀釋豬瘟活疫苗至1頭份/ml作為實驗材料，抽提總RNA后，根據(jù)設(shè)計的6對引物，RT-PCR分段擴增相應(yīng)的6個cDNA片段；(2)cDNA片段F1和F5中相應(yīng)分子標(biāo)記的引入；(3)全長cDNA克隆所需質(zhì)粒的改造；(4)全長cDNA載體的構(gòu)建。通過本發(fā)明可獲得攜帶分子標(biāo)記的豬瘟病毒兔化弱毒疫苗C株的感染性cDNA載體pA-FL22。由該載體獲得的RNA電轉(zhuǎn)豬瘟病毒的易感細(xì)胞，拯救具有感染性的子代病毒，且該子代病毒能穩(wěn)定遺傳上述構(gòu)建中引入的分子標(biāo)記。利用該感染性cDNA載體及子代病毒的拯救技術(shù)體系，可為深入研究該病毒的復(fù)制機制、致病機理以及新型標(biāo)記疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/40GK101864445SQ20091015547
公開日2010年10月20日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月20日
發(fā)明者扈鴻霞, 方維煥, 李得江, 李肖梁, 童超, 袁雪梅, 陳寧 申請人:浙江大學(xué)