專利名稱：黑翅土白蟻β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黑翅土白蟻β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體及應(yīng)用。 背景技術(shù)：
能源、資源以及環(huán)境問題是21世紀(jì)人類生存發(fā)展所面臨的最嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，也是制約我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的主要因素。從長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看，石油資源將在本世紀(jì)上半葉迅速走向枯竭的 邊緣，開發(fā)可持續(xù)利用的替代資源的任務(wù)已非常緊迫。我國(guó)自1993年開始，已成為石油凈 進(jìn)口國(guó)，2008年中國(guó)石油進(jìn)口依存度接近52 %。過(guò)分依賴進(jìn)口原油，對(duì)我國(guó)能源和資源供 應(yīng)戰(zhàn)略安全構(gòu)成了潛在威脅。同時(shí)，化石燃料的燃燒導(dǎo)致二氧化碳排放量不斷增加，造成全 球氣候變暖。我國(guó)的二氧化碳排放量近期仍將繼續(xù)增加，這就大大增加了國(guó)際上對(duì)我國(guó)二 氧化碳減排的壓力，要求我們盡快尋求緩解途徑。據(jù)估計(jì)，全世界綠色植物每年光合作用產(chǎn)生的生物質(zhì)總量達(dá)1730億噸，所合能量 為2Χ1021焦耳，相當(dāng)于全世界每年消耗能量的10倍(李忠仁.生物能源的開發(fā)和利用.延 邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25 (3) :225-227)。生物質(zhì)既是可再生能源，為人類提供能量；也是 可再生資源，為人類提供物質(zhì)性生產(chǎn)所需的原料；且其生產(chǎn)及使用過(guò)程對(duì)環(huán)境不造成污染。 纖維素類物質(zhì)是生物質(zhì)資源的主體部分，僅中國(guó)每年產(chǎn)生的農(nóng)林廢棄物就有約10億噸，價(jià) 格低廉，供應(yīng)充足，且未得到充分開發(fā)利用。目前，生物質(zhì)能源和化學(xué)工業(yè)多半使用糧食作為原料。在我國(guó)，由于人口龐大，糧 食安全是極其重要的，國(guó)家明確要求相關(guān)技術(shù)的發(fā)展要以“不與人爭(zhēng)糧、不與糧爭(zhēng)地、不破 壞生態(tài)環(huán)境”為前提。隨著我國(guó)農(nóng)村生活能源結(jié)構(gòu)的變化與集約化生產(chǎn)的發(fā)展，秸稈已經(jīng)逐 步由傳統(tǒng)的用于取暖燒柴及飼料演變成了 “廢棄物”。在收獲季節(jié)常常就地焚燒，造成嚴(yán)重 的環(huán)境污染，急需尋找新的高效利用之道。最有前景的方案之一是利用高效生物催化劑來(lái) 降解轉(zhuǎn)化秸稈，產(chǎn)生人類所急需的液體燃料及化工產(chǎn)品。纖維素的酶降解需要纖維素酶的參與，纖維素酶并不是一種簡(jiǎn)單的酶，而是由若 干種相互關(guān)聯(lián)的酶組成的一個(gè)復(fù)雜的酶系統(tǒng)，一般來(lái)說(shuō)，纖維素酶主要由三類組成(1)內(nèi) 切-β-1，4-葡聚糖酶(Endo—^-l,4-glucanase, EC 3. 2. 1. 4)，主要作用于纖維素分子 內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β _1，4糖苷鍵，將長(zhǎng)鏈纖維素分子鏈截短，產(chǎn)生大量帶有非還 原性末端的小分子纖維素和可溶性纖維寡聚糖；(2)外切-β_1，4-葡聚糖酶(Εχο-β-1， 4-glucanase, EC 3. 2. 1. 91)，主要作用于纖維素分子鏈的非還原末端，水解β_1，4糖苷 鍵，產(chǎn)生纖維二糖；(3) β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, EC 3. 2. 1.21)，水解上述兩種酶 產(chǎn)生的纖維二糖和其他低聚糖，生成葡萄糖(Coughlin M P，Ljungdahl J G. Comparative biochemistry of fungal and bacterial eellulolyticenzyme systems. In Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation. New York Academic, 1988,11-30 ；Goyal A, et al. Characteristics of fungalcellulases. Bioresource Technology,1991,36 (1) 37-50;王蘭芬.纖維素酶的作用機(jī)理及開發(fā)應(yīng)用.釀酒科技，1997,6:16-17;嚴(yán)巖，張全 福.纖維素酶的性質(zhì)、應(yīng)用及其環(huán)境意義.農(nóng)業(yè)環(huán)境與發(fā)展，1997，1 :17-20)。
自然界中，纖維素酶廣泛存在于細(xì)菌、真菌、軟體動(dòng)物、原生動(dòng)物、甲殼動(dòng)物和一些 昆蟲如蟑螂、天牛、白蟻等的體內(nèi)。其中，人們對(duì)細(xì)菌、真菌體內(nèi)的纖維素酶研究得最多，而 對(duì)昆蟲體內(nèi)的纖維素酶則研究得較少。目前有關(guān)昆蟲體內(nèi)纖維素酶的研究主要集中在天牛 和白蟻的一些種類上。白蟻是一類以木質(zhì)纖維素為主要食源的古老生物，在地球物理循環(huán)和能量流動(dòng)中 起著十分重要的作用。在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，白蟻為了適應(yīng)纖維素類食物的消化，體內(nèi)形 成了非常高效的降解纖維素的纖維素酶系統(tǒng)。近幾十年的研究結(jié)果表明，白蟻體內(nèi)的纖維 素酶主要由內(nèi)切_ β -1，4-葡聚糖酶和β -葡萄糖苷酶組成，在一定條件下，這兩種酶也具 有外切-β-1，4-葡聚糖酶活性。黑翅土白蟻Odontotermes formosanus在我國(guó)分布于北 緯35°C以南的廣大地區(qū)，國(guó)外則主要分布在緬甸、泰國(guó)和日本的沖繩等地，是一種建立菌 圃培養(yǎng)真菌的土棲性白蟻( 李棟，等.白蟻管漏的成因及其治理.昆蟲知識(shí)，2001，38(3) 182-185;黃復(fù)生，等編著.中國(guó)動(dòng)物志·昆蟲綱 第十七卷 等翅目.北京科學(xué)出版 社.2000)。發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室早期的研究結(jié)果表明，與黃胸散白蟻、細(xì)顎散白蟻、臺(tái)灣乳白蟻和 平陽(yáng)堆砂白蟻相比，黑翅土白蟻頭部的葡萄糖苷酶活性明顯要高，且酶來(lái)源研究表明， 黑翅土白蟻體內(nèi)的纖維素酶均由其自身分泌(Mo Jianchu, et al. Cellulaseactivity in five species of important termites in China. Applied Entomologyand Zoology,2004, 39(4) :635-641)。在當(dāng)前利用纖維素酶降解纖維素的生產(chǎn)工藝中，最困擾人們的是如何提高纖維素 酶的酶解效率和降低纖維素酶的生產(chǎn)成本(王景林.纖維素酶固定化的研究進(jìn)展.生命科 學(xué).1997，9(3) :116-118，135)。從自然界中尋找高活性的纖維素酶和利用分子生物學(xué)技術(shù) 改造纖維素酶基因，進(jìn)而開發(fā)活性高、熱穩(wěn)定性好、底物范圍廣、耐酒精能力強(qiáng)的纖維素酶 生物工程菌，是解決這一問題的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種葡萄糖苷酶及其編碼基因、載體與應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種β-葡萄糖苷酶，具有與SEQ ID No. 2所示多肽同源性95%以上的氨基酸序 列。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有與SEQ ID Ν0. 2所示氨基酸序列的肽蛋白同 源性在95%以上的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，均屬于本發(fā)明 保護(hù)范圍之列。具體的改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變 體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替 換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“ β -葡萄糖苷酶”、“黑翅土白蟻β -葡萄糖苷酶”或“酶OfBG” 都可互換使用，都指具有β _葡萄糖苷酶氨基酸殘基序列(SEQ IDNo. 2)的蛋白或多肽。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“β-葡萄糖苷酶”指具有β-葡萄糖苷酶活性的SEQ IDNo. 2的 全長(zhǎng)序列(第1-472位)的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有β-葡萄糖苷酶活性的SEQ ID No. 2 序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取 代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添 加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括葡萄糖苷酶的活性 片段和衍生物。該多肽的變異形式包括同源序列、等位變異體、天然突變體，誘導(dǎo)突變體，在高或 低的嚴(yán)謹(jǐn)度條件下能與葡萄糖苷酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。本發(fā)明還提供了其 他多肽，如包含葡萄糖苷酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包 括了 葡萄糖苷酶的可溶性片段。通常，該片段具有葡萄糖苷酶序列的至少約10個(gè) 連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨 基酸，最佳地約70個(gè) 連續(xù)氨基酸。發(fā)明還提供β -葡萄糖苷酶或多肽的類似物，這些類似物與天然β “葡萄糖苷酶 的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而 有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通 過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技 術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非 天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限 于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括；體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙 酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn) 行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng) 物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨 酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化 了溶解性能的多肽。優(yōu)選的，所述β -葡萄糖苷酶具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及所述的β -葡萄糖苷酶在纖維素降解中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉及一種編碼權(quán)利要求1所述β _葡萄糖苷酶的基因。具體的，所述基因具有SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列?；蛘?，所述基因具有SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“編碼葡萄糖苷酶的多核苷酸”指編碼具有葡萄糖苷酶 活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No. 1中第70 1488位(SEQID No. 3)核苷酸序列 及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指位于SEQ ID No. 1序列的編碼框第70 1488位(SEQ ID No. 3)核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的 序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID No. 1中第70 1488位核苷酸序列同源性低至 約70%。簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID No. 2所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件 下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID No. 1中從核苷酸第70 1488位(SEQ ID No. 3) 的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID No. 1中從核苷酸第70 1488 位(SEQ ID No. 3)的核苷酸序列的同源性至少70 %，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %的 核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與β -葡萄糖苷酶相同功能的蛋白的SEQ IDNo. 2序列 的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)核苷酸的缺失、插入或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)核苷酸。本發(fā)明還包括β -葡萄糖苷酶多肽編碼序列及其片段的反義序列，這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)葡萄糖苷酶的表達(dá)。本發(fā)明還涉及一種含有所述基因的重組載體，以及利用所述重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo) 或轉(zhuǎn)染得到的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的 原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌，枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲 細(xì)胞、和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如Tn細(xì)胞、CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。本發(fā)明還涉及所述的基因在制備重組β-葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種編碼黑翅土白蟻葡萄糖苷酶的基因，該基因可在宿主細(xì)胞 中大量表達(dá)以生產(chǎn)該葡萄糖苷酶，用于纖維素的降解，經(jīng)檢測(cè)本發(fā)明葡萄糖苷酶酶 活達(dá)117U。本發(fā)明所提供的葡萄糖苷酶及其編碼基因可應(yīng)用于纖維素的降解。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此實(shí)施例1 黑翅土白蟻β -葡萄糖苷酶基因(OfBG)的克隆1.基因克隆于冰浴條件下解剖黑翅土白蟻(采自杭州余杭區(qū)東笤溪大提)的唾液腺，并將 獲得的腺體迅速至于Trizol (Invitrogen)溶液中，迅速抽提其總RNA，并以oligo(dT)18 為引物反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用一對(duì)簡(jiǎn)并引物(Primer 1:
-taycaytgggayytnccncarga-3‘,Primer2 -tcraarttrtccatnarnswcca-3‘)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增到的片段進(jìn)行τ載體(Promega)克隆，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定(Invitrogen)。根據(jù)測(cè)序得到的結(jié)果設(shè)計(jì)特異性引物(Primer 3 :5’ -ttgaaccgataattgcctccaac gaaga-3‘, Primer 4 5' -ggtacaacctgtagccacgtagaagaac-3')，j^MM^iTim-^^ OfBG 長(zhǎng)cDNA的3，及5，端。以總RNA為模板，利用3，及5，RACE試劑盒(Takara-Clontech)， 參照試劑盒說(shuō)明書，分別擴(kuò)增該基因的3’端及5’端序列。分別對(duì)擴(kuò)增到的片段進(jìn)行T載 體(Promega)克隆，并對(duì)其進(jìn)行序列測(cè)定(Invitrogen)。將測(cè)序獲得的序列用軟件進(jìn)行序 列拼接，最終獲得全長(zhǎng)cDNA。2.序列比對(duì)利用DNAStar軟件對(duì)編碼OfBG的全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)該序列長(zhǎng) 1962bp(SEQ ID No. 1)，GC 含量為 41. 7%。其中開放閱讀框(open reading frame, 0RF)為 1419bp(SEQ ID No. 3)，編碼 472 個(gè)推導(dǎo)氨基酸殘基(SEQ ID No. 2)。利用http://aU. expasy. org/網(wǎng)站的在線工具預(yù)測(cè)該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量 為 54. 3KDa，等電點(diǎn)為 5. 75。使用在線 SMART 工具(http //smart, embl-heidelberg. de/) 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有一個(gè)典型的Glyco hydro 1結(jié)構(gòu)域。將該基因的ORF閱讀框所包含的cDNA序列于NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTn比對(duì)分 析，結(jié)果顯示其與多種昆蟲的葡萄糖苷酶基因高度同源。實(shí)施例2 黑翅土白蟻β -葡萄糖苷酶基因(OfBG)在大腸桿菌中的表達(dá)將得到的黑翅土白蟻β -葡萄糖苷酶(OfBG)的基因編碼區(qū)(SEQ IDNo. 3)，經(jīng)SacI和Hind III雙酶切后，連接入同樣酶切的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(NOVagen)中，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5 α，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后得到表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-0fBG。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21中，篩選陽(yáng)性克隆，并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將含有pET-28a-0fBG的表達(dá)菌株接種于LB培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液 按1 100體積比接種到大體積LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至OD值0. 6，加入IPTG至終濃 度為lmmol/L，28°C誘導(dǎo)4小時(shí)。將誘導(dǎo)培養(yǎng)物離心收集菌體，用含20mM Tris-HCl pH8. 0、 50mM NaCl、0. 5mM EDTA 的溶液洗菌體兩遍，重懸于含 20mM Tris-HCl pH8. 0、50mM NaCl,
0.5mM EDTA、0. 5mM PMSF、0. 5mg/ml溶菌酶的溶液中，超聲處理裂解細(xì)胞，取上清測(cè)酶活，沒 有活性。實(shí)施例3 黑翅土白蟻β -葡萄糖苷酶基因(OfBG)在真核細(xì)胞(Tn細(xì)胞株，即粉 紋夜蛾細(xì)胞株)中的表達(dá)將得到的黑翅土白蟻β _葡萄糖苷酶(OfBG)的基因編碼區(qū)(SEQ IDNo. 3) J^Not I和Hind III雙酶切后，連接入同樣酶切的Tn細(xì)胞表達(dá)載體pBacFastHTa(Invitrogen) 中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后得到表達(dá)質(zhì)粒PBacFastHTa-OfBG。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 至大腸桿菌DHlOBac中，篩選陽(yáng)性克隆，抽提質(zhì)粒。重組質(zhì)粒在Lipofectin(GiBco Life)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Tn細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集 細(xì)胞及細(xì)胞上清，含重組病毒粒子的細(xì)胞上清用于下一輪感染。經(jīng)2 3周的TC-100連續(xù) 傳代培養(yǎng)，收集細(xì)胞，用超聲裂解法破碎細(xì)胞，取上清測(cè)酶活，酶活大小為117U。實(shí)施例4 黑翅土白蟻β -葡萄糖苷酶的酶活測(cè)定β -葡萄糖苷酶的酶活測(cè)定采用Somogyi-Nelson微量法(Somogyi M，Areagent for the copper-iodometric determination of very small amounts ofsugar. Journal of Biological Chemistry,1937,117(2) 771-776 ；Somogyi Μ, Anew reagent for the determination of sugars. Journal of Biological Chemistry,1945,160 (1) 61-68 ； Somogyi Μ, Notes on sugar determination. Journal ofBiological Chemistry, 1952, 195(1) 19-23 ；Nelson N, A photometricadaptation of the Somogyi method for the determination of glucose. Journalof Biological Chemistry,1951,193(1) :375_380), 具體操作如下1.試劑配制Somogyi I 將288g無(wú)水硫酸鈉溶于IL煮沸的蒸餾水中，然后再依次加入24g酒 石酸鉀鈉晶體，48g碳酸鈉，32g碳酸氫鈉，溶解后用蒸餾水稀釋至1.6L，27°C保存。Somogyi II 將72g無(wú)水硫酸鈉溶于300ml煮沸的蒸餾水中，然后再加入8g硫酸 銅，用煮沸的蒸餾水稀釋至400ml，在27 °C保存。Nelson Reagent 將IOOg鉬酸銨溶解在1. 8L蒸餾水中，然后加入84ml98%濃硫 酸，再加入IOOml砷酸鈉溶液(12g砷酸鈉溶解在IOOml蒸餾水中)，然后溶液保存在棕色瓶 中并在37°C下儲(chǔ)存24 48h，最后保存在室溫下。2.葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作在8支試管中分別裝入200 μ g/ml標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖0,0. 2,0. 4,0. 6,0. 8,1. 0,1. 2、
1.4ml。再依次加入蒸餾水 2. 0,1. 8,1. 6,1. 4,1. 2,1. 0,0. 8,0. 6ml,配成每毫升含 0、20、 40、60、80、100、120、140μ g的葡萄糖溶液。每試管中加入銅試劑2ml (Somogyi I 1.6ml，SomogyiII 0. 4ml)，混勻后沸水浴中加熱15min，立即冷卻，再加入2ml砷鉬酸試劑 (NelsonReagent)，振蕩兩分鐘后用分光光度計(jì)在520nm下測(cè)定吸光值。以葡萄糖含量 (μ g/ml)為橫坐標(biāo)，520nm下吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.酶活測(cè)定以0.6% (w/v)的水楊素(溶劑為0. IM醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH5. 6)為底物。 取950μ1 底物與50μ 1酶液充分混合，在37 °C下水浴30min，水解產(chǎn)生的還原糖釆用 Somogyi-Nelson微量法進(jìn)行測(cè)定。最后在520nm下測(cè)定吸光值。一個(gè)酶活力單位定義為每 分鐘每克蛋白質(zhì)所產(chǎn)生還原糖的微摩爾數(shù)，表示為U。經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明β-葡萄糖苷酶的酶活達(dá)117U。SEQUENCE LISTING〈110〉浙江大學(xué)〈120〉黑翅土白蟻β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體及應(yīng)用〈130〉<160>7<170>PatentIn version 3.4<210>1<211>1962<212>DNA<213>0dontotermes formosanus〈400〉1cgaaacgaca cttgttactg tgtgttaatt cgtcacagac agctgtacca caaacgcagt 60tgtagcttca tggctggtca ggcgttcccc gctggatttc tgtttggaac agcatcgtct 120tcttatcaag taaaaggcgg ttggaacgaa aatggtaaag gcgagagtat atgggacaga 180ctgacccacg atcatccgga gatcatcaaa gataaatcaa ctggtgatgt ggcctgtaat 240tcctatcatt tgtataagga aaacgtccga atgctaaagg aattgggggt tcatttctac 300cggttctctg tgtcgtggcc gcgaattcta ccaactggac atgacaacgt agtgaatgaa 360gctggaattg cctattataa taatctgata aacgaactga tagccaatgg aatacagcct 420atgataacga tgtaccactg ggatctgcca caacctctgc aagatcttgg tggatggacc 480aatcctgctc tagcgaacta cttcgaggat tatgctcgtg tgctgtacgc taactttgga 540gacagggtaa aatggtggaa cactatcaac gaaccacaaa acattgctgt aggatatagc 600tcaccgtttg gagttgcacc taacattctt acacctggtc acggggacta cctggctatg 660catacgattc tgttatcaca cgccagggcg tacagactgt atgagcggga atttaaggat 720aaacaggaag ggaaagtatc tattgcggct tcgtgcgtct ggattgaacc gataattgac 780tccaacgaag aagaagaatc ggcttcgaga gtacggcaaa tgcatattgg atgggtgtta 840catcccatct acagtgcaac tggagattat ccgactgtaa tgaaggagtg gatagctaaa 900aaaagcaagg aggaaggtta cagcaggtcg agactgccga gattcaccaa ggaggagatt 960gaaatggtga aaggtacttg ggactacctg ggaattaacc actacaccac attcttcact 1020taccggagtg aaagtgaatc acttctactc ttgggtaccg gagttgctaa tattgcaaat 1080gaaaaatatg caactggttc ttctacgtgg ctacaggttg taccgtgggg tttcagaaag 1140
ttgctgaact ggatagccaa agagtacaac aatccacctg tcttggtaac agagaatggg 1200ttctctgatt atggagaact taacgacaga gatagaattg attaccacat aaagtacatg 1260tgggaattac tgaaggccat gaaggaagat ggatgcaacg taattggtta taccgcgtgg 1320
agtctgatgg acgactttga atgggcatct ggatatacag agaaatttgg cctgtttcac 1380gtagatttca atgaccctga tcggaaaaga acagccaaga agtcagcaga agtcttctct 1440gagataatta aaagcaacaa gattcctgta gaatggctga agttatagat ttctcagtga 1500cgcaatgtca cagtttgcag ctataaattc accacattga tttgtttgta catttgtcag 1560taccctgaac tgctggtcat tttaaccttt taaagcctag cggtttgttt atgtaccaca 1620aggttgaacc ttcaaaaatt ctacattgtt ttcgcttcga gttgagtgtt ttgtagggat 1680ctcagaacag acagtgaatt ttgccttata catcattgac tgattggttt ttataaccgt 1740ggtggaaagt gtttacagcg cggtacgaac tgggtcttta aagaaagctg tctgcgcttc 1800gtatttaaaa ggttaacttg gacattgctt gaagtcactt tatatattat tgtactactt 1860caattcttta atcatgggtt atataactcc aaggtcattg tgattgcata tttgatgtgt 1920taaatatttt gaataaatat ttaaatatta caaaaaaaaa aa1962<210>2<211>472<212>PRT<213>0dontotermes formosanus<400>2Met Ala Gly Gln Ala Phe Pro Ala Gly Phe Leu Phe Gly Thr Ala Ser1510 15Ser Ser Tyr Gln Val Lys Gly Gly Trp Asn Glu Asn Gly Lys Gly Glu2025 30Ser lie Trp Asp Arg Leu Thr His Asp His Pro Glu lie lie Lys Asp3540 45Lys Ser Thr Gly Asp Val Ala Cys Asn Ser Tyr His Leu Tyr Lys Glu5055 60Asn Val Arg Met Leu Lys Glu Leu Gly Val His Phe Tyr Arg Phe Ser6570 75 80Val Ser Trp Pro Arg lie Leu Pro Thr Gly His Asp Asn Val Val Asn8590 95Glu Ala Gly lie Ala Tyr Tyr Asn Asn Leu lie Asn Glu Leu lie Ala100105 110Asn Gly lie Gln Pro Met lie Thr Met Tyr His Trp Asp Leu Pro Gln115120 125Pro Leu Gln Asp Leu Gly Gly Trp Thr Asn Pro Ala Leu Ala Asn Tyr130135 140Phe Glu Asp Tyr Ala Arg Val Leu Tyr Ala Asn Phe Gly Asp Arg Val145150 155 160
Lys Trp TrpAsn Thr lie Asn Glu Pro Gln Asn lie Ala Val Gly Tyr165170175Ser Ser ProPhe Gly Val Ala Pro Asn lie Leu Thr Pro Gly His Gly
180185190Asp Tyr LeuAla Met His Thr lie Leu Leu Ser His Ala Arg Ala Tyr195200205Arg Leu TyrGlu Arg Glu Phe Lys Asp Lys Gln Glu Gly Lys Val Ser210215220lie Ala Ala Ser Cys Val Trp lie Glu Pro lie lie Asp Ser Asn Glu225230235 240Glu Glu GluSer Ala Ser Arg Val Arg Gln Met His lie Gly Trp Val245250255Leu His Prolie Tyr Ser Ala Thr Gly Asp Tyr Pro Thr Val Met Lys260265270Glu Trp lieAla Lys Lys Ser Lys Glu Glu Gly Tyr Ser Arg Ser Arg275280285Leu Pro Arg Phe Thr Lys Glu Glu lie Glu Met Val Lys Gly Thr Trp290295300Asp Tyr LeuGly lie Asn His Tyr Thr Thr Phe Phe Thr Tyr Arg Ser305310315 320Glu Ser GluSer Leu Leu Leu Leu Gly Thr Gly Val Ala Asn lie Ala325330335Asn Glu LysTyr Ala Thr Gly Ser Ser Thr Trp Leu Gln Val Val Pro340345350Trp Gly PheArg Lys Leu Leu Asn Trp lie Ala Lys Glu Tyr Asn Asn355360365Pro Pro ValLeu Val Thr Glu Asn Gly Phe Ser Asp Tyr Gly Glu Leu370375380Asn Asp Arg Asp Arg lie Asp Tyr His lie Lys Tyr Met Trp Glu Leu385390395 400Leu Lys Ala Met Lys Glu Asp Gly Cys Asn Val lie Gly Tyr Thr Ala405410415Trp Ser LeuMet Asp Asp Phe Glu Trp Ala Ser Gly Tyr Thr Glu Lys420425430Phe Gly LeuPhe His Val Asp Phe Asn Asp Pro Asp Arg Lys Arg Thr435440445Ala Lys LysSer Ala Glu Val Phe Ser Glu lie lie Lys Ser Asn Lys450455460lie Pro ValGlu Trp Leu Lys Leu
465470<210>3<211>1419<212>DNA<213>0dontotermes formosanus<400>3atggctggtc aggcgttccc cgctggattt ctgtttggaa cagcatcgtc ttcttatcaa 60gtaaaaggcg gttggaacga aaatggtaaa ggcgagagta tatgggacag actgacccac 120gatcatccgg agatcatcaa agataaatca actggtgatg tggcctgtaa ttcctatcat 180ttgtataagg aaaacgtccg aatgctaaag gaattggggg ttcatttcta ccggttctct 240gtgtcgtggc cgcgaattct accaactgga catgacaacg tagtgaatga agctggaatt 300gcctattata ataatctgat aaacgaactg atagccaatg gaatacagcc tatgataacg 360atgtaccact gggatctgcc acaacctctg caagatcttg gtggatggac caatcctgct 420ctagcgaact acttcgagga ttatgctcgt gtgctgtacg ctaactttgg agacagggta 480aaatggtgga acactatcaa cgaaccacaa aacattgctg taggatatag ctcaccgttt 540ggagttgcac ctaacattct tacacctggt cacggggact acctggctat gcatacgatt 600ctgttatcac acgccagggc gtacagactg tatgagcggg aatttaagga taaacaggaa 660gggaaagtat ctattgcggc ttcgtgcgtc tggattgaac cgataattga ctccaacgaa 720gaagaagaat cggcttcgag agtacggcaa atgcatattg gatgggtgtt acatcccatc 780tacagtgcaa ctggagatta tccgactgta atgaaggagt ggatagctaa aaaaagcaag 840gaggaaggtt acagcaggtc gagactgccg agattcacca aggaggagat tgaaatggtg 900aaaggtactt gggactacct gggaattaac cactacacca cattcttcac ttaccggagt 960gaaagtgaat cacttctact cttgggtacc ggagttgcta atattgcaaa tgaaaaatat 1020gcaactggtt cttctacgtg gctacaggtt gtaccgtggg gtttcagaaa gttgctgaac 1080tggatagcca aagagtacaa caatccacct gtcttggtaa cagagaatgg gttctctgat 1140tatggagaac ttaacgacag agatagaatt gattaccaca taaagtacat gtgggaatta 1200ctgaaggcca tgaaggaaga tggatgcaac gtaattggtt ataccgcgtg gagtctgatg 1260gacgactttg aatgggcatc tggatataca gagaaatttg gcctgtttca cgtagatttc 1320aatgaccctg atcggaaaag aacagccaag aagtcagcag aagtcttctc tgagataatt 1380aaaagcaaca agattcctgt agaatggctg aagttatag1419<210>4<211>23<212>DNA<213>Unknown〈220〉〈223〉人工序列〈220〉<221>misc_feature
〈222>(15). · (15)
<223>n is a, c, g, or t<220><221>misc_feature <222>(18). . (18)<223>n is a, c, g, or t<400>4taycaytggg ayytnccnca rga23<210>5<211>23<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<220><221>misc_feature<222>(15). . (15)<223>n is a, c, g, or t<220><221>misc_feature<222>(18). . (18)<223>n is a, c, g, or t<400>5tcraarttrt ccatnarnsw cca23<210>6<211>28<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>6ttgaaccgat aattgcctcc aacgaaga28<210>7<211>28<212>DNA<213>Unknown<220><223>人工序列<400>7ggtacaacct gtagccacgt agaagaac28
權(quán)利要求
一種β-葡萄糖苷酶，具有與SEQ ID No.2所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的葡萄糖苷酶，其特征在于所述葡萄糖苷酶具有SEQID No. 2所示的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的葡萄糖苷酶在纖維素降解中的應(yīng)用。
4.一種編碼權(quán)利要求1所述β _葡萄糖苷酶的基因。
5.如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述基因具有SEQID NO. 1所示的核苷酸序列。
6.如權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述基因具有SEQID NO. 3所示的核苷酸序列。
7.一種含有權(quán)利要求4 6之一所述基因的重組載體。
8.一種利用權(quán)利要求7所述重組載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染得到的宿主細(xì)胞。
9.權(quán)利要求4 6之一所述的基因在制備重組β-葡萄糖苷酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種黑翅土白蟻β-葡萄糖苷酶、編碼基因、載體及應(yīng)用。所述β-葡萄糖苷酶具有與SEQ ID No.2所示多肽同源性95％以上的氨基酸序列。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種編碼黑翅土白蟻β-葡萄糖苷酶的基因，該基因可在宿主細(xì)胞中大量表達(dá)以生產(chǎn)該β-葡萄糖苷酶，用于纖維素的降解，經(jīng)檢測(cè)本發(fā)明β-葡萄糖苷酶酶活達(dá)117U。本發(fā)明所提供的β-葡萄糖苷酶及其編碼基因可應(yīng)用于纖維素的降解。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101845426SQ20091015536
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月21日
發(fā)明者莫建初, 陳春潤(rùn) 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)