專利名稱：：人工改造合成的抗草甘膦基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種人工支造合成的抗草甘膦基因以及其構(gòu)建的植物表達(dá)載體及其在抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物研制方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：草甘膦是一種非選擇性除草劑，具有理化性質(zhì)穩(wěn)定、高效、廣語、低毒、低殘留、易于被微生物分解，不破壞土壤環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，成為目前世界上生產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種。自從1976年美國孟山都公司的草甘膦類除草劑-農(nóng)達(dá)(Roundup)研制成功并得到廣泛應(yīng)用以來，作物抗草甘膦轉(zhuǎn)基因研究成為抗除草劑基因工程研究的熱點(diǎn)。隨著抗草甘膦基因克隆的發(fā)展，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物也相繼問世并大面積推廣應(yīng)用，這些轉(zhuǎn)基因作物具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)減少除草劑總用量，使雜草防治費(fèi)用下降，增加農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)效益；(2)所用除草劑品種廣譜、選擇性強(qiáng)、對環(huán)境友好、使用方便，特別適用于保水，減輕土壤侵蝕及石油耗量少的少耕與免耕體系，減少機(jī)械耕作作業(yè)，大大節(jié)省能源；(3)解決了常規(guī)除草劑難以防治的特殊雜草問題，如稻田的野生稻、赤稻、寬葉臂形草、圓葉牽牛、大果田菁；小麥田的雀麥(Bromusspp)、莎草(Cyperusspp);大豆田的鴨趾草、薊、苣荬菜、純?nèi)~決明以及寄生雜草。(6)解決土壤長殘留性除草劑對后蕃作物的傷害。轉(zhuǎn)基因作物所使用的草甘膦無土壤殘留，故對后茬作物十分安全。草甘膦的作用機(jī)理主要是竟?fàn)幮砸种泼Р菟嵬緩街?-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。該酶是真菌、細(xì)菌、藻類和高等植物體內(nèi)芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成過程中一個(gè)關(guān)銀f生的酶。草甘膦是磷酸稀醇式丙酮酸(PEP)的類似物，是EPSPS竟?fàn)幮砸种苿?，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)結(jié)合形成EPSPS-S3P-草甘膦復(fù)合體(此復(fù)合體非常穩(wěn)定)，抑制EPSPS的活性導(dǎo)致分支酸合成受阻，阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最終導(dǎo)致一些激素和關(guān)鍵性代謝物如類黃酮、木質(zhì)素和酚類化合物代謝失調(diào)，從而擾亂了生物體正常的氮代謝而使其死亡。將編碼EPSPS的基因在植物體中過量表達(dá)、或選用對草甘膦不敏感的EPSPS(如從根癌農(nóng)桿菌CP4菌林中克隆的CP4-EPSPS編碼基因)、或?qū)PSPS的氨基酸序列進(jìn)行修飾或點(diǎn)突變，或?qū)虢到獠莞熟⒌幕?如編碼草甘膦氧化還原酶的gox基因)、或?qū)氲阴＾D(zhuǎn)移酶(GAT基因)使草甘磷乙?；龋墒怪参铽@得對草甘膦的抗性。目前國際上除抗草甘膦的大豆、玉米、油菜、棉花和苜蓿已商業(yè)化外，抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因小麥、甜菜和匍旬剪股穎(Creepingbentgrass,牧草)也已獲得。我國抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)相對滯后，趙福永等(2005)、王景雪等(2005)曾將aroAM12基因轉(zhuǎn)入棉花和油菜，分別獲得了抗草甘膦的轉(zhuǎn)基因棉花和油菜，迄今國內(nèi)尚未見具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗草甘膦作物成功商業(yè)化的報(bào)道。中國發(fā)明專利CN200610052573.4公開了一種來源于假單胞桿菌(PseudomonasspG3)的抗草甘膦基因(EPSPS基因)，但由于其來源于細(xì)菌，細(xì)菌密碼子偏好性與植物有較大差異，將來自細(xì)菌的EPSPS基因直接轉(zhuǎn)化植物，其表達(dá)效率較低。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種在植物中能高效表達(dá)的抗草甘膦基因，可以提高轉(zhuǎn)基因植物的抗除草劑能力。為解決上述技術(shù)問題而提供的一種人工改造合成的抗草甘膦基因，其是根據(jù)一種來源于細(xì)菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因，利用植物密碼子偏好性進(jìn)行設(shè)計(jì)改造后用人工合成的方法而獲得的，設(shè)計(jì)過程中去除了多聚腺苷酸加尾信號、切割加工序列、植物稀有密碼子、非預(yù)期產(chǎn)生的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)，并設(shè)計(jì)了便于進(jìn)一步實(shí)施利用的限制性內(nèi)切酶切位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，該基因命名為具有SEQIDNO:1中3-1325所示的核苷酸序列。在上述人工改造合成的抗草甘膦基因核芬酸序列5，端融合了一段編碼葉綠體導(dǎo)肽的核苷酸序列。融合棉花來源編碼葉綠體導(dǎo)肽(PTP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名為PTP—SHi2，具有SEQIDNO:2中10-1563所示的核苷酸序列。融合擬南芥來源編碼葉綠體導(dǎo)肽(ATP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名為ATP—Affl2，具有SEQIDNO:3中10-1560所示的核苷酸序列。融合矮牽牛來源編碼葉綠體導(dǎo)肽(CTP)核苷酸序列的抗草甘膦融合基因，命名為CTP-S/漢么具有SEQIDNO:4中10-1548所示的核苷酸序列。構(gòu)建流程為在導(dǎo)肽基因CTP、ATP和PTP的兩端分別加上BawHI和WcoI酶切位點(diǎn)，在兩端加上7VoI和5"acI位點(diǎn)，利用連接7VcoI位點(diǎn)連接兩基因，獲得融合基因PTP—^i/及2、ATP—5/W2和CTP—5/fi2。葉綠體導(dǎo)肽的作用是將在植物中表達(dá)的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶定位至葉綠體中。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種含有所述抗草甘膦基因或抗草甘膦融合基因的植物表達(dá)載體。構(gòu)建方法利5awHI和&cI兩個(gè)酶切位點(diǎn)將融合基因克隆到植物表達(dá)栽體中pBI121，獲得植物表達(dá)載體pBI121—PTP—5ffl2、pBI121—ATP—5/漢2和pBI121一CTP—肪及2。用所述植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或植抹。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供抗草甘膦基因或抗草甘膦融合基因在培育抗除草劑植物品種中的應(yīng)用，尤其是在培育抗除草劑棉花中的應(yīng)用。本發(fā)明設(shè)計(jì)、改造后而人工合成的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因，使該基因轉(zhuǎn)錄出來的mRNA在植物體內(nèi)能高效翻譯，并可以構(gòu)建植物表達(dá)載體。轉(zhuǎn)基因棉花鑒定結(jié)果表明所設(shè)計(jì)合成的EPSPS基因能在棉花內(nèi)高效表達(dá)，獲得的轉(zhuǎn)基因棉花具有極顯著的抗除草劑能力。圖1是ATP基因的重疊PCR擴(kuò)增示意圖2是PTP基因的重疊PCR擴(kuò)增示意圖3是植物表達(dá)載體pBI121-CTP-BHR2構(gòu)建示意圖4是植物表達(dá)載體pBI121-ATP-BHR2構(gòu)建示意圖5是植物表達(dá)載體pBI121-PTP-BHR2構(gòu)建示意圖。具體實(shí)施例方式實(shí)施例15//i2基因的優(yōu)化及合成原始基因密碼子用法中在編碼Leu的47個(gè)密碼子中存在一個(gè)CTA密碼子，在編碼Ala的43個(gè)密碼子中存在9個(gè)GTG密碼子，這10個(gè)密碼子在植物中為罕見密碼子，對基因在植物中表達(dá)的翻譯效率造成較大程度的不利影響。而且20種氨基酸密碼子的用法與植物，尤其是棉花密碼子的用法差異巨大。因此，實(shí)施例l中利用生物學(xué)軟件DNA2.0ToolGeneDesigner對該基因的序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，利用生物軟件DNAMAN對優(yōu)化后的序列作限制性酶切分析，對含有常見酶切位點(diǎn)的密碼子進(jìn)行同義修飾，消除常用酶切位點(diǎn)。將5/Zi2基因第二個(gè)密碼子上的天冬酰胺(AAT)替換為丙氨酸(GCT),使其5，端含iVcoI位點(diǎn)，在基因的3，端加上SacI酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)載體的構(gòu)建，基因序列如表SEQIDNo:l所示。該基因經(jīng)重新設(shè)計(jì)后按植物密碼子偏好性合成，與野生基因核苷酸同源性為72.79%。該基因的密碼子用法見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>注上表中各密碼子所編碼氨基酸符號后的三個(gè)數(shù)字分別表示密碼子數(shù)量/在蛋白中的出現(xiàn)頻率(％。)/密碼子用法(％)合成后的BWi2基因克隆在pUC57栽體中。實(shí)施例2葉綠體導(dǎo)肽基因的克隆根據(jù)NCBI上的序列，直接合成棉花葉綠體導(dǎo)肽CTP基因，在該基因的5，端加5aw/H酶切位點(diǎn)，3，端加iVcoI酶切位點(diǎn)。對NCBI上已報(bào)道的擬南芥和矮牽牛綠體導(dǎo)肽基因ATP和PTP的DNA序列進(jìn)行密碼子分析，經(jīng)同義替換消除APT和PTP中的稀有密碼了子，根據(jù)修飾、后的序列設(shè)計(jì)合成引物AST1、AST2、AST3、AST4、AST5、AST6及PST1、PST2、PST3、PST4、PST5、PST6,引物序列如下AST1:5，GAGGATCCCTTATGGCCCAAGTTAGCAGAATCTGCAATGGTGTGCAGAACCCATCTC3，AST2:5，GGAGATTTTCGTTGACTGGATTTA'GAGAGATTGGAGATAAGAGATGGGTTCTGCACAC3，AST3:5，TCCAGTCAACGAAAATCTCCCTTATCGGTTTCTCTGAAGACACAGCAGCATCCACGAG3，AST4:5，CACTCTTCTTCAATCCCCAAGACGAGGAAATCGGATAAGCTCGTGGATGCTGCTGTG3，AST5:5'TTGGGGATTGAAGAAGAGTGGGATGACGTTAATTGGCTCTGAGCTTCGTCCTCTTAAG3，AST6:5，TGCCATGGAAGCAGTGGAAACAGAAGACATGACCTTAAGAGGACGAAGCTCAG3，PST1:5,GAGGATCCCTTATGGCACAAATTAACAACATGGCTCAAGGGATACAAACCCTTAATCC3，PST2:5，GATTTAGGAACTTGGGGTTTATGGAAATTGGAATTGGGATTAAGGGTTTGTATCCCT3'PST3:5，TAAACCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGTTTCCTTGTTTTCGGATCTAAGAAGCTGAA3，PST4:5，AATCTTTCTTCAAAACCAACATAGAATTTGCTGAATTTTTCAGCTTCTTAGATCCGA3'PST5:5，ATGTTGGTTTTGAAGAAAGATTCAATTTTCATGCAAAAGTTTTGTTCCTTTAGGAT3，PST6:5'TGCCATGGATGCTGTAGCCACTGATGCTGAAATCCTAAAGGAACAAAACTTT3'其中AST1和AST6，PST1和PST6為外引物(outprimer),其余均為內(nèi)引物(innerprimer)。利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增得到ATP和PTP序列。重疊PCR技術(shù)原理如圖1、圖2，ATP和PTP基因序列如表SEQIDNo:2和SEQIDNo:3所示。重疊PCR^應(yīng)體系outprimer1(30yM)outprimer2(30yM)innerprimermixture(30yM)10XbufferPfuDNApolymerased鮮s(2.5mMeach)補(bǔ)水至重疊PCR擴(kuò)增條件第一輪94°C5min，58°C30s,72°C45s5cycle:lyl:0.5ul:5ul:150U1第二輪92°C30s，56°C30s，72°C45s，72°C5min-^^~25cycle擴(kuò)增得到的ATP和PTP序列克隆到pMD-18T載體中，進(jìn)行測序。測序結(jié)果正確后，設(shè)計(jì)引物AST5'、AST3'及PST5，、PST3，分別對這兩個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，使其5'端加BamHI酶切位點(diǎn)，3，端加NcoI酶切位點(diǎn)，引物序列如下AST5，5，-ATGGCCCAAGTTAGCAGMT-3'AST3，5，-AAGCAGTGGAAACAGAAGAC-3'PST5':5，-ATGGCACAAATTAACMCATG-3，PS丁3，5，-ATGCTGTAGCCACTGATGC-3'將帶酶切位點(diǎn)的ATP和PTP基因克隆到pMD-18T載體中，經(jīng)測序正確后保存?zhèn)溆?。?shí)施例3抗草甘膦融合基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建將含導(dǎo)肽序列的栽體用Sam//I和MroI酶切處理回收目的片^殳，構(gòu)建到用相同內(nèi)切酶處理的含5/Zi^基因的pUC57載體中，分別獲得含三個(gè)融合基因的載體pUCCTP-57漢2、pUCATP-5/漢2和pUCPTP-5/2。利用導(dǎo)肽序列5，端5awiH酶切位點(diǎn)和BHR2基因3，端的&cl酶切位點(diǎn)切下三個(gè)融合基因，回收后構(gòu)建到用同樣酶切處理的植物表達(dá)載體pBI121中，獲得三個(gè)抗章甘膦整合基因的植物表達(dá)載體pBI121-CTP-BHR2、pBI121-ATP-BHR2和pBI121-PTP-BHR2,具體構(gòu)建流程如圖3,4，5。實(shí)施例4利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法獲得抗草甘膦煙草用75%酒精浸泡煙草種子30s,再用0.P/。升汞浸泡8min，進(jìn)行表面消毒。將消過毒的煙草種子置于MS培養(yǎng)基(加蔗糖30g/L)上無菌發(fā)芽，制備無菌苗。取無菌苗葉片剪成5mmx5mm大小的葉盤，用處于對數(shù)生長期的含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌浸染葉盤10min,吸干菌液，在黑暗條件下共培養(yǎng)2天(MS培養(yǎng)基)。將葉片轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基(MS+lmg/LBA+0.1mg/LNAA+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢霉素)上，光照條件下培養(yǎng)45天左右，待芽長大后切下轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS+50mg/L卡那霉素+500mg/L頭孢霉素)中培養(yǎng)30天左右，待根系發(fā)達(dá)后將小苗轉(zhuǎn)入僅加有500mg/L頭孢霉素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行編號保存。取獲得的轉(zhuǎn)基因煙草葉片，提取DNA后進(jìn)行PCR鑒定，用0.2%的草甘膦噴PCR鑒定為陽性的煙草葉片，2周后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。轉(zhuǎn)3個(gè)不同基因的轉(zhuǎn)基因煙草均能正常生長，而非轉(zhuǎn)基因煙草生長顯著受抑制，葉片不同程度發(fā)黃、萎蔫。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PTP-5ffi2、ATP-BHi2和CTP-Affi2基因的煙草具有較好的草甘膦抗性。實(shí)施例5利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化棉花獲得抗除草劑轉(zhuǎn)基因棉花農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是本領(lǐng)域科研人員熟知的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法。具體操作程序?yàn)?.菌抹培養(yǎng)將所構(gòu)建的殺蟲基因植物表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌林LBA4404中，農(nóng)桿菌單菌落接種于含卡那霉素(kanamycin，km)50mg/L、利福平(rifampicin,rif)25mg/L的LB或YEB液體培養(yǎng)基中。28。C振蕩暗培養(yǎng)過夜到細(xì)菌生長對數(shù)期。用LB或YEB液體培養(yǎng)基稀釋菌液，再振蕩培養(yǎng)46h,將菌液稀釋至OD600值0.3~0.35。2.無菌苗制備(1)棉花種子用硫酸(H2S04)脫去短絨，自來水洗掉種子表面的硫酸，晾干后用70%乙醇對種子進(jìn)行表面消毒1min，再用10%15%過氧化氫(11202)處理2~4h,用無菌水沖洗23次；(2)在無菌水中浸泡1824h,待種子露白，再在無菌條件下剝?nèi)シN皮，種入種苗培養(yǎng)基(1/21\^+瓊脂6g/L,pH6.8)中；(3)25。C28。C光培養(yǎng)3~5d時(shí)備用。3.棉花外植體與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)取無菌苗的下胚軸，用解剖刀切成0.50.6cm小段，浸入稀釋好的菌液中5~10min,然后取出胚軸段，用滅菌濾紙吸干多余的菌液，放在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上(MS+2.4-D0.1mg/L+KTO.lmg/L+葡萄糖30g/L+乙酰丁香酮200mg/L+瓊脂6g/L,pH5.0,表面鋪一層滅菌濾紙)，用封口膜封口。22。C25。C共培養(yǎng)2天。4.誘導(dǎo)愈傷組織及抗性愈傷組織的篩選(1)愈傷組織的誘導(dǎo)經(jīng)共培養(yǎng)后的下胚軸段放入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(MS+2,4-D0.1mg/L+KT0.1tng/L+MgC120.91g/L+Gelrite2.0g/L+Km50~100mg/L+Cef500mg/L+葡萄糖30g/L,pH5.8),在常規(guī)條件下("。C)培養(yǎng)2個(gè)月(一個(gè)月?lián)Q一次相同的培養(yǎng)基)。(2)抗性愈傷組織的檢測無菌條件下挑取愈傷組織少許進(jìn)行選擇標(biāo)記基因的ELISA檢測或報(bào)告基因g附的檢測，檢測結(jié)果為陽性的愈傷組織繼續(xù)繼代，非陽性的愈傷組織淘汰。通過對";///或gwj基因表達(dá)的檢測，獲得棉花抗性愈傷組織的頻率為50%~76%。5.愈傷組織的增殖繼代誘導(dǎo)出的抗性愈傷組織接入增殖培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基+MgC120.91g/L+Gelrite2.0g/L+葡萄糖30g/L,pH5.8)中，常規(guī)條件下(25。C)培養(yǎng)，每隔一個(gè)月繼代一次，直到愈傷組織分化。在第一次和第二次轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基后有部分愈傷組織褐化死亡，正常愈傷組織增殖也不快，第二次繼代后，愈傷組織增殖速度才加快。6.愈傷組織的分化及轉(zhuǎn)基因苗移栽愈傷組織經(jīng)繼代幾次后，有的愈傷組織轉(zhuǎn)成米粒狀顆粒，將其轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中(無NH4+、且KN03加倍的MS+谷氨酰胺1.0g/L+天門冬酰胺0.5g/L+MgCI20.911.35g/L+GeMte2.0~3.0g/L+葡萄糖20~30g/L,pH5.8),進(jìn)一步分化成胚狀體，胚狀體長成為小植抹后再轉(zhuǎn)入大的三角瓶中，待根長好后練苗移栽。洗去再生棉林根部的培養(yǎng)基，栽到滅菌蛭石中，澆足營養(yǎng)液。栽好的再生棉苗放入控溫22。C、控濕80~85%的人工培養(yǎng)箱中5~7d，再在溫室中培養(yǎng)10~20d后移栽到土盆或大田中。利用上述方法，分別將三個(gè)融合抗除草劑基因植物表達(dá)載體導(dǎo)入棉花中獲得了轉(zhuǎn)基因棉花。轉(zhuǎn)基因棉花經(jīng)抗除草劑測試，三種轉(zhuǎn)基因棉花中均可篩選到抗?jié)舛葹?.2%草甘膦的轉(zhuǎn)基因棉花4直沖朱。SEQUENCELISTING<no〉創(chuàng)世紀(jì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)有限公司浙江大學(xué)<120>人工改造合成的抗草甘膦基因與應(yīng)用<130>pl0962<160>4<170>Patentlnversion3.3<210>1<2I1>1331<212>DNA<213>人工序列<400>1ccatggctgctaacgacttgatttttcttgcccaacctgggggtagacttaatggaagaa60tccgggtgcctggggataagtccattagtcatcggagtatcatgcttggttctcttgctg120agggcactacggaggtagagggcttcctcgaaggggaagatgcattagcaacattgcaag180ccttccgtgatatgggggttgtgattgagggtcccaaccacggaagagttacgattcacg240gcgtgggtttacatgggttgaagccacctcctggacccttatacgtaggtaactctggga300catctatgaggcttttgtccgggctgcttgctggacagtcttttgacgtgactatgactg360gtgatgcctccctttcgaagaggcccatgaacagagtcgctaatccccttcgagagatgg420gagctgtagttgaaactggtccggagggcagaccccctcttacaatcagaggaggccata柳aacttaagggacttacttatactctcccaatggccagtgcccaagtaaagagttgtctgc540ttttggcagggttgtatgccgaaggtaagactactgtgaccgagcctgcacctacgagag600atcatacagagaggatgctgagagggtttggatatagcgttgagtctaacggtcctgttg660catctttacaatccgggggaaaacttactgcaactaggatcgaagttccagctgatataa720gcagcgcagctttc臓ggttgctgccagtatcgccgaaggctcagaattagtgctcg780aacatgtcggtataaatccaactaggacaggcgtgatcgacatacttaggctcatgggtg840gcgatataactcttgaaaaccaacgagaggtaggaggagaacctgttgctgatttgcgag卯Ottcgaggagcacaactgaaaggtatcgatattcctgaggctttagtaccgcttgccatcg960acgaatttccagtgttatttgttgctgctgcatgtgcagaaggtcgtacagttctccgtg翻gggctgaagaacttcgagttaaagaatctgaccgtattcaagttatggccgacggtctta1080ttactctcggcataaaatgcgagccaacccctgatggcattatcattgacggaggacaac1140ttggtggcggtgaagtgcatggccacggtgaccacaggatcgctatggca加cggtag1200ccagtcttcgggcttctgccccaattagaatccacgattgtgcaaacgtggccacctcat1260tocccaactttttggcattgtgtgctgaagttgggatcagggttgctgaggagggaaaat1320cctgagagctc1331<210>2<211>1569<212>DNA<213>人工序列<400>2ggatcccttatggcaacgcagtttggcaaaatctacaatggaacacaaaaaacatgtgtt60cttcccaatgtttcaaaaacccagaatcccaaacatgttccttttgtttcattcaaatca120aatctcaatggaaagacaagttcttggggtttggttgtgaagaacaatgggaaatttggt180tcaataaaggttcggtctttgaaggtttctgcttcaacagcaacagctgagaaaccatecatggctgctaacgacttgatttttcttgcccaacctgggggtagacttaatggaagaatc300cgggtgcctggggataagtccattagtcatcggagtatcatgcttggttctcttgctgag360ggcactacggaggtagagggcttcctcgaaggggaagatgcattagcaacattgcaagcc420ttccgtgatatgggggttgtgattgagggtcccaaccacggaagagttacgattcacggc480gtgggtttacatgggttgaagccacctcctggacccttatacgtaggtaactotgggaca540tctatgaggcttttgtccgggctgcttgctggacagtcttttgacgtgactatgactggt600gatgcctccctttcgaagaggcccatgaacagagtcgctaatccccttcgagagatggga660gctgtagttgaaactggtccggagggcagaccccctcttacaatcagaggaggccataaa720cttaagggacttacttatactctcccaatggccagtgcccaagtaaagagttgtctgctt780ttggcagggttgtatgccgaaggtaagactactgtgaccgagcctgcacctacgagagat840catacagagaggatgctgagagggtttggatatagcgttgagtctaacggtcctgttgca900tctttacaatccgggggaaaacttactgcaactaggatcgaagttccagctgatataagc960agcgcagctttctttttggttgctgccagtatcgccgaaggctcagaattagtgctcgaa1020catgtcggtataaatccaactaggacaggcgtgatcgacatacttaggctcatgggtggc1080gatataactcttgaaaaccaacgagaggtaggaggagaacctgttgctgatttgcgagtt1140cgaggagcacaactgaaaggtatcgatattcctgaggctttagtaccgcttgccatcgac1200gaatttccagtgttatttgttgctgctgcatgtgcagaaggtcgtacagttctccgtggg1260gctgaagaacttcgagttaaagaatctgaccgtattcaagttatggccgacggtcttatt1320actctcggcataaaatgcgagccaacccctgatggcattatcattgacggaggacaactt1380ggtggcggtgaagtgcatggccacggtgaccacaggatcgctatggcattttcggtagcc1440agtcttcgggcttctgccccaattagaatccacgattgtgcaaacgtggccacctcattc500cccaactttttggcattgtgtgctgaagttgggatcagggttgctgaggagggaaaatcc1560tgagagctc1569<210>3<211>1566<212>DNA<213>人工序列<400>3ggatcccttatggcccaagttageagaatctgcaatggtgtgcagaacccatctcttatc60tccaatctctctaaatccagtcaacgaaaatctcccttatcggtttctctgaagacacag120cagcatccacgagcttatccgatttcctcgtcttggggattgaagaagagtgggatgacg180ttaattggctctgagcttcgtcctcttaaggtcatgtcttctgtttccactgcttccatg240gctgctaacgacttgatttttcttgcccaacctgggggtagacttaatggaagaatccgg300gtgcctggggataagtccattagtcatcggagtatcatgcttggttctcttgctgagggc360actacggaggtagagggcttcctcgaaggggaagatgcattagcaacattgcaagccttc420cgtgatatgggggttgtgattgagggtcccaaccacggaagagttacgattcacggcgtg480atgaggcttttgtccgggctgcttgctggacagtc加gacgtgactatgactggtgat600gcctccctttcgaagaggcccatgaacagagtcgctaatccccttcgagagatgggagct660gtagttgaaactggtccggagggcagaccccctcttacaateagaggaggccataaactt720aagggacttacttatactctcccaatggccagtgcccaagtaaagagttgtctgcttttg780gcagggttgtatgccgaaggtaagactactgtgaccgagcctgcacctacgagagatcat840acagagaggatgctgagagggtttggatatagcgttgagtctaacggicctgttgcatct900ttacaatccgggggaaaacttactgcaactaggatcgaagttccagctgatataagcagc960gcagctttctttttggttgctgccagtatcgccgaaggctcagaattagtgctcgaacat■gtcggtataaatccaactaggacaggcgtgatcgacatacttaggctcatgggtggcgat1080ataactcttgaaaaccaacgagaggtaggaggagaacctgttgctgatttgcgagttcga1140ggagcacaactgaaaggtatcgatattcctgaggctttagtaccgcttgccatcgacgaa1200tttccagtgttatttgttgctgctgcatgtgcagaaggtcgtacagttctccgtggggct1260gaagaacttcgagttaaagaatctgaccgtattcaagttatggccgacggtcttattact1320ctcggcataaaatgcgagccaacccctgatggcattatcattgacggaggacaacttggt1380ggcggtgaagtgcatggccacggtgaccacaggatcgctatggcattttcggtagccagt1440cttcgggcttctgccccaattagaatccacgattgtgcaaacgtggccacctcattcccc1500aactttttggcattgtgtgctgaagttgggatcagggttgctgaggagggaaaatcctga1560gagctc1566<210>4<211>1554<212>DNA<213>人工序列<400>4ggatcccttatggcacaaattaacaacatggctcaagggatacaaacecttaatcccaat60tccaatttccataaaccccaagttcctaaatcttcaagtttccttgttttcggatctaag120aagctgaaaaattcagcaaattctatgttggttttgaagaaagattcaattttcatgcaa180aagttttgttcctttaggatttcagcatcagtggctacagcatccatggctgctaacgac240ttgatttttcttgcccaacctgggggtagacttaatggaagaatccgggtgcctggggat300aagtccattagtcatcggagtatcatgcttggttctcttgctgagggcactacggaggta360gagggcttcctcgaaggggaagatgcattagcaacattgcaagccttccgtgatatgggg420gttgtgattgagggtcccaaccacggaagagttacgattcacggcgtgggtttacatggg480ttgaagccacctcctggacccttatacgtaggtaactctgggacatctatgaggcttttg540tccgggctgcttgctggacagtcttttgacgtgactatgactggtgatgcctccctttcg600aagaggcccatgaacagagtcgctaatccccttcgagagatgggagctgtagttgaaact660ggtccggagggcagaccccctcttacaatcagaggaggccataaacttaagggacttact720tatactctcccaatggccagtgcccaagtaaagagttgtctgcttttggcagggttgtat780gccgaaggtaagactactgtgaccgagcctgcacctacgagagatcatacagagaggatg840ctgagagggtttggatatagcgttgagtctaacggtcctgttgcatctttacaatccggg900ggaaaacttactgcaactaggatcgaagttccagctgatataagcagcgcagctttcttt960ttggttgctgccagtatcgccgaaggctcagaattagtgctcgaacatgtcggtataaat1020ccaactaggacaggcgtgatcgacatacttaggctcatgggtggcgatataactcttgaa1080aaccaacgagaggtaggaggagaacctgttgctgatttgcgagttcgaggagcacaactg1140aaaggtatcgatattcctgaggctttagtaccgcttgccatcgacgaatttccagtgtta1200tttgttgctgctgcatgtgcagaaggtcgtacagttctccgtggggctgaagaacttcga1260gttaaagaatctgaccgtattcaagttatggccgacggtcttattactctcggcataaaa1320tgcgagccaacccctgatggcattatcattgacggaggacaacttggtggcggtgaagtg1380catggccacggtgaccacaggatcgctatggcattttcggtagccagtcttcgggcttct1440gccccaattagaatccacgattgtgcaaacgtggccacctcattccccaac臓ggca1500ttgtgtgctgaagttgggatcagggttgctgaggagggaaaatcctgagagctc155權(quán)利要求1、一種人工改造合成的抗草甘膦基因，具有SEQIDNO1中3-1325所示的核苷酸序列。2、一種人工改造合成的抗草甘膦融合基因，具有SEQIDNO:2中10-1563所示的核普酸序列。3、一種人工改造合成的抗草甘膦融合基因，具有SEQIDNO:3中10-1560所示的核苦酸序列。4、一種人工改造合成的抗草甘膦融合基因，具有SEQIDNO:4中10-1548所示的核苷酸序列。5、含有權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述抗草甘膦基因或抗草甘膦融合基因的植物表達(dá)載體。6、用權(quán)利要求5所述植物表達(dá)栽體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或植林。7、權(quán)利要求6所述的具有殺蟲能力的植物細(xì)胞、組織或植抹在培育抗除草劑植物品種中的應(yīng)用。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有殺蟲能力的植物細(xì)胞、組織或植抹在培育抗蟲植物品種中的應(yīng)用，其特征在于所述植物為棉花。全文摘要本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供了一種在植物中能高效表達(dá)的抗草甘膦基因，本發(fā)明利用棉花優(yōu)化密碼子設(shè)計(jì)合成了5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因并構(gòu)建其植物表達(dá)載體，將三個(gè)融合抗除草劑基因植物表達(dá)載體導(dǎo)入棉花中獲得了轉(zhuǎn)基因棉花。轉(zhuǎn)基因棉花經(jīng)抗除草劑測試，三種轉(zhuǎn)基因棉花中均可篩選到抗?jié)舛葹?.2％草甘膦的轉(zhuǎn)基因棉花植株。文檔編號C12N15/52GK101619319SQ200910111230公開日2010年1月6日申請日期2009年3月13日優(yōu)先權(quán)日2009年3月13日發(fā)明者何云蔚,崔洪志,徐曉麗,林朝陽,沈志成,王君丹,王建勝申請人:創(chuàng)世紀(jì)轉(zhuǎn)基因技術(shù)有限公司;浙江大學(xué)