專利名稱：甘蔗桿狀病毒檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明植物保護領(lǐng)域，具體是一種甘蔗桿狀病毒檢測方法。
背景技術(shù)：
甘蔗桿狀病毒(Sugarcane Bacilliform virus, SCBV)是近年來新發(fā)生的一種傳 播很快的病毒病害，主要通過糖粉蚧(Saccharicoccus sacchari)和無性繁殖材料類種質(zhì) 傳播。由于甘蔗種苗及育種材料在世界范圍內(nèi)廣泛交流，現(xiàn)SCBV已擴散到世界上多個甘蔗 種植區(qū)如古巴、如澳大利亞、馬達加斯、馬拉斯、毛里求斯、南美洲、美國、馬德里、摩洛哥、留 尼汪、巴布亞新、幾內(nèi)亞等國，以及我國的臺灣、廣東、廣西；雖然到目前為止，該病毒對甘蔗 生產(chǎn)影響的研究報道還不多見，但建立該病毒的快速檢測方法是阻擊此危險性病毒擴散的 重要措施。指示植物法、電鏡技術(shù)或酶聯(lián)免疫技術(shù)是常用的檢測病毒的方法。由于SCBV癥狀 表現(xiàn)不穩(wěn)定，病株在一定條件下可隱癥，且難于通過機械摩擦傳毒，故利用指示植物癥狀進 行檢測難度大；免疫電鏡技術(shù)能直觀的觀察到病毒粒子，診斷比較可靠，但儀器昂貴、檢測 速度慢、程序繁瑣；酶聯(lián)免疫法雖然具有較高的額靈敏度，但制備高純度的抗體復(fù)雜繁瑣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、靈敏、特異檢測的甘蔗桿狀病毒檢測方法，以克服 現(xiàn)有檢測技術(shù)中存在的不足。本發(fā)明的這種甘蔗桿狀病毒檢測方法包括以下步驟1、引物設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的甘蔗桿狀病毒基因組序列的保守序列(序列登錄 號AJ277091和M89923)設(shè)計了擴增甘蔗桿狀病毒的特異性引物PC1/PC2，擴增的目的片段 大小為589bp，引物序列如下PCl 5' -ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3‘PC2 5' -TCACCTTGCCAACCTTCATA-3‘2、甘蔗葉組織總DNA抽提(1)稱取0. 5g甘蔗葉片放入研缽中，加適量液氮研磨至粉狀后轉(zhuǎn)至2ml離心管 中；(2)在裝有研磨物的離心管中加入800ul 65°C預(yù)熱的CTAB抽提液，倒置混勻后放 入65°C恒溫浴鍋中溫育2hr，中間每隔20min顛倒離心管數(shù)次；(3)取出裝有研磨物和CTAB抽提液的離心管置_20°C冷卻2min ；(4)加入600ul氯仿異戊醇(24 1)，充分混勻后室溫靜置30s, 12000rpm/min 離心6min ；(5)取上清液500ul加入2/3體積(340ul)的異丙醇，輕輕混勻；_20°C沉淀2hr ；(6)室溫下 8000rpm/min 離心 6min ；
(7)棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫風(fēng)干(8)沉淀用IOOul滅菌去離子水溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?、PCR 擴增在PCR 管里力口進 2 XPCR Taq mix IOul，PCl (20umol/L) 0. 2ul, PC2(20umol/ L) 0. 2ul，DNA模板2. 0ul,ddH20 7. 6ul，加完后短速離心8 10秒后放進PCR儀，94°C預(yù)變 性2min, 94°C變性30s, 50°C退火30s, 72°C延伸Imin，30個循環(huán)后72°C延伸5min, 4°C保存。4、電泳檢測取IOul PCR產(chǎn)物點進1. 0%瓊脂糖凝膠膠孔里(凝膠里預(yù)先加入0. 5%的0. 5ug/ ml溴化乙錠)，在0. 5 X TBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察， 在感染甘蔗桿狀病毒的蔗株中擴增到589bp的條帶，未感染的蔗株則未擴增出條帶。該發(fā)明的有益效果是根據(jù)甘蔗桿狀病毒基因組序列設(shè)計的特異性引物PC1/PC2， 提取甘蔗葉組織的總DNA，采用PCR擴增的方法，檢測甘蔗桿狀病毒，克服了現(xiàn)有檢測技術(shù) 中的缺點，提供了一種快速、靈敏、特異檢測甘蔗桿狀病毒SCBV的方法。
具體實施例方式1、引物設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的甘蔗桿狀病毒基因組序列的保守序列(序列登錄 號AJ277091和M89923)設(shè)計了擴增甘蔗桿狀病毒的特異性引物PC1/PC2，擴增目的片段為 大小為589bp，引物序列如下PCl 5' -ACCAGATCCGAGATTACAGAAG-3‘PC2 5' -TCACCTTGCCAACCTTCATA-3‘2、甘蔗葉組織總DNA抽提(1)稱取0. 5g甘蔗葉片放入研缽中，加適量液氮研磨至粉狀后轉(zhuǎn)至2ml離心管 中；(2)在裝有研磨物的離心管中加入800ul 65°C預(yù)熱的CTAB抽提液，倒置混勻后放 入65°C恒溫浴鍋中溫育2hr，中間每隔20min顛倒離心管數(shù)次；(3)取出裝有研磨物和CTAB抽提液的離心管置_20°C冷卻2min ；(4)加入600ul氯仿異戊醇(24 1)，充分混勻后室溫靜置30s, 12000rpm/min 離心6min ；(5)取上清液500ul加入2/3體積(340ul)的異丙醇，輕輕混勻；_20°C沉淀2hr ；(6)室溫下 8000rpm/min 離心 6min ；(7)棄上清，沉淀用70%乙醇洗滌2次，室溫風(fēng)干(8)沉淀用IOOul滅菌去離子水溶解，-20°C保存?zhèn)溆谩?、PCR 擴增在PCR 管里力口進 2 XPCR Taq mix IOul，PCl (20umol/L) 0. 2ul, PC2(20umol/ L) 0. 2ul，DNA模板2. 0ul,ddH20 7. 6ul，加完后短速離心8 10秒后放進PCR儀，94°C預(yù)變 性2min, 94°C變性30s, 50°C退火30s, 72°C延伸Imin，30個循環(huán)后72°C延伸5min, 4°C保存。4、電泳檢測取IOul PCR產(chǎn)物點入1. 0%瓊脂糖凝膠膠孔里(凝膠里預(yù)先加入0. 5%的0. 5ug/
4ml溴化乙錠)，在0. 5 X TBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察 在感染甘蔗桿狀病毒的蔗株中擴增到589bp的條帶，未感染的蔗株則未擴增出條帶。
上述的 CTAB 抽提液為IOOmmol/L TrisHCl pH8. 0 ； 20mmol/L EDTA ρΗ8· 0 ； 1. 4mol/L NaCl ；2% CTAB pH8. 0。
權(quán)利要求
一種甘蔗桿狀病毒檢測方法，其特在于包括以下步驟(1)引物設(shè)計根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的甘蔗桿狀病毒基因組序列的保守序列(序列登錄號AJ277091和M89923)設(shè)計了擴增甘蔗桿狀病毒的特異性引物PC1/PC2，擴增的目的片段大小為589bp，引物序列如下PC1 5′ ACCAGATCCGAGATTACAGAAG 3′PC2 5′ TCACCTTGCCAACCTTCATA 3′(2)甘蔗葉組織總DNA抽提①取0.5g甘蔗葉片放入研缽中，加適量液氮研磨至粉狀后轉(zhuǎn)至2ml離心管中；②在裝有研磨物的離心管中加入800ul 65℃預(yù)熱的CTAB抽提液，倒置混勻后放入65℃恒溫浴鍋中溫育2hr，中間每隔20min顛倒離心管數(shù)次；③取出裝有研磨物和CTAB抽提液的離心管置 20℃冷卻2min；④加入600ul氯仿∶異戊醇＝24∶1混合液，充分混勻后室溫靜置30s，12000rpm/min離心6min；⑤取上清液500ul加入2/3體積的異丙醇，輕輕混勻； 20℃沉淀2hr；⑥室溫下8000rpm/min離心6min；⑦棄上清，沉淀用70％乙醇洗滌2次，室溫風(fēng)干；⑧沉淀用100ul滅菌去離子水溶解， 20℃保存?zhèn)溆茫?3)PCR擴增在PCR管中按序加入以下試劑ddH2O7.6ul2×PCRTaq mix10ulPC1(20umol/L)0.2ulPC2(20umol/L)0.2ulDNA模板 2.0ul加完后短速離心8～10秒后放進PCR儀，94℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)后72℃延伸5min，4℃保存；(4)電泳檢測取10ul PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠，凝膠里預(yù)先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙錠，在0.5×TBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察；在感染甘蔗桿狀病毒的蔗株中擴增到589bp的條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗桿狀病毒檢測方法，其特征在于CTAB抽提液為 IOOmmol/L TrisHCl pH8. 0 ；20mmol/L EDTA pH8. 0 ；1. 4mol/L NaCl ；2% CTABpH8. 0。
全文摘要
一種甘蔗桿狀病毒檢測方法，根據(jù)甘蔗桿狀病毒基因組序列設(shè)計的特異性引物PC1/PC2，提取甘蔗葉組織的總DNA后，采用PCR擴增的方法，檢測甘蔗桿狀病毒，該方法克服了現(xiàn)有檢測技術(shù)中的缺點，提供了一種快速、靈敏、特異檢測甘蔗桿狀病毒的方法。
文檔編號C12Q1/70GK101906481SQ20091009488
公開日2010年12月8日 申請日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者盧文潔, 尹興祥, 李文鳳, 王曉燕, 羅志明, 黃應(yīng)昆 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所