專利名稱：一種改進(jìn)的甘蔗宿根矮化病菌pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其是一種改進(jìn)的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
甘蔗宿根矮化病(mtoon stuning disease，RSD)是普遍存在于所有植蔗地區(qū)
的一種世界性的重要病害。此病由一種棒桿菌屬細(xì)菌(07^^""^砂//8油5 .矽//)
寄生于蔗株的維管束中引起，主要通過甘蔗種苗傳播蔓延，且傳播性極強(qiáng)。蔗株染病后變矮，蔗莖變細(xì)，生長遲滯，宿根發(fā)株少，病害造成損失的程度隨宿根年數(shù)的增加而增加，一般減產(chǎn)10 30%，干旱缺水時(shí)可達(dá)60%以上，還可導(dǎo)致品種退化。由于甘蔗(RSD)無明顯的外部和內(nèi)部癥狀，傳統(tǒng)診斷方法極其困難，導(dǎo)致病害任意傳播、擴(kuò)展蔓延，對(duì)甘蔗生產(chǎn)危害極大。防止該病害的發(fā)生和蔓延，最經(jīng)濟(jì)有效的措施就是種植脫毒種苗，隨著甘蔗健康種苗在甘庶生產(chǎn)上的運(yùn)用，迫切需要建立起一種能快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、高靈敏度、特異性強(qiáng)檢觀!lRSD的方法。
目前我國對(duì)甘蔗宿根矮化病菌的檢測方法主要有電鏡負(fù)染檢測法(EM)、血清檢測法(包括間接酶聯(lián)免疫吸附法及組織斑點(diǎn)免疫檢測法)和PCR檢測法。但電鏡負(fù)染檢測需要昂貴的儀器，不適合田間大批量樣品的檢測；血清檢測法靈敏度高，但RSD難于人工分離、純化、培養(yǎng)，所以制備高純度抗體成為此項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用的瓶頸；而目前應(yīng)用于RSD的PCR檢測技術(shù)主要是用常規(guī)的CTAB法抽提DNA或病菌快速裂解法釋放DNA后再PCR擴(kuò)增，雖然快速、但由于抽提或裂解釋放的總DNA含量低，所以檢測靈敏度低、實(shí)驗(yàn)體系不易穩(wěn)定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、高靈敏度、特異性強(qiáng)的甘蔗
宿根矮化病菌PCR檢測方法，以克服現(xiàn)有檢測技術(shù)中的缺點(diǎn)。
本發(fā)明包括以下步驟1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)已報(bào)道的RSD病原細(xì)菌Lxx 16S-23SrDNA基因間隔區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物L(fēng)xxl/Lxx2，擴(kuò)增的目的片段大小為438bp，引物序列如下Lxxl: 5'-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3'，Lxx2: 5'-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3;
2、 樣品蔗汁采集
每個(gè)樣本隨機(jī)取6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成7cm左右長，再用鉗子擠壓25ml左右的甘蔗汁于50ml離心管內(nèi)混勻，放于-20"C冰箱保存待用。
3、 蔗汁總DNA提取
(1) 蔗汁DNA提取前，每樣品取2000ul蔗汁放入離心管中，12000rpm超速離心機(jī)上離心10min，棄上清，沉淀加入300ul滅菌去離子水稀釋混勻；
(2) 蔗汁DNA提取時(shí)，加入600ul經(jīng)65〃C預(yù)熱的2^CTAB抽提緩沖液，65"C水浴lhr，期間每隔20min搖勻一次；
(3) 加入600 ul氯仿/異戊醇(24: 1)劇烈振蕩30s, 12000rpm超速離心機(jī)上離心10min;
(4) 取上清液700ul置于新的1. 5ml離心管中，加入等體積氯仿異戊醇=24:1，溫和地混勻，12000rpm超速離心機(jī)上離心10min;
(5) 取上清液650ul置于新的1. 5ml離心管中，加入2 / 3體積(455ul)的異丙醇，混勻后置于-2(TC冰箱中沉淀4小時(shí)；
(6) 4。C下12000rpm超速離心機(jī)上離心10min，棄上清；
(7) 沉淀分別用400ul冷70X乙醇和冷無水乙醇各洗一次，室溫下風(fēng)干；
(8) 沉淀用30ul滅菌去離子水稀釋溶解-20〃C保存?zhèn)溆谩?br> 4、 PCR擴(kuò)增
在PCR管中按序加入以下試劑
ddH20 8.6ul2xPCRTaqmix 8ulLxxl (20umol/L) 0.2ulLxx2(20umol/L) 0.2ul
DNA模板 3.0ul加完后短速離心IO秒后放進(jìn)PCR儀，95'C預(yù)變性5mi， 94'C變性30s， 56°C退火30s， 72'C延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)后72'C延伸5min， 4匸保存；5、電泳檢測
取10ul PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠，膠里預(yù)先加入0. 5%的0. 5ug/ml溴化乙錠，在0. 5XTBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗樣品中擴(kuò)增到438bp的條帶。
該發(fā)明的有益效果是克服了現(xiàn)有檢測技術(shù)中的缺點(diǎn)，改進(jìn)了蔗汁總DNA的提取方法，提供了一種快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、高靈敏度、特異性強(qiáng)的甘庶宿根矮化病菌PCR檢測方法，適合田間大批量樣品檢測。
具體實(shí)施例方式
1、 引物設(shè)計(jì)
根據(jù)已報(bào)道的RSD病原細(xì)菌Lxx 16S-23SrDNA基因間隔區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物L(fēng)xxl/Lxx2，擴(kuò)增的目的片段大小為438bp，引物序列如下Lxxl: 5'-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3'Lxx2: 5'-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3
2、 樣品蔗汁采集
每個(gè)樣本隨機(jī)取6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成7cm左右長，再用鉗子擠壓25ml左右的甘蔗汁于50ml離心管內(nèi)混勻，放于-20°C冰箱保存待用。
3、 蔗汁總DNA提取
(1) 每樣品取2000ul蔗汁放入離心管中，12000rpm超速離心機(jī)上離心10min，棄上清；
(2) 沉淀加入300ul滅菌去離子水稀釋混勻，加入600ul經(jīng)65〃C預(yù)熱的2XCTAB抽提緩沖液，65。C水浴lhr，期間每隔20min搖勻一次；
(3) 加入600 ul氯仿/異戊醇(24: 1)劇烈振蕩30s， 12000卬m超速離心機(jī)上離心10min'，
(4) 取上清液700ul置于新的1. 5ml離心管中，加入等體積氯仿/異戊醇(24:l)溫和地混勻，12， OOOrpm超速離心機(jī)上離心lOmin;
(5) 取上清液650ul置于新的1. 5ml離心管中，加入2 / 3體積(S卩455ul)的異丙醇，混勻后置于-2CTC冰箱中沉淀4小時(shí)；
(6) 4"C下12000rpm超速離心機(jī)上離心10min，棄上清；
(7) 沉淀分別用400ul冷70X乙醇和冷無水乙醇各洗一次，室溫下風(fēng)干；
(8) 沉淀用30ul滅菌去離子水稀釋溶解-20"C保存?zhèn)溆谩?br> 4、 PCR擴(kuò)增
在PCR管里加進(jìn)2 X PCR Taq mix 8.0ul， Lxxl (20umol/L) 0.2ul, Lxx2 (20umol/L)0.2ul， DNA模板3.0ul , ddH20 8.6ul ，加完后短速離心10秒后放進(jìn)PCR儀，95。C預(yù)變性5min， 94""C變性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸lmin， 35個(gè)循環(huán)后72。C延伸5min， 4'C保存。
5、 電泳檢測
取10ul PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5°/。瓊脂糖凝膠(膠里預(yù)先加入0. 5%的0. 5ug/ml溴化乙錠)在0. 5XTBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗樣品中擴(kuò)增到438bp的條帶。未感染的甘蔗樣品中則未擴(kuò)增出條帶。
權(quán)利要求
1、一種改進(jìn)的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于包括以下步驟1)引物設(shè)計(jì)根據(jù)已報(bào)道的RSD病原細(xì)菌Lxx 16S-23SrDNA基因間隔區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物L(fēng)xx1/Lxx2，擴(kuò)增的目的片段大小為438bp，引物序列如下Lxx15′-CCGAAGTGAGCAGATTGACC-3′，Lxx25′-ACCCTGTGTTGTTTTCAACG-3；2)樣品蔗汁采集每個(gè)樣本隨機(jī)取6條蔗莖，每條蔗莖截取中下部莖節(jié)，用砍刀切成7cm左右長，再用鉗子擠壓25ml左右的甘蔗汁于50ml離心管內(nèi)混勻，放于-20℃冰箱保存待用，每取一個(gè)樣品后砍刀和鉗子均要用清水沖洗后再用70％的酒精消毒；3)蔗汁總DNA提取(1)蔗汁DNA提取前，每一樣品取2000ul蔗汁放入離心管中，12000rpm超速離心機(jī)上離心10min，棄上清，沉淀加入300ul滅菌去離子水稀釋；(2)蔗汁DNA提取時(shí)，加入600ul經(jīng)65″C預(yù)熱的2％CTAB抽提緩沖液，65℃水浴1hr，期間每隔20min搖勻一次；(3)加入600ul氯仿/異戊醇(24∶1)劇烈振蕩30S，12000rpm超速離心機(jī)上離心10min；(4)取上清液700ul置于新的1.5ml離心管中，加入等體積氯仿∶異戊醇＝24∶1，混勻，12000rpm超速離心機(jī)上離心10min；(5)取上清液650ul置于新的1.5ml離心管中，加入455ul的異丙醇，混勻后置于-20℃冰箱中沉淀4小時(shí)；(6)4℃下12000rpm超速離心機(jī)上離心10min，棄上清；(7)沉淀分別用400ul冷70％乙醇和冷無水乙醇各洗一次，室溫下風(fēng)干；(8)沉淀用30ul滅菌去離子水稀釋溶解-20″C保存?zhèn)溆茫?)PCR擴(kuò)增在PCR管中按序加入以下試劑ddH2O 8.6ul2×PCR Taq mix8ulLxx1(20umol/L)0.2ulLxx2(20umol/L)0.2ulDNA模板3.0ul加完后短速離心10秒后放進(jìn)PCR儀，95℃預(yù)變性5mi，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)后72℃延伸5min，4℃保存；5)電泳檢測取10ul PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠檢測，膠里預(yù)先加入0.5％的0.5ug/ml溴化乙錠，在0.5×TBE和140V的電壓下電泳20min后，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察；在感染甘蔗宿根矮化病的甘蔗樣品中擴(kuò)增到438bp的條帶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于 DNA提取前，取樣品蔗汁2000ul 12000rpm離心10min棄上清后，沉淀加300ul 滅菌去離子水稀釋。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于蔗 汁DNA提取時(shí)加入2%CTAB抽提緩沖液后，65。C水浴lhr。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于蔗汁 DNA提取時(shí)加入異丙醇混勻后-2CTC冰箱中沉淀4 hr。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于 PCR擴(kuò)增中的退火溫度為56°C。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于 PCR擴(kuò)增中循環(huán)數(shù)為35次。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，其特征在于電泳 檢測時(shí)瓊脂糖凝膠濃度為l. 5%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種改進(jìn)的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法，根據(jù)RSD病原細(xì)菌Lxx 16S-23SrDNA基因間隔區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異引物L(fēng)xx1/Lxx2，用改進(jìn)法提取蔗汁總DNA后，采用PCR擴(kuò)增的方法，檢測甘蔗宿根矮化病菌；該方法克服了現(xiàn)有檢測技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供了一種快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確、高靈敏度、特異性強(qiáng)的甘蔗宿根矮化病菌PCR檢測方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101633956SQ20091009487
公開日2010年1月27日 申請(qǐng)日期2009年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者盧文潔, 李文鳳, 王曉燕, 羅志明, 黃應(yīng)昆 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所