專利名稱：油藏中微生物菌群的組成和相對含量的監(jiān)測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種對油藏中的微生物菌群組成和相對含量進行監(jiān)測的方法。
背景技術：
微生物采油技術(MEOR)是通過利用微生物在油藏中的生命活動及其代謝產(chǎn)物來 提高原油產(chǎn)量和采收率的一種生物技術，微生物采油技術具有應用范圍廣、實施成本低及 經(jīng)濟效益顯著等特點，越來越受到人們的關注。油藏是一種復雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，對于一種成功的微生物采油技術來說，了解 微生物菌群在油藏中的組成及其含量以及它們在激活劑作用下的變化是非常重要的。對微生物菌群在油藏中的組成及其含量的檢測方法多基于培養(yǎng)技術，不僅費時費 力，并且自然界中的多數(shù)微生物是現(xiàn)有的人工方法所不能夠培養(yǎng)的，因此這種基于培養(yǎng)技 術的檢測方法不能夠真實地反映出油藏中微生物菌群的組成，從而導致對油藏中微生物菌 群的多樣性認識存在偏差。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，基于16S rRNA的非培養(yǎng)技術為揭示自然環(huán)境中 微生物菌群的組成和遺傳多樣性開辟了一條全新的途徑，克服了傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)技術的檢 測方法不能夠完整地反映環(huán)境中微生物菌群的全部信息的缺點(Amarm RI等.Microbiol Rev, 1995,59 143-169 ；Pace NR 等 Advances in Microbial Ecology，1986，9 1—55)。目前，有報道用DGGE方法監(jiān)測油藏微生物菌群結構的變化(VoordouwG等.Appl Environ Microbiol,1996,62 :1623_1629 ；Orphan VJ等ApplEnviron Microbiol,2000,66 700-711 ；佘躍惠等，生態(tài)學報，2005，25 :237_242.)，是利用梯度凝膠電泳分析16S rDNA可 變區(qū)序列的多樣性，反映油藏微生物菌群的組成。然而這種方法需要大量的人力勞動進行 梯度凝膠電泳，導致檢測過程過于復雜，即費時又費力。因此，開發(fā)出一種能夠對油藏中的微生物菌群的組成和相對含量進行監(jiān)測的更簡 便的方法成為迫切需要解決的問題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有的對油藏中的微生物菌落組成和相對含量進行監(jiān)測 的方法存在的檢測過程復雜的問題，提供一種能夠對油藏中的微生物菌群組成和相對含量 進行監(jiān)測的更簡便的方法。本發(fā)明提供了一種對油藏中的微生物菌群的組成和相對含量進行監(jiān)測的方法，其 中，該方法包括(1)提取油藏樣品的總DNA; (2)使用能夠特異性地使得到的總DNA中的 IBSrDNA進行擴增的具有熒光標記的引物，對總DNA中的16SrDNA進行擴增；(3)使用限制 性內切酶對所述擴增的產(chǎn)物進行酶切；(4)對酶切產(chǎn)物進行核苷酸序列片段大小和豐度分 析，得到酶切產(chǎn)物的核苷酸序列片段大小和豐度的圖譜；(5)通過在線分析程序MICA3對得 到的圖譜進行分析，得到微生物菌群的組成和相對含量。本發(fā)明的方法在對16S rDNA進行擴增以后不需要進行梯度凝膠電泳，而是通過使用DNA測序儀來對16S rDNA進行分析，大大地簡化了檢測步驟，從而能夠以簡單的方法進 行對油藏中的微生物菌群結構的檢測。


圖1顯示了實施例4中限制性片段的基因掃描結果的T-RFLP圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種對油藏中的微生物菌群的組成和相對含量進行監(jiān)測的方法，其 中，該方法包括(1)提取油藏樣品的總DNA; (2)使用能夠特異性地使得到的總DNA中的 IBSrDNA進行擴增的具有熒光標記的引物，對總DNA中的16SrDNA進行擴增；(3)使用限制 性內切酶對所述擴增的產(chǎn)物進行酶切；(4)對酶切產(chǎn)物進行核苷酸序列片段大小和豐度分 析，得到酶切產(chǎn)物的核苷酸序列片段大小和豐度的圖譜；(5)通過在線分析程序MICA3對得 到的圖譜進行分析，得到微生物菌群的組成和相對含量。本發(fā)明中，提取油藏樣品的總DNA的方法可以是各種提取DNA的方法，優(yōu)選使用 DNA提取試劑盒(UltraCleanTM Soil DNA kit)按照試劑盒的使用說明書記載的方法來提 取總DNA。根據(jù)本發(fā)明，對得到總DNA中的16S rDNA進行擴增的方法為本領域技術人員所公 知，例如，可以使用PCR儀(Mastercycler，Eppendorf公司)，根據(jù)《分子克隆實驗指南》第 三版(J.薩姆布魯克和D. W.拉塞爾著)記載的方法進行擴增，本領域的技術人員可以對 《分子克隆實驗指南》中記載的擴增方法和擴增條件進行各種適當?shù)母倪M。所述油藏中的微生物菌群主要包括細菌和古菌，因此，在對得到的總DNA中的 16SrDNA進行擴增時，既可以使用細菌和古菌的通用引物，例如，530f 5，-GTGCCAGCMGCCGCGG-3，，禾口1492r :5’ -GGMTACCTTGTTACGACT-3’ ；也可以分別使用針對細菌的引物和針對古菌的引物，分別對得到的總DNA中的 16SrDNA進行擴增，例如，Eub27f 5，-FAM-AGAGTTTGATC2CTGGCTCAG-3 ’，禾口Eub926r :5，-HEX-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3，；Arc21f :5，-FAM-TCCGGTTGATCCTGCCGGA-3，，禾口Arc934r :5，-HEX-GTGCTCCCCCGCCAATTCCT-3，；5，-FAM-GCTCAGTAACACGTGG-3，，禾口1495r :5’ -HEX-CTACGGCTACCTTGTTACG-3，。優(yōu)選情況下，使用針對細菌的引物和針對古菌的引物，分別以得到的總DNA為模
板進行擴增，所述擴增的條件可以為
4 優(yōu)選為
根據(jù)本發(fā)明，使用限制性內切酶對所述擴增的產(chǎn)物進行酶切的操作可以根據(jù)《分 子克隆實驗指南》第三版(J.薩姆布魯克和D. W.拉塞爾著)記載的方法進行，本領域的技 術人員可以對《分子克隆實驗指南》中記載的酶切方法和酶切條件進行各種適當?shù)母倪M。所述限制性內切酶的選擇，可以通過TAP-RFLP軟件將內切酶輸入到該軟件中 進行在線模擬分析，從而找到適合對油藏中的微生物群落進行分析的內切酶(MARSH TL, SAXM AN P, COLE J 等 Terminal restriction fragmentlength polymorphism analysis program, a web-based research tool for microbialcommunity analysis [J].Appl Environ Microbiol, 2000,66 (8) =3616-3620) 0所述熒光標記是指利用一些能發(fā)熒光的物 質共價結合或物理吸附在所要研究分子的某個基團上，利用它的熒光特性來提供被研究對 象的信息，例如借助FAM熒光和HEX熒光直接標記引物來監(jiān)測擴增產(chǎn)物的生成。在本發(fā)明中，所述限制性內切酶可以為選自由Hae III、Hha I, Msp I, Rsa I和 HinfI所組成的組中的至少一種；優(yōu)選情況下，使用Hae III和Hha I內切酶分別對擴增產(chǎn) 物進行酶切。酶切體系可以為 所述酶切體系優(yōu)選為 混勻后在35-37°C下酶切5-20小時，優(yōu)選在37°C下酶切5小時。然后在65_70°C 下放置15-20分鐘，使酶失活。根據(jù)本發(fā)明，酶切產(chǎn)物的核苷酸序列片段大小和豐度的分析可以通過使用ABI 310基因分析儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)進行，例如，通過將酶切產(chǎn)物的樣品與內標 (liz500)混合均勻，在95°C下變性3-5分鐘，之后置于冰浴中，在P0P4膠(GeneScan膠，美 國PE公司產(chǎn)品)進行毛細管電泳，電泳的時間為30-45分鐘。電泳結束后，通過與ABI 310 基因分析儀匹配的ABI PRISMR基因掃描軟件3. 7版對電泳結果進行分析，得到酶切產(chǎn)物的 核苷酸序列片段大小和豐度的圖譜(即T-RFLP圖譜)。以 T-RFLP 圖譜中每一個限制性片段(T-RF)為一個 OUT(operationaltaxonomic unit)即一個分類單元，相當于一種微生物。圖譜中OTU的數(shù)目作為微生物的種類數(shù)，OTU豐 度按照Saikaly的方法計算，即以相對峰高值(每個T-RF的峰高除以累計峰高值)作為該 類微生物的相對豐度，微生物的類型由在線分析程序MICA3(http://mica. ibest. uidaho. edu)確定。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明能夠提供的方法還包括在不同的時間點分別提取油藏樣品的 總DNA，并分別重復步驟(2)-(5)，將在不同時間點得到的微生物菌群的組成和相對含量進 行比較。實施例1樣品收集及環(huán)境總DNA提取樣品取自于山東省東營市勝利油田單12區(qū)塊S12-4油井產(chǎn)出水，根據(jù)水樣的混濁 程度，使用孔徑從大到小的濾膜逐級抽濾，最后一次抽濾用0. 22 μ m濾膜。收集濾膜上的 微生物細胞，用DNA提取試劑盒(UltraCleanTMSoil DNAKit)提取總DNA，提取的總DNA經(jīng) 0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-20°C保存。實施例216S rRNA 基因擴增各取1 μ 1環(huán)境總DNA作為模板進行PCR，引物為細菌(27F 5 ‘ -FAM-AGA G T T T G A T C 2 C T G G C T CA G - 3 ‘，1 4 9 5 R 5， -CTACGGCTACCTTGTTACG-3，)；古菌(21F5' -FAM-TCCGGTTGATCCTGCCGGA-3',1495R 5' -CTACGGCTAC CTTGTTACG-3，)。擴增條件-MV4min ；94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 60s, 30 個循環(huán)；72°C 7min。PCR 產(chǎn) 物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)量和特異性，并用DNA純化試劑盒純化。實施例3帶FAM標記16S rRNA基因的限制性酶切
采用HaeIII和Hha I兩種限制性內切酶分別對PCR產(chǎn)物進行酶切。限制性內切 酶酶切反應體系(20 μ L) 2. Ομ L 10 X Buffer，IOU限制性內切酶，IOyLPCR產(chǎn)物，7. OyL ddH20,混勻后37°C酶切5h，然后65°C 15min使酶失活。酶切后采用乙醇沉淀法脫鹽，脫鹽 后體積為IOyL0實施例4限制性片段的基因掃描基因掃描由上?；瞪锛夹g有限公司完成。取2 μ L樣品+10 μ L甲酰胺+IyL 內標(liz500)，混勻后95°C變性4min，馬上置于冰浴中，上樣。儀器為ABI 310 Genetic Analyzer，膠型是P0P4，毛細管電泳時間30min?；驋呙杞Y果分析軟件為ABI PRISM GeneScan Analysis Software Version3. 7。實施例5基于T-RFLP圖譜的微生物菌群結構分析以 T-RFLP 圖譜中每一個限制性片段(T-RF)為一個 OTU(operationaltaxonomic unit), OTU豐度按照Saikaly的方法計算，即以相對峰高值(每個T-RF的峰高除以累計峰 高值)作為OTU豐度。根據(jù)圖譜中OTU的數(shù)目及其豐度用ΒΙΟ-DAP程序(http //nhsbig. inhs. uiuc. edu/wes/populations. html)進行多樣性指數(shù)計算，登陸網(wǎng)站 http://mica. ibest. uidaho. edu/，選擇在線分析程序MICA3，對T-RFLP圖譜進行定性分析。圖1為S12-4油井四次取樣樣品HaeIII酶切T-RFLP圖譜，展示了該油井油藏微生 物群落結構在激活處理前后的變化，其中T-RFL-164bp，217bp和237_240bp是圖譜中的優(yōu) 勢峰。T-RFL-164bp 代表的是 Methanobacteria 綱和 Thermococci 綱微生物，T_RFL_217bp ^^W^Methanobacteria禾口Euryarchiieotii I、二，以Methanothermobacter 屬為主，T-RFL-240bp 代表Methanococci 綱微生物，以 Methanococcus 屬為主。T_RFL_182bp 代表了 Methanomicrobia綱微生物，以Methanosaeta屬為主。由圖譜可以直觀地觀測 到，經(jīng)過激活劑處理后，油藏微生物群落結構發(fā)生了較大的改變。油藏細菌群落在激活 劑注入后多樣性降低，以Thalassolituus屬為主的Oceanospirillales目微生物含量 銳減，隨著時間的推移，微生物群落的多樣性開始增加，先后出現(xiàn)了 α-proteobacteria 綱和Flavobacteriales目微生物，但是它們在群落中的豐度很低。而在整個過程中， 以Pseudomonas屬為主的Pseudomonadales目微生物禾口以Marinobacter屬為主的 Alteromaonadales目微生物一直保持著群落中優(yōu)勢菌的地位。古菌群落在激活處理的過程 中多樣性總體呈現(xiàn)了下降的趨勢，但是產(chǎn)甲烷菌一直是群落中的優(yōu)勢菌。以上結果說明了本發(fā)明提供的方法可用于監(jiān)測油藏微生物菌群的組成和相對含 量的動態(tài)變化。
權利要求
一種對油藏中的微生物菌群的組成和相對含量進行監(jiān)測的方法，其特征在于，該方法包括(1)提取油藏樣品的總DNA；(2)使用能夠特異性地使得到的總DNA中的16SrDNA進行擴增的具有熒光標記的引物，對總DNA中的16SrDNA進行擴增；(3)使用限制性內切酶對所述擴增的產(chǎn)物進行酶切；(4)對酶切產(chǎn)物進行核苷酸序列片段大小和豐度分析，得到酶切產(chǎn)物的核苷酸序列片段大小和豐度的圖譜；(5)通過在線分析程序MICA3對得到的圖譜進行分析，得到微生物菌群的組成和相對含量。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，所述具有熒光標記的限制性內切酶選自由Hae III、Hha I、Msp I、Rsa I和Hinfl所組成的組中的至少一種。
3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其中，所述具有熒光標記的限制性內切酶為HaeIII和 Hha I。
4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，該方法還包括在不同的時間點分別提取油藏樣 品的總DNA，并分別重復步驟(2)-(5)，將在不同時間點得到的微生物菌群的組成和相對含 量進行比較。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種對油藏中的微生物菌群的組成和相對含量進行監(jiān)測的方法，其特征在于，該方法包括(1)提取油藏樣品的總DNA；(2)使用能夠特異性地使得到的總DNA中的16SrDNA進行擴增的具有熒光標記的引物，對總DNA中的16SrDNA進行擴增；(3)使用限制性內切酶對所述擴增的產(chǎn)物進行酶切；(4)對酶切產(chǎn)物進行核苷酸序列片段大小和豐度分析，得到酶切產(chǎn)物的核苷酸序列片段大小和豐度的圖譜；(5)通過在線分析程序MICA3對得到的圖譜進行分析，得到微生物菌群的組成和相對含量。本發(fā)明的方法大大地簡化了檢測步驟，從而能夠以簡單的方法進行對油藏中的微生物菌群結構的實行監(jiān)測。
文檔編號C12Q1/68GK101892292SQ20091008453
公開日2010年11月24日 申請日期2009年5月21日 優(yōu)先權日2009年5月21日
發(fā)明者薛燕芬, 袁三青, 馬延和, 馬樹恒 申請人:中國科學院微生物研究所