專(zhuān)利名稱(chēng)：綿羊重組朊蛋白、其單克隆抗體及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及綿羊重組朊蛋白
PrPe51-216、其單克隆抗體及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癢病(scrapie)是綿羊的一種緩慢發(fā)展的致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退 行性疾病，病羊具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性、空泡化、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生 等特點(diǎn)，表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、痙攣、麻痹、衰弱和嚴(yán)重的皮膚搔癢，病 畜100%死亡，人們稱(chēng)之為羊癢病。羊群感染后，很難清除病原體。 羊癢病早在1732年在英格蘭發(fā)現(xiàn)，1920-1950年曾在英國(guó)嚴(yán)重流行， 現(xiàn)已廣泛分布于歐洲、亞洲和美洲多數(shù)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家。更為嚴(yán)重的 是，1986年發(fā)生于英國(guó)的瘋牛病，其病原因子后來(lái)被證實(shí)與羊癢病 的病原因子一致，而人類(lèi)變異性克雅氏病(vCJD)是由食入感染了 BSE的食物而傳播。因此，羊癢病發(fā)生或流行對(duì)于人類(lèi)社會(huì)公共衛(wèi) 生造成嚴(yán)重威脅，目前我國(guó)尚未見(jiàn)到發(fā)生羊癢病的報(bào)道，為了防患于 未然，國(guó)家投入大量資金和力量預(yù)防和控制這類(lèi)疾病的發(fā)生，目前該 病的診斷主要依據(jù)病理學(xué)檢查及用免疫組化、免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot)檢測(cè)神經(jīng)組織中的病原因子PrPSe，這些方法大多需要高度靈 敏、特異的抗體。由于單克隆抗體具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、成分均 一的優(yōu)點(diǎn)，已成為羊癢病檢測(cè)技術(shù)中的核心試劑。國(guó)外有商品化單克 隆抗體出售，但未見(jiàn)有使用去除N端信號(hào)肽、C端GPI錨定位點(diǎn)的 核心片段綿羊PrPSl-216重組蛋白制作的單克隆抗體。
目前我國(guó)羊癢病的檢測(cè)主要在O正的指導(dǎo)下，在專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行，包括病理組織學(xué)檢測(cè)、免疫組織化學(xué)檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)， 其中免疫組織化學(xué)檢測(cè)和Western Blot檢測(cè)是檢測(cè)羊癢病的"金標(biāo)準(zhǔn)"，這兩種方法的關(guān)鍵技術(shù)或核心試劑就是單克隆抗體，國(guó)內(nèi)尚沒(méi) 有商品化的產(chǎn)品。國(guó)際上商品化的羊癢病檢測(cè)試劑盒，每頭份的檢測(cè) 費(fèi)用約為0.04萬(wàn)，如果用自主研制的試劑盒代替進(jìn)口產(chǎn)品，我國(guó)羊 癢病的監(jiān)測(cè)工作每年僅試劑費(fèi)用就可節(jié)約百余萬(wàn)，并打破國(guó)際在瘋牛 病等重大外來(lái)動(dòng)物疫病檢測(cè)技術(shù)方面的技術(shù)壁壘，從而保障我國(guó)畜牧 業(yè)的健康發(fā)展以及人民的公共衛(wèi)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種綿羊重組朊蛋白Prpe51-216及其體外
制備方法。
本發(fā)明再一個(gè)目的是提供綿羊重組朊蛋白PrPe51-216。 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供用于制備綿羊重組朊蛋白PrPe51-216 的基因工程菌。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供采用綿羊重組朊蛋白PrPe51-216制 備的單克隆抗體。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明克隆和表達(dá)了綿羊朊蛋白PrPe51-216, 這段蛋白去除N端的信號(hào)肽，C端的GPI錨定位點(diǎn)，包含蛋白酶K 抗性片段，更有利于制備單克隆抗體。
本發(fā)明提供綿羊重組朊蛋白PrP^l-216，該蛋白具有序列表SEQ N0.2所示的氨基酸序列，或者是該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。該蛋白分子大小為 27kD。
本發(fā)明還提供編碼所述綿羊重組朊蛋白PrPe51-216的基因，優(yōu) 選地，該基因?yàn)镻RNP,其核苷酸序列如序列表SEQNO.l所示。
本發(fā)明進(jìn)一步提供所述綿羊重組朊蛋白PrPe51-216的制備方法， 包括如下步驟
利用所述PRNP基因構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過(guò)篩選得到 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體；陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，破碎菌體，分離純化PrPe成熟蛋白，經(jīng)復(fù)性，得到活性蛋白PrPe51-216。
本發(fā)明還提供由所述PrPe51-216作為免疫原制備得到的抗 PrP^l-216抗體。優(yōu)選地其為單克隆抗體。
上述抗體可由下述步驟得到釆用所述綿羊重組朊蛋白 PrPe51-216,免疫Balb/c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，經(jīng)融合篩 選出雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株能穩(wěn)定分泌針對(duì)綿羊朊蛋白PrPe 51-216 特異單克隆抗體。
本發(fā)明還提供含有上述抗體的診斷試劑。
具體地說(shuō)，本發(fā)明包括如下步驟
1、 基因工程菌的構(gòu)建
根據(jù)綿羊朊蛋白基因序列，截去PrNP部分N端信號(hào)肽(150bp) 和C端GPI錨定位點(diǎn)(123bp )形成PrNPq (其核苷酸序列如序列表 SEQNO.l所示)，設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增這段多肽的PCR引物(末端分別帶 有EcoR I和Hind III的酶切位點(diǎn))，以綿羊全血DNA為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，回收500bp左右DNA片段， 與pGEM-Teasy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞；純化重組質(zhì)粒， 用///雙酶切鑒定，并測(cè)序，測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng) ￡coR /////^////雙酶切后，與用經(jīng)過(guò)五co/ //歷/^///雙酶切的pET30a (+ )連接后，轉(zhuǎn)化至BL21 (DE3)菌株，用上述引物做菌落PCR, 篩選陽(yáng)性克隆，得到含有表達(dá)載體的宿主菌。
2、 重組蛋白的表達(dá)及純化
將含有表達(dá)載體的宿主菌接種到LB液體培養(yǎng)基，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)， 加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，取出菌液離心，菌體用裂解緩沖浪重懸，在冰 浴條件下超聲破碎，離心，沉淀即為包涵體。將獲得的包涵體蛋白用 結(jié)合緩沖液溶解，離心，取上清，加入經(jīng)pH值為7.4的結(jié)合緩沖液 平衡的HisTrap鎳瓊脂糖凝膠柱，結(jié)合10min,結(jié)合緩沖液沖洗3min, 然后用pH值為7.4洗脫緩沖液沖洗7min，分管收集。本發(fā)明還提供了一種可高效表達(dá)綿羊朊蛋白PrPe51-216的基因 工程菌Esherichia coli PET30/ovine-PrPe。該菌具有Kana抗性，對(duì) 人體無(wú)害，且在IPTG的誘導(dǎo)下，能夠大量表達(dá)綿羊朊蛋白PrPe 51-216。
本發(fā)明將獲得的綿羊朊蛋白PrPc51-216按《分子克隆》所述方 法進(jìn)行Western-blotting。 一抗為鼠PrP單克隆抗體AH6， 二抗為辣根 過(guò)氧化酶標(biāo)記兔抗鼠IgG， ECL化學(xué)發(fā)光曝光。結(jié)果顯示綿羊朊蛋白 PrPc 51-216能與鼠PrP單克隆抗體AH6發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)。
本發(fā)明將獲得的綿羊朊蛋白PrPSl-216免疫Balb/c小鼠，利用 淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，經(jīng)融合共篩選出3株能穩(wěn)定分泌針對(duì)綿羊朊蛋 白PrPc 51-216特異單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。免疫印跡試驗(yàn)表明 腹水單抗可特異識(shí)別重組綿羊朊蛋白PrPe51-216和綿羊腦組織朊蛋 白。
本發(fā)明具有以下有益效果
1 )本發(fā)明首次在體外表達(dá)并獲得了具有活性的綿羊朊蛋白 PrPG51-216，并且建立了純化的方法，該蛋白能與鼠PrP單克隆抗體 AH6發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)。PrPc成熟蛋白的表達(dá)量可達(dá)20 mg/L 培養(yǎng)基。
2) PrP^l-216蛋白去除N端的信號(hào)肽，C端的GPI錨定位點(diǎn)， 包含蛋白酶K抗性片段，更有利于制備單克隆抗體。
3) 本發(fā)明利用綿羊朊蛋白PrPgi-216免疫Balb/c小鼠，獲得了 針對(duì)綿羊朊蛋白PrpC 51-216的特異單克隆抗體，從而可以利用該單 克隆抗體作為診斷試劑用于瘋牛病、羊癢病診斷和研究。


圖1綿羊朊蛋白PrPe51-216的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖；M: Mark, 1:擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2 PGEM-T easy- PrPc51-216重組載體的￡coA //歷"^////雙酶
6切電泳圖；M: Mark, 1:雙酶切產(chǎn)物；
圖3菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒PET30a-PrpC51-216; M: Mark, 1: PCR產(chǎn)物；
圖4轉(zhuǎn)化子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)PET30a - PrPc51-216蛋白表達(dá)的電泳 圖；1、 2:轉(zhuǎn)化空質(zhì)粒的對(duì)照；3: 37'C誘導(dǎo)1.5h; 4: 37'C誘導(dǎo)2h; 5: 37。C誘導(dǎo)3h; M:蛋白Marker;
圖5純化后的PrPSl-216電泳圖；1:終末洗脫液中的產(chǎn)物；2、 3:純化洗脫后的產(chǎn)物；M:蛋白Marker;
圖6 PrPc51-216經(jīng)Western blotting顯影后的圖；1 、純化后的樣 品；2、 37。C誘導(dǎo)3h的樣品；M、蛋白Marker;
圖7間接ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)；
圖8腹水單抗特異性鑒定Western-blotting檢測(cè)；1、細(xì)胞克隆 3G11; 2、細(xì)胞克隆4E1; 3、陽(yáng)性對(duì)照(抗體AH6) ; Marker:低分 子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例l基因工程菌的構(gòu)建
根據(jù)已發(fā)表的綿羊朊蛋白基因(PrNP, GenBank accession EF189729 )序歹寸設(shè)計(jì)特異性引物1對(duì)。P1 5'- gga gaa ttc cgc tat cca cct cag gg -3'(下劃線為EcoR I酶切位點(diǎn)),P2 5'- ggg aag ctt aca ttt get cca cca etc -3'(下劃線為Hind III酶切位點(diǎn))；提取綿羊全血基因組 DNA，以全血DNA為模板，以P1、 P2為引物，參照TaKaRaEx Taq PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)PrPe51-216進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體積 為20 jaL:上下游引物、模板各lnL, PCRmix 10 ML,水7mL。 PCR程序94°C熱變性5min;加入Ex Taq酶；再94°C熱變性50s ， 然后60。C退火lmin, 72。C延伸50s, 33個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min; 4 °C保存。擴(kuò)增片段命名為ovine-PrP 51-216,即截去PRNPN端的信號(hào)肽和C端的GPI錨定位點(diǎn)，大小約498bp，編碼165aa (PrPc 51-216)。
反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1°/。瓊脂糖凝膠電泳(圖1),用OMEGA的GEL EXTRACTION KIT回收500bp左右DNA片段后，與pGEM-T easy 載體連接，轉(zhuǎn)化DH5oc感受態(tài)細(xì)胞；再用博大泰克的B型質(zhì)粒提取 試劑盒純化重組質(zhì)粒，用EcoR I/Hind III雙酶切鑒定(圖2),并測(cè) 序，測(cè)序正確的陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)EcoRl/Hind III雙酶切后，與用經(jīng)過(guò) EcoR I /Hind III雙酶切的pET30a( + )連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化到BL21( DE3 ) 菌株，用上述PCR引物做菌落PCR,快速篩選克隆，所得克隆再經(jīng) 菌落PCR (圖3 )及DNA測(cè)序鑒定。經(jīng)上述篩選獲得Esherichiacoli PET30/ PrPc51-216。 實(shí)施例2重組蛋白的表達(dá)及純化
將含有表達(dá)載體的宿主菌接種到LB液體培養(yǎng)基，待菌生長(zhǎng)到 A600約0.8時(shí),加終濃度為100jig/mLIPTG， 37。C誘導(dǎo)表達(dá)3h,取 出菌液離心，菌體用裂解緩沖液(Tris-base0.6056g, EDTA0.0186g， NaC10.2925g，甘油5 mL,加入去離子水95 mL至總體積為100mL， 調(diào)pH值至8.0，常溫保存)重懸，在冰浴條件下超聲破碎，10000 rpm/min，離心10min，沉淀即為包涵體，上清和沉淀用SDS-PAGE電 泳檢測(cè)(圖4)。結(jié)果在預(yù)期的27 KD處出現(xiàn)特異的、大量表達(dá)的蛋 白條帶，表達(dá)量占菌體總蛋白48%。
將獲得的包涵體蛋白依次加入10ml結(jié)合緩沖液(Na2HP04. 12H20 3.58g, NaH2P04 . 2H201.56g, NaCl 29.22g, 2g咪唑，6M尿 素，混合后，加入去離子水定容為lOOOml，調(diào)pH值至7.4，常溫保 存)，用槍吹打混合，超聲5min,條件同上。再加入5ml結(jié)合緩沖液， 吹打，超聲5min。再加入5ml吹打，超聲10min。最終體積20ml。 10000 rpm/min離心10min,棄沉淀，取上清用0.45um的濾膜過(guò)濾。 用蛋白純化儀純化，設(shè)定參數(shù)為用帶有His-標(biāo)簽的鎳柱純化蛋白，結(jié)合緩沖液平衡10min;進(jìn)樣10min，結(jié)合緩沖液沖洗3min,洗脫緩 沖液(Na2HP04 . 12H20 3,58g, NaH2P04 . 2H201.56g， NaCl 29.22g, 34g咪唑，6M尿素，混合后，加入去離子水定容為1000ml,調(diào)pH 值至7.4，常溫保存)沖洗7min。取280nm第二次出現(xiàn)波峰時(shí)的液體， 即為純化蛋白，如圖5所示，純化的蛋白在27KD處出現(xiàn)單一的條 帶，純化率在95%以上。PrPc 51-216的表達(dá)量可達(dá)20 mg/L培養(yǎng)基。 實(shí)施例3 Western-blotting鑒定
Western-blotting按《分子克隆》所述方法進(jìn)行。 一抗為鼠朊蛋 白單克隆抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠的抗體，顯色 劑為3, 3-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PrpC 51-216能與鼠朊蛋 白單克隆抗體發(fā)生特異性血清學(xué)反應(yīng)。如圖6所示。具體操作步驟如 下
SDS-PAGE結(jié)東后，取出凝膠，在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡30min,將 浸泡過(guò)的與膠同樣大小的NC膜和濾紙，按纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜 -濾紙-纖維墊的結(jié)構(gòu)，裝入轉(zhuǎn)印夾。轉(zhuǎn)印時(shí)凝膠惻接負(fù)極，NC膜側(cè) 接正極，電泳槽冰浴，200mA恒流轉(zhuǎn)印lh。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，剪下分子 量標(biāo)準(zhǔn)的膜條用氨基黑染色。其余部分置于封閉液中室溫振搖封閉 lh;取出NC膜置于用封閉液稀釋好的鼠朊蛋白單克隆抗體內(nèi)，4°C 過(guò)夜；TBS洗滌3次，每次5min;置于用封閉液稀釋好的辣根過(guò)氧 化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠的抗體溶液中，室溫振搖lh; TBS洗滌3次， 每次5min;最后將NC膜ECL化學(xué)發(fā)光曝光X-光片，顯影，定影。 實(shí)施例4綿羊重組蛋白PrPe 51-216單克隆抗體制備
1、用綿羊重組蛋白PrPc 51-216免疫Balb/c小鼠(見(jiàn)表1 ) 表1 Balb/c小鼠免疫方案
免疫時(shí)間 抗原類(lèi)型 免疫途徑 _(ug/只)_
首免 純化的綿羊重組蛋白PrP (用適100 頸背部皮下多點(diǎn)間隔2周 二免
間隔2周 三免
融合前3天 四免
量生理鹽水稀釋)+完全福式佐劑 純化的綿羊重組蛋白PrP (用適 量生理鹽水稀釋)+不完全福式佐100 劑
純化的綿羊重組蛋白PrP (用適 量生理鹽水稀釋)+不完全福式佐100 劑
純化的綿羊重組蛋白PrP (用適 量生理鹽水稀釋)
100
注射
頸背部皮下多點(diǎn) 注射
頸背部皮下多點(diǎn) 注射
腹膜內(nèi)注射
三免后7~ IO天釆血用建立的ELISA法測(cè)效價(jià)，選擇效價(jià)最高者 用于細(xì)胞融合
2、檢測(cè)方法的建立
健康和三免后10d的Balb/c小鼠尾部釆血O.lml,室溫靜置lh, 4 。C放2h, 3000rpm離心10min,收集血清，4。C保存。用間接非竟?fàn)幮?ELISA法測(cè)定血清效價(jià)并建立單抗篩選方法。
(1 )包被抗原用包被緩沖液將包被用綿羊重組蛋白Prpe 51-216 作倍比稀釋向微孔中每孔加100ul， fC過(guò)夜；然后棄去孔內(nèi)的液體。
(2) 封閉用封閉液向微孔中每孔加100ul， 37。C濕盒在溫箱中 孵育30min，同時(shí)用洗滌緩沖液(PBST)洗3次，每次卯s(簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌， 下同)，拍干。
(3) 加待測(cè)血清樣品將血清樣品按倍比稀釋后順序加入，每 孔100ul;每塊板同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各2孔。37°C 濕盒在溫箱中孵育lh，然后洗滌、拍干。
(4) 加酶標(biāo)羊抗鼠IgG:先用稀釋液將酶標(biāo)羊抗鼠IgG作倍比稀 釋?zhuān)靠准尤?00ul，置37。C濕盒在溫箱中孵育lh;然后洗滌、拍干。
(5) 加底物液各孔加新鮮配置的底物使用液100ul， 37'C濕盒 10 ~ 15min。
(6) 終止反應(yīng)每孔加終止液50ul。
10(7)判定結(jié)果陰性對(duì)照孔應(yīng)無(wú)色或接近無(wú)色，陽(yáng)性對(duì)照孔應(yīng)
明確顯色。測(cè)定OD值，以空白孔調(diào)零，若待測(cè)孔OD值大于或等于陰 性對(duì)照孔的2.1倍，即為陽(yáng)性，這樣可以得出血清的效價(jià)，同時(shí)選擇 OD值在1.0 1.5之間的包被抗原濃度，酶標(biāo)兔抗鼠IgG濃度等，建立 單抗篩選方案。 3、細(xì)胞融合
(1) 收集全部SP2/0細(xì)胞，1000rpm離心6分鐘，去上清，反復(fù)用 無(wú)血清培養(yǎng)基洗2次，最后懸浮于10ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，取0.1ml至住 0.9ml無(wú)血清培養(yǎng)基中，混勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)。
(2) 取全部脾細(xì)胞，將三免后效價(jià)較高的免疫Balb/c小鼠脾細(xì) 胞，與SP2/0細(xì)胞按5: 1~10: l的比例充分混勻，1000rpm離心5分鐘， 棄上清。
(3) 輕彈離心管管底，使沉淀細(xì)胞疏松，吸取lml DMEM液加 入lg滅菌的PEG2000 (預(yù)先要加熱融化)中，并用7.5。/。NaHC03調(diào)PH 值至7.5~7.8，混勻。 一手句速轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，另一手吸取lml上述調(diào)好 的PEG2000液，沿轉(zhuǎn)動(dòng)的離心管壁緩緩加入，控制在60s加完。然后 將懸液吸入移液管(時(shí)間控制在30s左右)，靜置30s,再將其吹入離 心管(時(shí)間也控制在30s左右)。融合時(shí)間共約2分鐘。
(4 )緩慢小心地加入25ml預(yù)溫的20。/。完全培養(yǎng)基以終止 PEG2000的作用，2分鐘完成，第一分鐘加入lml DMEM液，第二分 鐘緩緩加入4ml DMEM液，然后在3min內(nèi)緩慢加入剩余的20。/。完全培 養(yǎng)基。
(5 )將融合細(xì)胞8000rpm離心7min，棄上清，加入20ml 1%HAT
培養(yǎng)液輕輕吹吸，使沉淀細(xì)胞混合均勻，將懸浮細(xì)胞液加入有飼養(yǎng)細(xì) 胞的96孔板中，每孔100ul，置37'C，含5。/。C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。
(6)融合后，每天在倒置顯微鏡下注意觀察雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng) 情況，7 10天用HAT培養(yǎng)基半量換液。(7) 2周后換HT選擇培養(yǎng)基，3周后可換完全培養(yǎng)基。
4、 雜交瘤細(xì)胞的篩選
釆用間接非竟?fàn)幮訣LISA方法檢測(cè)。
(1)包被抗原用包被液將包被用綿羊重組蛋白Prpe 51-216稀 釋至適當(dāng)?shù)墓ぷ鳚舛?由建立的篩選方法確定)，向微孔中每孔加 100ul， 4。C過(guò)夜，然后棄去孔內(nèi)的液體。
(2 )封閉用封閉液向微孔中每孔加1 OOul, 3 7 °C濕盒孵育3 Omin, 然后用洗滌緩沖液(PBST)洗3次，每次90s (簡(jiǎn)稱(chēng)洗滌，下同)， 拍干。
(3) 加待測(cè)培養(yǎng)上清液將上清液順序加入，每孔100ul，每塊 板同時(shí)設(shè)空白對(duì)照、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各2孔。37'C濕盒在溫箱中 孵育lh，然后洗滌5次、拍干。
(4) 加酶標(biāo)第二抗體:先用稀釋液將酶標(biāo)羊抗鼠IgG作倍比稀釋?zhuān)?每孔加入100ul，置37'C濕盒溫箱中孵育lh;然后洗滌5次、拍干。
(5) 加底物液各孔加新鮮配置的底物使用液100ul， 37'C在溫 箱中孵育10-15min。
(6) 終止反應(yīng)每孔加終止液50ul。
(7) 判定結(jié)果陰性對(duì)照孔(適當(dāng)稀釋SP2/0上清和陰性血清) 應(yīng)無(wú)色或接近無(wú)色。
陽(yáng)性對(duì)照孔(免疫小鼠血清)應(yīng)明確顯色。測(cè)定OD值，以空白 孔調(diào)零，若待測(cè)孔OD值大于或等于陰性對(duì)照孔的2.1倍，即為陽(yáng)性。
5、 雜交瘤細(xì)胞的克隆
雜交瘤的克隆化的方法一有限稀釋法，即將細(xì)胞懸液連續(xù)稀釋?zhuān)?至一定濃度時(shí)就有可能得到含單個(gè)細(xì)胞的懸液，將其接種到培養(yǎng)板 中，就可由此單個(gè)細(xì)胞繁殖形成同源性的細(xì)胞克隆。釆用有限稀釋法 克隆，具體方法如下
(l)制備飼養(yǎng)細(xì)胞?？捎诳寺』耙惶熘苽?，也可于克隆化當(dāng)天制備。
(2 )將待克隆化的雜交瘤細(xì)胞用加樣器或彎頭吸管反復(fù)吹打均 勾后取少許細(xì)胞懸浮至另一無(wú)菌青霉素小瓶中，作10倍稀釋。
(3) 取上述無(wú)菌小瓶中的細(xì)胞準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。
(4) 根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，對(duì)細(xì)胞懸液做適當(dāng)稀釋。因計(jì)數(shù)誤差，
為保險(xiǎn)起見(jiàn)，可稀釋成不同梯度，如每孔5個(gè)，l個(gè)，0.5個(gè)細(xì)胞梯度， 這樣總會(huì)有一個(gè)梯度其細(xì)胞真實(shí)濃度在l個(gè)/孔附近。具體方法如下
取250個(gè)活細(xì)胞懸浮于4.6ml培養(yǎng)液中，此時(shí)平均每0.1ml溶液中含 5個(gè)細(xì)胞，接種96孔培養(yǎng)板，每孔0.1ml，共36孔。這樣就用去3.6ml。 余下l.Oml,再加入4ml培養(yǎng)液，共5ml(此時(shí)平均每0.1溶液中含l個(gè)細(xì) 胞)，接種此細(xì)胞液至其次的36孔，每孔0.1ml，最后剩余細(xì)胞懸液 1.4ml，再補(bǔ)加培養(yǎng)液1.4ml (此時(shí)平均每0.1ml溶液中含細(xì)胞0.5個(gè))， 接種最后的24孔，每孔0.1ml.這樣共以三種不同的細(xì)胞濃度進(jìn)行克隆 化，第一組36孔，平均每孔5個(gè)細(xì)胞，第二組36孔。平均每孔l個(gè)細(xì)胞， 第三組24孔，平均每孔0.5個(gè)細(xì)胞。
(5) 將培養(yǎng)板置5%(302, 37。C溫箱中培養(yǎng)。 一般5d左右(在此 之前不換液)即可在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞克隆生長(zhǎng)，注意記錄各孔 細(xì)胞生長(zhǎng)情況并確定單克隆細(xì)胞株。
(6) 適時(shí)進(jìn)行換液及檢測(cè)。有多孔陽(yáng)性時(shí)，應(yīng)盡可能取單克隆 孔進(jìn)行再次克隆化，同時(shí)轉(zhuǎn)入24孔板，繼而轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培 養(yǎng)，直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清液均為陽(yáng)性，克隆方算成功。
6、單克隆抗體的大量制備
釆用動(dòng)物體內(nèi)誘生單克隆抗體的方法。取健康Balb/c雌性小鼠10 只，每只腹腔注射液體石蠟lml， 1 2周后備用。將培養(yǎng)的陽(yáng)性克隆 雜交瘤細(xì)胞吹下來(lái)，1000rpm離心10min收集細(xì)胞，棄上清液。用不完 全培養(yǎng)基將細(xì)胞懸浮，混勻，并將細(xì)胞數(shù)調(diào)至106個(gè)/1111，每只預(yù)處理 的小鼠腹腔注射lml陽(yáng)性克隆雜交瘤細(xì)胞；7 ~ 9d后收集腹水，3000rpm離心10min，棄脂肪層和細(xì)胞層，收集中間澄清層，純化后小管分裝， -2(TC凍存。
7、單抗特異性鑒定
使用本實(shí)驗(yàn)室建立的Western-blot方法進(jìn)行，釆用BioRad微型 垂直板電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，分別將正常羊腦組織、綿羊重組朊蛋白上樣于 15%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。電泳后，4°C， 100V條件下轉(zhuǎn)印lh， 將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(NC膜)上。轉(zhuǎn)印后的NC膜用含5% 脫脂奶粉的PBS封閉lh,加入l: 1000稀釋的腹水單抗，室溫輕搖 作用2h,隨后與按l: 2000稀釋的辣根過(guò)氧化酶標(biāo)二抗反應(yīng)lh。最 后用增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒顯示印跡結(jié)果。
具體實(shí)驗(yàn)步驟如下
(1) 樣品腦勻漿處理和消化
勻漿從腦干的腦閂部位(obex區(qū))稱(chēng)取0.45 0.70g組織，放 入10ml的勻漿器中，加入10倍的勻漿緩沖液，然后手動(dòng)勻漿45s lmin， 800轉(zhuǎn)/秒離心lmin,取上層腦勻漿分裝，-20°0保存。
消化每個(gè)Eppendorf管中加入10pl消化緩沖液，再加入100 jil腦匈漿，混勻；加入10jiL蛋白酶K，充分混合均勻；水洛48'C， 消化40分鐘，然后迅速加入10 ji 1的終止緩沖液終止消化。
(2) SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
樣品變性上樣前每管中加入100juL電泳上樣緩沖液，混合均 勻；水洛96'C,煮沸5分鐘(已變性樣品可在使用前65匸溫育5分 鐘)。
上樣將10pL對(duì)照樣品加入右邊泳道，其余樣品分別為lOjiiL 按順序加入其它泳道。內(nèi)槽和外槽加入電泳緩沖液。
電泳恒定電壓180V電泳40-45分鐘，直到溴酚蘭指示劑到 達(dá)底端約1-2亳米處。
14(3) 電轉(zhuǎn)
準(zhǔn)備步驟將PVDF膜在1007。的甲醇中浸泡數(shù)秒，然后在蒸餾 水中洗滌數(shù)秒，再置于電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡IO分鐘；濾紙?jiān)陔娹D(zhuǎn)液中 平衡5分鐘。(PVDF膜和濾紙大小應(yīng)與凝膠基本一致)
電轉(zhuǎn)組裝打開(kāi)電泳槽，將凝膠的梳子部分切去，取出凝膠。然 后按照纖維墊-兩層濾紙-凝膠-PVDF膜-兩層濾紙-纖維墊的順 序組裝(注意濾紙與凝膠、PVDF膜務(wù)必對(duì)齊；每層接觸面都盡量趕 走氣泡)，將該"三明治"裝置裝入轉(zhuǎn)印夾，近膠的一面朝向陰極(黑)， 近PVDF膜的一面朝向陽(yáng)極(紅)，確保該裝置全部浸入電轉(zhuǎn)緩沖液。
蛋白轉(zhuǎn)印 4'C恒定電壓IOOV轉(zhuǎn)印75分鐘(內(nèi)槽加冰盒，外槽
可置于冰水混合物中)。
(4) 免疫檢測(cè)
封閉將PVDF膜從轉(zhuǎn)印夾中取出，做好標(biāo)記，然后把兩張膜分 別置于自封帶中，各加入25ml封閉液，于搖床室溫封閉50min,搖 床轉(zhuǎn)速約為60轉(zhuǎn)/min。封閉結(jié)東后用TBST洗液洗滌2次，每次5 分鐘。
一抗孵育將3.75 ji 1 —抗(AH6 )加入到15ml的TBST中(稀 釋倍數(shù)k 4000)，混勻，裝入自封袋中；作為陽(yáng)性對(duì)照；腹水用 TBST稀釋(稀釋倍數(shù)k 1000)，然后兩張膜凸面相對(duì)放置，置于 同一自封袋中，于搖床室溫孵育2小時(shí)，轉(zhuǎn)速約為65轉(zhuǎn)/min;孵育 結(jié)東后用TBST洗液洗滌5次，每次5分鐘。
二抗孵育將15 ja 1 二抗(羊抗鼠)加入到15mL的TBST溶液 中(稀釋倍數(shù)l: 2000)，混勻，裝入自封袋中；然后兩張膜凸面相 對(duì)放置，置于同一自封帶中，于搖床室溫孵育1小時(shí)，轉(zhuǎn)速約為65 轉(zhuǎn)/min;孵育結(jié)東后用TBST洗液洗滌5次，每次5分鐘。
曝光將PVDF膜置入暗盒中曝光5-10分鐘，取出放入顯影液中4 分鐘，然后再放入定影液中作用l分鐘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)，首次在體外表達(dá)并獲得了具有活性的
綿羊朊蛋白PrPc 51-216，并且建立了純化的方法；利用本發(fā)明的方 法，綿羊朊蛋白PrPe 51-216的表達(dá)量可達(dá)20 mg/L培養(yǎng)基。
本發(fā)明利用綿羊朊蛋白PrPe 51-216免疫Balb/c小鼠，獲得了針 對(duì)綿羊朊蛋白PrPe 51-216和綿羊腦組織朊蛋白的特異單克隆抗體， 從而可以利用該單克隆抗體作為診斷試劑用于瘋牛病、羊癢病診斷和 研究。序列表
〈110>中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120〉綿羊重組朊蛋白、其單克隆抗體及應(yīng)用
〈130〉 KHP09112351.2
〈■ 2
<170〉 Patentln version 3.5
<210> 1
<211〉 499
〈212〉 DNA
<213〉 羊(Ms aries)
<220>
<221〉 CDS
<222> (1). (498)
〈400〉 1
cgc tat cca cct cag gga ggg ggt ggc tgg ggt cag ccc cat gga ggt 48 Arg Tyr Pro Pro Gin Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly 15 10 15
ggc tgg ggc c肌cct cat gga ggt ggc tgg ggt cag ccc cat ggt ggt % Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly 20 25 30
ggc tgg gga cag cca cat ggt ggt gga ggc tgg ggt caa ggt ggt age 144 Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gin Gly Gly Ser 35 40 45
cac agt cag tgg aac aag ccc agt aag cca aaa acc aac atg aag cat 192 His Ser Gin Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His 50 55 60
gtg gca gga get get gca get gga gca gtg gta ggg ggc ctt ggt ggc 240 Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly 65 70 75 80
tac aag ctg gga agt gcc a/tg age agg cct ctt ata cat ttt ggc aat 288 Tyr Lys Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu lie His Phe Gly Asngac tat gag gac cgt tac tat cgt gaa aac atg tac cgt Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg 100 105
caa gtg tac tac aga cca gtg gat cag tat agt aac cag Gin Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gin Tyr Ser Asn Gin 115 120 125
teic ccc幼c
Tyr Pro Asn 110
eiEic aeic ttt
Asn Asn Phe
gtg cat Val ms 130
Thr Thr 145
cga gtg Arg Val
gac tgt gtc Asp Cys Val
aag ggg gag Lys Gly Glu
33C 3tC 3C3 gtC 33g C33 C3C 3C3
Asn lie Thr Val Lys Gin His Thr
135 140
aac ttc acc gaa act gac ate aag
Asn Phe Thr Glu Thr Asp lie Lys 150 155 160
gtc acc 3cc Val Thr Thr
ata atg gag lie Met Glu
gtg gag c肪 Val Glu Gin 165
3tg
Met
<210〉 2 〈211> 166 <212〉 PRT
<213> 羊(^.s a"'es) <400> 2
Arg Tyr Pro Pro Gin Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly
1
5
10 15
Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly
20
25 30
Gly Trp Gly Gin Pro His Gly Gly Gly Gly Trp Gly Gin Gly Gly Ser
35
40 45
His Ser Gin Trp Asn Lys Pro Ser Lys Pro Lys Thr Asn Met Lys His
336
384
432
480
499
50
55 60Val Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val Val Gly Gly Leu Gly Gly 65 70 75 80
Tyr Lys Leu Gly Ser Ala Met Ser Arg Pro Leu lie His Phe Gly Asn 85 90 95
Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu Asn Met Tyr Arg Tyr Pro Asn 100 105 110
Gin Val Tyr Tyr Arg Pro Val Asp Gin Tyr Ser Asn Gin Asn Asn Phe 115 120 125
Val His Asp Cys Val Asn lie Thr Val Lys Gin His Thr Val Thr Thr 130 135 140
Thr Thr Lys Gly Glu Asn Phe Thr Glu Thr Asp lie Lys lie Met Glu 145 150 155 160
Arg Val Val Glu Gin Met 165
19
權(quán)利要求
1、綿羊重組朊蛋白PrPC51-216，其特征在于，該蛋白具有序列表SEQ NO.2所示的氨基酸序列，或者是該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
2、 編碼權(quán)利要求1所述綿羊重組朊蛋白PrPe51-216的基因。
3、 如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于，該基因的核苷酸序 列如序列表SEQNO.l所示。
4、 權(quán)利要求l所述蛋白的制備方法，包括如下步驟 利用權(quán)利要求2或3所述的基因構(gòu)建表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化宿主菌，經(jīng)過(guò)篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體；陽(yáng)性轉(zhuǎn)化體經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，破碎菌體，分離 純化Prpe成熟蛋白，經(jīng)復(fù)性，得到活性蛋白PrPe51-216。
5、 由綿羊重組朊蛋白PrPe51-216作為免疫原制備得到的抗 PrPc51-216抗體。
6、 如權(quán)利要求5所述的抗體，其為單克隆抗體。
7、 含有權(quán)利要求5或6所述抗體的診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及綿羊重組朊蛋白PrP^C51-216及其制備方法，該蛋白具有序列表SEQ No.2所示的氨基酸殘基序列，或者是該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及編碼該蛋白的基因及利用該蛋白制備得到的單克隆抗體。本發(fā)明獲得的針對(duì)綿羊朊蛋白PrP^C51-216的特異單克隆抗體，可以作為診斷試劑用于瘋牛病、羊癢病診斷和研究。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101550186SQ20091008422
公開(kāi)日2009年10月7日 申請(qǐng)日期2009年5月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月14日
發(fā)明者琦 余, 周向梅, 尹曉敏, 奧 張, 李麗好, 楊利峰, 楊建民, 趙德明 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)