一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟：（1）菌種低溫保藏：取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護(hù)液，?20℃液體管冷凍保藏；（2）解凍：取凍存種，立即放入35?40℃的水中，搖晃快速解凍，然后轉(zhuǎn)入GPY固體培養(yǎng)基，25?28℃恒溫培養(yǎng)。本發(fā)明保持真姬菇菌種活力高、不退化、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、設(shè)備要求低、占據(jù)空間小、易于推廣。
【專利說(shuō)明】
一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法
[0001 ] 技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，涉及微生物菌種保藏技術(shù)領(lǐng)域。
[0002]【背景技術(shù)】:
真姬燕^ypsizygus marmoreus ),別名玉蕈、斑玉蕈，屬擔(dān)子菌門、層菌綱、傘菌目、白蘑科、玉蕈屬。真姬菇含有人體所需的八種必須氨基酸，且味道鮮美，熱量低，享有“聞則松茸，食則玉蕈”的美譽(yù)，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食用兼藥用的珍稀食用菌，也是目前進(jìn)入工廠化生產(chǎn)的重要食用菌之一，具有提高人體免疫力、預(yù)防衰老、延長(zhǎng)壽命等多種功效，廣受消費(fèi)者的喜愛(ài)，也是一種極具潛力的生產(chǎn)品種。隨著真姬菇科研及工廠化生產(chǎn)規(guī)模的日益加大，急需一種應(yīng)用廣泛、簡(jiǎn)便、有效、經(jīng)濟(jì)的真姬菇菌種保藏方法。
[0003]目前常用的菌種保藏方式為液氮超低溫保存、冷凍干燥保存、石蠟油保存、試管斜面?zhèn)鞔４娴取?br>[0004]液氮超低溫保存、冷凍干燥保存方法雖然效果良好，但其需要良好的設(shè)備及技術(shù)，投入過(guò)高，不適合在企業(yè)推廣;石蠟油保存、試管斜面?zhèn)鞔４娣椒m然簡(jiǎn)單、廉價(jià)，但保存時(shí)間短，每隔一段時(shí)間就得重新轉(zhuǎn)管、傳代，這對(duì)于遺傳穩(wěn)定性較高的菌株影響不大，但對(duì)于遺傳穩(wěn)定性較差的菌株則影響很大，會(huì)由于保藏時(shí)間長(zhǎng)及轉(zhuǎn)接次數(shù)過(guò)多導(dǎo)致培養(yǎng)基縮水、染菌、菌種退化，而且這兩種方法占用空間體積大，需要配備較多的冷藏設(shè)備空間。
[0005]液體管凍存方法操作簡(jiǎn)單、占用空間面積小、保藏時(shí)間長(zhǎng)，但卻并不適用于所有食用菌菌種保藏。許多食用菌菌種冷凍會(huì)致死。液體管凍存分為-20°C凍存(普通家用冰箱)和-70°C凍存(超低溫冰箱)兩種。超低溫冰箱凍存效果更好，但設(shè)備價(jià)格價(jià)格昂貴，在企業(yè)極少配備;而家用冰箱價(jià)格低廉，企業(yè)單位普遍配備。所以研究菌種的_20°C液體管冷凍保藏方法，更有推廣價(jià)值。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的在于克服上述已有技術(shù)的不足而提供一種保持真姬菇菌種活力高、不退化、操作簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉、設(shè)備要求低、占據(jù)空間小、易于推廣的真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法。
[0007]本發(fā)明的目的可以通過(guò)如下措施來(lái)達(dá)到:一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟:
(1)菌種低溫保藏:取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護(hù)液，-20°C液體管冷凍保藏；
(2)解凍:取凍存種，立即放入35-400C的水中，搖晃快速解凍，然后轉(zhuǎn)入GPY固體培養(yǎng)基，25-28 °C恒溫培養(yǎng)。
[0008]為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，其特征在于其包括如下步驟:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養(yǎng):
無(wú)菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計(jì)為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天；
②保護(hù)液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護(hù)液:準(zhǔn)確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min;
③超凈工作臺(tái)內(nèi)，采用無(wú)菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護(hù)液，然后加入準(zhǔn)備好的真姬菇液體菌種I.5ml ；
④將準(zhǔn)備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏；
(2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止；
②取0.5ml保藏菌種，無(wú)菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28 °(:恒溫培養(yǎng)，觀察測(cè)定菌絲生長(zhǎng)狀況。
[0009]本發(fā)明同已有技術(shù)相比可產(chǎn)生如下積極效果:
1.采用-20°C低溫冷凍保藏法，通過(guò)加入保護(hù)劑低溫進(jìn)行冷藏。其所需設(shè)備條件及操作程序遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于液氮冷藏，只需一臺(tái)普通冰箱就可完成。
[0010]2.通過(guò)篩選保護(hù)液及其濃度后，將保護(hù)液與菌種混合，放置于-20°c保存即可，不需要補(bǔ)充液氮，也不用像傳代培養(yǎng)一樣定期活化，保藏方法簡(jiǎn)便易行，價(jià)格低廉，非常適合應(yīng)用于普通科研單位及廣大生產(chǎn)單位。
[0011]3.保藏于2ml凍存管中，占用保藏體積小，一個(gè)一百平方厘米的凍存盒能裝一百個(gè)凍存管。
[0012]4.可以按盒分類，用時(shí)取出一管，管理方便。
[0013]5.保存時(shí)間2年以上，不需要定期傳代，減少染菌及菌種退化的幾率。
[0014]6.采用1%濃度的黃原膠作為保護(hù)液，黃原膠為微生物產(chǎn)生的生物大分子，無(wú)毒，易于降解，來(lái)源廣泛。具有快速吸水能力，吸收細(xì)胞外的水分，增加粘度，使菌液懸浮，減少冰晶的形成，同時(shí)使形成的刺狀冰晶尖端變鈍，從而降低細(xì)胞外水分低溫形成的冰晶刺破細(xì)胞的幾率;降低溶液中電解質(zhì)濃度，減少溶質(zhì)損傷;黃原膠是由微生物莢膜產(chǎn)生，對(duì)于微生物本身具有保護(hù)作用，且其受PH、鹽等條件影響較小。研究表明，黃原膠在溫度升高到120°C時(shí)，其粘度僅下降3%，非常適合保藏過(guò)程中的高溫滅菌環(huán)節(jié)。黃原膠來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜，保存效果好。
[0015]7.所用培養(yǎng)基及溫度等培養(yǎng)條件，均為試驗(yàn)后得出的結(jié)果，適合真姬菇菌絲生長(zhǎng)。
[0016]【具體實(shí)施方式】:下面對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說(shuō)明:
實(shí)施例1:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養(yǎng):
無(wú)菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計(jì)為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天。
[0017]②保護(hù)液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護(hù)液:準(zhǔn)確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0018]③超凈工作臺(tái)內(nèi)，采用無(wú)菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護(hù)液，然后加入準(zhǔn)備好的真姬菇液體菌種1.5ml。
[0019]④將準(zhǔn)備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏。
[0020](2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對(duì)細(xì)胞的傷害。
[0021]②取0.5ml保藏菌種，無(wú)菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28°C恒溫培養(yǎng)，觀察測(cè)定菌絲生長(zhǎng)狀況。
[0022]實(shí)施例2:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養(yǎng):
無(wú)菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計(jì)為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天。
[0023]②保護(hù)液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護(hù)液:準(zhǔn)確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0024]③超凈工作臺(tái)內(nèi)，采用無(wú)菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入Iml的1%濃度的黃原膠保護(hù)液，然后加入準(zhǔn)備好的真姬菇液體菌種lml。
[0025]④將準(zhǔn)備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于_20°C冷凍保藏。
[0026](2)解凍:
①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對(duì)細(xì)胞的傷害。
[0027]②取0.5ml保藏菌種，無(wú)菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28°C恒溫培養(yǎng)，觀察測(cè)定菌絲生長(zhǎng)狀況。
[0028]實(shí)施例3:
(I)菌種低溫保藏:
①真姬菇液體菌種的培養(yǎng):
無(wú)菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計(jì)為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天。
[0029]②保護(hù)液的制備:
制備1%濃度的黃原膠作為保護(hù)液:準(zhǔn)確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min。
[0030]③超凈工作臺(tái)內(nèi)，采用無(wú)菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入1.5ml的1%濃度的黃原膠保護(hù)液，然后加入準(zhǔn)備好的真姬菇液體菌種0.5ml。
[0031]④將準(zhǔn)備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于_20°C冷凍保藏。
[0032](2)解凍: ①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止，盡量減少形成的冰晶對(duì)細(xì)胞的傷害。
[0033]②取0.5ml保藏菌種，無(wú)菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28°C恒溫培養(yǎng)，觀察測(cè)定菌絲生長(zhǎng)狀況。
[0034]以上的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟: (1)菌種低溫保藏:取真姬菇液體菌種1.5ml，加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護(hù)液，-20°C液體管冷凍保藏； (2)解凍:取凍存種，立即放入35-40°C的水中，搖晃快速解凍，然后轉(zhuǎn)入GPY固體培養(yǎng)基，25-28 °C恒溫培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種真姬菇菌種低溫保藏及解凍方法，其特征在于其包括如下步驟: (1)菌種低溫保藏: ①真姬菇液體菌種的培養(yǎng): 無(wú)菌條件下，挑取黃豆粒大小真姬菇試管種，接種于GPY液體培養(yǎng)基中，GPY液體培養(yǎng)基的配方組分以g/L計(jì)為:酵母膏10，蛋白胨6，葡萄糖20，余量水；25-280C、160rpm恒溫培養(yǎng)10-12 天； ②保護(hù)液的制備: 制備1%濃度的黃原膠作為保護(hù)液:準(zhǔn)確稱取Ig黃原膠固體，溶于10ml水中，121°C，滅菌30min; ③超凈工作臺(tái)內(nèi)，采用無(wú)菌操作，用移液槍分別在不同的2ml凍存管中加入0.5ml的1%濃度的黃原膠保護(hù)液，然后加入準(zhǔn)備好的真姬菇液體菌種I.5ml ； ④將準(zhǔn)備好的凍存管菌種放入凍存盒，置于-20°C冷凍保藏； (2)解凍: ①取出凍存的真姬菇菌種，立即放入35-40°C的恒溫水浴鍋中，搖晃快速解凍，直到全部解凍為止； ②取0.5ml保藏菌種，無(wú)菌操作移至GPY固體培養(yǎng)基上25-28°C恒溫培養(yǎng)，觀察測(cè)定菌絲生長(zhǎng)狀況。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK105925483SQ201610308335
【公開(kāi)日】2016年9月7日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】程顯好, 孫磊, 劉靜, 李維煥
【申請(qǐng)人】魯東大學(xué)