專利名稱：：用于小rna檢測的探針組以及用此探針組檢測小rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及小RNA的檢測領(lǐng)域。技術(shù)背景小RNA是非編碼RNA家族(noncodingRNA，簡稱ncRNA)中的重要組成部分，包括微小RNA(microRNA或miRNA)、小型干擾RNA(siRNA)、小核RNA、小時(shí)序RNA，piwi蛋白結(jié)合RNA(piRNA)等。研究發(fā)現(xiàn)小RNA在生物體內(nèi)細(xì)胞、組織等的發(fā)育、生長、分化，甚至疾病的發(fā)生以及病毒的入侵和防御等方面發(fā)揮至關(guān)重要的作用。小RNA發(fā)揮作用的方式也是多種多樣，它們既可以通過修飾DNA直接調(diào)控基因的表達(dá)，也可以通過改變基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性等來調(diào)節(jié)蛋白的量等等。而在各種類型的小RNA中，微小RNA又是功能最為重要的一種。微小RNA是生物體內(nèi)源的長度為18-25個(gè)核苷酸的一種非編碼RNA分子。它們廣泛地分布在不同的器官中，主要是通過與耙mRNA的互補(bǔ)配對而在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。在過去十年中，科學(xué)家們從海藻到動(dòng)物體內(nèi)分離鑒定出了數(shù)千種保守的和非保守的miRNA。雖然很多證據(jù)清楚地表明miRNA在增殖、發(fā)育、腫瘤發(fā)生以及病毒感染等一系列生物學(xué)過程中充當(dāng)很重要的角色，但是我們對miRNA生理學(xué)功能的了解還很少。要想揭開miRNA在復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的角色這塊神秘的面紗，就需要發(fā)展靈敏、準(zhǔn)確的miRNA檢測方法。然而，由于miRNA很短，而且一些miRNA成員之間具有非常相似的序列(例如let-7家族系列)，檢測miRNA是一項(xiàng)非常有挑戰(zhàn)性的工作。雖然在早期的miRNA剖面測量研究中，Northern印跡法被當(dāng)作一種黃金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是它費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要大量的總RNA樣本，尤其是當(dāng)檢測低豐度miRNA的表達(dá)的時(shí)候，Northern方法就顯得非常困難。除Northern印跡法之外，近年也發(fā)展出了大量其他的miRNA檢測方法。在這些方法中，實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-TimePCR)毫無疑問是一種準(zhǔn)確、定量檢測基因表達(dá)的強(qiáng)大工具。如前所述，由于miRNA長度太短，以至于不能通過PCR方法直接來擴(kuò)增，為克服這些困難，科學(xué)家們通過在miRNA尾部連接多個(gè)腺嘌呤(A)來延長miRNA(Shi,R.;Chiang,V.L.歷o^c/zm'^^2005,39，519-525.)，或者使用長的DNA探針(Chen,C.;Ridzon,D.A.;Broomer，A.J.;Zhou,Z.;Lee，D.H.;Nguyen,J.T.;Barbisin,M.;Xu,N.L.;Mahuvakar,V.R.;Andersen,M.R.M/c/e/cf^fai"2005,el79.;Raymond,C.K.;Roberts,B.S.;Garrett-Engele,P.;Lim，L.P.;Johnson,J.M.32005,仏1737-1744.)。然而，這些方法需要使用Taqman或者LNA等改良的探針來保證檢測的特異性，從而顯著增加了制備的困難性和實(shí)驗(yàn)成本。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的正是為了解決上述技術(shù)問題，提供一種易于制備的小DNA檢測探針，以及使用此探針檢測小RNA的簡單、靈敏、精確且低成本的方法。在本發(fā)明中，術(shù)語"小RNA"指的是核苷酸數(shù)目少，不方便直接用PCR技術(shù)擴(kuò)增的RNA，包括但不限于微小RNA(microRNA，簡稱miRNA)、小型干擾RNA(shortinterferingRNA,簡稱siRNA)、小核RNA(smallnuclearRNA，簡稱snRNA)、小時(shí)序RNA(smalltemporalRNA，簡稱stRNA)、piwi蛋白作用的RNA(Piwi-interactingRNA，簡稱piRNA)等。本發(fā)明的實(shí)施例中涉及的都是miRNA，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以預(yù)見到，本發(fā)明的檢測探針以及使用此探針檢測小RNA的方法并不限于miRNA，而應(yīng)當(dāng)理解為上面定義的"小RNA"。在本發(fā)明中，術(shù)語"雜交"指的是一個(gè)單鏈核酸分子的至少一部分與另外一個(gè)單鏈核酸分子的至少一部分通過堿基配對形成一條雙鏈核酸分子。上述堿基配對可以是完全匹配的堿基配對，也可以是不完全匹配的堿基配對。其中如出現(xiàn)堿基不匹配的時(shí)候，只要探針分子能在目標(biāo)小RNA分子的介導(dǎo)(存在)下，通過連接酶的作用，連接成為一條完整的核酸鏈，也屬于本發(fā)明所稱的"雜交"。術(shù)語"探針"指的是根據(jù)目標(biāo)RNA分子的核苷酸序列，設(shè)計(jì)、制備出的一段能與目標(biāo)RNA分子至少部分核苷酸序列雜交的DNA分子。術(shù)語"連接產(chǎn)物"是指至少兩個(gè)DNA探針分子與目標(biāo)小RNA分子的互補(bǔ)配對后，在連接酶的作用下，連接形成的一條完整的DNA鏈。本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。先合成DNA探針分子，在小RNA的檢測過程中，探針分子是多個(gè)一起使用的，多個(gè)一起使用的探針分子連接起來以后，包括所有連接點(diǎn)在內(nèi)的一段核苷酸序列能與目標(biāo)小RNA分子的至少一部分核苷酸序列雜交;優(yōu)選兩個(gè)一起使用或者三個(gè)一起使用，兩個(gè)一起使用的探針分子連接起來以后，連接點(diǎn)左右的一段核苷酸序列能與目標(biāo)小RNA分子的至少一部分核苷酸序列互補(bǔ)；三個(gè)一起使用的探針連接起來以后，包括兩個(gè)連接點(diǎn)的一段核苷酸序列能與目標(biāo)小RNA分子的至少一部分核苷酸序列互補(bǔ)。優(yōu)選的，探針具有至少一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步優(yōu)選的，兩個(gè)一起使用的探針在莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開之前連接起來，包括連接點(diǎn)的一段核苷酸序列不能與目標(biāo)小RNA分子的核苷酸序列雜交；三個(gè)(或多個(gè))一起使用的探針在莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開之前連接起來，包括兩個(gè)連接點(diǎn)的一段核苷酸序列不能與目標(biāo)小RNA分子的核苷酸序列雜交。探針合成好以后，將探針分子加入到含有目標(biāo)miRNA分子的體系中，如果探針分子不具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，則兩個(gè)(或多個(gè))一起使用的探針分子與目標(biāo)miRNA分子雜交(如圖2所示)，在連接酶(如T4DNA連接酶)的作用下，兩個(gè)(或多個(gè))與目標(biāo)miRNA分子雜交的探針分子在2d處連接起來，成為一條完整的鏈；如果探針分子具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)(如圖3所示)，則先通過升溫將探針分子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，然后再緩慢地降溫，在這個(gè)緩慢降溫的過程中，兩個(gè)(或多個(gè))一起使用的探針分子與目標(biāo)miRNA分子雜交，而未雜交的探針分子在溫度降低之后又重新形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在T4DNA連接酶或其它連接酶的作用下，與目標(biāo)miRNA分子雜交的兩個(gè)(或多個(gè))探針分子在3d處連接起來，形成一條完整的鏈。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的作用在于，當(dāng)升溫時(shí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以打開，當(dāng)溫度降低后，未與目標(biāo)分子結(jié)合的探針分子，將重新形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而阻止了探針分子之間的自連接反應(yīng)，可大大減小了背景信號(hào)，提高了檢測靈敏度。使用具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針，可以檢測到總量低至0.02ng-0.2ng的RNA輸入。連接步驟完成以后，連接產(chǎn)物較目標(biāo)miRNA分子長度有所增加，可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；如沒有目標(biāo)miRNA分子存在時(shí)，探針分子不能正確連接，因而進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)不能給出陽性信號(hào)。擴(kuò)增反應(yīng)和檢測反應(yīng)符合常規(guī)的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)要求。簡單描述如下在反應(yīng)體系中加入SYBRGreenI染料、PCR引物，以及PCR反應(yīng)所需的緩沖液等，對探針連接產(chǎn)物(作為底物)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。同時(shí)，由于SYBRGreenI染料可以嵌入雙鏈的DNA分子中，熒光信號(hào)比嵌入單鏈DNA時(shí)強(qiáng)約1000倍，因此根據(jù)PCR的閾值CT以及標(biāo)準(zhǔn)溶液中模板的拷貝數(shù)就可以計(jì)算出初始體系中底物的濃度以及目標(biāo)miRNA分子的濃度。由于SYBRGreenI染料比Taqman或者LNA等改良的探針便宜得多，而且SYBRGreenI染料與所有的DNA分子都可以結(jié)合，不像Taqman或者LNA等改良的探針需要針對每個(gè)目標(biāo)miRNA分子設(shè)計(jì)特定的序列，使用本申請的方法檢測miRNA可以大大減少成本，增加使用靈活度。本發(fā)明技術(shù)方案總結(jié)如下1.一種用于檢測己知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于所述探針組由至少兩個(gè)探針組成，所述至少兩個(gè)探針的總核苷酸數(shù)目大于等于40，所述至少兩個(gè)探針連接起來以后，包括所有連接點(diǎn)在內(nèi)的一段核苷酸序列能與目標(biāo)小RNA的至少一部分核苷酸序列雜交。2.根據(jù)第1項(xiàng)所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于所述至少兩個(gè)探針連接起來以后，包括所有連接點(diǎn)在內(nèi)的一段核苷酸序列能與目標(biāo)小RNA的全部核苷酸序列雜交。3.根據(jù)第1項(xiàng)或第2項(xiàng)所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于所述探針組的至少一個(gè)探針具有至少一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。4.根據(jù)第3項(xiàng)所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于組成探針組的探針在所有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)都未打開的狀態(tài)下連接起來，包括所有連接點(diǎn)的任意一段核苷酸序列都不能與目標(biāo)小RNA分子的任意一段核苷酸序列雜交。5.根據(jù)第3項(xiàng)或第4項(xiàng)所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于組成探針組的每一個(gè)探針都有且僅有一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。6.根據(jù)第5項(xiàng)所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針中莖部的核苷酸數(shù)目不少于3個(gè)。7.使用第1-6項(xiàng)的任一項(xiàng)所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組檢測小RNA的方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)雜交步驟在此步驟中，探針分子與目標(biāo)小RNA分子互補(bǔ)雜交；(2)連接步驟在連接酶的作用下，與目標(biāo)小RNA分子雜交的探針分子之間連接起來，形成一條完整的核酸鏈；(3)檢測步驟對連接步驟得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行檢測。8.根據(jù)第7項(xiàng)所述的檢測小RNA的方法，其特征在于步驟(3)中的檢測為凝膠電泳、Northern印記、基因芯片、質(zhì)譜、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。9.根據(jù)第8項(xiàng)所述的檢測小RNA的方法，其特征在于所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。10.根據(jù)第7項(xiàng)所述的檢測小RNA的方法，其特征在于步驟(2)中的連接酶為T4DNA連接酶、T4RNA連接酶、TaqDNA連接酶、9°NDNA連接酶或￡Co"DNA連接酶。圖1本發(fā)明的小RNA檢測方法示意2直鏈DNA探針結(jié)構(gòu)示意3具有一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA探針結(jié)構(gòu)示意4Mmu-mir-122、syn-aa、aga-mir-210、has-mir陽549、has-mir-214和has-mir-21等6禾中miRNA連接反應(yīng)產(chǎn)物的凝膠電泳5老鼠let-7系列miRNA的檢測結(jié)果6具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針組與不具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針組對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖圖7莖環(huán)結(jié)構(gòu)的作用示意8本發(fā)明的小RNA檢測方法的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果9通過本發(fā)明中的基于酶促連接反應(yīng)的Real-TimePCR(T4ligationPCR)以及傳統(tǒng)的Real-TimePCR(RT-PCR)對老鼠體內(nèi)十種組織細(xì)胞中的U6表達(dá)水平進(jìn)行檢測的結(jié)果圖，ht:心臟；lv:肝臟；SP:脾臟；In:月市；kd:腎；br:腦；CO:結(jié)腸；pan:胰臟；ts:睪丸；Sm:骨骼肌肉圖10使用本發(fā)明的基于酶促連接反應(yīng)的Real-TimePCR對老鼠體內(nèi)十種組織細(xì)胞中的4種miRNA的檢測結(jié)果圖具體實(shí)施方式實(shí)施例1直鏈探針的設(shè)計(jì)與獲取。下面將結(jié)合圖2詳細(xì)說明直鏈探針的設(shè)計(jì)。圖2中的2a為miRNA-122序列示意圖，其具有22個(gè)核苷酸，長度不夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增。探針2b具有31個(gè)核苷酸，2c具有30個(gè)核苷酸，當(dāng)這一對DNA探針先與miRNA-122雜交，然后在T4DNA連接酶的作用下，在2d處連接起來之后，則能形成一個(gè)具有61個(gè)核苷酸的DNA鏈，而這個(gè)長度足夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增了。試驗(yàn)中用到的DNA探針是通過向中國上海的Invitrogen公司購買的。實(shí)施例2具有一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針的設(shè)計(jì)。下面將結(jié)合圖3詳細(xì)說明具有一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針的設(shè)計(jì)。圖3中的3a為miRNA-122序列示意圖，其具有22個(gè)核苷酸，長度不夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增。探針3b具有33個(gè)核苷酸，3c具有39個(gè)核苷酸，這一對探針在溫度升高的時(shí)候，莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以打開，成為直鏈的DNA分子，再與miRNA-122雜交，然后在T4DNA連接酶的作用下，在3d處連接起來之后，則能形成一個(gè)具有72個(gè)核苷酸的DNA鏈，這個(gè)長度足夠進(jìn)行PCR擴(kuò)增。實(shí)施例3miRNA的檢測方法。本實(shí)施例將利用類似實(shí)施例2中的具有一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針從含有6種miRNA的體系中檢測出目標(biāo)miRNA。6禾中miRNA分別是Mmu-mir隱122、syn-aa、aga-mir-210、has-mir-549、has-mir-214禾Bhas-mir-21，其核苷酸序列見圖4和表1所示。Mmu-mir-122為目標(biāo)miRNA。這6種miRNA中，除syn-aa序列為滿足本實(shí)驗(yàn)而人為設(shè)計(jì)，其余miRNA序列均從Sanger數(shù)據(jù)庫獲得。試驗(yàn)中用的上述6種miRNA都是從上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司購得的。圖4用著重號(hào)示出了5種非目標(biāo)miRNA核苷酸序列中與目標(biāo)miRNA相同的部分，由圖可見，非目標(biāo)miRNA中有2-8個(gè)核苷酸序列與目標(biāo)miRNA中相同，這種現(xiàn)象在實(shí)際的miRNA檢測中經(jīng)常遇到。我們?yōu)镸mu-mir-122設(shè)計(jì)了兩個(gè)DNA探針，分別是probe122-1(簡稱Spl)和probe122-2(P04)(簡稱Sp2)，其核苷酸序列見表2(下劃線標(biāo)出的核苷酸序列為與Mmu-mir-122雜交的部分)。分別將1.2X10"個(gè)上述6種miRNA分子配制成1pL的溶液，得到6個(gè)溶液。將25finolDNA探針(Spl和Sp2)與上述6個(gè)溶液之一混合，在65'C孵育3分鐘，緩慢降溫至室溫(約45分鐘)，最后將樣品置于冰塊上降溫以形成異源雙鏈核酸分子結(jié)構(gòu)。至此雜交步驟就已經(jīng)完成了。酶促連接反應(yīng)按如下方案進(jìn)行，準(zhǔn)備一個(gè)新鮮的緩沖溶液，其組分以及各組分的濃度為10mMMgCl2、lOmM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(TrisHCl)、10uM三磷酸腺苷(ATP)、0.5wLRnase抑制劑(Rnaseinhibitor)和70U/uLT4DNA連接酶。將此緩沖溶液加入到上述樣品溶液中，使最終溶液體積為10ixL，將溶液在16'C孵育過夜，最后加熱到70'C并保持20分鐘以終結(jié)連接反應(yīng)。將連接反應(yīng)之后得到的產(chǎn)物用10%的聚丙烯酰胺在200V下進(jìn)行30分鐘凝膠電泳，結(jié)果如圖4下部所示，兩個(gè)DNA探針Spl和Sp2只在目標(biāo)miRNAMmu-mir-122存在的情況下雜交并連接起來了，而在其他非目標(biāo)miRNA分子存在的情況下，并不發(fā)生連接反應(yīng)。實(shí)施例4miRNA的檢測方法。本實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)施例3中基本相同，只是檢測的對象變成了8個(gè)核苷酸序列非常接近的老鼠let-7系列的miRNA，包括mmu-let-7a7g以及mmu-let-7i，其核苷酸序列見圖5以及表1。圖5中用著重號(hào)示出了mmu-let-7b~g以及mmu-let-7i核苷酸序列中與mmu-let-7a不相同的部分，由圖5可知，這一組miRNA的核苷酸序列更加接近，因而檢測難度也就更大。我們?yōu)槊恳粋€(gè)miRNA都設(shè)計(jì)了DNA探針組，每個(gè)DNA探針組由兩個(gè)或者三個(gè)配合使用的DNA探針組成，相應(yīng)DNA探針的核苷酸序列見表2，其中用下劃線標(biāo)出的核苷酸序列為與目標(biāo)miRNA分子雜交的部分。酶促連接反應(yīng)的試驗(yàn)條件與實(shí)施例3中相似，只是用每一組DNA探針檢測所有8種miRNA，這樣一共有64個(gè)連接反應(yīng)試驗(yàn)。將連接反應(yīng)完成之后得到的產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析或者實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-TimePCR)，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別列于圖5b和5c。Real-TimePCR實(shí)驗(yàn)操作按如下方案進(jìn)行Real-TimePCR是在美國Bio-Rad(伯樂)DNAEngineOpticon2雙色實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行的，將10uLSYBRGreenqPCRSupermix(TransStart)、0.8uLlOyM正向和反向引物(forwardandreverseprimers)混合，移入酶連接反應(yīng)的產(chǎn)物作為PCR模板并使最后的混合溶液體積為20iiL。將反應(yīng)體系置于一個(gè)96孔板(96-wellplate)中，在95。C下孵育2分鐘，然后在94。C下15秒、60。C下30秒、72。C下30秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。所有的反應(yīng)均平行做三次。臨界循環(huán)數(shù)(CT)定義為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。C代表Cycle,T代表Threshold。由圖5b可以看出，檢測結(jié)果的特異性很好，只有當(dāng)用let-7a的探針檢測let-7e以及用let-7f的探針檢測let-7a的時(shí)候，凝膠電泳實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了噪音信號(hào)。由圖5c的Real-TimePCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，檢測結(jié)果的特異性也非常好。圖4c中的數(shù)值是這樣計(jì)算得到的以第一行為例，用let-7a的探針組檢測let-7ag以及l(fā)et-7i，得到各自Ct僮，將每組所測對象(CT值最低)的相對表達(dá)量設(shè)定為100%，其余各miRNA的相對表達(dá)量由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。由圖5c的結(jié)果可知，只有用let-7a的探針組檢測let-7d和let-7e、用let-7c的探針組檢測let-7b以及用let-7f的探針組檢測let-7a等4個(gè)數(shù)值在1%以上。更進(jìn)一步的，可以設(shè)計(jì)一組普適的DNA探針分子對一個(gè)系列的miRNA分子一起檢測。例如，可以用一對DNA探針分子probelet-7-l和probelet-7-2(P04)(其核苷酸序列見表2)不加區(qū)分地與let-7系列的8個(gè)miRNA分子發(fā)生連接反應(yīng)(圖5d)，這個(gè)特性可能在某些情況下得到應(yīng)用，例如一個(gè)miRNA系列的所有成員一起對一組功能性蛋白的表達(dá)起調(diào)控作用，因此并不需要區(qū)分系列中每個(gè)成員的表達(dá)水平。實(shí)施例5DNA探針中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的作用。為了說明DNA探針中莖環(huán)結(jié)構(gòu)的作用，我們?yōu)閙iRNA分子mmu-mir-122設(shè)計(jì)了兩組DNA探針，分別是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的probe122-1(簡稱Spl)、probe122-2(P04)(簡稱Sp2)和不具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)(即為線性結(jié)構(gòu))的probe122-3(簡稱Lpl)、probe122-4(P04)(簡稱Lp2)，它們的核苷酸序列列于表2中。利用上述兩組探針進(jìn)行如下兩個(gè)實(shí)驗(yàn)在第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，分別利用兩組探針與mmu-mir-122進(jìn)行酶促連接反應(yīng)并隨后進(jìn)行Real-TimePCR擴(kuò)增；第二個(gè)實(shí)驗(yàn)與第一個(gè)實(shí)驗(yàn)條件相同，只是不加入目標(biāo)miRNA分子mmu-mir-122。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。從圖6可以看出來，當(dāng)體系中有目標(biāo)miRNA分子mmu-mir-122存在的時(shí)候，用兩組探針得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果差不多(圖6中的Spl/2+mir-122和Lpl/2+mir-122);而當(dāng)體系中沒有目標(biāo)miRNA分子mmu-mir-122存在的時(shí)候，用兩組探針得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相差較大(圖6中的PureLpl/2和PureSpl/2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用Lpl和Lp2進(jìn)行檢測的情況下，沒有mmu-mir-122存在的時(shí)候得到的&值僅比有mmu-mir-122存在的時(shí)候的&值大一點(diǎn)，而使用Spl和Sp2進(jìn)行檢測的情況下，沒有mmu-mir-122存在的時(shí)候得到的CT值比有mmu-mir-122存在的時(shí)候的CT值大很多。這表明與直線型的探針相比，使用帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA探針可以明顯減小探針之間自連接帶來的背景噪音。這個(gè)結(jié)果可以作如下解釋莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA探針在升溫-退火的過程中打開莖環(huán)并與目標(biāo)miRNA分子雜交，溫度降低之后，未雜交上的DNA探針又會(huì)重新形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或者與自身雜交，從而由于空間位阻的原因，探針Spl和Sp2之間的自連接將被抑制(圖7)。9實(shí)施例6miRNA前體對miRNA檢測的干擾。包含整個(gè)成熟miRNA核苷酸序列的miRNA前體可能對miRNA的檢測造成干擾。為了研究本發(fā)明的miRNA檢測方法對miRNA前體的抗干擾能力，我們合成了mir-122和mir-l的前體，合成方法如下首先將50pmol的正向DNA引物與50pmol的反向DNA引物(序列見表三)混合后75°C加熱5分鐘，緩慢降到室溫進(jìn)行退火雜交(約30分鐘)。接下來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄所需的DNA模板合成，在20"L的反應(yīng)體系中加入上述己經(jīng)退火好的DNA引物，10mM三羥甲基氨基甲垸鹽酸鹽(Tris-HCl),50mMNaCl，10mMMgCl2,1mM二硫蘇糖醇(DTT),2.5dNTPs以及5U的Klenow(3'-5，exo)酶，37°C反應(yīng)1小時(shí)候以合成DNA模板。75°C加熱20分鐘失活Klenow酶，再將溶液緩慢降至室溫。最后是合成實(shí)驗(yàn)所需的miRNA前體，具體實(shí)驗(yàn)如下，50pL的反應(yīng)體系中含有20|iL上述合成的DNA模板，0.5mMNTPs,40mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)，6mMMgCl2,lOmM二硫蘇糖醇(DTT),2mM亞精胺，40~200URNA酶抑制劑以及50UT7RNA聚合酶，在37。C條件下反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，加入lU的DNAseI酶消化DNA模板，對溶液進(jìn)行酚氯仿抽提得到提純的miRNA前體。合成的miRNA前體可以通過2%的瓊脂糖凝膠檢測其合成質(zhì)量，使用NanoDrcp分光光度計(jì)測量其濃度。(dsDNA序列見表3)。在本實(shí)施例中，所有的探針都具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)。對mir-122，我們使用的DNA探針還是Spl和Sp2,而對mir-l，我們使用的探針是probemir-1-1和probemir-l-2(P04)(其核苷酸序列見表2)?？紤]到通常情況下，miRNA前體的熔點(diǎn)高于75"，我們在65'C下進(jìn)行雜交，以保證兩個(gè)具有基環(huán)結(jié)構(gòu)的探針Spl和Sp2與miRNA雜交，而不是與對應(yīng)的miRNA前體雜交。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表4中。由表4可以看出，相同數(shù)量的miRNA前體只能產(chǎn)生它們對應(yīng)的成熟miRNA0.2%的信號(hào)強(qiáng)度。即便體系中miRNA前體的量是對應(yīng)成熟miRNA的100倍，miRNA前體也只能貢獻(xiàn)小于1.5%的信號(hào)強(qiáng)度。這個(gè)結(jié)果表明，本發(fā)明的miRNA檢測方法能有效阻止miRNA前體與DNA探針雜交，其對成熟miRNA的檢測具有很高的特異性。實(shí)施例8本發(fā)明miRNA檢測方法的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍。我們用DNA探針Spl和Sp2與mmu-mir-122進(jìn)行酶促連接反應(yīng)并隨后進(jìn)行Real-TimePCR擴(kuò)增，目標(biāo)mmu-mir-122分子數(shù)從1(T減少到105，擴(kuò)增圖顯示了目標(biāo)分子數(shù)的對數(shù)與CT值之間具有非常好的線性關(guān)系，從而證明了本發(fā)明miRNA檢測方法具有至少從105到1(^一共6個(gè)log的動(dòng)態(tài)范圍(圖8a，8b)。另外，針對4種miRNA測試了本發(fā)明miRNA檢測方法的檢測下限，結(jié)果示于圖8c中。目標(biāo)miRNA的輸入量從2ug減少到0.02ng，在5個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)，CT值與miRNA的輸入量之間都呈現(xiàn)出很好的線性關(guān)系(R2>0.994)。由這些結(jié)果可知，本發(fā)明的miRNA檢測方法即便使用總RNA樣本的時(shí)候，也具有很寬的動(dòng)態(tài)范圍和很好的靈敏度。實(shí)施例9本發(fā)明miRNA檢測方法與傳統(tǒng)real-timeRT-PCR(實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶反應(yīng))在檢測內(nèi)參RNA的比較。在實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中，將不同樣本miRNA相對于內(nèi)參進(jìn)行歸一化對于miRNA的定量測定非常關(guān)鍵。小核RNA(snRNA)U6經(jīng)常被用來作為傳統(tǒng)miRNA或其他RNA檢測的內(nèi)參，我們用本發(fā)明中的基于酶促連接反應(yīng)的Real-TimePCR以及傳統(tǒng)的Real-TimePCR對老鼠體內(nèi)十種組織細(xì)胞中的U6表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果示于圖9。從圖9可以看出，本發(fā)明的基于酶促連接反應(yīng)的Real-TimePCR檢測U6結(jié)果與傳統(tǒng)的Real-TimePCR非常接近。這表明本發(fā)明的基于酶促連接反應(yīng)的Real-TimePCR可以用來定量檢測不同組織細(xì)胞中的miRNA。實(shí)施例10使用本發(fā)明的基于酶促連接反應(yīng)的Real-TimePCR方法檢測不同組織細(xì)胞中的miRNA。檢測對象為老鼠體內(nèi)10種組織細(xì)胞中的mir-122、mir-l、mir-34a和let-7a，使用的內(nèi)參為小核RNAU6。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于圖10，正與預(yù)計(jì)的結(jié)果一樣，mir-l主要表達(dá)在肌肉中，mir-122主要表達(dá)在肝臟中，而mir-34a和let-7a廣泛地分布在各種組織細(xì)胞中。附表表l，本申請涉及的miRNA核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表2，本申請涉及的DNA探針和PCR前體核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3，本申請涉及的dsDNA模板核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表4，miRNA前體對miRNA檢測的干擾IDSyntheticmiRNASyntheticprecursorcT(No.ofcopies)(No,ofcopies)miRNAmir-1016.54220lxlO825.700lxlO923.950lxlO1023.12lxlO8lxlO817.31lxlO8lxlO917.63lxlO8lxlO1017.47mir誦llxlO8013.260lxlO822.190lxlO919.610lxlO1018.13lxlO8lxlO812.80lxlO8lxlO913.1權(quán)利要求1.一種用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于所述探針組由至少兩個(gè)探針組成，所述至少兩個(gè)探針的總核苷酸數(shù)目大于等于40，所述至少兩個(gè)探針連接起來以后，包括所有連接點(diǎn)在內(nèi)的一段核苷酸序列能與目標(biāo)小RNA的至少一部分核苷酸序列雜交。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于所述至少兩個(gè)探針連接起來以后，包括所有連接點(diǎn)在內(nèi)的一段核苷酸序列能與目標(biāo)小RNA的全部核苷酸序列雜交。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于所述探針組的至少一個(gè)探針具有至少一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于組成探針組的探針在所有的莖環(huán)結(jié)構(gòu)都未打開的狀態(tài)下連接起來，包括所有連接點(diǎn)的任意一段核苷酸序列都不能與目標(biāo)小RNA分子的任意一段核苷酸序列雜交。5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于組成探針組的每一個(gè)探針都有且僅有一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測巳知序列的小RNA的DNA探針組，其特征在于具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的探針中莖部的核苷酸數(shù)目不少于3個(gè)。7.使用權(quán)利要求1-6的任一項(xiàng)所述的用于檢測已知序列的小RNA的DNA探針組檢測小RNA的方法，其特征在于該方法包括如下步驟-(1)雜交步驟在此步驟中，探針分子與目標(biāo)小RNA分子互補(bǔ)雜交；(2)連接步驟在連接酶的作用下，與目標(biāo)小RNA分子雜交的探針分子之間連接起來，形成一條完整的核酸鏈；(3)檢測步驟對連接步驟得到的連接產(chǎn)物進(jìn)行檢測。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測小RNA的方法，其特征在于步驟(3)中的檢測為凝膠電泳、Northern印記、基因芯片、質(zhì)譜、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測小RNA的方法，其特征在于所述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測小RNA的方法，其特征在于步驟(2)中的連接酶為T4DNA連接酶、T4RNA連接酶、TaqDNA連接酶、9°NDNA連接酶或￡Co7iDNA連接酶。全文摘要本發(fā)明涉及一種用于小RNA檢測的探針以及用此探針檢測小RNA的方法，屬于小RNA的檢測領(lǐng)域。本發(fā)明的用于檢測小RNA的DNA探針組由至少兩個(gè)探針組成，所述至少兩個(gè)探針連接起來以后，包括所有連接點(diǎn)在內(nèi)的一段核苷酸序列與目標(biāo)小RNA分子的核苷酸序列互補(bǔ)。本發(fā)明的檢測小RNA的方法包括將所述探針與目標(biāo)小RNA雜交、在連接酶的作用下連接，最后通過凝膠電泳或者實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等檢測目標(biāo)小RNA。本發(fā)明的檢測小RNA的方法具有靈敏度高、動(dòng)態(tài)范圍大、抗干擾能力強(qiáng)以及廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，在與小RNA探測相關(guān)的科學(xué)實(shí)驗(yàn)、臨床診斷等多個(gè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101591709SQ20091008447公開日2009年12月2日申請日期2009年5月19日優(yōu)先權(quán)日2009年5月19日發(fā)明者波姚,席建忠,娟李申請人:北京大學(xué)