專利名稱：脫支酶法水解糖生產(chǎn)檸檬酸工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)檸檬酸工藝，具體是脫支酶法水解糖生產(chǎn)檸 檬酸工藝。(二)現(xiàn)有技術(shù)檸檬酸廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥、輕工、原子能、環(huán)保等領(lǐng)域。目 前國內(nèi)檸檬酸工業(yè)化生產(chǎn)一般采用玉米、薯干、小麥等淀粉質(zhì)原料和糖蜜經(jīng)黑曲霉液體深 層發(fā)酵的方法生產(chǎn)，然后采用中和、酸解、離交、濃縮、結(jié)晶、干燥等工序制得。淀粉質(zhì)原料經(jīng) α -淀粉酶水解，制備成用于發(fā)酵的淀粉水解糖原料液(主要含葡萄糖、麥芽糖和低聚糖)， 進(jìn)入發(fā)酵罐后，再通過菌種自產(chǎn)糖化酶完成糖化。最后由黑曲霉通過EMP和TCA途徑將葡 萄糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸。現(xiàn)行生產(chǎn)工藝由于淀粉降解不完全，造成原料對產(chǎn)品的發(fā)酵轉(zhuǎn)化率不理想，發(fā)酵 后有部分或一定量未利用的殘?zhí)谴嬖?，是我國檸檬酸行業(yè)普遍存在的一個問題。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能提高檸檬酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率的脫支酶 法水解糖生產(chǎn)檸檬酸工藝，該工藝解決了長期困擾檸檬酸生產(chǎn)行業(yè)轉(zhuǎn)化率低的問題，且操作簡單，易于工業(yè)化。本發(fā)明的脫支酶法水解糖生產(chǎn)檸檬酸工藝，包括下述步驟(1)將原料加工，蒸煮，得發(fā)酵原料液；(2)將發(fā)酵原料液控溫在90°C，pH調(diào)整至4. 8-5.0，按原料液中淀粉含量加入 600-800ASPUkg淀粉高溫脫支酶；保溫26-30分鐘；(3)加入α-淀粉酶水解，滅菌，降溫，接種，培養(yǎng)，分離，精制，即得。上述所用的高溫脫支酶每Iml相當(dāng)于1000ASPU。本發(fā)明雖然僅僅只是在原工藝中加入了一種脫支酶，但為此本發(fā)明人做了大量的 實驗，包括對檸檬酸發(fā)酵殘?zhí)浅煞址治觯ㄟ^主要成分與生產(chǎn)工藝的對應(yīng)關(guān)系尋找出造成 檸檬酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率不理想的環(huán)節(jié)和原因，探討解決問題的方法和途徑，以及新方法所能 達(dá)到的技術(shù)效果，其具體實驗情況如下檸檬酸發(fā)酵原理1.檸檬酸合成途徑 2.檸檬酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)1)在正常情況下，檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶有抑制作用，而ΑΤΡ、無機磷、銨離 子對該酶則有激活作用，特別是還能解除檸檬酸、ATP對磷酸果糖激酶的抑制作用。2)比較底物錳充足、錳缺乏時分批培養(yǎng)物的最大活力時發(fā)現(xiàn)，錳缺乏時黑曲霉的 組成(合成)代謝受損傷，這與檸檬酸的積累有關(guān)。
3)丙酮酸激酶是EMP途徑的第2個調(diào)節(jié)點，在某些真菌得到證實，但黑曲霉未被證 實。3.檸檬酸生物合成代謝調(diào)節(jié)的特點1)TCA環(huán)的起始酶檸檬酸合成酶是一種調(diào)節(jié)酶。但在黑曲霉中，檸檬酸合成酶沒 有調(diào)節(jié)作用，不會因檸檬酸過多而降低合成速度，這是黑曲霉TCA環(huán)的第一個特點。2)第二個特點黑曲霉菌體內(nèi)α-酮戊二酸脫氫酶缺失或活力很低(TCA環(huán)被阻 斷，檸檬酸積累)。3)氧和ρΗ值對檸檬酸發(fā)酵的影響很大。4.檸檬酸積累的原因①Μη2+缺乏一抑制蛋白合成一ΝΗ4有一條呼吸活動強的不產(chǎn)生ATP的側(cè)呼吸鏈；②由于丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調(diào)節(jié)控制。丙酮酸氧化脫羧生成乙酰CoA 和C02的固定兩個反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強了合成檸檬酸的能力。③由于順烏頭酸水合酶在催化時建立了以下平衡檸檬酸順烏頭酸異檸檬酸=90 3 7同時控制Fe2+含量時，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。④隨著檸檬酸積累，ρΗ降低到一定程度時，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活， 更有利于檸檬酸的積累及排出細(xì)胞外。5.檸檬酸發(fā)酵原料_淀粉水解糖制備水解糖液的質(zhì)量直接關(guān)系到生產(chǎn)菌的生長速度與代謝產(chǎn)物的積累，其中的低聚糖 類與復(fù)合糖類等雜質(zhì)越低越好。原理 目前生產(chǎn)中采用添加α-淀粉酶對原料淀粉進(jìn)行水解，產(chǎn)生葡萄糖、麥芽糖和低 聚糖，再通過菌種自產(chǎn)糖化酶完成糖化。但由于原料中含有一定量的支鏈淀粉，而α-淀粉 酶只能水解直鏈淀粉上的α-1，4-糖苷鍵，不能水解支鏈淀粉分支上的α-1，6_糖苷鍵，不 能使極限糊精繼續(xù)降解。而脫支酶可使淀粉中的支鏈淀粉脫支而形成直鏈淀粉?？梢运?極限糊精上的α -1，6_糖苷鍵產(chǎn)生低聚葡萄糖，再由a_淀粉酶進(jìn)一步水解產(chǎn)生葡萄糖和麥 芽糖。最后由黑曲霉通過EMP和TCA途徑將葡萄糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸。實驗室工作1.檸檬酸發(fā)酵殘?zhí)浅煞址治鰳悠伏S石興華生化有限公司中和廢糖水方法還原糖的測定-3，5- 二硝基水楊酸比色法淀粉含量的測定_碘顯色法單糖和還原二糖的鑒定-Barfoed實驗
實驗結(jié)果參見圖1所示的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y = O. 0061+0. 34807X(Y為光吸收值，X為糖的含量)淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為Y = O. 01757+8. 28857Χ(Υ為光吸收值，X為淀粉的含量)還原糖平均光吸收值(0.015+0. 014+0. 016) /3 = 0. 015總糖平均光吸收值(0.160+0. 156+0. 158)/3 = 0. 158還原糖=0.0256mg/mLX 1. 2X5 = 0. 1536mg/mL總糖=0.4364mg/mLX 1. 8X5 = 3. 9276mg/mL淀粉=(0.01236mg/mL-0. 00958mg/mL) = 0. 00278mg/mL對樣品的單糖和還原二糖鑒定實驗表明，有少許的麥芽糖存在，基本沒有葡萄糖。檸檬酸發(fā)酵殘?zhí)浅煞譃榈矸酆惋@色的糊精共為0. 00278mg/mL,無色糊精為3·77122mg/mL麥芽糖為0·1536mg/mL葡萄糖為0檸檬酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率不理想的原因分析由于原料中有支鏈淀粉存在，而α-淀粉酶只能水解直鏈淀粉上的α-1，4_糖苷 鍵，不能水解支鏈淀粉分支上的α-1，6-糖苷鍵，所以不能使極限糊精繼續(xù)降解。生產(chǎn)菌種 又不能產(chǎn)生脫支酶，故不能將極限糊精轉(zhuǎn)化為檸檬酸。解決方法探討脫支酶又稱極限糊精酶，主要催化水解支鏈淀粉內(nèi)部的a-l，6_D-糖苷鍵。脫支 酶能夠催化支鏈淀粉分支位點的水解，但其主要作用是水解被a-淀粉酶和β _淀粉酶聯(lián)合 降解淀粉后形成的較小的分支寡糖。如在發(fā)酵原料液中加入脫支酶可能會提高轉(zhuǎn)化率。2、脫支酶對檸檬酸發(fā)酵原料液還原糖含量的影響研究樣品黃石興華生化有限公司淀粉水解糖液糖的分析方法與前述的殘?zhí)浅煞址治鱿嗤?)加酶量對發(fā)酵原料液還原糖含量的影響按表1試驗，取發(fā)酵原料液樣品10ml，以蒸餾水稀釋5倍，使用的脫支酶含量為 1000ASPU/ml,以蒸餾水稀釋1000倍，即每ml相當(dāng)于1ASPU，使用的α -淀粉酶為每ml相當(dāng) 于2萬u，試驗結(jié)果如表2中所示。表1各管成分
5 表2各管還原$
試驗結(jié)果表明α -淀粉酶和脫支酶對樣品都有水解作用。但在加入脫支酶之后 再根據(jù)現(xiàn)有工藝方法加入α-淀粉酶酶解，能夠達(dá)到較好的水解效果，樣品中還原糖含量 提高 27. 29%。
2)脫支酶加量的影響
表3
試驗結(jié)果表明脫支酶量為0.2ml(相當(dāng)于0.2ASPU)時曲線達(dá)到最高值，說 明0.2ml脫支酶即能夠滿足樣品水解的需要。若按樣品中的每g淀粉用酶量計算， 則IOml樣品中的淀粉含量為樣品量+稀釋倍數(shù)X原料含量X原料中淀粉含量= 10 + 5X20% XlQV0= 0. 28g，即每 kg 淀粉最佳用酶量為0. 2/0. 28X1000 = 714ASPU。
上述原料含量是指發(fā)酵原料液中含玉米、小麥、木薯等的總量。3)溫度的影響本發(fā)明中采用高溫脫支酶，其目的主要是考慮實際生產(chǎn)過程中煮沸的發(fā)酵原料液 要降溫到低溫酶的使用溫度55-60°C，需要采取一系列的降溫措施和花費一定的時間，增大 了生產(chǎn)成本。經(jīng)過試驗，采用高溫酶的最佳作用溫度為90°C，此時還原糖量達(dá)到最大值。隨 溫度升高，酶活力下降，影響樣品的水解，還原糖量降低。表 4 4)保溫時間的影響
表 5
從表中可看出，最佳保溫時間為26-30分鐘；
5)pH值的影響
表6
從表中可看出，最佳PH值為4.8-5. 0通過上述系列試驗，得出最佳酶解條件為脫支酶加入量按樣品(即發(fā)酵原料 液)中淀粉含量加入600-800AS PU kg淀粉，溫度為90°C，PH值為4. 8-5.0，保溫時間為 26_30mino按以上方法試驗，樣品還原糖含量可提高47. 13%，效果明顯。分析脫支酶打開a-l，6_糖苷鍵后，產(chǎn)生的直鏈寡多糖才能被α -淀粉酶水解，還 原糖含量才可大幅度提高，這也是兩酶須配合使用的原因。


圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為脫支酶加入量與還原糖含量的關(guān)系圖；圖3為加入脫支酶溫度與還原糖含量的關(guān)系圖；圖4為保溫時間與還原糖含量的關(guān)系圖；圖5為ρΗ值與還原糖含量的關(guān)系圖。
具體實施例方式實施例1(1)將原料加工，蒸煮，得發(fā)酵原料液；(2)將發(fā)酵原料液控溫在90°C，pH調(diào)整至4. 8，按原料液中每kg淀粉加入600ASPU 的高溫脫支酶；保溫26分鐘； (3)加入α -淀粉酶1. 5u/g (淀粉)水解，滅菌，降溫，接種，培養(yǎng)，分離，精制，即得 檸檬酸。本實施例中所用原料設(shè)備及工藝條件為IOL自控發(fā)酵罐兩臺(裝料6L)培養(yǎng)基搖瓶(種子)玉米粉2O %發(fā)酵玉米粉5 %，木薯粉15 %種子工廠孢子培養(yǎng)物一搖瓶(100mL/500mL)—接種(0. lg/IOOmL) — 36°C搖床 (300轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)20-24小時一鏡檢(菌絲生長正常，ρΗ 3. 0左右)一接種控制參數(shù)裝量6L/10L，溫度 37. 5°C，風(fēng)量 0. 3-0. 5L/L/min,罐壓0. IMPa,轉(zhuǎn)速 400 轉(zhuǎn) /min對比實施例1裝料-蒸煮_ α _淀粉酶水解-滅菌-降溫至40°C “接種_調(diào)整參數(shù)_培養(yǎng)_分 離-精制，即得檸檬酸。本對比實施例1中所用原料設(shè)備及工藝條件與實施例1完全相同，即IOL自控發(fā)酵罐兩臺(裝料6L)培養(yǎng)基搖瓶(種子)玉米粉20%
8
發(fā)酵玉米粉5%，木薯粉15%種子工廠孢子培養(yǎng)物一搖瓶(100mL/500mL)—接種(0. lg/IOOmL) — 36°C搖床 (300轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)20-24小時一鏡檢(菌絲生長正常，pH 3. 0左右)一接種控制參數(shù)裝量6L/10L，溫度 37. 5°C，風(fēng)量 0. 3-0. 5L/L/min,罐壓0. IMPa，轉(zhuǎn)速 400 轉(zhuǎn)/min實驗結(jié)果(平均值) 實施例2(1)將原料加工，蒸煮，得發(fā)酵原料液；(2)將發(fā)酵原料液控溫在90°C，pH調(diào)整至4. 8，按原料液中每kg淀粉加入714ASPU 的高溫脫支酶；保溫29分鐘；(3)加入α-淀粉酶2u/g(淀粉)水解，滅菌，降溫，接種，培養(yǎng)，分離，精制，精制， 即得檸檬酸。本實施例中所用原料設(shè)備及工藝條件為設(shè)備10m3發(fā)酵罐(裝料8m3)種子工廠16-18小時種子培養(yǎng)物培養(yǎng)基工廠發(fā)酵原料液工藝控制參數(shù)溫度37. 5°C，風(fēng)量 1. 5m3/min，罐壓 0. IMPa，轉(zhuǎn)速 100 轉(zhuǎn) /min對比實施例2裝料-蒸煮_ α _淀粉酶水解_滅菌-降溫至40°C -接種-調(diào)整參數(shù)-培養(yǎng)一分 離，精制，即得檸檬酸。本對比實施例2中所用原料設(shè)備及工藝條件與實施例2完全相同即設(shè)備10m3 發(fā)酵罐(裝料8m3)種子工廠16-18小時種子培養(yǎng)物培養(yǎng)基工廠發(fā)酵原料液實驗結(jié)果(平均值) 實施例3(1)將原料加工，蒸煮，得發(fā)酵原料液；(2)將發(fā)酵原料液控溫在90°C，pH調(diào)整至4. 8，按每kg淀粉加入800ASPU高溫脫 支酶；保溫30分鐘；(3)加入α-淀粉酶1.8u/g (淀粉)水解，滅菌，降溫，接種，培養(yǎng)，分離，精制，精 制，即得檸檬酸。本實施例中所用原料設(shè)備及工藝條件為設(shè)備10m3發(fā)酵罐(裝料8m3)種子工廠16-18小時種子培養(yǎng)物培養(yǎng)基工廠發(fā)酵原料液工藝控制參數(shù)溫度37. 5°C，風(fēng)量 1. 5m3/min，罐壓 0. IMPa，轉(zhuǎn)速 100 轉(zhuǎn) /min對比實施例3裝料-蒸煮_ α _淀粉酶水解_滅菌-降溫至40°C -接種-調(diào)整參數(shù)-培養(yǎng)一分 離，精制，即得檸檬酸。本對比實施例3中所用原料設(shè)備及工藝條件與實施例3完全相同即設(shè)備10m3 發(fā)酵罐(裝料8m3)種子工廠16-18小時種子培養(yǎng)物培養(yǎng)基工廠發(fā)酵原料液實驗結(jié)果(平均值) 從上述數(shù)據(jù)可以看出，通過對比試驗，檸檬酸發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率提高6. 1%、產(chǎn)酸率提 高0. 93%，發(fā)酵周期縮短7. 3%，經(jīng)濟效益明顯。
權(quán)利要求
脫支酶法水解糖生產(chǎn)檸檬酸工藝，其特征在于包括下述步驟(1)將原料加工，蒸煮，得發(fā)酵原料液；(2)將發(fā)酵原料液控溫在90℃，pH調(diào)整至4.8 5.0，按原料液中淀粉含量加入600 800ASPU/kg淀粉高溫脫支酶；保溫26 30分鐘；(3)加入α 淀粉酶水解，滅菌，降溫，接種，培養(yǎng)，分離，精制，即得。
全文摘要
脫支酶法水解糖生產(chǎn)檸檬酸工藝，包括下述步驟(1)將原料加工，蒸煮，得發(fā)酵原料液；(2)將發(fā)酵原料液控溫在90℃，pH調(diào)整至4.8-5.0，按原料液中淀粉含量加入600-800ASPU/kg淀粉高溫脫支酶；保溫26-30分鐘；(3)加入α-淀粉酶水解，滅菌，降溫，接種，培養(yǎng)，分離，精制，即得；本發(fā)明解決了長期困擾檸檬酸生產(chǎn)行業(yè)轉(zhuǎn)化率低的問題，且操作簡單，易于工業(yè)化。
文檔編號C12P7/48GK101899480SQ20091006227
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月27日
發(fā)明者石鶴 申請人:湖北師范學(xué)院